1

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

Licenciatura en Biología Experimental

Reporte final del Proyecto Docente de Investigación

Hayde Nallely Moreno Sandoval

“LA ASOCIACIÓN DE DISTINTOS POLIMORFISMOS DEL GEN

PPARGC1A Y PPARGC1B CON LA DIABETES TIPO 2 Y EL SÍNDROME

METABÓLICO EN UNA POBLACIÓN DE LA CIUDAD DE MÉXICO”

México, D.F. 9 de abril de 2007

2

Con la aprobación de los asesores

Dra. Karina Lizeth Tuz Moya Investigador Asociado B

Unidad de Investigación Médica en Bioquímica, Hospital de

Especialidades. CMN S XXI, IMSS

Dr. Pablo Damian Matzumura. Profesor Titular C, Área de

Reproducción Animal Asistida, UAM- Iztapalapa.

3

ÍNDICE

Introducción 4

Justificación 17

Objetivo general 17

Objetivos particulares 17

Hipótesis 17

Diseño de la investigación 18

Sujetos, materiales y métodos 18

Análisis estadísticos 21

Resultados y discusión

Características clínicas del grupo control y con DT2 22

Características clínicas del grupo control y con SM 22

Frecuencias genotípicas y alélicas del SNP Ser482Gly 24

Frecuencias genotípicas y alélicas del SNP Pro203Ala 25

Frecuencias genotípicas y alélicas del SNP Val279Ile 26

Asociación de los SNP Ser482Gly, Pro203Ala y Val279Ile 27

con el IMC

Conclusión 32

Bibliografía 33

Anexo

Funcionamiento de las sondas TaqMan 38

4

INTRODUCCIÓN

La Diabetes constituye un grupo heterogéneo de enfermedades

metabólicas que se caracterizan por elevadas concentraciones de glucosa en

sangre. Se clasifica en dos tipos, la diabetes tipo 1 es dependiente de insulina y se

produce por una disminución en la secreción de insulina por parte de las células β

pancreáticas. La diabetes tipo 2 (DT2) es poligénica y multifactorial, se produce

por defectos en la secreción y/o acción de la insulina, intolerancia a la glucosa y

resistencia a la insulina por parte de los tejidos periféricos, como el músculo

esquelético y el tejido adiposo (Fig. 1) (Skelly, 2006). La DT2 es progresiva y uno

de los factores responsables de esta progresión es el continuo decline en la

función de las células β pancreáticas. El riesgo de padecerla es mayor en quienes

consumen una alimentación hipercalórica, tienen una vida sedentaria y

antecedentes familiares con DT2 (Steven et al., 2006).

Figura 1. Patogénesis de la diabetes tipo 2.

La DT2 es una enfermedad de importancia creciente, tanto en los países

desarrollados como en las naciones en vías de desarrollo, ya sea que se mida

Hiperglucemia

Hígado Músculo

Intestinos Páncreas

Absorción intestinal de

carbohidratos

↑ Secreción de insulina

↓ Captación de glucosa

↑ Producción de glucosa

5

esta a través de su incidencia, prevalencia, o mortalidad. En México, ha habido un

aumento significativo en la incidencia de la DT2 desde 1980 (Fig. 2) (Olvera, 2000

y Cerda et al., 2003).

De acuerdo a los resultados de la Encuesta Nacional de Salud de 2000, la

prevalencia de la DT2 en los individuos mayores de 20 años fue de 7.5%. La

prevalencia fue ligeramente mayor en las mujeres (7.8%) que en los hombres

(7.2%), este valor se incrementa de acuerdo a la edad, ya que en sujetos de entre

70 y 79 años la prevalencia fue de 22.4% (Fig. 3). Se ha estimado que para el año

2025, habrán 11.7 millones de mexicanos diagnosticados con la enfermedad (Rull

et al., 2005 y Encuesta Nacional de Salud 2000).

Figura 3. Distribución porcentual de la prevalencia de la DT2, por grupos de edad y sexo de acuerdo a la Encuesta Nacional de Salud 2000.

Figura 2. Análisis retrospectivo de la mortalidad e incidencia de la diabetes tipo 2 en México. Mortalidad e incidencia. Sistema epidemiológico y estadístico de defunciones/DGE/SSA. Tasa por cada 100 mil habitantes.

6

La presencia de Síndrome Metabólico (SM) se relaciona con un incremento

significativo de riesgo de DT2. El SM no se trata de una única enfermedad, sino de

una asociación de problemas de salud que pueden aparecer de forma simultánea

o secuencial en un mismo individuo, causados por la combinación de factores

genéticos y ambientales asociados al estilo de vida en los que la resistencia a la

insulina se considera el componente patogénico fundamental (Rodríguez et al.,

2002).

La Asociación Americana del Corazón (AHA, por sus siglas en inglés) y el

Instituto Nacional de los Pulmones, el Corazón y la Sangre (NHLBI, por sus siglas

en inglés), presentaron su definición operacional del SM, el cual se identifica por la

presencia de al menos tres de los puntos mencionados en la tabla 1 (Gruñid et al.,

2005).

El SM tiene una prevalencia de 6.7% en sujetos de 20 a 29 años de edad y

de 43.5% en sujetos de 60 a 69 años de edad, la cual es similar en ambos sexos

(Lerman et al., 2004).

Aunque la mayoría de los pacientes con SM no presentan una franca

hiperglucemia, tienen un riesgo elevado para desarrollar DT2 en un futuro. Los

pacientes con SM mantienen su homeostasis a través de la hiperinsulinemia, sin

embargo, la diabetes se presenta cuando ya no son capaces de mantener esta

compensación (Lerman et al., 2004).

Criterio Punto de corte categórico

Perímetro de cintura ≥ 102 cm. (hombres) ≥ 88 cm. (mujeres)

Triglicéridos ≥ 150 mg/dL

HDL-C < 40mg/dL (hombres) < 50mg/dL (mujeres)

Presión Arterial ≥ 130 mm Hg ≥ 85 mm Hg

Glucosa en ayuno ≥ 100 mg/dL Tabla 1. Criterios para el diagnostico clínico de síndrome metabólico de acuerdo a la AHA/NHLBI

7

La DT2 per se es un estado de resistencia a la insulina y por lo tanto, en

forma estricta, el beneficio práctico de establecer el diagnóstico del SM, es cuando

éste se realiza en forma temprana, antes del diagnóstico de la DT2 (Lerman et al.,

2004).

Si bien el estilo de vida parece ser el detonante de los factores patogénicos,

los elementos genéticos están involucrados en la etiología de la DT2. Una historia

familiar positiva para el padecimiento confiere un incremento en el riesgo a

padecer la DT2. Del 15 al 25% de los sujetos con familiares afectados en primer

grado desarrollan intolerancia a la glucosa o DT2. El riesgo a desarrollar DT2 a lo

largo de la vida se ha calculado en 38%, si uno de los padres padece la

enfermedad; en 60%, si ambos padres están afectados (Stumvoll, 2005).

Algunas líneas de investigación demuestran claramente el papel de los

factores genéticos en la patogénesis de la DT2, las cuales se anuncian a

continuación:

a) Análisis en gemelos muestran una mayor concordancia para la DT2 en

gemelos monocigóticos que en heterocigóticos.

b) Análisis de segregación muestran que la mayoría de las familias con DT2

exhiben una compleja herencia paterna, en donde la relación en primer

grado, representa un mayor riesgo a desarrollar la enfermedad.

c) La inactivación selectiva de diferentes genes en modelos animales causan

resistencia a la insulina, daños en la secreción de insulina y el fenotipo de la

DT2.

d) Estudios de mapeo genético en donde se hacen búsquedas en el genoma

entero, demuestran la participación de diferentes regiones de cromosomas

que confieren la susceptibilidad al desarrollo de la DT2 (Tusié, 2005).

