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Reporte de l Proyecto de Servicio Social.

"ESTODIO DE LOS EFlSePOS DE U PROGESTF!XONA SOBWZ J

LA TRARAIJSCRIPCION DE CEUTLAS ENDOMETREAL.EC."

Realizado por:

War : I W C R U ZA"DT.0 aXAYA.

Laboratorio de Ilcros- copfa Electrdnica de la Facultad de Uedicina U.N.A.M.

8 . b O O . a

. . . . . o . . . . . . . .

En el curso de la vida colular, todas lar c8luukr p a w fundamentaimente por dos perfodosr uno de Faterfase, o de no di- visibn, y otro de diviaión, nor medio del cual se producen dos - cdlulas hi jas.

Eate ciclo ae repite en aada generación celular, Ter0 el tiempo de ganoracidn varfa de un tipo colular a otro.

Durante la división celular el núoleo experimenta una sq ríe de cambios complejos pero reguiares y constantea, en auyo - transcurso la membrana nuclear y el nucieóio desaparecen y la -- sustancia crodtica ae condensa en cuerpos intensamente colorea- dos: los cromosomas.

En La interfass, loa cromoaomas generalmente no son vi- sibles porque ae encuentran en un estado de disnersibn o hidraw- tación muy intensa y SUS componentes macromleculares están dis- tribufdos laixamente dentro del núcleo.

Núcleo Faterfds1co.- En el material fijado y coloreado, la estructura del n b

cleo se distingue por su gran comalejidad y varfa de acuerüo con el tipo de aelula y el fijador emnleado. Hn general oodemos dfs- tinguir: 1) una membrana nuclear, 2101 nucieopiasma o jugo nuclq ar, 3) los cromocentros o falsos nucleólos y 4) los nucieóios.

La membrana nuclear aparece como una lfnea bien delimita da sobre ambos lados, citopl6siico y nuclear. Examinada con el - miaroacoaio electrdnico, presenta dos membrana8 y mueatra l o s pg ros tlucleares.

El nucleoplasma ocupa la mayor parte del esnacio nuclear &te representa l a s porciones no condensadas do Iti cromatine, en l a s cuales los cromosomas re hallan dispersos en sus finos comg nentes macromoleculares. Estas regiones son las que conocemos az mo Eucronatina.

Los cromocentros junto con los filamentos retorcidos de- cromatina, representa la parte de los cromosomas que permaneoen condensadas durante la interfaye. A esks regiones ae les conoce como heterocromatina, la que frecuentemente se encuentracercn de la aiemkrana nuclear y también adherida al nucledlo.

-2-

LOS nuciéoios, generalmente esfér icos y muy voluainosos_ en las células que la síntesis de m o t e h a s ea muy activa. El-

c ~ o l o puede ser dnico o nnfltip1pp- es generalmente aciddfilo y, contiene ribonucleoprotefnas.

E l Nucldül0.- LO8 nucldolos fueron descritos por prlmeia JBZ , por Fon-

tana en 1781 como grhu los intranucleares densos. Los nuciéoios se p r e sman como cuerpos w;r refringentes

por la gran concentración de aater ia l sólido, el cual puede me-- dirse por microscop&i de interferencia de fase. Con 01 nicrOSCQ-

-io 6ptic0, e1 nUC@QlO aparece como una estructura homogdnea, - aunque en ocas&.onq se observan pequeños corpdscuios o vacuolas.

E l nucledlo presenta uha respuesta negativa a la t6aoica de Feulgen y Rossenbech (1) que determina la presencia de ADN, - l o que sugerfa que e l ADN no es uta carpaian t e primordial del ma- cl6olo.

Heitc(2) señala la formacibn del nucldolo sobre u ~ a por- cidn def inida del onoad pero no a part ir de l material d.1 - crornosoma. Pocos 060s después Mc Clintock (3) denominó a esta rg

gidn norganbaaor riucieoiar”.

t b i c a basada en e l verde de metilo de Pappmheim (7) y p i r o - R i m demostraran &a abundancia de Am en e l nucldolo.

E l ronoclmicnto de ki función y coinposicibn nucleolar i-

vanz6 graaias a lor trabajos realizados por Thorell y Cacpersson (8) quienes emplearon t é c n f w con luz uitravioieta y h técnica de Feulgen, desarrolldndose tisf el concepto de croaatina asocia- da a l nucl6olo.

Estable y Sotelo (9) reportarcin la -mesencia del nucleo- lonema, empleando una tdcnicu de ilapregnacidn wetdlica, conside- rado estar compuesto de ribonucleoprotekias que persisten a tra- vés de la mltoais.

