Reporte8.-Inmovilizacion de enzima Xilanasa usando alginato de sodio

8/15/2019 Reporte8.-Inmovilizacion de enzima Xilanasa usando alginato de sodio

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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO || FACULTAD DE QUIMICAINGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA

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INMOVILIZACIÓN DE XILANASAAlbo Josué Hernández Rojas

Ingeniería en biotecnología, Universidad Autónoma de Querétaro, [email protected]

Fernando Olvera Martínez


Natalia García Orihuela


RESUMEN:La inmovilización sobre enzimas es una aplicación que mejora alguna de las cualidades durantela obtención de un producto, como es la reutilización de las enzimas, mejora su estabilidad y separación del

producto para volver a ser usadas. En la presente práctica se realizó la inmovilización de la enzima Xilanasausando el alginato de sodio como medio de soporte, formando esferas que retienen a las enzimas, se realizó

el ensayo la actividad enzimática comparando la enzima libre frente a la inmovilizada, así como también losresiduos de enzima no inmovilizados, se calculó el porcentaje de eficiencia, actividad recuperada yrendimiento, y se obtuvieron los siguientes resultados respectivamente 153.631, 52.298 y 34.042, también secuantificaron la concentración de enzima en mg/L que se tenía en las esferas de alginato, la enzima libre y enlos residuos no inmovilizados y los resultados fueron los siguiente respectivamente 2.156 mg/mL, 0.124mg/mL y 0.195 mg/mL. Logramos una efectiva inmovilización de la enzima xilanasa en soporte de alginatode sodio, con una alta eficiencia, esto se traduce en que se puede reusar la enzima por varios ciclos.

PALABRAS CLAVE: Alginato de sodio, cloruro de calcio, encapsulación, inmovilización, XilanXilano.

ABSTRACT:The immobilization of enzymes is one of the applications that improves the qualities of theextraction of the product, such as the reuse of the enzymes, stability and isolation of the product to be usedagain. The present paper presents the immobilization of the Xylanase using sodium alginate and calciumchlorine, producing spheres that retain the enzyme. An enzyme activity assay was performed to determine theactivity in the free enzyme, in the immobilized and in the waste- To evaluate the immobilization threeconcepts were evaluated obtaining the following results: 153.631% efficiency, 52.298% recovered activityand 34.042% yield. In order to get these parameters, the amount of protein was quantified in the alginatespheres, the free enzyme and in the wastes, 2.156 mg/mL, 0.124 mg/mL and 0.195 mg/mL.respectively. Meteffective immobilization of the xylanase enzyme in sodium alginate support, with high efficiency, this means

that the enzyme can be reused for several cycles. KEY WORDS: sodium alginate, calcium chlorine, spherification, immobilization, xylanase, xylan

mailto:[email protected]















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INTRODUCCIÓN

En los últimos años, la biotecnología haexperimentado grandes avances y, paralelamentesus aplicaciones industriales en la obtención de

productos químicos, en la industria alimentaria yfarmacéutica. Los procesos catalizados porenzimas en la industria son cada día másnumerosos, ya que presentan una serie de ventajasfrente a los catalizadores convencionales no

biológicos, ya que presentan una alta actividadenzimática, especificidad, son muy activos atempera tura ambiente y a presión atmosférica, sinembargo a pesar de estas ventajas, el uso de

enzimas no se ha generalizado en los procesosindustriales debido a que no son estables en lascondiciones de trabajo y la separación de lasenzimas después de obtenido el producto es difícil.Una solución frente a este problema es lainmovilización enzimática al ser un proceso

biotecnológico económico y rentable [1].

Diversas técnicas para la inmovilización decélulas han sido propuestas. Reciente el uso detrampas de geles de polisacáridos o encapsulaciónse han convertido en un método desafiante. Y eluso de esferas de gel de alginato se destaca comoel método más prometedor y versátil todavía [2].

