UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALAFACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACIADEPTO. QUMICA ORGNICAQUMICA ORGNICA III

Sntesis eficiente de nuevas chalconas a base de cafena, pirazolinas y pirazol[3,4-b][1,4]diazepinas como agentes potenciales antimalricos, antitripanosmicos y antileishmanisicosInsuasty, B., Ramrez, J., Becerra, D., Echeverry, C., Quiroga, J., Abonia, R., Robledo, S., Dario, I., Upegui, Y., Muoz, J., Ospina, V., Nogueras, M. & Cobo, J. Elsevier, 93, 401-413.

Bruno Colussi (201280033), Rosa Peralta (201315386), Zucel Romero (201315415), Leonel Salazar (201315509), Javier Mendoza (201322066)

INTRODUCCINLa cafena es un heterociclo que posee actividad biolgica debido a que acta como estimulante del sistema nervioso central. De acuerdo a la literatura, el anillo de la cafena, al ser sustituida en el C-8, puede inhibir la actividad de la monoaminooxidasa MAO (Tipo A y B), enzima que est localizada en el exterior de la membrana de la mitocondria en clulas del cerebro, intestino, msculos y otros rganos. No obstante, cada nueva sustitucin va a impartir su propia caracterstica qumica, con propiedades farmacodinmicas y farmacocinticas distintas a sus anlogos. En estudios previos se demostr que la chalcona tiene la caracterstica de producir compuestos que poseen accin antitumoral, antibacterial, antiinflamatoria, antileishmanisica, antimalrica y antitriponosmica, dependiendo de la sustitucin aromtica. La reaccin de chalconas con derivados de hidrazina es una de las reacciones mayor extendida en la sntesis orgnica. Investigadores han revelado que en la mayora de casos, el producto formado es un derivado de pirazolinas. Estos derivados presentan diversas actividades biolgica como antimoral, antifngica, antiviral, inhibidor de MAO, hipotensiva, etc (Loh, et. al., 2013). De lo contrario, desde el descubrimiento de la benzodiazepinas, muchos derivados de diazepina como las pirazoldiazepinas se han sintetizado las cuales han presentado una importante actividad antitumoral, antitripanosomal y antileishmanial (Lee & Kim, 2009). El objetivo principal de este trabajo fue evaluar la capacidad de las chalconas a base de cafena, de las pirazolinas y de las pirazol[3,4-b][1,4]diazepinas para inhibir el crecimiento de Plasmodium falciparum, Leishmania panamensis y Trypanozoma cruzi, con el fin de determinar si son agentes potencialmente activos antes estos patgenos. Entre ellos, solo la pirazolina 6a-f mostr una sobresaliente crecimiento inhibitorio de 85.2 5.4%. Mientras las diazepinas 10a-f mostraron un crecimiento inhibitorio remarcable en el rango de 80.3 13.5% a 94.2 0.2% cuando fueron examinadas a 20 g/mL. Por ende, la sntesis de chalconas a base de cafena, pirazolinas y pirazolo[3,4-b][1,4] bajo condiciones normales y tiempos de reaccin cortos fue llevada a cabo exitosamente, sin embargo se debe de confirmar las actividades evaluadas en ensayos in vivo.

