Revisión Bibliográfica 2015: Investigación Básica Fernandez... · Perfusión microvascular y...
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Revisión Bibliográfica 2015: Investigación Básica Patricia Fernández-Llama Unidad de HTA
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Revisión Bibliográfica 2015:
Investigación Básica
Patricia Fernández-Llama Unidad de HTA
Arterioscler Thromb Vasc Biol 35, 2015 WJ Cao et al
Angiogénesis terapéutica por la entrega de MicroRNA 126-3p mediada por ultrasonidos
• MicroRNA (miRNA): moléculas de RNA pequeñas no codificantes que
regulan de la expresión génica mediante la inhibición transcripcional y
postranscripcional de RNAs mensajero diana
• Hay miRNAs en el endotelio vascular que regula la angiogénesis
como el miR-126-3p. Este efecto se ha atribuido a la represión de dos
reguladores negativos de factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEGF), lo que lleva a un mayor efecto de este
• La entrega del miRNA mediante la destrucción de microburbujas que
contienen el miRNA por ultrasonido (Ultrasound-targeted
microbubble destruction, UTMD) en la zona diana es una técnica
segura y eficaz
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Angiogénesis terapéutica por la entrega de MicroRNA 126-3p mediada por ultrasonidos
Objetivo:
•Optimizar la técnica UTMD para el uso terapéutico del miR126-3p en un
modelo de rata con isquemia crónica de extremidades
Material y métodos:
•Se probó el potencial angiogénico del miR-126-3p in vitro en células
endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) e in vivo mediante la
entrega por UTMD en ratas Fischer-344 antes y después de la ligadura
de la arteria femoral izquierda
•Se evaluó la expresión y caída del miR-126-3p y miR-126-5p así
como, los niveles de Tie2 fosforilados (receptor de angiopoyetina) y de
otras proteínas implicadas en la angiogénesis: la subunidad reguladora
2 de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PIK3R2) y del sprouty-related, EVH1
domain containing 1 (SPRED1)
•También se estudio la perfusión microvascular y la densidad de los
vasos
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Experimentos in vitro con células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC)
•Las HUVECs mostraron una transfeccion
efectiva y estable del miR-126-3p que se
acompañaba de una disminución de los
niveles de PIK3R2 y SPRED1, sin cambios
en los niveles del receptor Tie2 fosforilado.
Datos que no se observaron cuando se
transfectaron sin miRNA o con una mezcla de
varios miRNA
•Microscopía fluorescente mostró que el miR-
126-3p transfectado se localizaba en el
núcleo y en el citoplasma de las células
•Al estimular las células transfectadas con
angiopoyetina-1 se detecto, mediante
inmunoblot, un aumento del receptor Tie2
fosforilado mediado por la disminución del
PIK3R2
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Experimentos in vitro con células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC)
•El estudio de las HUVEs en una
matriz mediante microfotografías
mostró un aumento en el numero de
nudos, de túbulos y de la
respuesta migratoria a VEGF en las
células transfectadas con miR-126-3p
comparada con las controles
•El desarrollo de estas redes
capilares no se producía cuando las
células se co-incubaban con
bloqueante del VEGF o del
receptor Tie2 demostrando la
capacidad pro-angiogénica in vitro del
miR-126-3p
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Experimentos in vivo: ratas machos Fischer 344 sin isquemia
• La conjugación del miRNA
con microburbujas
catiónicos destruyéndolas
posteriormente con
ultrasonidos para que se
libere el miRNA en la zona
diana consigue niveles
elevados y mantenidos de
miRNA-126-3p
• Se confirma los datos
observados in vitro en relación a la disminución del mRNA y las proteínas de SPRED-1 y PIK3R2
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Experimentos in vivo: ratas machos Fischer 344 con isquemia de extremidades
• El aumento de los miR-126-3p se
detecto también mediante
hibridación in situ y
microscopia fluorescente del
musculo afecto. Esta última
demostró que el miRNA se co-
localizada con las células
endoteliales en el músculo tratado
• Cuando se aumentó la cantidad
de mRNA-126-3p en la
administración o se realizaron
administraciones repetidas, se
consiguieron niveles más
elevados de miRNA y durante
más tiempo. También la
disminución de PIK3R2 y de
SPRED1 fue mayor y se mantuvo
mas tiempo tras de la cirugía
