RESULTADOS Y DISCUSIÓN Generación del Extracto...

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Generación del Extracto Metanólico y sus Fracciones

Los especímenes de Acalypha californica fueron colectados en Septiembre del 2009 en

el cerro del Bachoco, ubicado en los alrededores de Hermosillo (29º8’51.3’’ N,

110º57’0’’O) con ayuda del Ing. Jesús Sánchez, taxónomo del herbario de la

Universidad de Sonora. El número de clasificación de Acalypha californica en dicho

herbario es el 06686.

El rendimiento del proceso de obtención del extracto metanólico fue del 13%

(193.68 g de 1.5 Kg de materia vegetal seca) debido a que la planta presentó una gran

cantidad de material insoluble en metanol, mientras que en las fracciones fue de 1.7%

para la de hexano, 4.7% para la de acetato de etilo, 45% para la de etanol y 6.74% para

la fracción residual.

Cambios Morfológicos Inducidos por el Extracto Metanólico de Acalypha

californica y sus Fracciones en la Línea Celular M12.Ak.C3.F6

En los diferentes cultivos bajo tratamiento se observaron cambios morfológicos que

sugieren que el extracto y las fracciones poseen actividad antiproliferativa. Los

mencionados cambios se presentaron con distinta magnitud dependiendo de la fracción y

de la concentración de la misma.

Se realizó un análisis microscópico de los cultivos a las 24 horas de aplicación

del extracto y sus fracciones, resultando que los cultivos control (con DMSO y sin

tratamiento) no mostraron evidencias de cambios morfológicos o de daño celular, ya que

en condiciones normales las células de esta línea se adhieren a la superficie plástica de la

placa de cultivo, presentado una morfología alargada similar a la de los fibroblastos,

condiciones similares a las que se presentaron en el experimento.

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En el caso de las poblaciones celulares que recibieron tratamiento con el extracto

metanólico de Acalypha californica y la fracción residual presentaron cambios

significativos tanto en el número de células viables como en la morfología de las

mismas, comparando con los controles, ya que las células perdían su capacidad de

adherencia y cambiaban de la forma habitualmente alargada a una redonda pequeña y

con la membrana deforme; también se pudo observar una gran cantidad de detrito

celular, sobre todo en la fracción residual.

Williams (2004) señala que los cambios observados, tales como el encogimiento

de las células, la deformación de la membrana celular, así como la condensación nuclear

obedecen a la activación de vías bioquímicas de la apoptosis.

Conforme se disminuyó la concentración del extracto metanólico y de la fracción

residual los cambios morfológicos también disminuyeron, los pozos que contenían los

cultivos tratados con el extracto metanólico a las concentraciones de 400 y 200 μg/mL y

con la fracción residual a las concentraciones 400, 200, 100 y 50 μg/mL seguían

mostrando una cantidad considerable de detrito celular, sin embargo la adherencia de las

células se fue recuperando conforme disminuía la concentración. En cuanto al resto de

las fracciones estos cambios se observaban a una escala menor a la de las ya

mencionadas.

Lo anterior evidencia que existe un efecto dosis dependiente por parte del

extracto metanólico y la fracción residual, a la vez obtenemos seguridad en que los

cambios presentados por las células son propiamente causadas por interacción de los

compuestos del extracto y sus fracciones con la célula y no a la cantidad aplicada del

mismo, ya que, con excepción de los cultivos tratados con la fracción residual, el resto

de las células se encontraban levemente dañadas. Las concentraciones con las cuales se

trabajó en este experimento han sido ampliamente utilizadas en la búsqueda de

compuestos con actividad antiproliferativa derivados de plantas, con los que se brinda un

sustento al diseño experimental (Abbu y col., 2007; Dermitas y col., 2009).

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Reducción del MTT por Compuestos Presentes en el Extracto Metanólico de

Acalypha californica

Una vez que se realizó el análisis microscópico de los cultivos del experimento se

procedió a evaluar la actividad antiproliferativa por medio del método de reducción del

MTT. Este es un ensayo para cuantificar la viabilidad y la proliferación celular y debido

a que es una técnica no radiactiva y económica, es el ensayo más utilizado en la

detección de compuestos con actividad antiproliferativa. Sin embargo, existen

substancias con potencial reductivo intrínseco que pueden generar malas

interpretaciones de los resultados (Bruggisser y col., 2002).

Como se señaló en la sección de materiales y métodos, la actividad

antiproliferativa del extracto metanólico y sus fracciones químicas en las líneas celulares

L-929, HeLa y RAW 264.7 fueron evaluadas por medio del método de reducción del

MTT, mientras que para el caso de la línea celular M12.Ak.C3.F6 se utilizó citometría

de flujo.

En un estudio anterior (Rascón, 2009), y en el presente, se observó que el

extracto metanólico de Acalypha californica tenía la capacidad de reducir la sal MTT.

Por medio de observaciones morfológicas y cuentas celulares con tinciones supravitales,

nos percatamos de que en los cultivos tratados con el extracto el número de células

disminuía, pero la formación de formazan incrementaba, sugiriendo una interacción

directa de algún componente del extracto con la sal de MTT que causaba la reducción de

esta última. Midiendo la absorbancia, el potencial reductivo fue observado en sistemas

libres de células, lo que confirmó la intervención del extracto en la formación del

formazan.

En la literatura, se ha reportado que agentes antioxidantes tales como los

flavonoides pueden interferir directamente con el ensayo del MTT. Las propiedades de

reducción de la sal por los flavonoides pueden ser debidas a la hidroxilación en la

posición 3, ya que se ha observado que la flavona kaempferol muestra interacción

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directa con la sal de MTT, mientras que la isoflavona genisteina no lo hace. Esta última

está substituida en el anillo B en la posición 3 (Natarajan y col., 2000).

Un estudio publicado por Plumb y colaboradores (1999), acerca de las

propiedades antioxidantes del kaempferol y la quercitina en forma de glicósidos y no

glicósidos, mostró que los glicósidos fueron menos activos que la forma no glicosilada

que posee su grupo hidroxilo libre en la posición 3. Con lo que explican la leve

interferencia del extracto de Ginkgo biloba con el ensayo del MTT. Los flavonoides de

Ginkgo biloba son principalmente glicósidos de quercitina, kaempferol e isorhamnetina,

los cuales en su forma no glicosilada reducen fuertemente el MTT tetrazolio

convirtiéndolo en formazan. Así, pues, aunque no existen estudios referentes al potencial

antioxidante de Acalypha californica, podemos argumentar que posiblemente ésta

contenga flavonoides en forma no glicosilada capaces de interferir con el ensayo.

Por la razón anterior, el ensayo de reducción del MTT no pudo implementarse

para medir el potencial antiproliferativo del extracto en la línea celular M12.Ak.C3.F6;

sin embargo, para el caso de las mediciones de la actividad en las líneas celulares

adherentes L-929, RAW 264.7 y HeLa, pudieron realizarse modificaciones a la técnica

(retirar el extracto y hacer lavados con PBS antes de la aplicación del MTT) los cuales

permitieron suprimir el efecto reductor de los componentes del extracto. En la línea

celular M12.Ak.C3.F6 estas modificaciones no podrían realizarse, pues es una línea

celular que no se adhiere fuertemente al fondo de los pozos de la placa y con simple

agitación mecánica las células serían resuspendidas. Así, la actividad antiproliferativa en

líneas celulares adherentes pudo ser evaluada por el método de reducción del MTT,

mientras que en la línea que no se adhiere fuertemente se tuvo que buscar otra estrategia.

Debido a que la mayoría de los métodos para medir la proliferación celular tienen

como base la reducción de algún compuesto (azul de alamar, resazurina) se optó por

utilizar la citometría de flujo. Cuando una célula entra en apoptosis suceden una serie de

cambios en su fenotipo, entre ellos se encuentra el encogimiento celular y un incremento

temporal en la granularidad. Estos cambios permiten la distinción entre las células

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viables y las apoptóticas con base a las propiedades de dispersión de la luz, lo cual puede

ser medido por el citómetro.

Con el objetivo de comparar los resultados entre el método de reducción del

MTT y el de citometría de flujo se realizaron ensayos de viabilidad utilizando la línea

celular no cancerosa L-929. En la tabla I, se puede observar como en ambos métodos se

obtuvieron resultados muy parecidos, por lo cual se procedió a utilizar esta metodología

para evaluar la actividad antiproliferativa del extracto metanólico y sus fracciones en la

línea celular M12.Ak.C3.F6.

Evaluación de la Actividad Antiproliferativa del Extracto Metanólico de Acalypha

californica y sus Fracciones en la Línea Celular M12.Ak.C3.F6 por Citometría de

Flujo

Para medir la actividad antiproliferativa del extracto metanólico y de sus fracciones en la

línea M12.Ak.C3.F6 se realizaron ensayos de citometría de flujo. El parámetro evaluado

fue el porcentaje de viabilidad celular, el cual se estableció con base a las variables de

tamaño y complejidad de las células, las cuales fueron analizadas mediante gráficos de

puntos.