El alginato es un hidrocoloide que posee propiedades gelificantes, estabilizantes yespesantes, razones por las cuales ha sido de graninterés para la industria alimentaria. El alginato esdescrito como un polisacárido lineal poliónico ehidrofílico proveniente de algas marinas

conformado por dos monómeros en su estructura,el ácido α -L- gulurónico (G) y el ácido β -D-manurónico (M) que se distribuyen en seccionesconstituyendo homopolímeros tipo G-bloques (-GGG-), M-bloques (-MMM-) o heteropolímerosdonde los bloques M y G se alternan (-MGMG-).Tanto la distribución de sus monómeros en la

cadena polimérica como la carga y volumen de losgrupos carboxílicos confieren al gel formadocaracterísticas de flexibilidad o rigidezdependiendo del contenido en G. Si en su

estructura polimérica se tiene mayor cantidad deG-bloques, generalmente el gel es fuerte y frágil,mientras que con la presencia de mayor proporciónde M-bloques el gel formado se presenta suave yelástico. El proceso de gelificación ocurre en

presencia de cationes multivalentes (excepto elmagnesio) donde el ión calcio es el más empleado

por la industria alimentaria. La gelificación tienelugar al producirse una zona de unión entre un G-

bloque de una molécula de alginato que se enlazafísicamente a otro Gbloque contenido en otramolécula de alginato a través del ión calcio [3].

Con el objetivo de familiarizarse con lainmovilización de enzimas, así como calcular laeficacia de la inmovilización a través de tres

parámetros: rendimiento, eficiencia, y actividadrecuperada, se trabajará con xilanasa, alginato desodio y cloruro de calcio.

METODOLOGÍA

Inmovilización de la enzima

En un vaso de precipitado se mezclaron 15 mLde una solución de alginato de sodio (40 g/L) con15 mL de una solución de la enzima xilanasa (1%Peso /Volumen ) en un amortiguador de acetatos 0.1 M(pH 5), de esta mezcla se tomaron alícuotas conuna jeringa tipo insulina de 6 mL para poder hacer

pequeñas gotas esta mezcla, que se dejaron caer enuna solución de CaCl 2 0.4M, con esto se lograronla creación de esferas de la mezcla de alginato desodio (40 g/L) y de la enzima xilanasa (1%Peso /Volumen ), ya que se han formado las esferas seretiraron de la solución de CaCl 2 0.4M, después selavaron con el amortiguador de acetatos (pH 5), seretiró el exceso de amortiguador con papel




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absorbente o una toalla de papel, después sevolvieron a lavar con el amortiguador de acetatosy nuevamente se retiró el exceso de amortiguador,se aseguró que las esferas estén completamente

secas. Este proceso se repitió para una mezcla dealginato de sodio (20 g/L) pero sin mezclar conenzimas, se obtuvieron esferas solo de alginato desodio.

Nota: Para conseguir que las esferas fueran similares en tamaño se presionó la jeringa con fuerza constante, esto fue necesario para poder hacer pruebas posteriormente .

Ya obtenidas las esferas, tanto de alginato de

sodio con la enzima, como las de alginato de sodiosolas, se procede a pesar 20 esferas de cadamezcla, y así calcular el peso promedio de cadaesfera.

Ensayo enzimático para la enzima libre

En un tubo de ensayo con 700 µL delamortiguador de acetatos, se le agregan 200 µL delsustrato (Xilano 1%) y 100 µL de la enzima, seincubó a 50°C durante 10 minutos, pasado eltiempo de incubación se tomaron 500 µL de lamezcla de enzima-sustrato y se trasvasaron a untubo Eppendorf y a este se le agregaron 500 µL delreactivo de DNS, se volvió a incubar durante 10minutos 100°C, el ensayo se hizo por triplicado.Por último, se midió la absorbancia a 570 nm. Secalculó concentración de xilosa con la curva decalibración para DNS y la absorbancia obtenida(figura 1).