La búsqueda de un gen único causante de la DT2 ha sido infructuosa, sin

embargo, hay avances importantes en la identificación de genes relacionados a la

DT2, denominados genes candidatos. El procedimiento usual de asociación

8

consiste en seleccionar uno o más genes con base en su función o relación

biológica, buscando variantes en la secuencia del DNA que se asocien con el

fenotipo de la enfermedad. Se han descrito genes relacionados con la DT2, entre

los que destacan, los que codifican para proteínas involucradas en la señalización

de la insulina, en el transporte de glucosa, en la síntesis de glucógeno, en la

síntesis y absorción de ácidos grasos y en la diferenciación adipocítica (Cruz et

al., 2005). Asimismo, los miembros de la familia del coactivador 1 del receptor γ

activador de los peroxisomas (PGC-1) se han identificado como posibles genes

candidato para la DT2 (Kunej et al., 2004 y Andersen, 2005).

Los coactivadores son proteínas o complejos de proteínas que interactúan con

factores de transcripción e incrementan la velocidad de la misma. (Puigserver,

2003). La unión de un ligando al factor de transcripción, lo activa e induce un

cambio conformacional. El receptor activado se une a secuencias específicas de

DNA y permite el reclutamiento de los coactivadores de la transcripción (Fig. 4)

(Glass et al., 1997 y Finck et al., 2006).

La familia PGC-1 está compuesta por 3 miembros: PGC-1α, PGC-β y PRC

(coactivador relacionado con el PGC-1). Son proteínas que interactúan con

factores de transcripción de la familia de los receptores nucleares, como son:

Receptor γ activador de los peroxisomas [PPARγ, PPARα, PPARβ, el receptor a

hormonas tiroideas, el receptor X de los retinoides (RXR), el receptor de

glucocorticoides (RG), el receptor de estrógenos, el factor nuclear 4 de los

hepatocitos (HNF-4), el receptor X del hígado (LXR) y el receptor relacionado con

Figura 4. La familia de coactivadores PGC-1 incrementan la transcripción. Estos coactivadores activan la transcripción al unirse a los receptores nucleares (NR) aunado al reclutamiento de los complejos de proteínas.

9

los estrógenos (ERRs)]. Además, se ha descrito que estos coactivadores

interactúan con receptores no nucleares como: el potenciador 2 específico de

miocitos (MEF-2), forkhead box 1 (FOXO1) y la proteína 1 que se une al

elemento regulador del esterol (SREBP1). A través de la asociación de estos

factores de transcripción con los coactivadores PGC-1, se ejerce un efecto sobre

muchos aspectos del metabolismo energético, como la biogénesis mitocondrial, la

gluconeogénesis, la lipogénesis, entre otros (Finck et al., 2006).

El PGC-1α y PGC-1β se expresan en tejidos con alta actividad mitocondrial,

incluyendo el tejido adiposo, páncreas, músculo esquelético, corazón y cerebro

(Handschin et al., 2006).

El PGC-1β y PGC-1α, comparten una extensa secuencia homóloga (Fig. 5)

(Puigserver, 2003). Ambos presentan una estructura multidominio: un dominio de

activación en el extremo N-terminal, un dominio central de regulación/represión

con sitios de fosforilación, sitios LXXLL los cuales son regiones de unión al factor

de transcripción, un extremo C-terminal que contiene dominios de procesamiento

de RNA, como el dominio RS y RMM (Fig. 6) (Puigserver, 2003).

Figura 5. Secuencia de la proteína de la familia PGC-1. Porcentaje de homología entre los diferentes dominios. Nótese que los dominios más conservados son el extremo N-terminal y el extremo C-terminal.

10

Figura 6. Arquitectura de la proteína PGC-1α y PGC-1β .

Las alteraciones en la expresión o las modificaciones postraduccionales del

PGC-1 pueden modular su actividad transcripcional. En el caso del PGC-1α, se ha

descrito que estímulos ambientales que promueven la activación de los receptores

β adrenérgicos como: el frío (en adipocitos marrones), ayuno (en el hígado) y

ejercicio (en el músculo esquelético), regulan su expresión y/o actividad (Finck et

al., 2006). En contraste, estos estímulos no tienen efecto en la expresión o

actividad del PGC-1β (Andersen, 2005).

La cantidad de energía para satisfacer las funciones vitales es crítica para

realizar el proceso de homeostasis. En los mamíferos, el metabolismo energético

es adaptable a ciclos nutricionales cortos como ayuno/estado postprandial y ciclos

nutricionales largos como sequía/abundancia. En este contexto, los cambios en la

regulación de la expresión y/o actividad del PGC-1 pueden servir como un

mecanismo clave en la homeostasis energética, ligando el ambiente nutricional

con el metabolismo oxidativo y la termogénesis (Pihlajamäki y Patti, 2005).

El PGC-α es un potente regulador del metabolismo energético, incidiendo

en la termogénesis adaptativa, la captación de glucosa en el tejido adiposo y

músculo esquelético, la biogénesis mitocondrial, la diferenciación de los adipocitos

y también promueve la gluconeogénesis. El PGC-1β induce un incremento en el

transporte de lipoproteínas, regula la biogénesis mitocondrial, la oxidación de los

ácidos grasos y la lipogénesis (Handschin et al., 2006).

11

Dentro de las funciones de los PGC-1 destacan:

� La expresión de los PGC-1 es muy elevada en tejidos con sistemas

mitocondriales muy desarrollados y su expresión se induce en situaciones

fisiológicas que se caracterizan por un aumento en la demanda del

metabolismo mitocondrial, para producir energía en forma de ATP o calor,

como la exposición al frío en el tejido adiposo pardo, ejercicio físico en el

músculo y ayuno en el hígado. El PGC -1α y el PGC-1β tienen un papel

significativo en la biogénesis mitocondrial en el tejido adiposo marrón y en

el músculo esquelético, coactivando la actividad transcripcional del factor de

transcripción mitocondrial A (mtTFA) y al factor 1 respiratorio nuclear (NRF-

1), que induce a su vez la expresión del NRF-1 y NRF-2 (López, 2005).

� La reducción en la coactivación del PPARα por el PGC-1 genera un

decremento en la actividad de la β oxidación, dando como resultado un

incremento en la concentración de los ácidos grasos libres en el plasma

sanguíneo. Estos ácidos grasos se acumulan dentro del tejido no adiposo,

particularmente músculo esquelético, hígado y páncreas (Muller et al.,

2003). La acumulación de ácidos grasos es un marcador temprano del

riesgo a la DT2. La acumulación intramiocelular de lípidos puede contribuir

a la resistencia a la insulina. Análogamente, la grasa ectópica en el hígado

puede conducir a la resistencia a la insulina, gluconeogénesis

descontrolada, síntesis creciente del colesterol y triglicéridos, e inflamación

(Pihlajamäki y Patti, 2005). La acumulación de lípidos en las células β

pancreáticas puede contribuir a la disfunción en la secreción de insulina,

asociándose a la obesidad y a la DT2. La disminución en la expresión de

los genes relacionados con el metabolismo mitocondrial también puede

contribuir a la acumulación de lípidos en el músculo esquelético,

contribuyendo con la resistencia a la insulina y dando como resultado la

DT2 y/o el SM. Se ha descrito que la expresión del PGC-1α y PGC-1β se

reduce significativamente en pacientes con intolerancia a la glucosa y con

DT2 (Muller et al., 2003).

12

� El PGC-1β está involucrado en la lipogénesis, coactivando al factor de

transcripción SREBP1c. En el hígado, la sobrexpresión del PGC-1β

estimula la secreción y producción de triglicéridos, resultando en

hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia (Finck et al., 2006).