Las investigaciones que reai izd Brachet (4,5,6) coll su

-3-

Moaorioiogfai U~ í c r o s c op í a óptica:

Lo visualízacidn de l nucleolo con microscopio de luz nit$ posible con e l desarrollo de las técnicas de tíncíbn: anilinas,- imoregnaciones argdnticas, técnicas de localítacibri de dcidos 11%

cleícos; preientbndoae una variedad de formas y tniPatios de nualg 010s en diferentes tejidos y especf8ene8, debido a esto algunos autores (10) clasificaron l o s nucléolos en simples, formados por una esfdrula b í c a , compuestos por estructuras de díferente for- ma y tamaño.

surgí6 un nuevo período en la historla de l nuciQoio, ya que se - aonslderd como una estructura espeafrica en células vivas, t.s - que un artefecto que redultaba de l o s procedimientos de fiJaciÓn y tincidn empleados.

A pesar de 3.68 limitaciones que existen tanto con e1 mí- croscoaio de campo claro como con e l de contraste de fases, am- bos han jugado e1 panel más importante en definir algunos de los eventos fisioidgicoa y patol@cos debidos a la funcídn nuuleo-- lar, por ejemplo; los hfgador de rata tratados con tioacetaiidti_ presentan un enorme incremento en e l tamaño nucleolar, abarcando casi totLlaente e l nbaleoi ado& existen otros agentes uomo fi- toheaaglutínine y sistemas de eatlrulación hormonal que producen un aumento en la masa nucleolar. Estos aambios ocurren por e l -

incremento en la síntesis de o r o t e h s de las c6lulas. - ARN con la latenab de la &tesis protefoa f u i %escrita por CM- persson y colaboradores (11). Esto$ autores coupararon los nucQ

010s de las celular del pdncroek exócrino de l conejli, donde se - l leva a cabo une intensa sfnteais de protehas con los de las e$ lu lae de Langerhans donde esta actividad es menos intenso, y QOQ chyerón que en las primeras b s nucieoios eran mtaho más gran-- des y ríoos en ARN.

En neuronas gangiionares, Orlam (U) relacionó e1 estado de actividad funcional y la fraccidn del voli(nen nucleolar om-

Con e l desarrollo de l microscopio de contraste de fases

La relacidn de l tamaño de1 nucldolo y su contenido ea

d

pada por e l nucldolo. La actividad motora intensa puede duplicsr e l voldmen rucleolar de los nucldolos de l a s motoneuronas (13). Estudios del. vo lhen nucleolar y de la relación v o l d t r i c a en-- t re nuclelo $ núcleo, aontinuan a-&I siondo realizados por medio- de la microscopfa Óptica ti%). La variación de estos par8metros- estudiada con mdtodos de estersologfa cuantitativa en diferentes estados f isioldgicoa de un nismo te j ido es similar a la variaoi- bn de la sfa%tasis de ARN nucleolar estimada por autorradiograha cuantitatloa 41% o por i&otios bioqufnicos (16). De esta manera se demuestra objetivamente que las variaciones de tamaño nucleo- lar, que apreciaban cualitativamente los autores antes nienciona- dos, se relaciocan eirectaaente con su funcidn da centro de for- macidn de ribosomas. La ventaja de la microscopfa dptíca en es-- te t i p o de mediciones radica en que los cortes son mucho d 8 --- gruesos que 105 utilizados en microscopfa electrónica,g por l o - tanto todo e l organoide puede quedar en e l espesor del*mismo.

Las c6iuias de mayor sfntesis tienen nucldolos grandes - que pueden ocupar hasta la cuarta parte del voldaen nuclear. To- rlo dsto indica que e l nucldolo es una estructura muy dindmica -- que sufre cainbios norfoldgicas como resouesta a los camblos en - la actividad celular. 2) Microscoo fa electrdnicar

E l andlisis del nucléolo mediante un aicroscopio eleatrg nico permitid mayores avances en e l conociníento de la funcídn - nucleolar ya que se denostrd que no o s sólido, y que es una es-- tructura l i b re de sosbrana.

A niveles de resoluclbn elevados Barnhard (17) describid 3 elementos ultraestructurales fundamentales en e l nucleolor fi- b r i l l a s de 50 84q diámetro que contienen ARN y protehas, grbñu- los de 150 2 pairedidos a ribosoges comauestos aparentemente por- AñNr 28S, y una matriz d i f uw que contiene solamente protehas.

los aomponentes f i b r i l a res y eranulares es variable y depende Gel t i n o de c&la, la produclidn nucleolar y de l transporte núcleo- citoplasma. Análisis cuiint‘ltativos del tamaño relativo de dreas aarede ser eatable para cada tipo de cdlula y no depende de la - posición de l nucl6oio en e l ndcleo.