Ensayo enzimático para la enzima inmovilizada

En un tubo de ensayo con 700 µL delamortiguador de acetatos, se le agregó 200 µL delsustrato (Xilano 1%) y 0.5 g de la enzimainmovilizada, se incubó a 50°C durante 10minutos pasado el tiempo de incubación se

tomaron 500 µL de la mezcla de enzima-sustrato yse trasvasaron a un tubo Eppendorf y a este se leagregaron 500 µL del reactivo de DNS se volvió aincubar durante 10 minutos, pero a 100°C, se hizo

por triplicado la cuantificación de azucaresreductores. Por último, se midió la absorbancia a570 nm.

Ensayo enzimático para la enzima residual

En un tubo de ensayo con 700 µL delamortiguador de acetatos, se le agregan 200 µL delsustrato (Xilano 1%) y 100 µL de la enzima queestá mezclado con el alginato de sodio y el CaCl 2 y que no se esterifico, se incubó a 50°C durante 10minutos, pasado el tiempo de incubación setomaron 500 µL de la mezcla de enzima-sustrato yse trasvasaron a un tubo Eppendorf y a este se leagregaron 500 µL del reactivo de DNS, se volvió aincubar durante 10 minutos 100°C, , se hizo portriplicado la cuantificación de azucaresreductores.. Por último, se midió la absorbancia a570 nm. Se calculó la actividad con la curva decalibración para DNS (Figura 1). Y se utilizaron

las formulas del anexo para calcular los porcentajes de actividad recuperada, rendimiento yeficiencia

Concentración de la enzima

En una microplaca se agregó en un pocillo 100µL de la enzima libre con 100 µL del reactivo deBradford. Se midió 595 nm. Este proceso serepitió para medir la concentración de la enzimainmovilizada y para el residual, pero para estos setomaron 0.1 g con 100 µL del reactivo deBradford. Se utilizó la curva de calibración paraBradford (Figura 2) para calcular la concentraciónen mg/mL.

Determinación de efectividad de lainmovilización de la enzima




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La efectividad de la inmovilización se determinó através de tres parámetros:

Porcentaje de actividad recuperada (%AR)

%A R = [(Activad observada de la enzima libre) /(activad observada de la enzimainmovilizada)]*100

Porcentaje de rendimiento (%R)

%R= [(actividad observada de la enzima libre -actividad de los residuos)/ (actividad observada dela enzima libre)]*100

Eficiencia (E)

E= [(activad observada de la enzima inmovilizada)/ (actividad observada de la enzima libre -actividad de los residuos)]

RESULTADOS

Con la concentración en mM del Xilano y laabsorbancia promedio de la tabla 1 se obtuvo lacurva de calibración para DNS (Figura 1). Parahacer la curva de calibración para Bradford (figura2) se utilizó la concentración en mg/mL de la

enzima y la absorbancia que están en la tabla 2.

Tabla 1. Absorbancias obtenidas para la curva decalibración de DNS Concentración Mm deXilosa

Absorbancia 1

Absorbancia 2

Absorbancia Promedio

2 0.301 0.303 0.302

4 0.627 0.672 0.6495

6 1.055 1.064 1.0595

8 1.341 1.275 1.308

10 1.571 1.543 1.557

La curva de calibración para azucares reductores por el método de DNS tiene una correlación linealde 0.9885 y para la curva de calibración deBradford esta correlación lineal es de 0.9373.

Tabla 2. Absorbancias obtenidas para la curva dcalibración de BradfordConcentración[mg/ml] deproteína

ABS1 ABS2 ABSpromedio

0.125 0.15 0.143 0.14650.25 0.212 0.25 0.2310.375 0.288 0.276 0.2820.5 0.291 0.32 0.3055

10987654321

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

S 0.0624315R-Sq 98.8%R-Sq(adj) 98.5%

Concentración mM de Xilosa

A b s o r b a n c

i a

Curva de ca libración para azúcares reductores por DNSAbsorbancia = 0.02465 + 0.1584 [mM]

Figura 1. Curva de calibración del DNS con Xilano.Eje de las ordenas es la absorbancia y eje de lasabscisas es la concentración del azúcar reductor.