� En el hígado, el PGC-1α promueve la expresión de las enzimas

fosfoenolpiruvato carboxicinasa y glucosa 6 fosfatasa, las cuales controlan

la vía gluconeogénica. Esto indica que el PGC-1α es un modulador clave en

la gluconeogénesis hepática y es un blanco central de la acción de la

insulina en el hígado (Yoon et al., 2001).

� El PGC-1α afecta la función de las células β pancráticas, coactivando al

factor de transcripción FOXO1. Éste factor se ha visto ligado al promotor

de la glucosa 6 fosfatasa en el hígado, y por otro lado, produce un déficit

en la secreción de la insulina en las células β pancreáticas. La coactivación

de FOXO1 en las células β pancráticas, puede conducir a la supresión de

los factores dominantes de la transcripción de los islotes pancreáticos, tales

como PDX-1 (Yoon et al., 2003).

� El coactivador PGC-1α induce la expresión del transportador de glucosa

sensible a la insulina (GLUT4) incrementando la captación de glucosa en el

músculo esquelético y en el tejido adiposo marrón (Michael et al., 2001). La

expresión del gen del GLUT 4 está mediada por la unión PGC-1α al

regulador transcripcional de músculo MEF-2 (Puigserver, 2003).

� El mecanismo más conocido de la termogénesis adaptativa es el que opera

en el tejido adiposo marrón. Su base molecular es la actividad de la

proteína desacoplante 1 (UCP1), esta proteína es característica de los

adipocitos marrones, se encuentra en la membrana interna mitocondrial y

es capaz de disipar como calor la energía generada por el gradiente de

protones, desacoplando así la oxidación de sustratos metabólicos de la

13

síntesis de ATP (Fig. 7) (Palou et al., 2004). El PGC-1α coactiva receptores

nucleares de hormonas, como los receptores que se unen al promotor de

� UCP-1 y que modulan su expresión (Puigserver et al., 1998).

� El PGC-1α está involucrado en la diferenciación de los adipocitos. El PGC-

1α es la única proteína, descrita hasta el momento, capaz de activar la

expresión del UCP-1. En líneas celulares sin relación con el tejido adiposo

marrón, se ha visto que cuando se introduce el PGC-1 en células adiposas

blancas, induce la expresión endógena del UCP-1 y activa la biogénesis

mitocondrial, ambas características típicas del adipocito marrón (Fig. 8). El

PGC-1α está regulado por la activación de receptores β-adrenérgicos y

AMPc intracelular, agentes conocidos que inducen la expresión de UCP-1 y

la hipertrofia del tejido adiposo marrón (Puigserver et al., 1998).

Síntesis de ATP

H+ATP ADP + Pi

ATP sintetasa

Cadena respiratoria

Oxidación de sustratos

H+ H+ H+H2O O2

Producción de calor

UCP 1

DesacoplamientoAcoplamiento

(fosforilación oxidativa)

Espacio intermembranal

Membrana

interna

Matriz

mitocondrial

H+

H+H+H+

H+

H+H+H+

H+

H+H+ H+ H+

H+

H+H+

H+

H+H+H+

H+

H+H+H+

H+

H+H+H+

Figura 7. Esquema del funcionamiento de la UCP1 en las mitocondrias del tejido adiposo marrón.

14

Figura 8. Control transcripcional del destino de la célula adiposa. Los preadipocitos pueden diferenciarse potencialmente a adipocito blanco o adipocito marrón. La activación PPARγ/RXRα es requisito indispensable para la diferenciación de ambas células adiposas. A partir de este momento, la presencia de distintos coactivadores determinará la diferenciación hacia un tipo celular u otro. La actuación del coactivador PGC-1α puede activar la expresión génica asociada con la conversión de preadipocito a adipocito marrón. Si existe una conversión entre adipocitos marrones y adipocitos blancos se desconoce.

Algunos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP por sus siglas en inglés)

del PGC-1α y PGC-1β se han asociado con el fenotipo de la DT2 y el SM como la

resistencia a la insulina, la obesidad, la oxidación de los lípidos y los niveles de

expresión del PGC-1 (Fig. 9).

Genética• Secuencia de polimorfismos

Ambiente• Sobrenutrición• Dieta no óptima• ↓ Actividad Física

Expresión alterada del PGC-1

Fenotipo de riesgo a DT2 y SM

MÚSCULO ESQUELÉTICO

• Acumulación de lípidos

• Disfunción mitocondrial

• ↓ Oxidación de ácidos grasos

• Resistencia a la insulina

HÍGADO

• Acumulación de lípidos

•↑ Gluconeogénesis

•↑ Síntesis de triglicéridos

TEJIDO ADIPOSO

• ↓ Termogénesis

• Alteración de la función de los adipocitos

PÁNCREAS

• Acumulación de lípidos

* Deficiencia en la secreción de insulina

Figura 9. Papel del los miembros de la familia PGC-1 como mediadores de las interacciones genéticas y ambientales que participan en el desarrollo del fenotipo del SM y la DT2.

Adipocito blanco

Célula madre mesenquimal

Adipocito marrón (UCP1, Alto contenido de mitocondrias)

Otros coactivadores

Preadipocito

15

Los polimorfismos genéticos hacen referencia a la existencia de múltiples

alelos de un gen presentes en una población. Es decir, un polimorfismo es una

variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN entre los individuos de

una población. Aquellos polimorfismos que afectan a la secuencia codificante o

reguladora y que producen cambios en la estructura de la proteína o en el

mecanismo de regulación de la expresión, pueden traducirse en diferentes

fenotipos. Un polimorfismo puede consistir en la sustitución de un solo nucleótido

(Fig. 10) (Shastry, 2002).

Se ha identificado que los SNP causan o predisponen a enfermedades y su

caracterización sirve para el diagnóstico, pronóstico, tratamiento y eventualmente

para la prevención de enfermedades. Estos SNP están asociados con la

diversidad entre las poblaciones y la respuesta individual a los medicamentos.

Algunos SNP también son útiles como marcadores genéticos ya que podrían

constituir la mutación que predispone a una enfermedad. Se ha estimado que hay

una variante en cada 1000 pares de bases de los 3000 millones que forman el

genoma humano. Una de estas variaciones debe darse al menos en un 1% de la

población para ser considerada como un SNP (Fig. 11) (Shastry, 2002).

Figura 10. Polimorfismos genéticos, alelos distintos de genes homólogos presentes en una población.

A-T C-G G-A G-C

16

Figura 11. Ejemplificación de polimorfismo de un solo nucleótido, SNP (Tomado de http://www.genomenewsnetwork.org/resources/whats_a_genome/Chp4_1.shtml).

El SNP Ser482Gly de PGC-1α es un factor de riesgo al desarrollo de la DT2

en la población caucásica Eslovena, Danesa e Inglesa (Kunej et al., 2004), así

como también en sujetos del norte de China (Sun et al., 2006). Además, se ha

reportado que el alelo Ser es el que confiere el riesgo de desarrollar DT2

(Sookoian et al., 2005).

El SNP Pro203Ala del PGC-1β se ha relacionado con la obesidad en

hombres y mujeres. Los portadores del alelo prolina en su forma homocigota

presentan una disminución en el IMC comparado con los portadores del

homocigoto alanina en sujetos daneses blancos de Copenhague. Se considera

que el alelo Ala es el que confiere el riesgo a la obesidad (Andersen, 2005).

Asimismo, el SNP Val279Ile del PGC-1β se ha asociado con la obesidad en

sujetos daneses blancos de Copenhague y se ha determinado que está en

desequilibrio de ligamiento casi completo con el polimorfismo Pro203Ala

(Andersen, 2005).