Coincidiendo con los resultados de la observación microscópica, fueron el

extracto metanólico y la fracción residual quienes mostraron actividad antiproliferativa.

En la tabla II se puede observar que el extracto metanólico presentó un valor de IC50 de

247.22 μg/mL, mientras que la fracción residual disminuyó aún más su IC50 a 59.90

μg/mL, posiblemente debido a la concentración de los compuestos con actividad. En el

resto de las fracciones no se pudo evaluar el valor de IC50, debido a que a la

concentración más alta existía un porcentaje mayor al 50% de células viables. El

comportamiento del extracto metanólico y sus fracciones fue que a mayor concentración

mayor actividad antiproliferativa, evidenciando un efecto dosis dependiente.

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Tabla I. Comparación de resultados de la determinación de la actividad

antiproliferativa del extracto metanólico de Acalypha californica en la línea L-929,

entre el método de reducción de MTT y el de citometría de flujo.

Concentración

del extracto

% de células viables por

reducción del MTT

% de células viables por

citometría de flujo

25 87.00 83.10

50 66.28 68.00

100 55.09 54.95

200 42.94 41.02

400 25.12 22.63

800 7.31 10.94

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Evaluación de la Actividad Antiproliferativa del Extracto Metanólico de Acalypha

californica y sus Fracciones en la Líneas Celulares L-929, RAW 264.7 y HeLa

Mediante el Ensayo de Reducción del MTT

Una vez que se evaluó el potencial antiproliferativo del extracto metanólico de Acalypha

californica y sus fracciones químicas en la línea celular M12.Ak.C3.F6 , se procedió a

determinar si en otras líneas celulares cancerosas (RAW 264.7 y HeLa) poseían el

mismo efecto; así también se evaluó la citotoxicidad de los mencionados en una línea

celular no cancerosa, L-929, con la finalidad de valorar una posible selectividad de los

compuestos presentes en las fracciones hacia las células cancerosas.

Se evaluó el crecimiento de las células RAW 264.7, que fueron tratadas con dosis

desde 12.5-400 µg/mL del extracto y sus fracciones; así como de los cultivos control que

contenían DMSO. Como se observa en la tabla II el extracto metanólico tuvo un efecto

antiproliferativo superior en esta línea que en la M12.Ak.C3.F6, con un IC50 de 100.50

µg/mL; la fracción con mayor actividad fue la de hexano con un IC50 de 52.08 µg/mL,

seguida en efecto por la fracción de acetato de etilo (IC50 57.54 µg/mL) y la residual

(IC50 58.93 µg/mL); por su parte la fracción etanólica presentó un IC50 muy cercano al

del extracto sin fraccionar.

Al igual que en la línea RAW 264.7, el extracto metanólico y la fracción de

etanol presentaron un valor de IC50 más altos (151.35 y 116.95 µg/mL, respectivamente)

en la línea celular de cáncer cérvico uterino, HeLa; las fracciones con mayor actividad

fueron la residual (IC50 50.11 µg/mL) y la de hexano (IC50 46.77 µg/mL), seguida por la

de acetato de etilo con un IC50 57.41 µg/mL (tabla II).

En la línea celular no cancerosa L-929, de tejido conectivo de ratón, la tendencia

del extracto metanólico fue similar a las líneas anteriores; la fracción hexánica no fue

selectiva ya que presentó un IC50 de 46.03 µg/mL , el cual es, muy cercano e incluso

menor al que se presenta en las líneas cancerosas; la fracción de acetato de etilo también

afecta igualmente a la línea no cancerosa y a las cancerosas; en tanto las fracciones de

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Tabla II. Actividad antiproliferativa del extracto metanólico de Acalypha

californica y sus fracciones de solventes en diversas líneas celulares.

Extracto o

Fracción

IC50 ± desviación estándar (µg/mL)

M12.Ak.C3.F6 RAW 264.7 HeLa L-929

Extracto

metanólico

247.22 ± 1.16 100.50 ± 1.16 151.35 ± 1.86 130.26 ± 1.091

Fracción de

hexano

-o- 52.08 ± 1.06 46.77 ± 1.09 46.03 ± 1.15

Fracción de

Acetato de etilo

-o- 57.54 ± 1.057 57.41 ± 1.14 59.98 ± 1.07

Fracción de etanol

-o- 103.51 ± 1.41 116.95 ± 1.05 139.86 ± 1.10

Fracción residual 59.90± 1.05 58.93 ± 1.26 50.11 ± 1.135 100.00 ± 1.09

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etanol y residual mostraron cierta selectividad, debido a que sus valores de IC50 (139.86

µg/mL y 100 µg/mL respectivamente) fueron mayores en esta línea que los de las

células cancerosas. Esta propiedad, en las terapias contra el cáncer es muy requerida, ya

que permite atacar a las células con cáncer, dañando en menor grado a las células sanas.

Las diferencias en la susceptibilidad de estas líneas celulares a las distintas

fracciones del extracto radica en la naturaleza de las mismas; en el estudio se incluyeron

líneas de diferentes especies (humano y ratón), orígenes y propiedades (sensibilidad a

hormonas, tasa de crecimiento, tumorigenicidad), los cuales las convierten en más o

menos propensas a la acción de ciertos compuestos; así bien, una sustancia puede

presentar gran efecto en una línea y en otra ser totalmente inactiva.

Observamos que el valor de IC50 disminuyó en el caso de las fracciones activas

con respecto al extracto metanólico, esto podría ser debido a que mediante los lavados

con solventes de distinta polaridad los metabolitos secundarios, los cuales son

responsables de la actividad biológica, se concentraron, según su naturaleza, y por tanto

poseen un mayor efecto, pues se encuentran sin tantos compuestos que interfieran.

A causa de los efectos secundarios de las drogas y a la resistencia que algunos

tipos de cáncer presentan hacia ellas, se requieren nuevos agentes que posean

selectividad contra las células malignas. La fracción residual del extracto metanólico de

Acalypha californica mostró actividad diferencial, siendo más efectiva en las líneas

celulares cancerosas que en la que no lo es, razón por la cual se eligió para fraccionarla

por cromatografía en columna.

Separación de los Componentes de las Fracciones con Actividad por

Cromatografía de Adsorción

La fracción residual del extracto metanólico de Acalypha californica generó 198

fracciones, de las cuales se generaron 61 grupos de fracciones de acuerdo al perfil

mostrado en la cromatografía en capa fina después de la observación en el UV y el

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revelado con sulfato cérico. El fraccionamiento tuvo un rendimiento del 72.4%. En la

tabla III se muestran los agrupamientos de las fracciones así como sus condiciones en las

que fueron eluidas.

Actividad Antiproliferativa de las Fracciones Derivadas de la Cromatografía de

Adsorción de la Fracción Residual

Con el objetivo de rastrear los grupos de compuestos responsables de la actividad

antiproliferativa en la fracción residual, se midió la proliferación de cultivos de la línea

M12.Ak.C3.F6 previamente tratados por 48 horas con cada uno de los 61 grupos de

fracciones cromatográficas; esto a una única dosis de 100 µg/mL; posteriormente, los

diez grupos que exhibieron mayor actividad antiproliferativa fueron probados a una

concentración de 200 µg/mL.

Ninguno de los 61 grupos de compuestos obtenidos del fraccionamiento por

cromatografía de adsorción presentó una actividad antiproliferativa superior a la fracción

residual, que fue la que le dio origen. El grupo con mayor actividad fue el perteneciente

a F122-F141, con un porcentaje de inhibición del 36.31% a la concentración de 100

µg/mL, mientras que bajo estas condiciones la fracción residual exhibió un porcentaje de

inhibición aproximado al 63%, razón por la que no se descartan efectos de sinergia entre

los compuestos que constituyen la fracción residual (tabla IV).

El concepto de que medicinas derivadas de plantas dependen, únicamente, de los

principios activos ha sido modificado; en muchos casos, substancias adyuvantes

presentes en la planta mejoran la actividad de los compuestos responsables del efecto.

Esta sinergia puede involucrar protección de una substancia activa de la

degradación por enzimas, facilitar el transporte a través de barreras tales como las

membranas de las células u organelos, superar los mecanismos de resistencia a múltiples

medicamentos o proporcionar otras señales a las células que se traducen en una mayor

eficacia de la droga cruda, en comparación con los componentes aislados (Gilbert y col.,

2003).

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Tabla III. Separación de la fracción residual por cromatografía.