-a

La distribucidn morfoldgica, asf como la proporción relativa de -

~omposicidn ~ l i e i c a s ~a informcibn que er is te acerca de ia composición qu&A

ca de l nucleolo ha s i@ obtenida de dos formas: pruebas citoquf- micas y nor métodos bíoquf~licos en nucieolos aislados.

No obstante, tanto 113s d t o d o s cldsicüs, como 1cs noder- nos demuestran la misma coaposición global de l nucleolor 80 a -0

$$ de protehas, 12% de ARN y 6; de ADN. Los elementos bloqulmicos de l nuclioio son:

1) La kRN políiaerasa I, enzima de d l t i p l e s subunidaues 2) Protehas prehbosomalea especiales de a l to P.M. que nunca -- dejan e l nuci6oio. 3) Muchas de Las protélnaa ribQaoPaiQs. 4) Ehziaas procesadoras de l pre AMr, entre l a s que se encuentran

enciaas modificadoras, metilasas, fosfatasas, endonucloasas .. productoras de hidrdl is is de enlaces especfficos durante e l - l as eneimas, quinasas, foafatasae,etc.

5) ARN de a l to P.M.r e l 45s producto de la transcripcidn, los -- productos intermedios de l procesamiento y los productos fina- l es 28s y 16s.

6) Un ABN de bajo P.M. llamado U3 que solo se encuentra en el -- nucldoio . 7 ) 90$ de l áüNr de la cdlulii. 8) ADN que no tiene ias secuencias p r e r i b o s o ~ i e s pero está mi-

procesamiento postranscriocional; protehas modificadoras de -

do a l nueldolo.

Acid0 Rlbonucldlco ( A N ) t La primero evidencia de que en el nucláolo ae sintetir:

e1 Aiüi ribosomal fié aportada nor ?erry (181, la cual reforzada r)or otras ínírestígaciones poateriores, pudd ser confirmada. E l ARn nucleolar a l ser marcado con un precursor radioactivo, es encontrado inicialmente en e.L ARN 45S, transferido de 45.5 a 35s y a l ARN 28s; por medio de rayos ultravioleta se logra la in-

hibicídn de la biosfnterio de ARN ribosonal; la sfntesis de ARN

ribosomal no ocurre en mutantea que no contienen organizadores - nucleolares.

E l proce,o de Sfntesis de SdrJ in vivo incluye varias -0

etapas: iniciación, elongacidn y ternii.iaciÓn de l a cadena, e1 cp nocimiento de dichos procesos fue obtenido en sistemas bacteria- nos l ibres de cdlulas. Recientemente se hn comenzado ha estudiar dichos procesos en nucldolos aislados de c6iulas de mamíferos, y se ha conclufdo que los nucldolos aislados poseen los elenentos- necesarios para mantenar la eapecificidad de la. transcriocidn, - nero DOCO QS l o que se ha avanzado, t a l vez debido a alteracio-- ne8 en los nucldolos durente su e is lani 1.

Protehas Se ha demostrado l a presencia de proteínas comunes tanto

en e l nucldolo coa0 a los ribosomas mediante pruebas de so lubi l l dad, electroforesis y características de antigenicidad.

M ida se demostrd la presencia de 200 protéinas diferentes en 01 nucléoio .

Los estudios c l d t i c o s de las protehas nucleolares, in- dican que l as protefnas ribosodales "fluyen" por e l nucldolo, -- pues so sintetizan en e l citoplasma, migran hasta 61 donde se u- nen a l Añt? y vuelven a i citoi,iasma, mientras que ias proteínas - nucleolares .on ribosornaleo no remtilizadas en e l nucL6olo.

Xediante electroforesls bldiiensional en g e l de poliacri_l

Croaatina nucleoiar Comprende l o que se ha d e n w d o organicador nucleolar

o s e a a l ADH que coztiene l a s secuencias donde est$ codificado - e1 pre ARRr.

Es tudios tanto norfológicos, citoqufmicoa y autorradiogri ricos luic deaostrac?o la actividad de s h t e s i s de ARN prerente en e l organizador nucleolar, la localicacidn de éste en uno o varios alt ios de l genom y l a multiplicidad de unidades g6nicws que lo- cow onen. Ciclo generacional de l nueldolo

Desds e l siglo pasado se sabe que e lnucldo lo desaparece durante la profwe o a l principio de la pronetafase y reaparece- en la telofase, Mnt&aiéndose v is ib le durante toda la intorfaee. La prlmern demostración de l o que sucede durante las fases de -

-7-

la mitosis en l a s que no se ve el nucldolo, ae debe a los trabajos de &table y Satelo (20) con técnicas de impregnación metdlica. Por estor redios se demuestra en variedades Be cdlulas animales que pay t e de l material del nucldolo que se doda ver en profaae, re rdhiere a loa cromosomas ietafásicos, y anaibaicoa, con los cue es tranapop tado hasta los ndaleoa telofásicos. En esta etapa dicho asteria1 - participa en la reconstrdccibn de l o s nuevos nuclsolos hijos, agm- pdndose alrededor de l o de l o s organleadores nucleolaree.