Mutación Población

general 99% 1%

17

JUSTIFICACIÓN

La DT2 y el SM representan unos de los principales problemas de salud

pública en México. Nuestro país se ubica entre los de mayor número de casos

registrados en el ámbito mundial. La perspectiva futura señala que se mantendrá

el incremento en la cantidad de individuos diabéticos y con síndrome metabólico.

De acuerdo con la información disponible, el país ocupaba el décimo lugar mundial

en 1995, con 4 millones de enfermos, y se estima que para el 2025, ocupará el

séptimo con 11.5 millones.

Los coactivadores PGC-1α y PGC-1β están involucrados en el metabolismo

energético de múltiples tejidos implicados en la patogénesis de la DT2 y el SM, se

piensa que diversos SNP en estos genes candidato pueden actuar como posibles

marcadores de susceptibilidad a desarrollar estas enfermedades en la población

mexicana.

OBJETIVO GENERAL

Determinar si los polimorfismos de un sólo nucleótido de los genes

coactivadores PGC-1α y PGC-1β están involucrados con el riesgo a desarrollar

DT2 y/o SM en una población de la ciudad de México.

OBJETIVOS PARTICULARES

Determinar la frecuencia genotípica y alélica de los SNP Ser482Gly del gen

que codifica para el PGC-1α, Pro203Ala y Val279Ile del gen que codifica para el

PGC-1β y su asociación con la diabetes tipo 2 y/o el síndrome metabólico en una

población de la ciudad de México y estimar las diferencias entre los grupos.

HIPÓTESIS

Si los SNP Ser482Gly del gen PGC-1a, Pro203Ala y Val279Ile del gen

PGC-1b aumentan el riesgo a desarrollar DT2 y/o SM en una población de la

ciudad de México, entonces podrían actuar como marcadores de susceptibilidad

para estos padecimientos .

18

DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

SUJETOS, MATERIALES Y MÉTODOS

Se estudió una muestra representativa de la población de la Ciudad de

México, que incluyó 1300 sujetos, de los cuales 553 fueron controles, 448 con

DT2 y 229 con SM. Los criterios de inclusión fueron: edad de 35 a 65 años y sin

antecedentes de DT2 en familiares de primera línea.

Los individuos con DT2 que participaron en el estudio tenían un diagnóstico

previo, el cual se estableció de acuerdo a los criterios de la Asociación Americana

de Diabetes (ADA por sus siglas en inglés): glucosa postpradial ≥ 200mg/dL y la

presencia de síntomas típicos (polidipsia, polifagia, poliuria y pérdida de peso),

Selección de los pacientes

Sanos DT2 SM

Toma de sangre periférica

Prueba de integridad y cuantificación

Genotipificación en 7900HT

Amplificación del DNA, Q-PCR

Discriminación alélica

Análisis estadístico

Sondas TaqMan

Perfil Bioquímico Extracción de DNA

Examen físico e historia clínica completa

19

glucosa en ayuno ≥ 126mg/dL en dos ocasiones o niveles de glucosa ≥ 200 mg/dL

en un análisis de dos horas posterior a una sobrecarga oral de glucosa de 75

gramos.

El diagnóstico de SM se estableció de acuerdo a los criterios de la

AHA/NLHBI, los sujetos positivos requirieron de la presencia de al menos tres de

los siguientes paramentos: glucosa en ayuno ≥ 100mg/dL, presión arterial ≥

130/85 mmHg, triglicéridos ≥ 150 mg/dL, HDL-C < 50 mg/dL en mujeres y < 40

mg/dL en hombres, perímetro de cintura > 88cm en mujeres y >102 en hombres.

Se realizó historia clínica completa y examen físico a cada uno de los

sujetos. El peso (Kg) e IMC (Kg/m2) se determinó con la báscula Body

Composition Analyzae BC-418 (TANITA, Corp. Illinois). La presión arterial se

determinó con un esfingomanómetro de columna de mercurio (America Diagnostic

Corp. NY). Se realizó perfil bioquímico a cada uno de los pacientes, el cual incluyó

los siguientes parámetros: glucosa (mg/dL), insulina (µU/mL), urea (mg/dL),

creatinina (mg/dL), colesterol total (mg/dL), C-LDL (mg/dL), C-HDL (mg/dL),

triglicéridos (mg/dL), albúmina (mg/L) a través del equipo ILab 350 Clinical

Chemistri System (ILab. Barcelona). El perímetro de cintura y de cadera se midió

con una cinta métrica flexible y se obtuvo el ICC. El índice de resistencia a la

insulina se determinó a través la fórmula de Matthews (1985):

HOMAIR = [insulina (µU/mL) *glucosa (mmol/L) / 22.5

Se obtuvieron muestras de sangre periférica de todos los sujetos, a partir de

las cuales se extrajo el DNA geonómico de acuerdo al siguiente protocolo del kit

QIAamp® DNA Blood de QIAGEN:

A cada una de las muestras de sangre se le agregaron 200 µL de

proteinasa K (QIAGEN, 19155) para degradar las proteínas unidas al DNA y 2.4

mL de buffer de lisis (QIAGEN, 19075), esta mezcla se calentó en un baño con

20

agitación a una temperatura de 68 °C a 70 °C por 30 min. Posteriormente, se

agregaron 2 mL de etanol y la mezcla se transfirió a la columna, la cual se

centrifugó a 3000 rpm por 3 min. a 15 °C y se decantó el filtrado. Se agregaron 2

mL de buffer de lavado (QIAGEN, 19081) para eliminar los contaminantes de la

membrana de la columna y se centrifugó a 4000 rpm por 3 min. a 15 °C, se

añadieron 2 mL de un segundo buffer de lavado (QIAGEN, 19072) para eliminar

los restos de contaminantes en la membrana de la columna y se centrifugó a

4000 rpm por 20 min. a 15 °C. A continuación, el etanol restante se evaporó en un

horno a 70 °C durante 10 a 12 min. Por último, se agregaron 600 µL de buffer de

elusión (QIAGEN, 19077) de DNA, se incubó 5 min. a temperatura ambiente y se

centrifugó a 4000 rpm durante 8min. a 15 °C. En el sobrenadante se obtuvo el

DNA el cual se almacenó a 4°C.

Se verificó la integridad de cada una de las muestras de DNA con

electroforesis en gel de agarosa al 0.8%. Se determinó la concentración del DNA

en el fluorómetro VICTOR3 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer precisely, Turku),

la pureza se determinó de acuerdo a la relación 260/280 nm en el mismo equipo.

La genotipificación de los sujetos se llevó a cabo con sondas TaqMan

específicas para los SNP Pro303Ala, Ser482Gly y Val279Ile en el equipo 7900HT

SDS Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems. California) para 384

pozos. Las sondas TaqMan utilizadas fueron: C_29133871_10, C_1643192_20 y

C_33288674_10, respectivamente.

Cada una de las sondas está marcada con 2 fluoróforos diferentes: VIC y

FAM, la discriminación alélica se determina de acuerdo a la fluorescencia emitida,

ya que si se emite sólo fluorescencia de VIC, el aleo 1 se encuentra en su forma

homocigota; si se emite sólo fluorescencia de FAM, el aleo 2 es homocigoto y si

emiten ambas fluorescencias, es heterocigoto (ver anexo).