Fracciones ( Peso en mg) Fase móvil

(Columna)

Fase móvil

(TLC)

Solvente,

recuperación

F1(4.9), F2-F3(5.1),F4-F7(4.3), F8(0.5), F9-

F18(11.1)

Acetato de etilo 5 hexano/5

acetato de etilo

Diclorometano

F19(1.5), F20(0.3),F21-F25(27.6) 95 acetato de

etilo/5 metanol

3 metanol/7

acetato de etilo

Metanol

F26(9), F27(3.5),F28(10.7) 90 metanol/10

acetato de etilo

3 metanol/7

acetato de etilo

Metanol

F29(95),F30(80.1),F31-F32(56.3),F33(7.9)

,F34(1), F35(8.1)

50 acetato de

etilo/ 50

metanol

3 metanol/7

acetato de etilo

Metanol

F36-F37(19.5), F38-F44(26.1), F45-

F48(12), F49-F54(21.5)

50 acetato de

etilo/ 50

metanol

5 metanol/5

acetato de etilo

Metanol

F55-F62(10.5), F63(12),F64-F69(15.5),

F70(16.8),F71(1.6),F72(24.9), F73(8.1),

F74-F75(9.8), F76-F78(5.6)

50 acetato de

etilo/ 50

metanol

6 metanol/4

acetato de etilo

Metanol

F79(6.5), F80(6.7), F81(12.9), F82-

F86(3.8),F87(1.3), F88(4.1), F89-F91(1)

25 acetato de

etilo/ 75

metanol

6 metanol/4

acetato de etilo

Metanol

F92-F95(82.1), F96(8.7), F97-F99(35.1),

F100-F101(5.1), F102-F103(14.1), F104-

F106(3.5), F107-F109(5.4), F110(1.5),

F111-F121(38.3)

Metanol 7 metanol/3

acetato de etilo

Agua

F122-F141(35.8), (F142-F146-F148-

F150)(21.1) F147(11.1), F151-F159(8.1),

F160-F161(1.4), F162-F166(16.5)

Metanol Metanol Agua

F167-F176(93.5) 10 agua/90

metanol

Metanol Agua

F192(105.4), F193(58.6), F194(35.1),

F195(12.8), F196(25.6), F197(16.2),

F198(3.7)

50 agua/ 50

metanol

Metanol Agua

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Tabla IV. Grupos de compuestos obtenidos de la separación en columna de la

fracción residual que presentaron mayor actividad antiproliferativa en la línea

celular M12.Ak.C3.F6.

Grupo de fracciones % de inhibición

(100µg/mL)

% de inhibición

(200µg/mL)

30 38.31 48.00

31-32 25.50 44.00

38-44 23.60 49.47

45-48 23.46 58.00

49-54 20.88 38.00

100-101 28.92 43.60

102-103 25.51 14.40

111-121 25.12 42.27

122-141 36.31 61.74

151-159 23.77 53.87

45

Existen algunos casos de interacciones sinérgicas entre los componentes de los

extractos de plantas. Actualmente, el ejemplo más ilustrativo de este tipo de mecanismos

lo brinda el jugo de granada, al cual se le atribuyen propiedades como antioxidante y

anticancerígeno. Se ha observado que el jugo sin fraccionar posee una mayor actividad

antiproliferativa sobre las líneas de cáncer de colon (HT29, HCT116, SW480, SW620) y

de próstata (RWPE-1, 22Rv1) que los compuestos que han sido purificados del mismo.

Por lo que no se excluye la posibilidad de que en el caso de la fracción residual del

extracto metanólico de Acalypha californica suceda una situación similar (Seeram y col.,

2005).

Estudios Fitoquímicos de las Fracciones Químicas del Extracto Metanólico de

Acalypha californica

Con la finalidad de elucidar los compuestos presentes en el extracto metanólico de

Acalypha californica, que como se ha mencionado anteriormente posee actividad

antiproliferativa, se realizaron una serie de estudios químicos encaminados a cumplir

este objetivo. En todos los experimentos se trabajó con las fracciones generadas por los

lavados con hexano, acetato de etilo y etanol del extracto metanólico, así como con la

fracción residual, nos referiremos a ellas como las fracciones químicas para evitar

confusiones con las fracciones generadas por procesos cromatográficos.

Prospección Preliminar de las Fracciones Químicas

La investigación fitoquímica persigue elucidar los constituyentes químicos de las

especies vegetales con las cuales se esté trabajando o bien evaluar la presencia de los

mismos. Cuando no se dispone de estudios químicos anteriores de las especies que

direccionen el trabajo a desarrollar, como es el caso de Acalypha californica, un análisis

de prospección preliminar es muy importante.

Así, con la finalidad de identificar los grupos de metabolitos secundarios

relevantes presentes en las fracciones químicas del extracto metanólico de Acalypha

46

californica se realizaron ensayos de cromatografía en capa fina usando como

reveladores agentes específicos para alcaloides (reactivo de Dragendorff), para

triterpenos/esteroides (reactivo de Lieberman Burchard) y para taninos (solución de

cloruro férrico).

La primera parte de los ensayos se realizaron para encontrar los sistemas de

solventes que ofrecieran una mejor resolución en las placas cromatográficas,

evaluándose por manchas definidas y la menor cantidad posible de muestra retenida en

el punto de aplicación. Después de varias pruebas, se concluyó que el mejor sistema para

el desarrollo de las muestras de la fracciones de hexano y acetato de etilo fue una mezcla

de cloroformo/metanol 98:2 v/v (figura 5A). En tanto, en las fracciones de etanol y

residual no se obtuvo buena resolución, inclusive con sistemas tan polares como alcohol

butílico/ácido acético/agua 4:1:5 v/v (figura 5B).

Por lo anterior, las fracciones de etanol y residual fueron sujetas a un

procedimiento de limpieza en un cartucho de sílica C-18, para esto 20 mg de las

muestras fueron diluidos en la fase agua/metanol 8:2, con auxilio del sonicador. Las

muestras fueron aplicadas en los cartuchos y se eluyeron con agua/metanol 8:2, 1:1 y

metanol. Cada elución fue colectado como una fracción separada y monitorizado por

cromatografía en capa fina como una fracción diferente. El revelado fue hecho con

anisaldehído sulfúrico.

Como se observa en la figura 9C, la fracción de etanol obtuvo una mayor

resolución al eluirse con el sistema 6 metanol: 4 acetato de etilo, en tanto que la fracción

residual mantuvo la mayor parte del material en el punto de aplicación, lo que demuestra

la alta polaridad de los compuestos presentes en ella y mismo que se evidenció por la

gran cantidad de material retenido en el cartucho de SPE (figura 5D).

47

Figura 5. Elución de las fracciones químicas del extracto metanólico de Acalypha

californica. A. Elución cloroformo/metanol 98:2 v/v. B. Elución alcohol

butílico/ácido acético/agua 4:1:5 v/v. Leyendas. 1. Extracto metanólico, 2.

Fracción de hexano, 3. Fracción de acetato de etilo, 4. Fracción de etanol, 5.

Fracción residual. C.Elución metanol/acetato de etilo 6:4, de las fracciones de

limpieza de la fracción de etanol. D. Elución metanol/acetato de etilo 6:4, de

las fracciones de limpieza de la fracción residual. Leyendas. 1. Fracción de

etanol o residual, 2.Fracción agua/metanol 8:2, 3. Fracción agua/metanol 1:1,

4. Fracción metanol, 5. Fracción cloroformo.

48

Una vez definidos los sistemas de solventes se utilizaron diferentes agentes

reveladores específicos para una clase de metabolitos secundarios. Los resultados fueron

considerados positivos por el surgimiento de una coloración naranja para alcaloides,

verde o azul para triterpenos/esteroides y azul para taninos. Las tablas V y VI resumen

los tipos de metabolitos presentes en cada fracción.

Es de notar que el perfil químico de la fracción de hexano y acetato de etilo es

similar, además el patrón de manchas de los ensayos en cromatografía en capa fina es el

mismo, razón por la cual estas dos fracciones se juntaron, el grupo se denominó fracción

hexano-acetato de etilo.

Debido a la metodología con la que se obtuvieron las fracciones químicas del

extracto metanólico (lavados de este con hexano, acetato de etilo y etanol) eran de

esperarse los resultados obtenidos. En el revelado con los distintos reactivos pudimos

percatarnos de que la fracción hexánica y de acetato de etilo poseen sustancias como

terpenos o esteroides, principalmente, sin embargo, no posee compuestos del tipo de los

alcaloides y taninos, situación que no sorprende ya que estos últimos son de polaridad

alta y por lo tanto fueron encontrados en las fracciones de etanol y residual.

Así, una técnica de prospección preliminar como la cromatografía en capa fina

permite realizar un abordaje acerca del comportamiento químico de los extractos con los

cuales se trabaja. Con base a lo anterior se trabajó en dos líneas principales para la

purificación y caracterización de compuestos, una representada por la fracción hexano-

acetato de etilo (polaridad baja) y otra por las fracciones de etanol y residual (polaridad

alta).

49

Tabla V. Análisis fitoquímico por prospección preliminar de las fracciones de

hexano y acetato de etilo del extracto metanólico de Acalypha californica.

Metabolitos Fracción de hexano Fracción de acetato

de etilo

Alcaloides x x

Esteroides/triterpenos

Taninos x x

50

Tabla VI. Análisis fitoquímico por prospección preliminar de los grupos resultados

del proceso de extracción por fase sólida de la fracción de etanol y

fracción residual de la planta Acalypha californica.