Progesterona LR pro3estsrona ea una hormona esteroide que jueg:c un papel

fundamental en la regulacibn de1 proceso reproductivo femenino, SU

mecanismo de acción es entendido muy poco. A l i g u a l que otras hor- monas, Ln progesterona necesita de un reseptor C i t O p l á 8 i i C 0 , pa80 - primordial para e l efecto de la homona(2l).

Cuando un oviducto ni6 tratado con estrógeno y posterior- rente con grogesterona-a, la mayor partedel esteroide fue detec-- tado en e l citoniasma y núcleo de l oviducto (22). E l tratamiento - con estrdgeno aumenta el niircaro de sitios de enlace para la progea- terona, lor cudes se han visto que decrecen deepobs de la ovariect- t o d a y son restaurados soditinte la adpinistracidn de estrbgeno(22)

Ins estudios realizados por Jensen y Gorski (23) llevardn - a la hipótesis de que a l urirse la hormona a la proteína, ésta ma- i re un cambio conformicionel induaido por l a misma hormona, ilegui-- do por e l transporte de l c o q l e j o hormona-receptor a l &+1*a*

Is necesaric, que, se forme e l complejo hormona-Trm3ptor, e l cual a r e una transformación estructural, y a d , es capaz 6e inte- ract- con los s i t ios aceptores nucleares y poiterioniente unirse a l ADN. &to ha 81150 eemostrudo en ADN purificado de po l lo que tie- ne Lo capacidad de enlaaarse y retener el coaplejo proscasterow-re- ceptor. La mbunidad A de la proteína recptora es l a dnica que tie- ne la capacidad para enlazarse a l ADN. No existe ninguna evidenola_ que apoye e l hecho de que e l complejo hormona-receptor se enlace a secuencias de ADN eapecffícaa. En este mecanismo l a s protofuas no histónicaa juegan un papel primordial, ya que experiaentaimente se ha demostrado que a l remover dichas protefnas de la cromatiaa, da- t a pierde su capacidad de en:iasar el complejo hormona-receptor.

EII conclusión, se especiia que nosteriormente a ia entra-- da de l comnlejo progesterona-recntor a l núcleo, su intsraccidn con

la cromatim oourre de la siguiente maneras la subunidad A se une a l ADM de la cromatina, y la subunídad U es une a las protehas g ceptoras no hiotdnicas (24) 8

Otro de los efectos de ia Drogesterona es estimular b 4$

tividad d e b ART aol i ierasa , narece cierto que e l erecto de la hog mona es mejorar la actividad de las moléculas de La aw,ima exis- tent 88.

Toda esta serie de datos nos dan idea de l mecanismo de as cidn tan coaplejo de Is progosterona, ea por eso que eate trabajo trato (le esclarecer e l mecanismo de acción de dicha hormona.

-9-

OBJETIVOS

1.- Obtener un mayor conoc1ii.ent.o de los mecanismos de acción horntonel a n ive l subcelular.

2.- Conocer e l efecto de la prosesterma sobre e l vol&en nu* elear y nucleolar de las cdlutita rpiWliales endometrides de rcta, considerando h * O o wh$r&i%?hoaa. Indicadores 0-

morfoidgicosl de ioos proaesos transcripcionaies.

3.- Determinar la pO6iCiQ de l nud.&& &&o de l núcleo J de sus posibles varisciones Rn diferentes estados aetebdlicos.

HETODOLOGIA

Se ovaiectomizaron 40 ratas Wistar de 3 meses de edad, .. bajo anestesia de (ter y se l e s inyectó O.J.33 y/rata de foafg t o de pol iestradiol una vez por semana durante 3 semanas, a l - cabo de las cuales ae procedld a real izar e l owerimento on l a - siguiante forma: 1.- Resección de un cuerno uterino, de l cual se tomaron muestras

que se f i ja rón oar. microBaopfa 6ptica. 2.0 hinyecci6n intraperitoneal de 5 mg/rata de progesterona. Re-

seccidn de l otro cuerno uterino V2, 1, 2, 4, 8, 24, 40 horas deapu6s de la inyecci6n da la hormona, tomando mestras para f i jac idn en l as misias condicione8 que e l cuerno control.