21

A continuación se enlistan los componentes de la PCR

En cada uno de los pozos de la placa se colocaron:

Las muestras se cargaron en oscuridad. La placa se cubrió con una

membrana adhesiva MicriAmp (Applied Biosystems, California) para evitar que la

muestra se evaporara. La placa se centrifugo 3 min. a 1000 rpm y se analizó en el

equipo 7900HT SDS Fast Real-Time PCR System a los siguientes tiempos y

temperaturas:

Pasos iniciales Activación de la DNA pol AmpliTaq

Gold®

10 min a 95°C

Terminados los ciclos de amplificación PCR, se ejecutó el análisis de

Discriminación Alélica del equipo 7900HT SDS Fast Real-Time PCR System.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOS

Se utilizó la prueba de Chi cuadrada (X2) para comparar las frecuencias

alélicas entre los casos y controles. La prueba de Razón de Momios (OR por sus

Componente de reacción

Concentración Volumen

Master mix universal para

PCR 2X 2.5 µL

Sonda TaqMan

20X 0.25 µL

DNA 20ng 1 µL Agua estéril 3 µL

Total 6.75

PCR (por cada 40 ciclos) Desnaturalización Alineación/

Elongación Ciclos

15 seg. a 95°C 1 min. a 60°C

22

siglas en inglés) se empleó para determinar la asociación del genotipo con la DT2

y el SM. Las diferencias significativas en los parámetros bioquímicos y

antropométricos entre los grupos se determinaron con la prueba de U de Mann-

Whitney. Se realizaron regresiones logísticas para estimar la relación entre el alelo

de riesgo y el IMC. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS

versión 11.0 para Windows (SPSS INC. Illinois).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

• Características clínicas del grupo control y con DT2.

Las características antropométricas y bioquímicas del grupo control y el grupo de

pacientes con DT2 fueron significativamente diferentes (tabla 2). Se observa que

la media de glucosa en el grupo control es de 87.01 mg/dL, valor que se encuentra

en el intervalo normal, mientras que la media de glucosa en el grupo con DT2 fue

de 182.38 mg/dL, muy por encima del punto de corte de 99 mg/dL. En el grupo de

diabéticos el valor promedio del HOMA IR indica una resistencia a la insulina

(6.14), aunque no hay hiperinsulinemia en la población (considerando el valor

promedio) (tabla 2).

• Características clínicas del grupo control y con SM.

En la tabla 3 se muestran los valores promedio de las características

antropométricas y bioquímicas de los grupos control y con SM (tabla 3). Los

valores promedio de glucosa se encuentran en ambos grupos en el intervalo

normal, aunque en el grupo de SM el valor es más alto. También se observa que

en el grupo de SM hay resistencia a la insulina (determinada a través de

HOMAIR), sin encontrarse hiperinsulinemia poblacional. Con respecto a la presión

arterial, las medias de la TAS y TAD se encontraron elevadas en el grupo de SM

comparado con el control, sin llegar a ser hipertensión.

23

Tabla 2. Características clínicas entre los sujetos control y con DT2. Parámetro Control (n=553) DT2 (n=448) p Edad (años) 43.54 ± 6.58 53.42 ± 7.45 <0.0001

Talla (m) 1.65 ± 0.09 1.56 ± 0.08 <0.0001

IMC 27.52 ± 3.58 29.25 ± 4.66 <0.0001

ICC (Kg/cm2) 0.90 ± 0.06 0.92 ± 0.18 0.03

TAS (mm Hg) 116.29 ± 9.48 118.31 ± 13.87 0.01

TAD (mm Hg) 73.53 ± 7.24 76.45 ± 9.06 <0.0001

Glucosa (mg/dL) 87.01 ± 8.24 182.38 ± 79.31 <0.0001

Insulina (µU/L) 9.46 ± 4.77 14.03 ± 9.94 <0.0001

HOMA IR 2.04 ± 1.11 6.14 ± 4.89 <0.0001

Colesterol total (mg/dL) 200.82 ± 41.55 222.08 ± 65.71 <0.0001

C-LDL (mg/dL) 128.35 ± 32.94 139.42 ± 38.23 1,2 X10-4

C-HDL (mg/dL) 44.84 ± 12.04 48.73 ± 15.21 1,4 X10-4

Triglicéridos (mg/dL) 169.25 ± 92.32 237.78 ± 172.48 <0.0001

Los datos están expresados como la media ± desviación estándar.

Tabla 3. Características clínicas entre los sujetos control y con SM.

Los datos están expresados como la media ± desviación estándar. En rojo se señalan parámetros involucrados en el diagnóstico del SM. *Diferencias no significativas.

Parámetro Control (n=553) SM (n=299) p

Edad (años) 43.54 ± 6.58 44.57 ± 6.80 0.022

Talla (m) 1.65 ± 0.09 1.64 ± 0.09 0.029

IMC 27.52 ± 3.58 30.57 ± 3.96 <0.0001

ICC (Kg/cm2) 0.90 ± 0.06 0.95 ± 0.51 <0.0001

TAS (mm Hg) 116.29 ± 9.48 126.74 ± 12.49 <0.0001

TAD (mm Hg) 73.53 ± 7.24 78.47 ± 8.79 <0.0001

Glucosa (mg/dL) 87.01 ± 8.24 95.29 ± 16.31 <0.0001

HOMA IR 2.04 ± 1.11 3.19 ± 2.04 <0.0001

Insulina (µU/L) 9.46 ± 4.77 13.66 ± 7.57 <0.0001

Colesterol total (mg/dL)

200.82 ± 41.55 202.03 ± 39.80 0.81*

C-LDL (mg/dL) 128.35 ± 32.94 124.42 ± 34.93 0.109*

C-HDL (mg/dL) 44.84 ± 12.04 36.51 ± 9.17 <0.0001

Triglicéridos (mg/dL)

169.25 ± 92.32 265.23 ± 162.34 <0.0001

24

• Frecuencias genotípicas y alélicas del SNP Ser482Gly

En los tres grupos (controles, con diabetes tipo 2 y con síndrome metabólico), la

distribución alélica para el polimorfismo Ser482Gly se encuentra en equilibrio de

Hardy-Weinberg y la distribución de las frecuencias genotípicas se muestran

similares (Fig. 12).

Se determinó que no hay diferencias significativas en las frecuencias genotípicas y

alélicas entre los grupos de acuerdo con el valor obtenido de la prueba de X2

(p=0.5813 y p=0.5802 para DT2 y SM, respectivamente) (tabla 4), por lo tanto, el

SNP Ser482Gly no esta relacionado con el riesgo a desarrollar DT2 o SM en la

población de la ciudad de México.

0

10

20

30

40

50

60

Controles Diabetes tipo 2 SíndromeMetabólico

GG

GA

AA

Figura 12. Distribución de las frecuencias genotípicas del polimorfismo Ser482Gly en las tres poblaciones.

25

Tabla 4. Distribución del genotípica y alélica del polimorfismo Ser482Gly del PGC-1α con Diabetes tipo 2, con Síndrome Metabólico y controles.

� Frecuencias genotípicas y alélicas del SNP Pro203Ala

En los tres grupos, los alelos del polimorfismo Pro203Ala se encuentran en

equilibrio de Hardy-Weinberg, se analizó la distribución de las frecuencias

genotípicas de los tres grupos, mostrando frecuencias similares (Fig. 13).

Se determinó que no hay diferencias significativas en las frecuencias genotípicas y

alélicas entre los grupos de acuerdo con el valor obtenido de la prueba de X2

(p=0.9178 y p=0.5287, para DT2 y SM, respectivamente) (tabla 5), por lo tanto, el

Genotipo Controles n (%)

Diabetes Tipo 2 n (%)

Síndrome metabólico n (%)

GG 289 (52.36) 248 (55.61) 166 (55.52) GA 228 (41.30) 165 (37.00) 112 (37.46) AA 35 (6.34) 33 (7.40) 21 (7.02) Alelo Gly 806 (73.01) 661 (74.10) 444 (74.25) Ser 298 ( 26.99) 231 (25.90) 154 (25.75) OR=1.058 OR=1.066 X2=0.30 X2=0.31 p=0.5813 p=0.5802

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Controles Diabetes tipo 2 SíndromeMetabólico

CC

CG

GG

Figura 13. Distribución de las frecuencias genotípicas del polimorfismo Pro203Ala en las tres poblaciones.