Metabolitos Fracción de etanol Fracción residual

Crudo 8agua:

2metanol

5agua:

5metanol

Metanol CHCl3 Crudo 8agua:

2metanol

5agua:

5metanol

Metanol CHCl3

Alcaloides x x x x x x x x x x

Esteroides/

triterpenos

x x x x x x x x x x

Taninos x x x

51

Identificación de Compuestos de las Fracciones Químicas Polares (Etanol y

Residual) del Extracto Metanólico de Acalypha californica

Los ensayos de prospección preliminar permitieron evidenciar la complejidad de las

fracciones químicas de etanol y residual. Los metabolitos presentes en ellas son de

naturaleza muy polar, lo que quedó reflejado mediante los ensayos de cromatografía en

capa fina, ya que una gran cantidad de material se mantenía retenido en el punto de

aplicación, aún utilizando sistemas de elución fuertemente polares. El revelado con los

agentes específicos para determinados grupos de metabolitos secundarios demostró que

taninos se encuentran presentes en ambas fracciones químicas. Contando con esta

información se procedió a iniciar la investigación fitoquímica de dichas muestras, con la

finalidad de caracterizar los compuestos presentes en ellas.

Cromatografía de exclusión molecular para la fracción de etanol. Para iniciar

el estudio cromatográfico de las fracciones químicas polares se hizo uso de la técnica de

cromatografía de permeación en gel o de exclusión molecular, utilizando sephadex LH-

20 como fase estacionaria; ésta constituye una de los procedimientos de aislamiento de

metabolitos secundarios más efectivos y más utilizados en el área de los productos

naturales (Qa’Dan y col, 2010; Shu y col, 2010; Wan y col, 2011).

Sephadex LH-20 ha sido ampliamente empleado para la cromatografía de

sustancias polares desde 1974, utilizando fases móviles como metanol y mezclas de

metanol- agua y metanol-acetona, lo que permite la elución de compuestos polares.

Razón por la cual fue elegido como método de trabajo para las fracciones en cuestión

(Lea y col.,1974; El-Alfy y col., 2011; Shu y col, 2011).

La primera de las fracciones químicas que se sometió a análisis fue la generada

con etanol. Se obtuvieron 600 fracciones, que fueron analizadas por cromatografía en

capa fina, utilizando mezclas de metanol y acetato de etilo como fase móvil, éstas fueron

reveladas con anisaldehído sulfúrico. De acuerdo al perfil presentado en las placas

cromatográficas las fracciones fueron reunidas en 31 grupos.

52

Mediante los ensayos anteriores se observó que el patrón de los grupos de

fracciones era muy complejo. Las sustancias eran altamente polares y se encontraban en

mezclas que difícilmente se separarían por métodos tradicionales. Por lo que se

consideró que posiblemente las muestras contenían taninos condensados.

Estudios realizados por Andrade (2002), acerca de la constitución química del

extracto etanólico de la corteza de Harconia speciosa mostraron que dicha especie

presenta un elevado contenido de taninos condensados, este autor empleó la técnica de

cromatografía contracorriente de alta velocidad (HSCCC), resultando en la obtención de

fracciones impuras de las cuales no se consiguieron aislar metabolitos. Situación que se

presentó en el análisis de la fracción de etanol de Acalypha californica.

Así, la complejidad de esta fracción no permitió un estudio fitoquímico más

profundo de este material con la utilización de las técnicas de uso común para el

aislamiento. La tentativa de utilizar cromatografía de permeación en gel usando

sephadex LH-20 no fue eficiente en la separación de los metabolitos de la fracción de

etanol. Se presentó una fuerte adsorción del material en la matriz, se utilizaron grandes

cantidades de solventes para la elución del material retenido y se requirió la

regeneración de la fase estacionaria. Debido a lo anterior y al hecho de que en la

fracción residual se encuentran metabolitos con naturaleza similar a la fracción de etanol

no se realizó la separación mediante esta metodología para la primera.

En la literatura, se reporta que taninos condensados difícilmente son separados

usando técnicas cromatográficas de fase normal, fase reversa o exclusión por tamaño,

estas metodologías solo permiten una buena separación de sustancias sencillas, y

comienzan a ser ineficientes para taninos condensados con un grado de polimerización

elevado. Aunado a esto, este tipo de sustancias son difícilmente aisladas, generalmente

solo se realiza una identificación de las mismas (Rodrigues, 2007; Shu y col., 2011).

Las experiencias anteriores direccionaron el estudio hacia el establecimiento de

una nueva estrategia de investigación para la identificación de los metabolitos presentes

en las fracciones químicas polares de Acalypha californica.

53

Perfil cromatográfico por HPLC-PAD de las fracciones etanólica y residual

del extracto metanólico de Acalypha californica. En un intento por realizar una

identificación directa de los metabolitos contenidos en las fracciones etanólica y residual

del extracto metanólico de Acalypha californica y con la finalidad de generar el perfil

químico de las mismas se optó por implementar metodologías basadas en el análisis por

HPLC-PAD. La identificación de los metabolitos sería realizada por la comparación de

los espectros de ultravioleta de los picos principales presentados en los cromatogramas

con aquellos de la biblioteca generada por la inyección de patrones auténticos y/o

sustancias previamente aisladas y caracterizadas.

Para iniciar los análisis de la fracción etanólica y residual fue disuelto 1 mg de

cada fracción en 1 mL de la mezcla agua- metanol 95:5 (v/v), seguido de una filtración

en membrana de PTFE con poro de 0.45 µm. La primera evaluación de los perfiles

cromatográficos fue realizada inyectando 20 µL de la solución en HPLC analítico. Fue

utilizada una columna RP18 y se empleó un gradiente exploratorio lineal con variación

del solvente B (metanol) en un intervalo de 5-100% en 60 minutos.

Al observar los cromatogramas de ambas fracciones se denotó la clara

complejidad de las matrices. Una baja resolución cromatográfica y una elución

característica de una banda alargada en la región entre tr= 10-35 minutos fueron otros

indicativos de la presencia de taninos condensados en ambas fracciones (figura 6 y 8).

Cabe señalar, que comparando los perfiles cromatográficos de la fracción

etanólica (figura 6) y de la fracción residual (figura 7), la primera presentó un

comportamiento cromatográfico más afectado, lo que se denota en la altura mayor de la

rampa del cromatograma y que indica que la concentración de taninos condensados debe

de ser mayor en esta fracción. Sin embargo, es preciso señalar que debido a la alta

polaridad de los compuestos presentes en la fracción residual se presentaron problemas

en la disolución de ésta, y al filtrar la muestra por medio de la membrana de PTFE gran

cantidad del material quedo retenido en ella; por lo que las sustancias contenidas en

54

dicha fracción son muy complejas, probablemente, taninos con alto grado de

polimerización que no atravesaron la membrana y por tanto, no fueron analizados.

Haciendo uso del detector PAD, el cual realizó un barrido de 200-600 nm, tres

clases de metabolitos fueron identificados en las fracciones químicas del extracto

metanólico de Acalypha californica, en estudio. Catequinas monoméricas y oligoméricas

(taninos condensados o proantocianidinas) fueron determinados con base a sus espectros

de absorción en la región UV; estos exhiben una banda débil cerca de 280 nm, un

pequeño hombro próximo a 220 nm y una máxima entre 205-210 nm. En tanto, los

derivados del ácido gálico presentan bandas de máxima absorción intensas en 215 y 271

nm. Los flavonoides, por su parte, presentan una Banda II, con máximos en la región

espectral de 240-290, atribuida al anillo A y de la banda I, con máximos en la región

espectral de 300-390 nm, atribuida al anillo B. Así, los picos 1,2,3 de la fracción

etanólica (figura 7) y 1,2,3 de la fracción residual (figura 9) exhibieron espectros

similares a compuestos derivados del ácido gálico, mientras los picos 4,5 de la fracción

etanólica (figura 7) y 4,5,6 de la fracción residual (figura 9) mostraron el espectro

característico de los taninos condensados; el pico 6 de la fracción etanólica (figura 7)

coincide con el espectro de los flavonoides (Merken y col., 2000; Rohr y col., 2000;

Wang y col., 2000).

Por medio de experimentos de co-inyección de patrones y mezclas de

metabolitos conocidos se identificó el pico 4 (tr= 29.52 min) y el pico 5 (tr= 30.76 min)

de la fracción etanólica (figura 7) como catequina y epicatequina, respectivamente.

En el estudio de Rodrigues (2007) se señala que el largo período de tiempo que

transcurre entre la producción, almacenamiento y secado de los extractos contribuye a la

polimerización de los taninos condensados, y consecuentemente en la dificultad de un

análisis cromatográfico uniforme. A la par, el autor sugiere implementar etapas de

extracción en fase sólida (SPE) para obtener resultados más informativos con relación a

la composición química de los extractos.

55

Figura 6. Perfil cromatográfico de la fracción etanólica del extracto metanólico de

Acalypha californica obtenidos por HPLC-PAD. Sistema de elución

gradiente: 5-100% de metanol en 60 minutos; columna Phenomenex®

Luna

(2) RP18 (250 x 4.6 mm di; 5 µm), HPLC (Jasco®

), flujo 1 mL/min, = 254

nm.