3.- La f i jac ión se l l eva a cabo oon glutaraldehfdo a l 2.5% en b& f f e r de cacodilato 0.W a pH7.3 durante 2 hrs.

4.- Posteriormente se lavan con e l mismo Buffer durante 15 minu- tos dos veces, se deehidrntan l a s muestras en alcoholes gra- duales, pet.urnociendo durante 15 minutos m aada uno.

5.- Se ham la preincluaidn can dxido de propilmm, 2 oambios de 20 minutos.

6.- Se c o l o~a n . d(r:?pa~pillieom~¿s Epon con pronorcidn 1: 1 durante 12 horas a temeratura .=biente; otro cambio en &xi- do de propileno nds Bpdn em proporción 2i1 durante l2 horas8 ae colocan en Epdn puro U horas.

7.- Nuevamente en Epdn puro para polimerizar durante 24 horas 8-

8.- De los bloquea obtenidos se hacen cortes semifinos de .5 a 1 micra de espesor; se tiñen con am1 de toluidina y se aontan con Sdlsnmo de Canadá.

Axiomat (Carl Zeias) wovisto de vernier (u1 l a imagen inter- media, empleando también dptica de contraste de fase y f i l t r o s de colores, l b p a r a de Cesio y accesorios de l mismo microsq pío. Los pardmetros medidos aona didmetro mayor nuclear, d i d metro menor nuclear (dterminan e l voidmen nuclear) ; diámetro mayor nucleolar, diámetro menor nucleolar (determinan e l vo- ldmen nucleolar) ; ndaero de nucldolos; coordenada vertical -

-

60OC.

9.- Se procede a rea l izar la5 mediciones en un microscopio &tic0

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(es la distancia de l a base del núcleo u1 centro de l nuciéoio, -0

cuando se estd midiendo en e l eJe didmetro niyor)l coordenada b p rieontal (distanala de la base de l núcleo a l centro de l nucldolo, cuando su amti$ midiendo en e l e j e dol didmetro menor). Tales qedi clones se ].levan a cabo a 3200 aumentos y por cada bioquc? tunto - control como tratado se miden 300 núcleos. 10.- las datos obtenidos se procesan en una coaputadora HP 9825 - Darn cd1cul.o~ estereol¿gicos, para el archivo de inf oraacidn, ad& culos estadísticos y expreaiion grdfica de los resultados. T-les - pasos fueran realizados, elsborrndo progranas especfficos @te nos per;aiitia-¿mi comparor &os datos de las maestras contr& y tratadas.

1-- - .__

-12-

MORFC LVG IA. - ¡as núcleos de l o s cdlulas epitel iales endomctiieles son

alergades en e l sentido dpico-basal, de form generalmente ovol- de o fusiforme.

Tanto los gru~os control como los tratados con progeste- rona presentan uno o dos nucléolos y eventuabisente hasta tres. En l a ntafrorfa de los núcleos, el nucl6oio toma oosicidn central, no &,?;i.L.nte, se l lega a presentar en la periSsrba. En e l COSO de núcleos coa dos nucléolos, la posicldn de &tos es varihbles 88-

presentan núcleos con dos nucléolos disnuestos slndtricanente so bre e l ese mayor; taabi6n dispuestos lateralmente; e irrbgularmq te. E l p#lmero de los casos es el d s c o d en todos los cortes analizados en este estudio.

se podrfa decir que la progesterona no afecta la forma de l núcleo, ni la ~ o s i c i d n de l nucldolo.

De acuerdo a estas consideraciones puramente cualitativas

ESTERECIAIGIA Y MORFOMETRIAo- La comparacidn por estadfstica de pruebas apareadas a&-

trol-tratado para cada reta sin tener en cuenta e l n h e r o de ~ 1 6 0 1 0 ~ por núcleo muestra que i a progesterona produce aumento - de volthen nucleolar entre media y 8 horas como se lluirtra en la grdfica 1. La poblaclgn de núcleos con un solo nucldolo pertsno- clente a raths control, no di f iere en 8u volúmen nuclear da nqu2 l l a s de l as ratas trotadas con diversos tiempos de progesterona- (Tabla la). Lo mismo sucede con l a s qoblaciones db núcleos oue + tiaen dos nucléolos (Tabla lb).

los que tienen das, observamos que éstos últimos son rlgnifíca-- tívamente aayores que aquellas (Tabla lc). E l ilsao resultado -- mesent6 esta comparacidn co dc l eos de ratas tratadas con pro- gesterona (Tabla U). 8 1 unlfiaa.os h a pobheiaaee de tratados y controle& oon e l misio nffmsro de nucldolos y coiparanos los vp

.a

si aompararaos los núcleos controles con un nuciéolo con

li’. . .-A

lhenes nucleares de los que tienen dos nucldolos con los que tle- nen & de (aos, encontramos que no existen diferencias. (Tabla le>.