26

SNP Pro203Ala no está relacionado con el riesgo a desarrollar DT2 o SM en la

población de la Ciudad de México.

Tabla 5. Distribución genotípica y alélica del polimorfismo Pro203Ala del PGC-1β en pacientes con Diabetes tipo 2, con Síndrome Metabólico y controles.

Genotipo Controles n (%)

Diabetes Tipo 2 n (%)

Síndrome metabólico n (%)

CC 13 (2.35) 11(2.46) 8 (2.68) CG 140 (25.32) 111(24.78) 67 (22.41) GG 400 (72.33) 326(72.77) 224 (74.92) Alelo Pro 166 (15.01) 133 (14.84) 83 (13.88) Ala 940 (84.99) 763 (85.16) 515 (86.12) OR=0.987 OR=0.913 X2=0.01 X2=0.40 p=0.9178 p=0.5287

• Frecuencias genotípicas y alélicas del SNP Val279Ile

En los tres grupos, las frecuencias alélicas del polimorfismo Val279Ile se

encuentran en equilibrio de Hardy-Weinberg, se analizó la distribución de las

frecuencias genotípicas de los tres grupos, mostrando frecuencias similares (Fig.

14).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Controles Diabetes tipo 2 SíndromeMetabólico

AA

GA

GG

Figura 14. Distribución de las frecuencias genotípicas del polimorfismo Val279Ile en las tres poblaciones.

27

Se determinó que no hay diferencias significativas en las frecuencias

genotípicas y alélicas entre los grupos de acuerdo con la prueba de X2 (p=0.7075,

p=0.8531, para DT2 y SM, respectivamente) (tabla 6), por lo tanto, el SNP

Pro203Ala no esta relacionado con el riesgo a desarrollar DT2 o SM en la

población de la Ciudad de México.

Tabla 6. Distribución genotípica y alélica del polimorfismo Val279Ile del PGC-1β en pacientes con Diabetes tipo 2, con Síndrome Metabólico y controles.

• Asociación de los SNP Ser482Gly, Pro203Ala y Val279Ile con el IMC

Se realizó un análisis de regresión logística para determinar si hay asociación con

cualquiera de los polimorfismos y el IMC, se encontró que los valores de OR no

tuvieron significancia estadística (tabla 7), por lo que no hay asociación con el IMC

y cualquiera de los polimorfismos, esto es contrario a lo que se ha descrito para

otras poblaciones, en donde se han relacionado estos polimorfismos con el

fenotipo de la obesidad (Muller et al., 2003).

El gen PPARGC1A que codifica para el coactivador PGC-1α y el gen

PPARGC1B que codifica para el coactivador PGC-1β, son genes candidato que se

han relacionado principalmente con el fenotipo de la obesidad y en el caso

particular del PGC-1α con la DT2, ya que algunos estudios han encontrado

asociaciones de riesgo con algunas variaciones en estos genes, relacionándolas

Genotipo Controles, n (%) Diabetes Tipo 2, n (%)

Síndrome metabólico, n (%)

AA 9 (1.63) 16 (3.57) 8 (2.68) GA 146 (26.50) 96 (21.43) 71 (23.75)

GG 396 (71.87) 336 (75.00) 220 (73.58)

Alelo Val 164 (14.88) 128 (14.29) 87 (14.55) Ile 938 (85.12) 768 (85.71) 511(85.45)

OR=0.953 OR=0.974 X2=0.14 X2=0.03 p=0.7075 p=0.8531

28

con el fenotipo de estos padecimientos. Esta idea, consolida más afondo la

evidencia dada por las exploraciones en el genoma, en las que se demuestra que

hay regiones específicas en los cromosomas que se asocian con la DT2 y la

obesidad y probablemente con el SM.

Las alteraciones en el PGC-1α se han relacionado con intolerancia a la

glucosa, resistencia a la insulina, factores importantes en el SM y la DT2. Sin

embargo, el papel del PGC-1α como factor protector contra mediador en la

progresión de la enfermedad es confuso, particularmente en la intolerancia a la

glucosa y en la resistencia a la insulina, las cuales varían de acuerdo al tejido (Fig.

15) (Finck et al., 2006).

Tabla 7. Análisis de regresión logística de los polimorfismos Pro203Ala, Ser482Gly o Val279Ile con el IMC en los grupos Control, DT2 y SM

Pro203Ala OR 95% IC p

Control 0.966 0.802 -1.163 0.714

DT2 0.914 0.817 - 1.023 0.18

SM 0.836 0.672 -1.040 0.108

Ser482Gly

Control 0.981 0.926 -1.040 0.526

DT2 1.000 0.956 - 1.046 1.000

SM 1.048 0.971 -1.132 0.227

Val279Ile

Control 1.059 0.989 -1.133 0.102

DT2 1.011 0.959 -1.066 0.676

SM 1.008 0.925 -1.098 0.857

29

Figura 15. La expresión y actividad del PGC-1α se ha visto incrementada en las células β pancreáticas y en el hígado de modelos animales de la DT2. Inversamente, la expresión del gen del PGC-1 es reducida en el músculo esquelético de sujetos con DT2, así como también ha una disminución en la expresión de los genes implicados en la fosforilación oxidativa (OXPHOS). En este contexto, la regulación de la actividad del PGC-1α es tejido-especifica. El PGC-1α contribuye con la resistencia a la insulina, la intolerancia a la glucosa, y deficiencia de insulina.

La actividad del PGC-1α aumenta en el hígado diabético durante el ayuno,

lo que contribuye con la hiperglucemia. El PGC-1α puede promover la resistencia

a la insulina, directamente por la inducción de TRB-3, que es un inhibidor de la

señalización Akt y es componente crítico en la vía de señalización de la insulina.

El mecanismo preciso implicado en la regulación del la vía de señalización de la

insulina por la actividad del PGC-1α en el estado diabético, representa un área de

investigación activa (Koo et al., 2004).

El PGC-1α se activa en las células β pancreáticas en algunos modelos de

obesidad y DT2 en roedores. La glucosa inhibe la sobrexpresión del PGC-1α

estimulando la despolarización de la membrana y la secreción de insulina en

cultivos de islotes o líneas celulares de insulinoma. Se han realizado transplantes

de islotes normales en ratones a los que se les indujo diabetes con

estreptozotocina y se observó que los niveles de glucosa regresaban a la

normalidad y los islotes que sobrexpresaron PGC-1α fueron incapaces de revertir

la inducción experimental de diabetes. El fenotipo de las células β pancreáticas de

ratones deficientes de PGC-1α y PGC-1β y los efectos que tienen sobre de ellas

aún no ha sido dilucidado (Yoon et al., 2003).

Incremento en la actividad PGC-1α, Estimula la producción de

glucosa hepática Resistencia a la insulina

Decremento en la actividad PGC-1α, Reducción de

OXPHOS Intolerancia a la glucosa

Incremento en la actividad PGC-1α, Suprime la secreción de insulina

Deficiencia de insulina

Hígado Músculo Páncreas

30

En contraste con los resultados que se han obtenido en el hígado y el las

células β pancráticas, hay una evidencias, que sugieren que, en el músculo

esquelético, el PGC-1α puede ser protector del desarrollo de la resistencia a la

insulina, ya que el PGC-1α promueve la expresión de los GLUT4. La

sobrexpresión PGC-1β en el músculo esquelético protege a los ratones de la

obesidad y resistencia a la insulina inducida por una dieta alta en grasas.

El PGC-1α es un amplificador de la función mitocondrial, también es un

excelente candidato a prevenir la resistencia a la insulina y la disfunción

mitocondrial. Estudios en humanos han mostrado una correlación inversa en los

niveles del PGC-1α en el músculo y la actividad mitocondrial, con la resistencia a

la insulina y la diabetes (Finck et al., 2006).