0.50.40.30.20.1

0.325

0.300

0.275

0.250

0.225

0.200

0.175

0.150

S 0.0215876R-Sq 93.7%R-Sq(adj) 90.6%

Concentracion en mg/mL de proteina

A b s o r b a n c

i a

Curva de calibración para proteínas por el metódo de Bradford.Absorbancia = 0.1093 + 0.4224 [mg/mL]

Figura 2. Curva de calibración de Bradford con enzima xilanasa. Eje de las ordenadas es la absorbancy eje de las abscisas es la concentración de la enzima.




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Con la absorbancia promedio se calculó laactividad observada utilizando la curva decalibración para DNS (Figura 1) en la enzimalibre, inmovilizada y la residual, estos datos se

encuentran la tabla 3.Tabla 3. Absorbancias y concentración de xilosa yactividad enzimática. Muestra AB

S1ABS2

ABS3

ABSp

[mM] deXilosa

Libre 0.182

0.186

0.167

0.178

0.971

Inmovilizadac/enzima

0.143

0.046

0.126

0.105

0.508

Residuos noinmovilizados

0.126

0.126

0.126

0.126

0.640

Para obtener la concentración de la enzima libre,

inmovilizada y el residual se utilizó la curva decalibración para Bradford (figura 2). De acuerdo alo resultados (ver tabla 5), la inmovilización haceque la enzima se concentre 11 veces comparadacon la enzima libre, por lo que concuerda con elaumento de la eficiencia en la enzimainmovilizada .

Tabla 4. Cuantificación de la concentración de proteínapor medio de Bradford.Muestra Absorbancia Concentración

(mg/ml)EnzimaLibre

0.162 0.124

Residual 0.192 0.195Enzima inmovilizada 1.02 2.156

Como se observa en la tabla 5 las esferas delalginato de calcio sin la enzima pesa el doble quecon enzima.

Tabla 5. Pesos de las esferas de la enzima inmovilizada yel alginato sin enzima.

Sin enzima Con enzima

Cantidad de perlas 25 50Peso (g) 0.5 0.5

En la tabla 6 se expresa la actividad que es lacantidad de sustrato expresada en nkat que es lacantidad de nanomoles de producto por segundoque se obtiene y la actividad especifica que es la

cantidad de micromoles de producto que seobtiene por minuto por cada miligramo de enzimaque se tiene en el medio.

Tabla 6. Actividad enzimática de XilanasaActividad (nkat) Actividad

especifica

Unidades nmol/s µmol/(min*mg)

Libre 1.617 0.782

E. Inmovilizada 0.846 0.023

Residuos 1.067 0.388

Con la activad observada se calcularon los porcentajes de actividad recuperada que fue del52.3%, que es la relación entre la actividadobservada de la enzima libre y la enzimainmovilizada, se tiene un 34% de rendimiento conla inmovilización, con una eficiencia del 153.6%comparando la enzima inmovilizada y la enzimalibre (Tabla 7).

Tabla 7. Propiedades de la inmovilización.%Actividad recuperada 52.298 %

% Rendimiento 34.042 %

%Eficiencia 153.631 %

DISCUSIÓN

El alginato de sodio es un polisacárido aniónico, esdecir que contiene iones con carga eléctricanegativa [4]. Su estructura (C6H7NaO6)n se

muestra en la figura 3, donde se observa la presencia de los iones de sodio.




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Figura 3. Estructura del alginato de sodio, donde seobserva la presencia de sodio (Na).

Cuando el alginato de sodio mezclado con la

enzima, xilanasa, entra en contacto con el clorurode calcio, los iones de sodio en el alginato de sodioson sustituidos por los iones de Calcio (2+),formando así enlaces diferentes en el alginato. Elcalcio es capaz de formar dos enlaces, mientrasque el sodio solo puede formar uno. Este procesose observa en la figura 4.