RESULTADOS Y DISCUSINQumicaEl 8-clorocafena 1 fue sintetizada y fue sometida a una reaccin de sustitucin nucleoflica aromtica con la vainillina 2 en DMF y carbonato de potasio, lo cual dio la formacin de un aldehdo 3 mediante una SN2 al realizarse en un solo paso expuesta a radiacin de microondas. La reaccin de Claisen-Schmidt se dio entre el compuesto 3 y una acetofenona sustituida que form un intermediario ceto-enol en medio bsico y una E1, para la sntesis de las chalconas 5a-f. Las chalconas se obtienen fcilmente a partir de la condensacin de acetofenonas y aldehdos aromticos, se observ que los compuestos activos guardan una clara coplanaridad entre los tomos del fragmento definido por el carbono carbonilo del sistema ,-insaturado (Pontificia Universidad Javeriana, s.f.). Posteriormente, los compuestos 5a-f se trataron con hidracina y etanol a altas temperaturas dando como resultado la formacin de los derivados de pirazol 6a-f en un alto rendimiento (90-96%). Esta reaccin se llev a cabo mediante una aminacin reductiva. Las propiedades qumicas del anillo de pirazol estn influenciadas por la posicin relativa de los heterotomos, la unin directa de 1,2-azoles implica un mayor grado de efecto inductivo en el ciclo y la presencia de los dos nitrgenos vecinos en el pirazol reduce la basicidad del nitrgeno bsico (C=N) (Joule, 1972). El grupo NH- de dihidro-1H-pirazol del anillo, una amina con hibridacin sp3, 6a-f se trat con anhdrido actico para dar 7a-f o con cido frmico para 8a-f a partir de una adicin nucleflica. El compuesto 5a-f se trat con 4,5-diamino-3-metil-1-fenilpirazol 9 en N,N-dimetilformamida y BF3 en Oet2, catalizada con irradiacin dando pirazol[3,4-b][1,4]diazapina 10a-f. Esta reaccin se dio mediante otra aminacin reductiva. Debido a la presencia de grupos aminos no equivalentes en el anillo de pirazol pueden esperarse dos productos posibles de ciclacin regioisomrica; no obstante, solo se obtuvo uno de los dos tipos de productos debido al efecto electrnico del anillo de pirazol que incrementa selectivamente la nucleofilicidad del grupo amino en el carbono-4, al encontrarse menos impedido. Sin embargo, el rendimiento de este tipo de reacciones oscila entre los 60-75%. Se emplearon distintas tcnicas para caracterizar e identificar cada uno de los derivados obtenidos. Se emple una cromatografa en capa fina para determinar la pureza de la sntesis y los puntos de fusin fueron determinados experimentalmente. As como los espectro de IR, el espectro de masas, el RMN 1H y el RMN 13C de cada unos de los derivados. En la siguiente tabla se observan los compuestos ms representativos de cada una de las series sintetizadas, con las bandas de absorcin ms caractersticas. SERIE 1SERIE 2SERIE 3

Compuesto5d6b7b8b10d

Nombre IUPAC(E)-3-((4-(2,6-Dioxo-1,3,7-trimethyl-2,3,6,7-tetrahydro-1hpurine-8-yl)oxy)-3-methoxyphenyl)-1-(4-methylphenyl)-prop-2-en-1-one3-(4-Chlorophenyl)-5-((4-(2,6-dioxo-1,3,7-trimethyl-2,3,6,7-tetrahydro-1H-purine-8-yl)oxy)-3-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1Hpyrazole1-Acetyl-3-(4-chlorophenyl)-5-((4-(2,6-dioxo-1,3,7-trimethyl-2,3,6,7-tetrahyd ro-1H-purine-8-yl)oxy)-3-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pirazole3-(4-Chlorophenyl)-5-((4-(2,6-dioxo-1,3,7-trimethyl-2,3,6,7-tetrahydro-1H-purine-8-yl)oxy)-3-methoxyphenyl)-1-formyl-4,5-dihydro-1H-pirazole5-(4-Chlorophenyl)-7-((4-(2,6-dioxo-1,3,7-trimethyl-2,3,6,7-tetrahydro-1H-purine-8-yl)oxy)-3-methoxyphenyl)-3-methyl-1-phenyl-1,6,7,8-tetrahydropyrazolo[3,4-b][1,4]diazepine

Estructura

Espectro IR1713cm-1 grupo C=O ,- insaturado1703 cm-1 y 1662 cm-1 grupos C=O de la cafena3322cm-1 grupo NH del pirazol1703 cm-1 grupo C=O 1693 cm-1 y 1659 cm-1 grupos C=O de la cafena1706 cm-1 grupo carbonilo 1691 cm-1 y 1668 cm-1 grupos carbonilo de la cafena1602 y 1506 grupo N=C y C=C

3261cm-1 banda del grupo NH1703cm-1 y 1658cm-1 banda del grupo carbonilo de la cafena1613cm-1 banda C=N