Minutos

56

Figura 7. Espectros en la región de UV para los principales picos eluídos en el

cromatograma de la figura 6. Los espectros 1, 2, 3 fueron atribuidos a

derivados del ácido gálico, 4 y 5 fueron identificados como catequina y

epicatequina respectivamente.

18.52 min 19.76 min

21.12 min 29.52 min

30.76 min 31.43min

57

Figura 8. Perfil cromatográfico de la fracción residual del extracto metanólico de

Acalypha californica obtenidos por HPLC-PAD. Sistema de elución

gradiente: 5-100% de metanol en 60 minutos; columna Phenomenex®

Luna

(2) RP18 (250 x 4.6 mm di; 5 µm), HPLC (Jasco®

), flujo 1 mL/min, = 254

nm.

Minutos

58



derivados del ácido gálico, y 4, 5, 6 fueron a taninos condensados.

19.62 min 20.86 min

22.09 min 30.47 min

30.89 min 31.85min

59

Justamente, con la finalidad de obtener un perfil cromatográfico de las fracciones

etanólica y residual con mayor resolución se realizaron ensayos de SPE. Durante la

realización del procedimiento de SPE para la fracción etanólica no se presentó

inconveniente alguno. El análisis por cromatografía en capa fina mostró una mejor

resolución a lo largo de las eluciones, sugiriendo una mayor concentración en la fracción

eluída con agua-metanol 8:2 v/v. Otro factor importante del proceso fue la eliminación

de material apolar, el cual permaneció retenido en el cartucho y fue evidenciado por la

desorción con cloroformo; este tipo de sustancias deben de evitarse en los análisis por

HPLC fase reversa, pues podrían comprometer la vida útil de la columna.

Por otro lado, en el procedimiento con la fracción residual acontecieron una serie

de problemas relacionados a la baja solubilidad de la fracción aún en mezclas con alta

proporciones de agua. El material, altamente polar, no consiguió internalizarse en la

matriz del cartucho y quedó retenido en el filtro poroso; al final del proceso el cartucho

permaneció impregnado con gran cantidad de material aplicado. La fracción

aparentemente más rica en manchas fue la eluída con la mezcla agua-metanol 8:2.

Así, las tres fracciones resultantes para cada una de las fracciones químicas en

cuestión fueron analizadas por HPLC bajo las condiciones señaladas anteriormente para

las fracciones etanólica y residual.

Los cromatogramas de las figuras 10 y 12 muestran el perfil de las fracciones

obtenidas mediante la SPE de la fracción de etanol, se observa como existe una mayor

cantidad de picos que en la fracción de origen, así como una mayor resolución de los

mismos. En la fracción de la SPE eluida con agua-metanol 8:2 v/v (fracción de SPE 8:2)

las sustancias eluyeron en los primeros 20 minutos del desarrollo del método, en tanto en

la fracción de la SPE eluida con agua-metanol 1:1 v/v (fracción de SPE 1:1) aconteció

de los 20-30 minutos, lo que evidencia la naturaleza altamente polar de las sustancias

presentes en la fracción de SPE 8:2. A la par, en el cromatograma de la figura 12 fue

advertida la presencia de taninos condensados, reflejada en el alargamiento de la banda

60

cromatográfica que va de 20 a 30 minutos, comportamiento típico de este tipo de

compuestos.

Mediante la comparación de los espectros en la región del ultravioleta para los

picos principales presentes en los cromatogramas de las fracciones de SPE 8:2 y 1:1 de

la fracción etanólica con los de la literatura y la biblioteca de padrones del equipo fueron

identificados taninos condensados (figura 11: 1,4,5) (figura 13: 1,5,6,7) y derivados del

ácido gálico (figura 11: 2,3) (figura 13: 2,3,4). Estos datos son consistentes con los

obtenidos para la fracción total de etanol.

El cromatograma presentado en la figura 14 pertenece al perfil generado para la

fracción de SPE 8:2 derivada de la fracción residual. Se observa un mejor desarrollo y

resolución de los picos de las sustancias comparando con el cromatograma de la fracción

residual total, las sustancias eluyeron dentro de los primeros 30 minutos de la

implementación del método, debido a su polaridad elevada. Mediante los espectros en la

región del ultravioleta de los principales picos señalados en el cromatograma fue

determinado que esta fracción contiene taninos condensados (figura 15: 1,2,4,5) y fue

identificado el flavonoide quercitina-3-O-α-L-ramnopiranósido (figura 15:3).

La fracción de SPE 1:1 de la fracción residual produjo un cromatograma con

mucho ruido, en el cual sobresalían tres picos, sin embargo ninguno de ellos fue

identificado.

Las fracciones eluidas con metanol en el procedimiento de SPE tanto de la

fracción etanólica como de la residual mostraron un perfil cromatográfico poco

informativo por lo que no fueron considerados para la presente discusión.

Posteriormente, se realizaron ensayos para optimizar las condiciones del método

de elución en la HPLC con la finalidad de lograr una mejor resolución de los picos del

cromatograma de las fracciones y así, continuar con una separación mediante un equipo

de HPLC preparativa; sin embargo no se tuvo éxito en las separaciones cromatográficas,

aún intentando reproducir fases móviles descritas en la literatura.

61

Figura 10. Perfil cromatográfico de la fracción de SPE eluida con agua:metanol 8:2

v/v de la fracción etanólica del extracto metanólico de Acalypha

californica obtenidos por HPLC-PAD. Sistema de elución gradiente: 5-

100% de metanol en 60 minutos; columna Phenomenex®

Luna (2) RP18 (250

x 4.6 mm di; 5 µm), HPLC (Jasco®

), flujo 1 mL/min, = 254 nm.

Minutos

62



taninos condensados, y 2, 3 fueron a derivados de ácido gálico.

3.95 min 9.03 min

17.96 min 20.72 min

22.09 min 24.42 min

63





Luna (2) RP18 (250



Minutos

64


cromatograma de la figura 12. Los espectros 1, 5, 6, 7 fueron atribuidos a

taninos condensados, y 2, 3, 4 a derivados del ácido gálico.

3.12 min 9.03 min

17.83 min 19.06 min

20.59 min 29.52 min 31.02 min

65


v/v de la fracción residual del extracto metanólico de Acalypha



Luna (2) RP18 (250



Minutos

66


cromatograma de la figura 14. Los espectros 1,2, 4, 5 fueron atribuidos a

taninos condensados, y 3 fue identificado como quercitina-3-O-α-L-

ramnopiranósido.

11.91 min 21.55 min

21.95 min 26.21 min

29.93 min 31.16 min 32.12 min

67





Luna (2) RP18 (250



Minutos

68

Lo anterior posee una explicación; como se abordó en párrafos pasados las

fracciones en cuestión generaron espectros en la región de ultravioleta característicos de

taninos condensados; estos son polifenoles constituidos por unidades de flavan-3-ol, los

cuales se encuentran unidos a través de enlaces C4-C6 o C4-C8, formando oligómeros y

polímeros de alto peso molecular. La elucidación estructural de estos compuestos,

principalmente de aquellos con alto grado de polimerización, es difícil debido a su

carácter heterogéneo, es esta complejidad y diversidad exhibida por los taninos

condensados lo que causa que su caracterización permanezca sin muchos cambios, así

como que sus relaciones estructura-actividad sean poco conocidas (Shu y col., 2010).

Otra de las dificultades de este tipo de compuestos (taninos condensados) es que

no son completamente resueltos durante las separaciones cromatográficas por HPLC.

Generalmente, existe la necesidad de análisis muy largos, principalmente para garantizar

que los analitos sean eluidos del sistema cromatográfico. Además, los análisis de los

espectros en la región del ultravioleta dan apenas una orientación sobre el tipo de

compuestos presentes y no permiten saber cuántas unidades componen la estructura total

del compuesto; un monómero, dímero, trímero o un polímero, generan un espectro en

ultravioleta similar, esto debido a que la constitución del cromóforo es la misma (Wu y

col., 2005; Karonen y col., 2006).

La elucidación de las estructuras de taninos condensados se realiza comúnmente

por medio de una purificación extensiva, por métodos espectrales y degradación química

con aducción tiolítica o fluroglucinol. Sin embargo, la multiciplidad de la resonancia y

los problemas asociados con el isomerismo rotacional y conformacional a menudo

complican la interpretación de sus secuencias. La degradación química requiere de una

tediosa separación a grande escala, purificación múltiple y varias reacciones químicas, y

al final, muchas identidades estructurales pueden permanecer sin resolver por la carencia

de muestras auténticas (Hui y col., 2007).

De esta forma, teniendo en vista la dificultad de aislamiento de los metabolitos

de las fracciones etanólica y residual del extracto metánolico de Acalypha californica

69

sea por cromatografía de adsorción o por cromatografía de partición, la etapa siguiente

consistió en hacer uso de la espectrometría de masas en tándem para investigar la

constitución química de las fracciones.