La reciente explosión de nueva información, indica que la familia de

coactivadores PGC-1 tiene funciones clave en el control transcripcional de las vías

del metabolismo energético en una gran variedad de tejidos de mamíferos (Finck

et al., 2006).

La asociación de los PGC-1 con la DT2 se ha encontrado en estudios con

polimorfismos de un solo nucleótido. El SNP Ser482Gly se localiza en la región

codificante del gen PPARGC1 y se ha relacionado con un riesgo creciente de DT2.

Sin embargo, en estudios realizados en los Caucásicos Franceses (Lacquemant

et al., 2002), Chinos (Chen et al., 2004) e Indios Pima (Muller et al., 2003), se vio

que el SNP Ser482Gly del PGC-1α no tiene efecto sobre el riesgo a desarrollar

DT2, al igual que los resultados obtenidos en nuestro estudio (tabla 4). En

contraste con estos resultados, en la población Eslovena (Kunej et al., 2004),

Danesa (Andersen et al., 2001) así como también en sujetos del norte de China

(Sun et al., 2006) este SNP está estrechamente relacionado con la DT2 (tabla 8).

Al parecer este SNP no es un factor de riesgo para la DT2 en todas las

31

poblaciones y queda por definir cuál es el papel de este polimorfismo en la

patogenia de la DT2.

Tabla 8. Comparación del genotipo y frecuencias alélicas del polimorfismo Ser482Gly en diferentes poblaciones.

En un estudio realizado en caucásicos Daneses se determinó que el SNP

Ser482Gly no esta asociado con el riesgo a desarrollar SM al igual que lo obtenido

en nuestro estudio, y no se encontraron diferencias significativas del genotipo con

respecto el IMC, lípidos en suero durante el ayuno, insulina en suero y resistencia

a la insulina (Ambye et al., 2005).

Los SNP Pro203Ala y Val279Ile se encuentran en la región codificante del

gen PPARGC1b y se les ha encontrado en equilibrio de ligamiento, estos SNP se

han relacionado con la obesidad en una población Danesa de Copenhague

(Andersen, 2005), donde al igual que en nuestro estudio, no se encontró

asociación con el riesgo a desarrollar la DT2 (tabla 5 y 6). En este estudio, no se

encontró asociación de los polimorfismos del gen PPARGC1b con el IMC, lo que

la relación de estos polimorfismos con la obesidad difiere entre las poblaciones.

Si los polimorfismos afectan o no la actividad de los PGC-1 aún se

encuentra sujeto a discusión, pero es conocido que el cambio de aminoácido en el

DT2 Controles Frecuencia del aleo Ser

GG GA AA Total GG GA AA Total p DT2 (%)

Controles (%) p

Daneses � 186 200 68 454 97 80 21 198 0.11 37 30.8 0.032 Daneses�� 262 297 96 655 243 196 52 491 0.003 37.3 30.5 0.0007 Eslovenos 141 129 35 305 114 111 15 240 0.10 32.6 29.4 0.036 Norte de

China 122 190 78 390 181 256 88 525 0.37 44.4 41.1 0.169

Franceses 280 284 95 659 323 327 98 748 0.77 36 35 0.88 Chinos 155 255 84 494 185 264 106 555 0.40 42.8 42.8 0.975 Cd. de

México * 248 165 33 448 289 228 35 553 - 25.90 26.99 0.58

� Estudio inicial, �� Estudio replicado, * Resultados del presente estudio.

32

SNP Ser482Gly es conservativo y no crea o elimina motivos funcionales de la

proteína (Esterbauer et al., 2002), mientras que se piensa que los SNP Pro203Ala

y Val279Ile que podrían tener efecto dentro de la estructura y función de la

proteína (Park et al., 2006).

Un factor importante que podría afectar los resultados de este estudio, es

el hecho de que la población de la Ciudad de México y en general del país no es

genéticamente homogénea, ya que se ha determinado que la mayor parte de la

población mexicana es una mezcla que consiste de diferentes acervos genéticos,

incluidos los amerindios (65%), los europeos (principalmente de España, 30%) y

en menor grado los africanos (5%) (Martínez et al., 2007), de tal modo que la

población mexicana se encuentra estratificada. Posteriormente, se pretende

realizar estudios más extensos sobre la estratificación de la población estudiada,

donde se utilizarán marcadores de etnicidad, con lo cual se determinará la

similitud genotípica entre los grupos estudiados.

CONCLUSIÓN

Los SNP Pro203Ala, Val279Ile y Ser482Gly no están relacionados con el

riesgo a desarrollar diabetes tipo 2 o síndrome metabólico en una población de la

Ciudad de México. De igual forma, no encontramos asociación de estos SNP con

el IMC en esta población.

33

BIBLIOGRAFÍA

Ambye L, Rasmussen S, Fenger M, Jorgensen T, Borch-Johnsen K, Madsbad S,

Urhammer SA (2005) Studies of the Gly482Ser polymorphism of the

peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1alpha (PGC-

1alpha) gene in Danish subjects with the metabolic syndrome. Diabetes Res

Clin Pract; 67(2):175-9.

Andersen G, (2005). Evidence of association between genetic variation of the

coactivador PGC-1b and obesity. J Med Genet 42; 402-7.

Andersen G, Urhammer S, Gaede P, et al (2001) Mutation analysis of

peroxisome proliferator-activated receptor-γγγγ coactivator- 1 (PGC-1) and

relationships of identified amino acid polymorphisms to type II diabetes

mellitus Diabetologia; 44: 2220–6.

Applied Biosystems (2005). Allelic Discrimination Getting Started Guide; Allelic

Discrimination Assay Getting Started Guide for the 7900HT Fast System. pp

1-110, Manual del usuario.

Cerda R, et al (2003). Genética de la diabetes mellitus tipo 2 en el noreste de

México. III, RESPYN 4(3).

Chen F et al (2004). Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-g

Coactivator-1a Polymorphism Is Not Associated with Essential Hypertension

and Type 2 Diabetes Mellitus in Chinese Population. Hypertens Res 27(11):

813-9.

Costa J. (2004). Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real.

Enferm Infecc Microbiol Clin; 22(5): 299-305.

Cruz M, et al (2005), Genes candidatos como posibles marcadores de

susceptibilidad a diabetes tipo 2, REB 24(3,4): 81-86.

34

Encuesta Nacional de la salud, la salud de los adultos 2000.

Esterbauer h, Oberkofler H, Linnemayr V, Iglseder B, Hedegger M, Wolfsgruber P,

Paulweber P, Fastner G, Krempler F, Patsch W. (2002). Peroxisome

Proliferator–Activated Receptor-γγγγ Coactivator-1. Gene Locus. Associations

with Obesity Indices in Middle-Aged Women. Diabetes; 51, 1281-6.

Finck B, Kelly D, (2006). PGC-1 coactivators: inducible regulators of energy

metabolism in health and disease. Review series 116 (3): 615-622.

Glass C, Rose D, Rosenfield M (1997). Nuclear receptor coactivators. Curr Opin

Cell Biol; 9: 222-2.

Grundy S, Cleeman J, Daniels S, Donato K, Peter J (2005) Association/National

Heart, Lung, and Blood Institute Scientific Statement: Diagnosis and

Management of the Metabolic Syndrome: An American Heart Executive

Summary. Circulation; 112: 285-290.

Handschin C, Spielgeman B. (2006). PGC-1 coactivators energy homeostasis

and metabolism. Endocrine Reviews; 27:728-35.

Koo S, Satoh H, Herzig S, Lee CH, Hedrick S, Kulkarni R, Evans RM, Olefsky J,

Montminy M. (2004) PGC-1 promotes insulin resistance in liver through

PPAR-alpha-dependent induction of TRB-3 Nat Med;10(5):530-534.