Los histograms de distribución de l o s volbenes nucleares en las poblaciones mezclcdas de controles y tratados, con un nucld o h (Gréffica 2) y con dos nucldolos (Grdfica 3) ; nos muestran se-- paraciones importantes de la c u r m nornal. Eatns se deben en esbos casos a cantidades pequeñas de núcleos anormahente grsnües, l o -- que produce quo lo media estadística del prirner g r w o est6 en 83 - nientras e l modo 0s 38 y que la nedia del segundo g r m o ?rea l& en tanto e l nodo es de 63. Posiblemente haya un cierto número de nd-- cleos con d s nucléolos que 10s detectados riezcladov en estas PO-- blaciones.

E l estudio de las variaciones del voltfuen n u c b o k r proaU- cldes por e l tratamiento con mogesterona, mediante m@bgl de es- tadística epareada control-tratada, nuestra en núcleos con uno o - d s nial8olos, una inhibicidn marcada media hora después de la ad- ainiatracibn, ateaida de un aumento que derrap lMirs0 .W h s 4 y - 8 horas (GriflCioa 4). E l volúien nucleolar &r.&aciQI, tsmnu~ nucfe- o10 en l a s ratan control no d i f i m e con respecto a l grupo de ratas tratadas con progesterone, con un nucldolo (Tabla 2a) . $1 voldmsn nucleolar to ta l de los núcleos con dos nucldolos es mayor que e t - volhen nucleolar único del grupo de mononucleados, tanto en 108 - controles (Tabla 213) com en l o s tratados (Tabla 2d). Tambidn se - encuentra eete.diferencie s i 88 reunen controles y tratados &one- nucleados en un grupo y lod aultinucleados en otro (Tabla 2s).

frecuencias d. los volúmenes nucleolares en ndcleos mononucleehdai de tratadosi y controlos reunidos sn un solo grupo, como en los ca- sos de volúmenes nuabares, también existe un exceso de n m l e o b s mucho rasyores que e l nodo ( 1.5 3). pil q*arp?odsee~~nfde6p8iicda aeObhiQ1mdm U # ? & b ? h ~ ~ ~ S . k & o b ~ b + &)3. El histogram de ffecuencia de voldmenes nucleolares en la pobi.&,cidn tota l de nú-- CleOs (controles y tratados) que csntienen más de un nucl6olo 86

nuestra elaranente bimodal (Graiiaa 6). ITxm de fix sdxx’mos cob--

el otro, que es e l d x b o absoluto sa aproxima mucho a l doble de l anterior (2.7 $1. En esta caso existen a b d s nucléolos de gran tamatio.

La OFdfiOa 5 nos muestra un histogram de d i s t r i buo ih de

cide con e l modo de l grupo ilononucleolado (1.5 u 3 ) mienC,ras que

- 14-

El estudio de la nosicidn de l nuclkolo se hie6 en cada gru- po de andonetitas tratados y controles; los resultados que se pre- sentan aaaf son obtenidos reuniendo controles y ti'abbrs, ?nononucig o k r e s en M grupo de trr,tados y controles con dos nucieolos en t ro grupo. Loa pardmetros que se analizan fueron definidos anter mente. sin embargo, recordemos que e l núcleo es generalmente si lar a un elipsoide de revolucidn cuyo e je mayor es e l épico-basal, que se denimina "vertical" en este trabajo y que se divide en 10 -- partes con ( e l cero en su extremidad basal y e l 1 on e l extremo bpi- cal. E l diámetro perpendimilnr a l punto dentral de l dpico-basal se dbulniinu "horizontoln y r e divide también en 10 partes con e l ow?o a i twdo arbitrariamente de l lado derecho de la imagen y e l 1 a isquierda. En este sistema dn coordenadas situamos e l punto central de l nucleolo dentro de l espacio nuclear. i%l grupo de núcleos mono-- nucleoledos presenta une distribucidn de frecuencias de situacibn - de l punto central delnucldolo a l o k r g o de l eJe vertical , como e l ilustrado en la gráfica 7. En e l l a se aprecia que l a s posiciones -- d 8 frecuentes son l a s correspondientes a laa doe clases centrales a par t i r de las cuales la frecuoncia cae rii&ricamente hacia arb08 lados. ~a dlstrlbución a e i nucUolo &io0 a i o largo del didmetro - horizontal $e maestra en la gráitoa 8. E l tipo de distribucidn es - slrililar a le Vertical, 10 que indica que en e l espacio definido por n l quinto (20@ central de ambos d ihe t ros , se encuentra e l nucl%olo mucho más iremu.ntemente que en cualquier otro punto del espacio -- nuclear.