Análisis por FIA-ESI-IT-MS. La espectrometría de masas con ionización por

electrospray se ha convertido en uno de los métodos más populares para la

caracterización de productos naturales, incluyendo polifenoles (Hui- Jing y col., 2008).

Catequinas y taninos condensados son frecuentemente analizados en los modos

positivo y negativo, y varias interfaces son empleadas para la generación de estos iones,

siendo, como ya se mencionó, la ionización por electrospray la más común. Esta técnica

es reconocida por permitir la investigación de los tipos más diversos de matrices en fase

gaseosa, incluyendo analitos que exhiben alta polaridad, permitiendo así, la

caracterización estructural con cantidades mínimas de muestra ( Rodrigues, 2007).

En años recientes, el acoplamiento de la cromatografía líquida y la

espectrometría de masas con ionización por electrospray, han proveído una poderosa

herramienta para la caracterización de los taninos condensados. Sin embargo, como ya

se comentó, los análisis por HPLC demoran mucho tiempo lo que constituye una

desventaja cuando se busca la obtención de un perfil químico de cierta matriz en un

tiempo relativamente corto (Roopesh y col., 2010).

Diversos trabajos han demostrado que análisis por espectrometría de masas

utilizando el modo de inserción directa de la muestra (FIA), se han distinguido como una

forma más representativa y rápida para establecer la composición química de una

determinada matriz (Catharino y col., 2006; Rodrigues y col., 2007).

Tomando en cuenta las observaciones anteriormente expuestas y teniendo una

idea de la composición química de las fracciones, se realizó una caracterización química

de los metabolitos secundarios presentes en las fracciones etanólica y residual mediante

70

la técnica de espectrometría de masas con ionización por electrospray y trampa de iones

(ESI-IT-MS) empleando el modo de inserción directa.

Comparado con el modo positivo, el modo negativo generó resultados más útiles

acerca de la composición química de las fracciones etanólica y residual del extracto

metanólico de Acalypha californica. De esta manera, aunque se realizaron los espectros

de masas en modo positivo, solamente los resultados en modo negativo serán

presentados y discutidos. Así, el modo negativo fue seleccionado teniendo en cuenta el

conocimiento previo de la composición fenólica de la fracciones, dada por los espectros

en la región de UV obtenidos de los análisis por HPLC-PAD. Esta clase de metabolitos

secundarios ionizan fácilmente por la desprotonación de los hidróxilos fenólicos,

posteriormente estas moléculas desprotonadas son transferidas eficientemente para la

fase gaseosa como iones negativos.

En la figura 17 se muestra el espectro de masas de barrido completo presentando

los iones de las moléculas desprotonadas ([M-H]-) de la fracción etanólica de Acalypha

californica.

Para proporcionar una mayor selectividad y especificidad de los iones

precursores observados y para tener más indicios sobre la naturaleza química de esta

matriz, fueron generados espectros de segundo orden (MS/MS) de los principales iones

diagnósticos. En la tabla VII se resumen las principales características sobre los iones

producidos durante los análisis por FIA-ESI-IT-MS/MS de la fracción etanólica. Fueron

realizadas comparaciones de los espectros MS2 con los presentados en la literatura.

El primero de los picos del espectro al que fue atribuido un compuesto fue el de

m/z 183 el cual fue asignado al galato de metilo cuya estructura se muestra en la figura

18A; este hallazgo va soportado a su vez por la información proporcionada por los

espectros UV de los análisis en HPLC-PAD, ya que estos resultaron en perfiles

característicos de compuestos derivados del ácido gálico.

La estructura mostrada en la figura 18B fue propuesta para generar el ión de m/z

593; esta pertenece a la familia de las proantocianidinas y se encuentra constituida por

71

un dímero de [epi]catequina- [epi] galocatequina. Cabe señalar, que la estereoquímica de

los carbonos C2 y C3 de las catequinas no se puede determinar en experimentos de MS,

esto a causa de que el único dato que se genera sobre la estructura es precisamente la

masa que esta posee; esta es la razón por la cual al compuesto se le denomina

[epi]galocatequina.

Otro de los picos relevantes referentes a proantocianidinas, mostrados en el

espectro de masas fue el de m/z 609 y se atribuyó a dos unidades de [epi] galocatequina,

la estructura de este compuesto se muestra en la figura 18C.

El ión perteneciente a m/z 301 fue identificado como el flavonoide quercetina. Al

igual que este último el ácido elágico genera un ión en m/z 301, sin embargo cuando se

realizó el MS2

de dicho ión no se registraron iones producto, lo que confirma que se trata

de quercetina y no del ácido elágico el cual genera iones de m/z 257,229 y 185 en el

espectro MS2 (figura 18D) (Kajdzanoska y col., 2010).

El fragmento m/z 633 fue identificado como galoil-HHDP-glucopiranosa; en la

figura 19 se muestra el espectro de MS2 de este ión; se puede observar que sobresalen

dos fragmentos de ión, uno m/z 463 el cual es debido a la pérdida de ácido gálico (170

uma) y otro de m/z 301 después de la pérdida de galoilglucosa (332 uma) (Soong y col.,

2005; Kajdzanoska y col., 2010).

Se encontraron evidencias de que en la muestra se encontraba presente el

compuesto sulfoquinovosil diacilglicerol teniendo esterificados el ácido palmítico y el

ácido linóleico; en el espectro de MS2 de la figura 20 se observa el ión base en m/z 815,

así como los iones productos de m/z 599, que revela la pérdida de ácido palmítico, y el

de m/z 537 generado por la pérdida del ácido linóleico (Gage y col., 1992).

De esta forma los experimentos que fueron realizados empleando la técnica FIA-

ESI-IT-MS/MS generaron datos importantes que permitieron identificar las clases de

sustancias presentes en la fracción etanólica. Estos mostraron que dicha fracción se

encuentra constituida principalmente por flavonoides, proantocianidinas y derivados del

72

Figura 17. Espectro de masas de primer orden, en modo de barrido completo de la

fracción etanólica del extracto metanólico de Acalypha californica. Los

iones señalados ( ) fueron identificados mediante su espectro de MS2 o por

comparación con la literatura.

F.EtOH.esineg25V_0305201 101_110408093345 #1-17 RT: 0.00-0.27 AV: 17 NL: 1.8E2 T: ITMS-cESI Fullms [150.00-

2000.00]

73

Tabla VII. Datos espectrométricos de los compuestos identificados durante los

experimentos de FIA-ESI-IT-MS/MS de la fracción etanólica.

Compuesto Ión precursor

(m/z)

Iones productos (MS2)

(m/z)

Ácidos fenólicos

Galato de metilo 183

Proantocianidinas

Dímero [epi] catequina,

[epi] galocatequina

593

Dímero [epi] galocatequina 609

Flavonoides

Quercitina 301

Glicósidos

Galoil-HHDP-

glucopiranosa

633 463, 301

Otros

Sulfoquinovosil

diacilglicerol (R1= ácido

palmítico, R2=ácido

linoleico)

815 559, 537

74

Figura 18.Metabolitos secundarios identificados en la fracción etanólica mediante

análisis de FIA-ESI-IT-MS/MS. A. Galato de metilo, B. Dímero de

[epi]catequina- [epi]galocatequina, C. Dímero [epi]galocatequina, D.

Quercetina, E. Galoil-HHDP-glucopiranosa, F. Sulfoquinovosil diacilglicerol

HO

OH

COOCH3

OH

OHO

OH

OH

OH

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

OH

OH

O

O

HO

OH

OH

OH

OH

O

OHHO

O

S OHO

O R2

O

O

R1

O

O

R1 = Ácido palmítico

R2= Ácido linoleico

A B

C

D

EF

75

ácido gálico. Estos resultados son consistentes con los obtenidos mediante la técnica de

HPLC-PAD.

En cuanto a la fracción residual, ésta también fue analizada por FIA-ESI-IT-

MS/MS en modo negativo; en la figura 21 se muestra el espectro de masas en “full-

scan” para esta fracción y se señalan los iones que fueron identificados; también en la

tabla VIII se exhiben las características de los compuestos identificados.

El ácido quínico, perteneciente al grupo de los ácidos fenólicos, fue identificado, su

presencia es denotada por el ión en m/z 191 que se muestra en el espectro de la figura 21.

La estructura de este compuesto es presentada en la figura 22A.

Del grupo de las proantocianidinas solo fue posible identificar el dímero de

[epi]galocatequina, el cual generó una molécula desprotonada con m/z 609 y cuya

estructura es mostrada en la figura 22B.

Varios flavonoides fueron determinados mediante los espectros de masas. El

primero de ellos fue la quercitina, en cuyo MS2 no generó fragmento del ión m/z 301,

bajo las condiciones de trabajo (figura 22C) (Rodrigues, 2007).

La fragmentación de segundo orden de la molécula desprotonada de m/z 433

resultó en el espectro de iones producto mostrado en la figura 23, el cual ilustra

informaciones estructurales compatibles con el compuesto quercitina-3-O-arabinósido.

Como se observa, se genera el pico máximo en m/z 301 perteneciente a la fracción de

quercitina después de la pérdida de la unidad de arabinosa (figura 22D) (Kubomura y

col., 2006).