Actividad antiplasmdicaLa malaria es una enfermedad producida por parsitos del gnero Plasmodium, la infeccin ms comn es la causada por P. falciparum. La actividad antiplasmdica se evalu en cultivos de P. falciparum a partir de los compuestos sintetizados, a una concentracin de 20 g/ mL. El efecto de cada compuesto en el crecimiento del parsito se midi cuantificando la tincin de ADN parsito con bromuro de etilo, donde la cantidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN, siendo proporcional a la cantidad de parsitos viables. Si la inhibicin era mayor al 50% se hizo una serie de cuatro diluciones, se determin la IC50, concentracin a la cual el 50% del crecimiento del parsito ya fue inhibido. La chalcona 5d y tres pirazolinas 6a, 6c y 7a presentaron un % de inhibicin > 50% siendo 54.3 1.0, 85.2 5.4, 56.8 9.0 y 62.5 1.2% respectivamente. El compuesto 6a y la serie 10a-f presentaron un crecimiento inhibitorio mayor que la cloroquina, frmaco utilizado para el tratamiento de la malaria cuyo IC50 fue 58.2 5.6%,. Los compuestos 10c, 10d y 10f presentaron % de inhibicin mayor al 90%. De los compuestos que presentaron un IC50 < 20 g/mL a excepcin son bastante activos contra la sepa de P. falciparum, siendo el compuesto 10f el ms activo de todos con un IC50 = 11.3 g/mL y el 10b el menos activo con un IC50 = 14.1 g/mL. Ninguno de los compuestos activos present actividad hemoltica contra P. falciparum por lo que estos compuestos fueron considerados no txicos. Por lo tanto, estos resultados sugieren que los compuestos 6a, 7a y 10a-f tiene un alto potencial antimalrico, los cuales sugieren realizar un ensayo posterior in vivo.Actividad Citotxica y antileishmanisicaDebido a que Leishmania es un parsito intracelular, todos los compuestos fueron probados inicialmente por su toxicidad en clulas humanas en cuatro series de concentraciones diluidas. La actividad citotxica de los compuestos se evalu sobre los monocitos humanos. Dicha actividad para cada compuesto fue determinada de acuerdo a su efecto en la viabilidad celular por el mtodo microenzimtico MIT, en el cual el bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio es reducido a un producto prpura llamado formazn por la enzima succinasa deshidrogenasa luego de 72 horas. La citotoxicidad fue determinada de acuerdo a sus porcentajes de viabilidad y mortalidad obtenidos en cada condicin del experimento. Los resultados fueron expresados como concentracin letal al 50%, la cual es la concentracin necesaria para matar al 50% de las clulas. La toxicidad fue establecida de acuerdo a los valores de LC50 como la siguiente escala: LC50 < 100 MTxico

LC50 > 100 g/mL o 200 MNo txico

Por lo tanto, el compuesto 7a fue el compuesto que present mayor actividad citottoxica 14.8 3.5 g/mL en comparacin a los otros y el antibitico control anfotericina B mostr una actividad citotxica de 36.0 7.5 g/mL.En cuanto a su actividad antileishmanisica, se evalu frente a Leishmania panamesis, en uno de los dos estados morfolgicos: amastigotes intracelulares introduciendo cidos nucleicos a las clulas con un gen proteico fluorescente de color verde. L. panamesis produce una Leishmaniasis Cutnea Difusa y las clulas infectadas fueron determinadas de acuerdo a sus eventos por doble fluorescencia: fluorescencia de color verde (para parsitos) y la fluorescencia de color rojo (clulas). La actividad se realiz a una concentracin de 20 g/mL y los compuestos que mayor inhibicin tuvieron fue el 5b y 5e (88.3 1.5 y 82.6 2.2%). Sin embargo, el compuesto que mostr mejor actividad antileishmanisica fue el compuesto 5d porque es activo a 2.6 1.0 g/mL EC50, la cual es muy cerca a la concentracin de la anfotericina B (0.05 0.01 g/mL), la cual fue utilizada como el control para la actividad antileishmanisica dando como control positivo, mientras que las clulas infectadas fueron incubadas en ausencia de cualquier compuesto o droga control. Asimismo, los compuestos 7c-7f tienen la capacidad de inhibir ms del 50% del crecimiento del parsito a una concentracin de 20 g/mL.Actividad AntitripanosmicaPara medir la actividad antitripanosomal se emple a una concentracin de 20 g/mL contra a los microorganismos de la especie Trypanosoma cruzi, la cual produce la enfermedad de Chagas. Si la inhibicin era mayor al 50%, los compuestos se evaluaban posteriormente a cuatro concentraciones distintas. Para esto, la actividad tripanosmica fue evaluada en amastigotes intracelulares de T. cruzi, introduciendo cidos nucleicos a las clulas con un gen -galactosidasa. Luego de 72 horas de incubacin se determin el efecto de todos los compuestos en amastigotes intracelulares viables empleando un mtodo colorimtrico, midiendo la actividad de -galactosidasa. Las clulas infectadas expuestas a drogas control (benznidazol) fueron usadas como control para la actividad tripanosomal, mientras que las clulas incubadas en ausencia de alguno de los compuestos o drogas fueron utilizadas como control negativo. Los resultados para las actividades antimalricas, antileishmanisicas y antitripanosmicas fueron expresadas a una concentracin efectiva al 50% (EC50). La actividad de cada compuesto fue establecida de acuerdo a sus valores de EC50 utilizando la siguiente escala: LC50 < 20 MActivo