En le poblacidn de ndoleoa con dos nucldolos se observa una distribucidn de posiciones much d s extendida y ligeramente biro-- da1 a l o largo de l didietro vert ical (Gráfica 9). S i n embargo, a lo largo de l eJe horizontal la distribucidn es simikir a l a de la PO--

blacidn mononucieolada (GrdSica 10).

-15-

x p a des, I

Núcleos con dos nu- lOb.0091 76.6878 cléoios . Control

Ndcleos con dos nu- cléolos. Tratados. 104.9878 66.4574

e., N t 159

-0.1193

149 -

TABLA IC

”

dbs 88 N t 3 - X P

Núcleos con un nu- 83.3998 65.5385 1.8718 1226 c 160 lo. -3.6544 - Núcleos con dos nu-

159 . c1éolos 104.009i 76.6878 -

Ndpleos con un nu- cl8olo.

104.987E. ~

Núcleos con dos nu- cléolos.

149 66.4574 -

TABLA l d Volrlipen Nuclear

des; I es I B I t 83.0153 I 59.1831 I 1.7142 I 1192 I

I I I -4.2124 I

-16-

19úcieos C O ~ dos nu- cléo io ai

Ndcleos. con tres, nu- cL6olos.

dea em I t 5 c x p 102.19~ 74.821 u5

-0.6651 c

26 - 112.9675 86.5771

, -

Núcleos con 1 nu- cl6olo. Control

Ntfcleos con un nu- cléolo. Tratados.

- x E1' des es N t 2.587 ' 2.1101 1283

2.5036 1.7724 d 1212

- 1.0659

Ndcleos con 2 nu- cléoios. Control

des J - x f i

3.4153' 1.9781

Ndcleos eon 2 nu- clbolos. Tratados

3.3789 2.3035

Núcleos con 1 nu- c iaoio.

Kúcleos con 2 nu- Cl8olos

des . e a N t a X $ 2.1101 0.0589 1283 2.5870-

*

-4.8437 - - 170 3.4153 - ' .1.9781

m

4 - X p . ' . ties es B

1212 d

Núcleos con 1 nu- 2.5636 1.7724 cl6olo.

,t

Núcleos con doanu- 3.3789 2.3035 - 150 cleolos

t

-5. SO17

c

1

Núcleos con 1 nu- cl8olo. Control y Tratado

Núcleos con más de 1 nucléolo. Control y Tratado.

dea es N t X - p 2.4791 1.9690 0.0450 1907

-4.5668

3 O772 1.9862 0.1238 257

-18-

GRAFICA 1 . ._ - , -. .. . .. . ~ _I_.

~~ . . . ~ . ~ . . . .. . . . . .

GBAFICA 2

o I.

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- 19-

CRAFICA 3,

n

GRdPICA 4 Efecto de l a Progesterona sobre e l Vo lhen nucleolar.

- -__ . - _. ,__ -

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c

GñAFICP 5

Nuc ims can u n nuc iea lo control y t ro tados

Vo lumen n u c l e o i a i D *I I -

7

GRAFICA 6

Nucleos con dos n w l e o l o s control y Iratodos

Volumen nucleolar

9. :: 1 o . I S

o . o , I I ti h

f medias de c lose

- . . . . _ J

-21-

o I.

D I* o > o I O - o I 7

o I.

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o. I.

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6 0.10 !! Lr 0 . 0 .

o. o.

L M e d i o s de c l o s e

GRAFICA 8

Nucleor con un nucleolo

L

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-22-

GRAFICA 9 . ~ ~ ~ . . - r-- '' -- - "

Nucleos cm da nrl.ola

I M e d i o s de c l o f e

O I T ]

GRAFICA 10

Nucleos con dos nucleoios

1 . .

I

I . ~~

-. ,

I M e d i o s d e c l o s e

J

-23-

DISCUSION.

Le ovoriectomfa a la que fueron sometidas todas las ratas usadas evita las fiuctriaciones cíc l icas hormonales y permite cons cer l a s dosis y e l momento exacto de administracidn de los este-- roldes. Se mantuvo un tratamiento don estradiol durante el tlsnpo que aedia entre l a ovariectoda y e1 experimento para evitar la - gran variacidn de efectos de la progesterbna debidos a la prssen- c ia o ausencia de M pretrataaiento con estrógeno5 (25, 26).