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Perfusión microvascular y microangiografias fluorescentes e inmunofluoresecencia del
musculo isquémico
• Mayor perfusión que en los controles
• Mayor longitud de los vasos, de la densidad vascular, y de la relación de
arteriolas/capilar
• Mayor de cobertura de pericitos indicativo de una mayor maduración vascular
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Conclusiones
1. La conjugación de miR-126-3p a microburbujas catiónicas de
lípidos prolonga su circulación sistémica y pueden someterse a una
transfección en la “zona diana” mediante la aplicación externa de
ultrasonido (UTMD) lo que facilita la entrada del miRNA dentro de
la célula
1. La entrega del miR-126-3p en el músculo esquelético afecto de
isquemia crónica mejora la perfusión tisular a través del aumento
de la densidad vascular, la formación de las arteriolas, y la
maduración de neovasos, sin aparentes efectos en órganos
distantes
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• El aneurisma de aorta abdominal (AAA) es una patología vascular
frecuente que aumenta con la edad. Hasta el momento, no existe un
tratamiento efectivo para evitar la progresión del aneurisma, ni el
riesgo de ruptura
• El hierro es un elemento esencial para el mantenimiento de muchas
funciones fisiológicas sin embargo, el exceso del mismo puede
ocasionar daño tisular mediante el estrés oxidativo y la inflamación
• El exceso de hierro se ha relacionado con distintas patologías
cardiovasculares como lesiones ateroescleróticas, AAA y proteinuria
entre otras
Estrés oxidativo e inflamación asociados a la sobrecarga de hierro en un modelo
experimental de AAA
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Objetivo: estudiar si el hierro está involucrado en la fisiopatología
del AAA y la influencia de la restricción dietética de hierro en el
desarrollo del aneurisma en un modelo murino de AAA
Material y métodos:
•Se analizó la pared de la aorta de 53 pacientes que fueron
sometidos a cirugía cardiovascular (43 sin AAA y 19 con AAA)
•Se desarrolló un modelo de AAA mediante la infusión de
angiotensina II a ratones knockout de apolipoproteína E
•Se estudio el depósito de hierro mediante tinción de Berlin Blue e
inmunohistoquimica con 8-hidrosil-2´-deoxyguanosina (8-OHdG) y
F4/80, y marcadores de inflamación mediante inmunohistoquimica de
CD68 en la pared de la aorta con y sin aneurisma
•Se investigó también en el modelo animal la influencia de la
restricción dietética de hierro en la formación del AAA
Acumulación de hierro en el aneurisma aórtico abdominal humano
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• En la pared de la aorta de los
pacientes con AAA se demostró un
acumulo de hierro, 8-OHdG, CD68
e infiltración de macrófagos que
no presentaba la pared de la aorta
de los pacientes sin aneurisma
Acumulación de hierro en la pared del AAA murino y los efectos de la restricción
dietética de hierro en el desarrollo del aneurisma
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IR: restricción de hierro
AngII-IR
Efectos de la restricción dietética de hierro sobre la respuesta inflamatoria y fibrótica
en los ratones con AAA inducido por AngII
Arterioscler Thromb Vacs Biol 35, 2015 Sawada H et al
IR: restricción de hierro
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Actividad de metaloproteasa de matriz (MMP) y la expresión de distintas MAPKs y del
receptor de trasferrina (TfR1) en el modelo murino y en pacientes
Arterioscler Thromb Vacs Biol 35, 2015 Sawada H et al
Efecto de la quelación de hierro en MMP y la fosforilacion de JNK en cultivo celular
Arterioscler Thromb Vacs Biol 35, 2015 Sawada H et al
Conclusiones y aspectos relevantes
Arterioscler Thromb Vacs Biol 35, 2015 Sawada H et al
1. Este trabajo muestra el papel del estrés oxidativo en la patogénesis del AAA.
El estrés oxidativo ocasiona un trastorno estructural en la pared de la aorta a
través de la activación de inflamación y de enzimas proteolíticos que
progresivamente van debilitando la pared lo que facilita la formación del
aneurisma. En concreto, hay una activación MMP-2 inducida por la
fosforilación de JNK.
1. El estudio pone de manifiesto la importancia del hierro como mediador del
estrés oxidativo en la pared del aneurisma así como, la posible existencia de
una alteración en la homeostasis del hierro en la pared del vaso que facilita
su acumulo dado el aumento del receptor de trasferrina 1 en el aneurisma.
