8/16/2019 Resultados practica3

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I. INTRODUCCIÓN

Dentro de la Medicina y demás ciencias biomédicas, una célula es

considerada como un sistema biológico que permite al investigador hacer

estudios sobre respuesta de una célula frente a un determinado compuesto,

también es utilizado para poder expresar genes foráneos, es decir utilizarlos

como verdaderas fabricas biológicas en benecio del hombre

!na de las células de mam"feros más utilizadas como sistema biológico para

hacer investigación en el campo de la #nmunolog"a, son los macrófagos

$os macrófagos son glóbulos blancos de la sangre que son especializados en

la digestión de part"culas y son distribuidos indistintamente en la sangre y

te%idos y participan en la defensa, tanto en la respuesta inmune adaptativa,

como en la respuesta inmune innata, a través de la ingestión de patógenos,estas células también participan en el importante rol de limpieza de células

da&adas o muertas

II. OBJETIVOS.

- 'btener macrófagos activados a través de la infección de ratas con lisadode bacterias

- (xtraer, )islar y *ultivar macrófagos- *uanticar la producción de 'xido +itrico +'-

III. MATERIALES Y REACTIVOS.

- .atas adultas- *ultivo de bacterias (coli-- /eringas hipodérmicas- 0ipetas pasteur- 0ipetas de 1,2 y 3 ml- +a*# 45 6 y +a*# 17 6- 8ulfanilamida- +aftilendiamina- Medio de *ultivo .0M# 19:4

IV. PROCEDIMIENTO

A) Preparación de i!ad" de #ac$eria!%

1 *on la ayuda de una asa de colé cosechar las bacterias crecidas en una

placa de agar nutritivo y resuspenderlas en un tubo de ensayo que

contiene 1ml de +a*# al 4562 *alentar la suspensión de células bacterianas hasta ebullición, durante

tres veces, agitando cuidadosamente el tubo para evitar que el

contenido se proyecte

PRACTICA &EL MACRÓ'A(O COMO SISTEMA INMUNOLÓ(ICO% EVALUACION

DE LA PRODUCCION DE OIDO NITRICO

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B) In*ección de ra$a! c"n i!ad" de #ac$eria!.1 0roceder a inyectar intraperitonialmente los ratones con 14 ml de lisado

bacteriano, utilizando una agu%a hipodérmica apropiada2 )l retirar la agu%a, de la piel de la rata, hacerle masa%es suaves en el

vientre durante unos veinte segundos

3. De%ar en incubación al ratón durante tres a cuatro d"as, cuidando que nole falte la alimentación

C) E+$racción , ai!a-ien$" de -acró*a"!.1 ;ranscurrido los d"as de incubación, en donde los macrófagos migraran

desde la sangre hacia el l"quido citico en donde se encuentra restos de

lisado bacteriano, inyectar 2 ml de +a*# al 45 6 o 0<8, por v"a

intraperitonial2 =acer masa%es en el vientre del ratón durante 1 min> )brir el abdomen del ratón como indica el esquema y con ayuda de una

pipeta, retirar cuidadosamente todo el l"quido c"trico y colocarlo en un

tubo de ensayo: 0ara concentrar los macrófagos, centrifugar la suspensión celular a 2444

rpm, durante cuatro minutos3 .etirar el sobrenadante y resuspender el pellet con 1ml de +a*# a 45 69 .ealizar el recuento celular con ob%etivos de mediano aumento

+ota? 8i la suspensión celular se encuentra contaminada con glóbulos

ro%os, lo que se maniesta con la presencia de una coloración ro%iza,

se recomienda eliminarlos mediante un choque osmótico?

resuspender el pellet en 2ml de agua destilada, y mezclar durante

veinte segundos e inmediatamente a&adir 2ml de +a*# a 17 6 y

proceder con el lavado normal

D) C/$i0" de -acró*a"!(n una placa de cultivo celular de 2: pozos que contiene 4,3 ml de medio

de cultivo para macrófagos medio .0M# 19:4- sembrar 1x149 células e

incubar a >@A* en un atmosfera de '2 y 36 *'2 durante >4 a :4 minutos

E) C/an$i1cación de O+id" N2$ric" 3NO)1 ;erminado el tiempo d cultivo transferir los macrófagos de la placa de

cultivo a un tubo eppendorf 

2 *entrifugar la suspensión celular a 2444 rpm, durante cuatro minutos> ;ransferir 344ul del sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf : )gregar 344ul del reactivo de Brees3 #ncubar en oscuridad durante 14 min9 $eer en el espectrofotómetro a 334nm@ Multiplicar la )bsorbancia de la muestra por el factor de calibración

obtenido a partir de una curva de calibración con nitrito de sodio

V. RESULTADOS

1 (squematizar el proceso de obtención de los macrófagos murinos2 Determinar el nCmero de células por ml de suspensión

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> olumen de suspensión que contiene 1444 444 de células: .eportar el porcenta%e de viabilidad celular

4% E!5/e-a$i6ar%

1)brir el abdomen del ratón como indica el esquema y con ayuda de

una pipeta, retirar cuidadosamente todo el l"quido c"trico y colocarlo en

un tubo de ensayo

 

2E0ara concentrar los macrófagos, centrifugar la suspensión celular a 2444rpm, durante cuatro minutos

 

>E.etirar el sobrenadante y resuspender el pellet con 1ml de +a*# a 45 6

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 :E.ealizar el recuento celular con ob%etivos de mediano aumento

 

Re!/$ad"!%

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• (l conteo de macrófagos fue?

11@3x2x144F 2>344 células por 144 mililitros de suspensión  =ay 2>3 células por mililitro de suspensión

•

8i

hay 2>3 por mililitro de suspensión en 1444444 células el volumenseria?

  :233,>2ml

VI. CUESTIONARIO.

1. ¿Qué es un sistema biológico?Es un conjunto de órganos y estructuras similares que trabajan en conjunto para cumplir 

alguna función fisiológica en un ser vivo relacionado con la biología. El sistema inmunitario

es aquel conjunto de estructuras y procesos biológicos en el interior de un organismo que

le protege contra enfermedades identificando y matando células patógenas y cancerosas

Detecta una amplia variedad de agentes, desde virus  asta par!sitos intestinales, y

necesita distinguirlos de las propias células y tejidos sanos del organismo para funcionar 

correctamente

2. Describa una aplicación que daría al sistema macrófago para hacer 

investigación en nmunología.El sistema macrófago tiene aplicación en la aplicación de vacunas y trasplante de órganos,

también en el nuevo tratamiento de enfermedades autoinmunes como el "#$ y lupus.

3. ndique ! características de un macrófago activado "%resenta antígenos, produce citoquinas, produce sustancias to&icas como '(, $('(

'$-,)'. *ienen m!s prolongaciones de membrana, mayor n+mero de vacuolas, de

lisosomas, fagosomas y cuerpos residuales.

!. Describa la respuesta inmunológica al in#ectar $%& 'lipopolisacaridos(.os lipopolisacaridos al ser detectados por los macrófagos se unen al receptor D y

ocurre la formación de una vesícula endolitica dentro del macrófago llamada fagosoma.

). ¿*u+l es el mecanismo por el cual el macrófago produce ,-?os macrófagos activados contienen el interferon gama el cual induce y activa a la en/ima

i)'0, esta estimula la producción de )' que ataca a virus y células tumorales.

 

NO ACTIVOS ACTIVOSVIABLES 24 23>NO VIABLES 3 EETOTAL 78 78&