LC50 > 20 g/mL o 50 MNo activo

A una concentracin de 20 g/mL los compuestos 6d y 10f presentaron un crecimiento inhibitorio del 61.9 7.8 y 56.6 9.0%. Los compuestos 5d y 5f fueron evaluados a 1 g/mL, donde nicamente 5f present inhibicin contra T. cruzi, por lo que el valor de EC50 es mucho mejor que 20 g/mL siendo de 5.9 1.4 g/mL respectivamente. El EC50 fue determinado tambin en compuestos 5f, 6d y 10f que inhibieron el crecimiento de T. cruzi a ms del 50% a una concentracin de 20 g/mL o cercana al 10% a una concentracin de 1.0 g/mL, por lo que pueden ser utilizados como frmacos antitripanosomales. No obstante, el compuesto 6d present el mayor porcentaje de inhibicin de 61.9 7.8 % y un EC50 de 19.4 g/mL.CONCLUSIONES En conclusin, la sntesis de chalconas a base de cafena, pirazolinas y pirazolo[3,4-b][1,4] en buenas cantidades bajo condiciones normales y tiempos de reaccin cortos fue llevada a cabo exitosamente, sin embargo se debe de confirmar las actividades evaluadas en ensayos in vivo. En cuanto actividad antimalrica, el pirazolo[3,4-b][1,4]diazepinas presentaron las mejores respuestas inhibitorias en un rango de 80.3 13.5 al 94.2 0.2%, especialmente el compuesto 10f, cuyo porcentaje de inhibicin fue de 94.2 0.2% mayor que el estndar del cloroquina. La actividad antileishmanisica revela que los compuestos 7c-7f muestran un porcentaje de inhibicin mayor al 50% frente a Leishmania panamensis y valor de EC50 entre 12.6 2.2 y 18.1 1.8 %. No obstante, fue el compuesto 5d que present la mejor actividad antileishmanisica al presentar una EC50 cercana a la anfotericina B de 2.6 1.0 g/mL. En la actividad antitripanosmica, el compuesto 6d present el mayor porcentaje de inhibicin con 61.9 7.8%. y un EC50 de 19.4 g/mL, mientras que el compuesto 5f present un porcentaje de inhibicin a una baja concentracin de 9.7 1.5 % y un EC50 de 5.9 g/mL respectivamente, cuyo EC50 fue mucho menor que el del benznidazol de 10.7 2.0 g/mL. REFERENCIASInsuasty, B., Ramrez, J., Becerra, D., Echeverry, C., Quiroga, J., Abonia, R., Robledo, S., Dario, I., Upegui, Y., Muoz, J., Ospina, V., Nogueras, M. & Cobo, J (2015). An efficient synthesis of new caffeine-based chalcones, pyrazolines and pyrazolo[3,4-b][1,4]diazepines as potential antimalarial, antitrypanosomal and antileishmanial agents. Elsevier, 93, 401-413Lee, J. & Kim, Y. (2009). Combinatorial Library Synthesis and Biological Evaluation of Pirazolo[4,3-e][1,4]diazepine as a Potential Privileged Structure. Wiley-InterScience, 4, 733-737. doi: 10.1002/cmdc.200800453 Loh, W., Kheng, C., Shyang, T., Fun, H., Sapnakumari, M., & Narayana, B. (2013). Synthesis and Crystal Structures of N-substituted Pyrazolines. Molecules, 18, 2386-2396. doi: 10.3390/molecules18022386