El compuesto quercitina-3-O- ramnósido fue postulado a encontrarse en la

fracción residual debido a la presencia del pico del ión m/z 447, mostrado en el “full-

scan” de la figura 21. La estructura de este compuesto se puede ver en la figura 22E.

Al igual que en la fracción etanólica, el compuesto galoil-HHDP-glucopiranosa

fue detectado en la fracción residual en m/z 633.

76

Figura 19. Espectro de masas de segundo orden del ión precursor de m/z 633

atribuido a la molécula galoil-HDDP-glucopiranosa. El ión producto de

m/z 463 es debido a la pérdida de ácido gálico, en tanto el ión de m/z 301 es

causado por la pérdida de la fracción galoilglucopiranosa. El espectro fue

obtenido en modo negativo, con energía de colisión del 25%.

77


atribuido a la molécula sulfoquinovosil diacilglicerol. El ión producto de

m/z 599 es debido a la pérdida de ácido palmítico, en tanto el ión de m/z 537

es causado por la pérdida del ácido linoleico. El espectro fue obtenido en

modo negativo, con energía de colisión del 33%.

78

Figura 21. Espectro de masas de primer orden, en modo “full- scan” de la fracción

residual del extracto metanólico de Acalypha californica. Los iones

señalados ( ) fueron identificados mediante su espectro de MS2 o por

comparación con la literatura.

79

Tabla VIII. Datos espectrométricos de los compuestos identificados durante los

experimentos de FIA-ESI-IT-MS/MS de la fracción residual.

Compuesto Ión precursor

(m/z)

Iones productos (MS2)

(m/z)

Ácidos fenólicos

Ácido quínico 191

Proantocianidinas

Dímero [epi] galocatequina 609

Flavonoides

Quercetina 301

Quercetina-3-O-

arabinósido

433 301

Quercetina-3-O-ramnósido 447 301

Glicósidos

Galoil-HHDP-

glucopiranosa

633 463, 301

80

Así, al comparar las figuras 17 y 21 se observa que los espectros de masas

indican que existe una gran similitud entre los metabolitos secundarios de ambas

fracciones, ahora bien, pensado en la actividad biológica, estas dos fracciones exhiben

propiedad antiproliferativa muy diferente, siendo la fracción residual la más activa.

Al revisar los procesos a los cuales dichas fracciones fueron sometidas se encuentra una

explicación a lo anteriormente expuesto. Tanto para los análisis de espectrometría de

masas como para los de HPLC-PAD, se precisa que las muestras sean disueltas y,

posteriormente, filtradas mediante membrana de PTFE con tamaño de poro de 0.45 µm,

esto con la finalidad de no dañar los equipos. Este proceso fue llevado a cabo sin

contratiempos para la fracción etanólica, sin embargo, y como ya se había mencionado,

con la fracción residual surgieron muchos problemas, ya que debido a la alta polaridad

de sus constituyentes fue difícil de disolver, y al ser filtrada la gran mayoría del material

fue retenido en la membrana, por lo que los constituyentes mostrados en los perfiles son,

apenas, aquellos que no fueron retenidos.

Observando las características físicas de la fracción residual; sólido quebradizo

de color rojo, se piensa que la muestra contiene una gran cantidad de taninos

condensados con alto grado de polimerización, los cuales no fueron analizados y,

posiblemente sean los responsables de la actividad antiproliferativa que exhibe dicha

fracción.

Con la información obtenida por HPLC-PAD como por MS se reveló que la

fracciones etanólica y residual contienen, mayormente, compuestos fenólicos, los cuales

se caracterizan por ser altamente hidroxilados; así surge otra respuesta a eventos

presentados en las pruebas de actividad biológica. Recapitulando, el extracto metanólico

de Acalypha californica posee la capacidad de reducir la sal de MTT, también se

comentó que metabolitos como los flavonoides con un hidroxilo libre en la posición 3

causan dicho efecto. Ahora, observando las estructuras identificadas para ambas

fracciones nos percatamos de que gran parte de ellas poseen la característica mencionada

y probablemente sean las responsables de reducir el MTT.

81

Figura 22. Metabolitos secundarios identificados en la fracción residual mediante

análisis de FIA-ESI-IT-MS/MS. A. Ácido quínico, B. Dímero

[epi]galocatequina, C. Quercetina, D. Quercitina-3-O-arabinósido, E.

Quercitina 3-O-ramnósido, F. Galoil-HHDP-glucopiranosa.

82


atribuido al compuesto quercitina-3-O- arabinósido. El ión producto de

m/z 301 es debido a la pérdida de la porción de arabinosa .El espectro fue

obtenido en modo negativo, con energía de colisión del 22%.

83

Relacionando las clases de metabolitos que se encuentran presentes en las

fracciones etanólica y residual con la actividad antiproliferativa del extracto resulta que,

ha sido reportado que compuestos fenólicos poseen propiedades antiinflamatorias,

inmunomoduladoras y antioxidantes. Este grupo ha sido postulado como el más

promisorio para ser utilizado en la quimioprevención. Existe evidencia de que estas

sustancias suprimen, retardan y revierten el proceso de carcinogénesis (Nichols y col.,

2010; Forambi y col., 2011; Kilami y col., 2011; Tan y col., 2011).

Entre los flavonoides, la quercitina es considerada un excelente antioxidante,

además ejerce un efecto pro-apoptótico directo en las células tumorales y puede

bloquear el crecimiento de varias líneas celulares de cáncer de humano en diferentes

fases del ciclo celular. El efecto de la quercitina es selectivo, ya que exhibe una alta

toxicidad en las células de cáncer, en tanto, en las células normales, no transformadas,

muestra una casi total ausencia de daños (Gibiellini y col., 2011). Dicho compuesto se

encuentra presente en la fracción etanólica y residual.

Son encontradas un gran número de publicaciones que evidencian la propiedad

antiproliferativa de las proantocianidinas. Vaid y col. (2011) señalan que las

proantocianidinas presentes en las semillas de las uvas poseen efecto sobre la migración

celular en mielomas, el cual está asociado con la reducción de los niveles de COX-2 y la

expresión y producción de prostaglandinas. También, se reportan efectos de éstas en

cáncer colorrectal y de pulmón, donde actúan a través de la modulación de la expresión

de genes y por una rápida inducción de la apoptosis (Pan y col., 2010; Bobe y col., 2011;

Kresty y col., 2011).

Estudios han demostrado que el ácido gálico y sus derivados evitan la invasión

de las células de melanoma a través de la inhibición de la metaloproteinasa-2 y Ras.

Otras investigaciones muestran que este induce la muerte de las células de cáncer de

pulmón por el incremento de especies reactivas de oxígeno y por la depleción del

glutatión (Lo y col., 2011; You y col., 2011).

84

De esta forma se concluye que los metabolitos secundarios pertenecientes a los

grupos de los flavonoides, proantocianidinas y ácidos fenólicos pueden ser los

responsables de la actividad anticancerígena de las fracciones etanólica y residual.

Purificación y Caracterización de Compuestos de la Fracción Hexano-Acetato de

Etilo

Cromatografía de exclusión molecular para la fracción hexano-acetato de

etilo. Una vez que se realizaron los análisis de prospección preliminar, los cuales

permitieron generar una idea acerca de la composición química de la fracción hexano-

acetato de etilo, se efectuaron procedimientos para la purificación de los compuestos

presentes en ella, dando así la pauta para posteriores etapas de elucidación estructural.

La separación de la fracción hexano-acetato de etilo se realizó por cromatografía

de exclusión molecular, utilizando sephadex LH-20, el cual fue empaquetado con el

sistema de solventes n-hexano/cloroformo/metanol 2:2:1 v/v. Así, 3 g de la muestra

fueron aplicados y eluídos en un gradiente de polaridad creciente.

Fueron obtenidas 420 fracciones de aproximadamente 5 mL cada una, éstas se

colectaron en tubos de ensayo. Después de la reducción de la cantidad de solvente, todas

fueron analizadas por cromatografía en capa fina, usando como fase móvil mezclas de

hexano - acetato de etilo, y cloroformo-metanol. Se utilizó como revelador la solución

de anisaldehído sulfúrico.

Las fracciones que presentaron manchas con valores de Rf’s y coloraciones

semejantes fueron reunidas y secas, dando así un total de 39 grupos, todos con

características de polaridad muy distintas, debido al gradiente de elución utilizado.

Las fracciones eluidas con los sistemas menos polares mostraron masas

mayoritarias, esto debido a la naturaleza no polar de los solventes utilizados para el

fraccionamiento del extracto metanólico (en este caso hexano y acetato de etilo).

También fueron eluidas sustancias de naturaleza polar, posiblemente arrastradas del

85

extracto metanólico por los lavados con acetato de etilo; sin embargo, su masa fue

despreciable lo cual imposibilitó continuar con la purificación de las mismas.

Los primeros 10 grupos obtenidos mostraron matrices complejas de sustancias y

rindieron masas importantes, razón por la cual se comenzó a trabajar con dichos grupos.