Kunej T, Petrovi G, Dov P, Peterlin D, Petrovi D (2004). A Gly482Ser

polymorphism of the peroxisome Proliferator –Activated receptor-g

Coacticador-1 (PGC-1) Gene is associated with Type 2 Diabetes in

Caucasians, Folia Biologica (Praha) 50, 157-158.

35

Lacquemant C, Chikri M, Boutin P, Samson C, Froguel P (2002). No association

between the G482S polymorphism of the proliferator-activated receptor-

coactivator-1 (PGC-1) gene and type II diabetes in French Caucasians (Letter).

Diabetologia 45:602–603,

Lerman I, Aguilar A et al (2004). El síndrome metabólico. Características del

síndrome metabólico en México, 12(3): 109-122.1

López J, (2005). Función y biogénesis mitocondrial. Diferencias entre

géneros. Tesis doctoral de la universidad de Illes Balears, 123pp.

Martinez-Marignac V, Valladares A, Cameron C, Chan A, Perera A, Globus-

Goldberg R, Wacher N, McKeigue P, O’Donnell D, Shriver M, Cruz M, Parra J. E

(2007). Admixture in Mexico City: implications for admixture mapping of Type

2 diabetes genetic risk factors, Hum Genet 120:807–819.

Matthews DR, Hosker JP, Rudenski AS, Naylor BA, Treacher DF, Turner RC.

(1985). Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell

function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man.

Diabetologia; 28(7):412-9.

Michael F, et al (2001). Restoration of insulin-sensitive glucose transporter

(GLUT4) gene expression in muscle cells by the transcriptional coactivator

PGC-1. PNAS 98(7): 3820-25.

Muller L, Bogardus C, Pedersen O, Baier L (2003). A Gly482Ser Missense

Mutation in the Peroxisome Proliferator–Activated Receptor _ Coactivator-1

Is Associated With Altered Lipid Oxidation and Early Insulin Secretion in

Pima Indians. Diabetes, 52: 895-898.

36

Olvera, E (2000). El panorama epidemiológico de la diabetes mellitus, Revista

Mexicana de Enfermería Cardiológica 8(1-4): 56-59.

Palou A, Bonet M, Rodríguez A. (2004). Nutrigenómica y obesidad. Rev Med

Univ Navarra 48(2): 36-48.

Park K, Shin D, Park B, Cheong H, Cho Y, Lee H, Lee J, Tae Kim H, Park C, Han

H, Kimm K, Oh B (2006). Putative association of peroxisome

proliferatoractivated receptor γγγγ co-activator 1 β β β β (PPARGC1B) polymorphism

with Type 2 diabetes mellitus. Journal compilation Diabetes UK. Diabetic

Medicine; 23: 635–642.

Pihlajamäki J, Patti M (2005). Regulation of PGC-1 in Humans with Insulin

Resistance and Type 2 Diabetes: Functional Implications, Research Division,

Joslin Diabetes Center One Joslin Place.

Puigserver, P., Wu, Z., Park, C.W., Graves, R., Wright, M., and Spiegelman, B.M.

(1998). A cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptive

thermogenesis. Cell 92, 829–839.

Puigserver P (2003). Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-_ coactivator

1 (PGC-1): Transcriptional Coactivator and Metabolic Regulator. Endocrine

Reviews 24(1):78–90

Rodríguez, L, Sánchez M y Martínez L, (2002). Síndrome Metabólico Enfoque

actual Rev Cubana Endocrinol, 13(3):238-52.

Rull, J et al, (2005), Epidemiology of type 2 diabetes in México, Arch Med Res.

36(3): 188-196.

37

Shastry B, (2002). SNP alleles in human disease and evolution, Biomedical and

Life Sciences and Medicine; 47(11): 561-566.

Skelly, AH (2006). Type 2 diabetes mellitus. Nurs Clin North Am. 41(4):531-47.

Sookoian S et al (2005). Peroxisome proliferator-activated receptor gamma

and its coactivator-1 alpha may be associated with features of the metabolic

syndrome in adolescents. Journal of Molecular Endocrinology. 35; 373–380.

Steven, E. Kahn, Rebecca L. Hull1 & Kristina M. Utzschneider (2006).

Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes,

NATURE 444(14) 840-46.

Stumvoll, M, (2005). Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy.

Seminar 365: 1333-46.

Sun L, Yang Z, Jin F, Zhu X, Qu Y, Shi H, Wang L. (2006). The Gly482Ser variant

of the PPARGC1 gene is associated with Type 2 diabetes mellitus in northern

Chinese, especially men. Diabetic Medicine 23(10): 1085.

Tusié, L (2005). Genes and Diabetes type 2 mellitus. Arc Med Res 36: 210-22.

Yoon C, et al. (2001). Control of hepatic gluconeogénesis through the

transcriptional coactivator PGC-1. NATURE 413: 131-138.

Yoon J, Xu G, Deeney J, Yang S, Rhee J, Puigserver P, Levens, Yang R, Zhang C,

Lowell B, Berggren P, Newgard C, Weir S, Weir G Spiegelman B. (2003).

Suppression of β cell energy metabolism and insulin release by PGC-1α. Dev.

Cell. 5:73–83.

38

ANEXO. Funcionamiento de las sondas TaqMan

Una sonda TaqMan es un oligonucleótido cuya secuencia es complementaria a la

región central del DNA a amplificar (esta sonda se encuentra flanqueada por las

secuencias específicas de los iniciadores que se utilizan para la amplificación por

PCR). La sonda tiene una secuencia de 13 a 18 nucleótidos que presenta en el

extremo 5’ una marca fluorescente (reportero) y en el extremo 3’ un apagador (no

fluorescente) de tal forma que cuando estas dos moléculas se encuentran unidas

por la sonda, la fluorescencia global observada es igual a cero [fenómeno FRET

(Fluorescent Resonant Energy Transfer)] (Applied Biosystems, 2005).

Las sondas TaqMan tienen una temperatura máxima (TM) mayor que los

iniciadores, por lo que durante la etapa de alineación se unen a su secuencia, y

posteriormente los iniciadores, de tal forma que cuando la DNA polimerasa se une

al extremo 3’ del iniciador inicia la elongación, en su paso se encuentra a la sonda

y la degrada utilizando su actividad de exonucleasa 5’ – 3’. Al ser degradada,

libera al reportero del apagador lo que suprime el fenómeno FRET y la

fluorescencia emitida puede ser detectada por el sistema de detección del equipo.

Dado que la fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de sonda

degradada, y esta a su vez es proporcional a la cantidad de templado generado,

este sistema permite visualizar el incremento de la amplificación a lo largo de la

reacción de PCR (Applied Biosystems, 2005).

Para la determinación del SNP, se utilizan, en el mismo sistema de

amplificación, dos sondas, cada una de las cuales presenta en la posición central

una de las variantes del nucleótido dimórfico, utilizando como reporteros a FAM y

VIC para diferenciarlas entre sí. La sonda que híbrida perfectamente con la

secuencia blanco es escindida por la Taq polimerasa, mientras que una unión

inespecífica en el nucleótido dimórfico reduce la eficiencia de unión de la sonda a

la secuencia blanco. De esta forma, un aumento en la señal de uno de los

reporteros indicará homocigocidad para el nucleótido dimórfico que reporta la

fluorescencia específica; mientras que si se observa fluorescencia de VIC y FAM,

39

es un indicativo de heterocigocidad (Costa, 2004 y Applied Biosystems, 2005) (Fig.

16).

Figura 16. Ilustración de los fluoróforos VIC y FAM y como se unen a la secuencia blanco específica.

Unión específica

Unión específica

Unión no específica

Unión no específica

Alelo 1

Alelo 2

Leyenda