E l tratamiento eon nrogesteronu produce pequeñas variaoie n20 da1 voldtmn nuaiear, l o que uoncueraa con haUzgos anteriores qu.' demuestran la ausencia de variaciones de este pardmetro d u r e te el ciclo entra1 (27) y durante los aamblos de concentracidn de estradiol (14). Sin embargo, los núcleos que paseen d s de un nu- eldolo son mucho mayores que los que tienen uno, Fndependienteaq t e do los tratamientos.

Este aumento de l voldmen nuclear podrfa deberse a que pr$ ducen y albergan dentro de l núcleo d8 partfculas ribrinucieopro-- tefcar (RiVF) de origen nucleolar que los otros.

Ha sido demostrada la util idad de las mediciones de vol& men nucleolar en la evaluacidn do su función, por los trabajos cid- sicos de MO Carty (28) y Edstror (u), entre otros y qodernaisente conparando datos norfomdtricos y autorradiogrdf icas mantitativos (19, a s í como resultados estereol6gicos y f isioldgiaos (14, 27). Los histogramas de frecuencia de las distintas clases de voldmenes nucleares demuestran la existencia i?u un elevado número de niícleoe que tienen dos nueléoloa de am uolúmen de l doble o m8s de los que ?oseen uno solo. &to sugiere la posibilidad de que los núcleos - con dos nucléolos sean tetraploides o poliploides en general. 6in embargo, para demostrar la p s i b i l i d a d de variaciones de ploiüis- mo entre io5 núcleos con un riucldoio y con varios nuciéoios se hg rán mediciones fotoitátricas de núcleos colooehdos con Ze tdcnicn de FeUlgen. Por ,otra parte, 01 andtlisis de los tiistograms de dig tríbacl5n de frvuencias: de l voldnen nuclaolar demuestra que los núcleos con dos nucidolos tienen un voi&en nucleolar t u t r i i <le cey ca del. do t l o Jel voP&en promedio de l nucldoio -&ico. Erto indica que las c8itXhs cor- do6 nuei.soi2s estan sintetiznndo aproxlrJndemen_ te el doblo XRN ?re-ribosomaL que las que tienen uno solo. Se pu9

í4

de sugerir La axistencia de uri sistena de regubci6n de la acti- vidad nucleolar ajustado a un nfve l O a adltiplos de l mismo.

de la progesterona en pollos (26) y en ratas (29) pretratados 0-

eon estradiol. Este aumento se extiende en ambos sistemas bioló- gicos, dwante las primeras iioras de tratamiento, l o Q U ~ aodrfa explicar, dada la intensidad y la coiencidmcia temporal, al au- Qe!l%O #imh?&Mrio de l volúmen nuclear que se advierte entre 0.5 y 8 h0ra-a en nuestros experimentos.

IDS resultados del. presente eet.Lidio sugieren que la pro- gesterona tiene acciones nucleares muy rápidas, m y anteriores a la aparicidn de sus efectos sotre l a afntesis proteicu ( 6 horas) (30) y aún Más FdrddOs que ia acumulación ne i~:cnsaj~ros especa; cos (26, 29).

La actividad de la Ami polimerasa I1 numentn por accidn

CONC LUSIONESB

1.- Ea administración de la hormona progesterana precedida de un $ratamiento con estradiol provoca un aurnanto de l voldmm nu- clear, durante l a s 8 horas después d e l suministm de dicha - hormona

2.- E l voldmen nucleolar rufre una pequeña diSQbUCidn en media hora seguida de un aumento que desaparece entre 4 y 8 horas de3pUéSt de l a administracidn de la progesterona,

3.- Estas variaciones de los voldmenes nuclear y nucf;eoW colnc& den con datos de l a s variaciones transcripuionales, obtenidos ?or mdtodos bioqufmicos; l o quo r e w m La confianza en que estos pardmetros morfom8tricos son bueror, inlicadores de l o s

4,- h l cura0 temporal y la inteneldaa de estos fendmenos indican una mujj temprana accidn de la progenterona sobre e l núcleo.

5.- Ius núcleos con dos o d s nucldolos son de mayor volúmen que los que tienen un solo nuc16050, tanto en 108 grupos control

.: m a i m h tratados. 6.- E l voldraen nucleolar to ta l es prdcticanente e l doble -do

7.- Existe un mecanismo de reguhci& de La rorfclogfa y la

. procesos funcionales.

hay dos nucl6olos que cuando existe un5 sólo.

ción ajustado a un nivel BUS a l to en los núcleos con das oloi , que en los que tienen uno.

~16010 , éste es central; y s i son dos nUcl&los se observan preferentemente a 10 largo de l didmetro nayor dol núcleo a 0%

do lado de su punto medio.

m.

8.- E l nuciéoio pre&nta una posicidn única: en e l caso de un

=26-

B I R L I O G ~ F ~

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