Cromatografía líquida de media resolución de la fracción G5. El grupo G5

proveniente de la columna de sephadex de la fracción de hexano-acetato de etilo rindió

una masa de 0.753 g. Esta fracción contenía una gran cantidad de sustancias en su

matriz, características que permitieron seguir la purificación de los compuestos presentes

en ella.

Debido a la naturaleza no polar de la fracción no fue viable trabajar con HPLC,

ya que el equipo utiliza columnas de fase reversa y solventes como agua, metanol y

acetonitrilo, que no son apropiados para el análisis de esta tipo de muestras; sin embargo

se pudo trabajar con cromatografía líquida de media presión (MPLC) con la cual se

realizan separaciones en fase normal.

Se obtuvieron 120 fracciones de aproximadamente 5 mL cada una; de las cuales

se generaron 27 grupos de fracciones según el perfil en cromatografía en capa fina

después del revelado con anisaldehído.

De las 120 fracciones de la 8-13 y de la 41-43 precipitaron en forma de cristales

color blanco en forma de agujas finas. Sin embargo, estos se encontraban inmersos en

una gran cantidad de sustancias que constituían la misma fracción, como es posible

observar en las cromatoplacas presentadas en la figura 24, A y B.

Con la finalidad de recuperar dichos cristales se adicionó metanol frío para

aumentar la polaridad y promover la cristalización; el sobrenadante fue retirado y los

cristales fueron de nuevo lavados con metanol frío; este proceso se repitió hasta que los

cristales se encontraban aparentemente libres de impurezas.

86

A. B.

C. D.

Figura 24. Purificación de cristales. En A y B se muestra el perfil de manchas de

cromatografía en capa fina de las fracciones que precipitaron cristales, en C y

D se muestran las manchas generadas por los cristales purificados. A.

Fracciones 8-13 eluidas con hexano/acetato de etilo 75:25 v/v. B. Fracciones

41-43, eluidas con cloroformo/metanol 98:2 v/v. C. Perfil cromatográfico de

los cristales de las fracciones 8-13, elución con hexano/acetato de etilo 75:25

v/v. D. Perfil cromatográfico de los cristales de las fracciones 41-43, elución

con cloroformo/metanol 98:2.

87

Los cristales fueron disueltos en hexano y su purificación se monitorizó por

cromatografía en capa fina. Como se observa en la figura 24, C y D, se generó solo una

mancha violeta muy intensa con Rf’s similares en todas las muestras, lo cual indica que

son pertenecientes a una misma sustancia.

Comparando las manchas generadas por los cristales purificados con las manchas

de las fracciones que les dieron origen (figura 24) se observó que los cristales eran

responsables de la mancha más prominente en las cromatoplacas. De acuerdo a la

literatura, las características de los cristales obtenidos bajo las condiciones de estudio, y

la apariencia de las manchas generadas en cromatografía en capa fina, son un fuerte

indicativo de sustancias esteroidales (Fierro y col.,2004; Salas y col., 2009).

Coincidiendo con los análisis preliminares, se encontraron esteroides/triterpenos

en la fracción de hexano-acetato de etilo. Así, para corroborar lo anterior, las muestras

de cristales fueron identificadas por métodos de elucidación estructural.

Resonancia magnética nuclear. Con la finalidad de obtener cantidad suficiente

de cristales para los análisis de resonancia magnética nuclear se reunieron los

precipitados de las fracciones 8-13 en un grupo llamado AC1, en tanto que los cristales

de las fracciones 41-43 formaron el grupo AC2. Ambos agrupamientos fueron diluidos

en cloroformo deuterado y analizados por 1H-RMN, para su posible identificación.

En la figura 25 se muestran los espectros de 1H-RMN para AC1; en tanto el

espectro para AC2 se muestra en la figura 26. Nótese que tanto AC1 como AC2

generaron espectros con desplazamientos similares.

Por lo tanto, esto confirmó los hallazgos de la cromatografía en capa fina de los

cristales, ya que AC1 y AC2 presentaban el mismo valor de Rf y coloración semejante

de las manchas reveladas. Las sustancias identificadas fueron -sitosterol y

estigmasterol. Se describirá solo el espectro de AC1.

88

Figura 25. Espectro de 1H- RMN de la fracción AC1. Mediante la interpretación de las señales se identificó como una

mezcla de -sitosterol y estigmasterol (Condiciones: 500 MHz, CDCl3).

89

Figura 26. Espectro de 1H- RMN de la fracción AC2. Mediante la interpretación de las señales se identificó como una

mezcla de -sitosterol y estigmasterol (Condiciones: 500 MHz, CDCl3).

90

En el espectro de 1H-RMN de AC1 (figura 25) se observa un perfil característico

para compuestos esteroidales, Las señales en 4.95 y 5.1 (integrando cada una para

1H) son características de los protones vinílicos sobre C-22 y C-23 del estigmasterol; en

la ampliación de esta zona es posible conocer la ubicación espacial de H-22 y H-23 por

las constantes de acoplamiento de ambos, dobletes de dobletes, con un valor

característico de 15 Hz el cual es un intervalo para hidrógenos en posición trans. Otra

señal característica es la de 5.29, que integra para 1H, que genera un doblete y es

correspondiente al H oleofínico en la posición 6 del núcleo esteroidal, En 3.5 (1H) se

observa un multiplete dado por un H sobre un carbono unido a un oxígeno, característico

de un hidroxilo en la posición 3 del anillo esteroidal, y de acuerdo a las constantes de

acoplamiento permiten ubicar el grupo OH en posición axial.

El resto de los H se ubican en un campo más alto (entre 0.62 y 3) la cual es una

zona característica de H de grupos metilenos y metilos, con señales muy intensas.

Dentro de esta zona, específicamente entre 1.4 y 2.4, se encuentran presentes los

hidrógenos alfa a dobles enlaces, en este caso, H-4, H-7 y H-20 (Salas y col., 2009;

Viera, 2010).

Ensayos de cromatografía en capa fina para AC1 y AC2. Una vez que se

caracterizaron las sustancias que se encuentran presentes en las fracciones AC1 y AC2,

se llevaron a cabo ensayos de cromatografía en capa fina haciendo uso de patrones de -

sitosterol y estigmasterol, esto con la finalidad de observar si las muestras exhiben el

mismo perfil de manchas que los patrones y de esta forma dar otro soporte a la

identificación de las sustancias de las muestras.

Como se observa en la figura 27, el Rf de las muestras coincidió con el de los

patrones, además el color y forma de las manchas, generadas por el revelado con

anisaldehído, fueron similares, por lo que se puede concluir que, precisamente, las

sustancias encontradas en las fracciones AC1 y AC2 son -sitosterol y estigmasterol.

91

Figura 27. Características en CCF de las fracciones AC1 y AC2 y patrones de -

sitosterol y estigmasterol. En la primera línea se colocó el patrón de -

sitosterol, en la segunda el de estigmasterol, en tanto AC1 y AC2 se muestran

en las líneas 3 y 4. La elución fue llevada a cabo con hexano/acetato de etilo

75:25 v/v.

92

En un principio, se consideró realizar solo los estudios fitoquímicos para la

fracción residual esto debido a la selectividad que ésta presenta hacia las células

cancerosas, propiedad que no fue mostrada por la fracción hexano-acetato de etilo ya

que daña igualmente a las células de la línea L-929. Sin embargo, no implica que esta

última no sea una buena candidata para la generación de compuestos activos. Las células

L929 (control) han sido inmortalizadas, lo que significa que aunque no provienen de

cáncer, no son células normales, sino que su maquinaria celular ha sido alterada, esto

podría explicar los efectos de las fracciones mencionadas. Para establecer

comparaciones lo óptimo sería trabajar con la línea cancerosa y su contraparte no

cancerosa.

Mediante técnicas cromatográficas fue posible aislar de la fracción de hexano-

acetato y, posteriormente por 1H-RMN, identificar una mezcla de los esteroides -

sitosterol y estigmasterol. Las características de los cristales, así el espectro de 1H-RMN

fue comparado con los de la literatura (Fierro y col., 2004; Salas y col., 2009).

Numerosos estudios experimentales han demostrado los efectos antiproliferativos

del -sitosterol y estigmasterol sobre los cánceres de colon, de mama, próstata,

estómago y pulmón. Así también, se ha estudiado el efecto de reducción de la metástasis

que presentan estas sustancias. Los mecanismos de acción por lo que se logra la

mencionada actividad antitumoral han sido elucidados, estas sustancias pueden

modificar las membranas de las células tumorales, pueden activar el ciclo de la

esfingomielina, activar las caspasas, suprimir la expresión de bcl-2 e incrementar la

expresión de bax (Awad y col., 2000; Imanaka y col., 2008; Rubis y col., 2008; Choon y

col., 2009; Younghuan y col., 2009).

Lo anterior es una evidencia muy fuerte de que probablemente la actividad

antiproliferativa mostrada por la fracción de hexano-acetato de etilo sea debida a la

presencia de dichas sustancias.

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