Debido a esta interacción, la rigidez del geldependerá del tiempo que estén en contacto así

como la concentración del cloruro de calcio, queen este caso fue de 0.4M, es decir de la cantidadde iones de calcio disponibles en el medio [5].

Como se muestra en la tabla 4, se observa unrendimiento del 34.04% de inmovilización y una

porcentaje de eficacia de 153.6%, lo que significaque no se realizó una efectiva inmovilización perola enzima que se logró inmovilizar tiene una altaactividad, que se demuestra en el porcentaje de

eficiencia, aunque ésta solo represente el 52.2% dela actividad de la enzima libre, es decir el

parámetro que representa la actividad recuperada[6].

CONCLUSIONES

Se logró el objetivo de la práctica al obtener lostres parámetros; rendimiento, eficacia y actividadrecuperada, que determinan la efectividad de lainmovilización de xilanasa realizada. A pesar deque no se logró una inmovilización muy eficaz, laenzima que sí se inmovilizó presentó un alto gradode actividad reflejado en la eficiencia del 153%.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a la Academia de Biotecnología por brindar el espacio y las instalaciones necesarias

para llevar a cabo este trabajo. Tambiénagradecemos al Dr. Aldo Amaro Reyes el apoyo

brindado al proporcionar equipo, material yreactivo, indispensable para la obtención de losresultados aquí presentados. Agradecemos a losmiembros de la sesión por la compra del alginatode sodio así como de las jeringas utilizadas.

BIBLIOGRAFIA

[1] Arroyo M. Inmovilización de enzimas.Fundamentos, métodos y aplicaciones. Madrid.Departamento de bioquímica y biología molecularI Facultad de Ciencias Biológicas, (1998).

[2] Lupo-Pasin B., Gonzales Azon C., MaestroGarriga A. Microencapsulación con alginato en

Figura 4. Proceso de formación delas esferas alentrar en contacto el alginato de sodio con elcloruro de calcio.




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alimentos. Técnicas y aplicaciones. Revista VCyTA2012 ; 1: 130-151

[3] Olav-Smidsrod & Skjak-Braek G., Alginate asinmobilization matrix for cells. Revista TIBTECH1990; 8:71-74

[4] Garibay M., Quintero R., López-Munguía A.Biotecnología alimentaria. Editorial Limusa. 1963.

[5] Waldman, AS, Schechinger, L, Govindarajoo,G, Nowick, JS, Pignolet. The alginatedemonstration: polymers, food science, and ionexchange. Journal of Chemical Education. 1998.

[6] Sheeldon R. Van Pelt S. Enzymeimmobilisation in biocatalysis: why, what andhow. Chem Soc Rev. RSC Publishing. 2013.

ANEXOS

Preparación de las soluciones

100 mL de Alginato de calcio (40 g/L) enAmortiguador de acetatos 0.1M pH 5

Se pesaron 4 g de alginato de calcio y se aforarona 100mL con el amortiguador de acetatos

200 mL de cloruro CaCl 2 (0.4M)

11.7584 g de cloruro de calcio di hidratado semezclan y aforar a 200mL con agua destilada

200 mL Amortiguador de acetatos 0.1 Men cloruro de sodio 0.5 M

Mezclar 1.7548g de acetato de sodio, 0.40 mL deácido acético concentrado y 5.8440g de cloruro desodio y aforar a 200 mL

200 ml del reactivo de DNS

En un matraz de 200 mL se mezclan 0.2g de ácido3,5-dinitrosalicilico, 60g de tartrato de sodio y

potasio y 40 mL de NaOH 4M (5.2g de NaOH

disueltos en 40 mL de agua destilada) y sedisuelven en 200 mL de agua destilada.

Formulas Ecuación de la curva de DNS

Absorbancia = 0.1584[mM]+ 0.0246

Ecuación de la curva de Bradford

Absorbancia = 0.4224+ 0.1093

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