Además, la disminución de la ingesta de hierro o el uso de quelantes de
hierro mejora estas alteraciones
1. Estos resultados apuntan al hierro como un elemento clave en el desarrollo
del AAA y que la limitación de la ingesta del mismo puede ser una nueva
estrategia terapéutica para limitar su formación. Será preciso que se realicen
estudios a largo plazo para ver riesgos-beneficios de esta estrategia
M Sanchez de la Torre et al J Am Coll Cardiol 66, 2015
• La apnea obstructiva del sueño (SAOS) se asocia con un aumento de la
morbimortalidad CV, y es un causa frecuente de HTA resistente (HTA-R)
• El tratamiento con CPAP de forma continua mejora el control de la HTA
aunque la respuesta es variable, entre un 25-30% de pacientes no presentan
mejoría de la PA sin que se conozca la causa
• Los microRNA (miRNA) regulan el proceso post-trascripcional y es conocido
su implicación en el desarrollo de diversas enfermedades entre ellas las
enfermedades CV
M Sanchez de la Torre et al J Am Coll Cardiol 66, 2015
Objetivos:
•Investigar si varones con SAOS e HTA-R tienen un perfil concreto de miRNA que
discrimine aquellos pacientes con una respuesta favorable de la PA al tratamiento
con CPAP
•Estudiar si hay diferencia en las características de los miRNA así como, de las
hormonas y péptidos relacionados con el sistema CV en pacientes con SAOS e
HTA-R antes y después de una respuesta favorable a la CPAP
Objetivos / Material y Métodos
Material y métodos:
•Se incluyeron varones con SAOS e HTA-R procedentes de un ensayo
multicentrico controlado que evaluó el efecto en el nivel de la PA de tres meses de
tratamiento con CPAP
•Aislamiento de miRNA del plasma con array comercial de miRNA relacionado con
enfermedades CV. Los miRNA identificados se confirmaron con RT-PCR
cuantitativa
•Determinación de diversos péptidos y hormonas en plasma
•Técnicas de bioinformática para identificar el perfil de miRNA que se asocia con
buena respuesta de la PA a la CPAP así como, para el estudio de las vías de
señalización donde están involucradas estos miRNA
M Sanchez de la Torre et al J Am Coll Cardiol 66, 2015
Resultados
M Sanchez de la Torre et al J Am Coll Cardiol 66, 2015
Resultados
• El estudio de los miRNA del sistema CV comparando los pacientes con
mejor y peor respuesta de la PA al tratamiento con la CPAP mostro una
expresión diferencial en 47 de los 87 miRNA estudiados.
M Sanchez de la Torre et al J Am Coll Cardiol 66, 2015
Resultados
M Sanchez de la Torre et al J Am Coll Cardiol 66, 2015
Resultados
•El análisis de enriquecimiento mostro que estos miRNA están
implicados en distintos procesos biológicos relacionados con el cáncer,
las enfermedades cardiovasculares, la transducción de señales, así
como con el sistema endocrino y el sistema nervioso
•En el estudio hormonal, los pacientes con una respuesta más
favorable de la PA al tratamiento con CPAP presentaron una
disminución significativa del ratio aldosterona/renina en relación a
los peor respondedores
M Sanchez de la Torre et al J Am Coll Cardiol 66, 2015
Conclusiones
1. Han identificado un perfil concreto de miRNA relacionado con patología CV
que discrimina de forma especifica que pacientes con HTA-R y SAOS tratados
con CPAP responden favorablemente con un descenso de la PA
1. Han desarrolla un modelo sencillo “HIPARCO-score” a partir del estudio en
sangre de estos biomarcadores genéticos que permitiría conocer a priori la
respuesta de los pacientes a la CPAP y así, identificar aquellos pacientes que
van a necesitar intervenciones adicionales para el control de la HTA
1. El tratamiento con CPAP en los pacientes con SAOS e HTA-R induce una
modificación en miRNA implicados en procesos biológicos especialmente
relacionados con las enfermedades CV y procesos neoformativos. Esto estaría
en línea con el mayor riesgo CV que presentan estos pacientes aunque está
por demostrar la disminución del mismo con el tratamiento con CPAP
1. La disminución del ratio aldosterona/renina en el grupo de pacientes
respondedores frente al no respondedores sugiere un control del potencial
hiperaldosteronismo en los pacientes con SAOS e HTA-R y mejora de la PA
con la CPAP
1. La transfección de microRNA pro-angiogénico guiada por microburbujas y
ultrasonidos (UTMD) conduce a una entrega del plásmido en el lugar deseado
que aumenta la densidad vascular, y mejora de la perfusión microvascular de la
zona isquémica con mínima captación en órganos remotos. Se trata de una
técnica no invasiva con un potencial futuro para la terapéutica pro-angiogénica
mediada por miRNA
Conclusiones finales
2. En la pared del AAA se produce un acumulo de hierro acompañado de
fenómenos de estrés oxidativo e inflamación. La restricción de hierro en la dieta
inhibe la formación del AAA por lo que podría ser una nueva estrategia
terapéutica para la prevención y progresión del aneurisma
3 En pacientes con SAOS e HTA-R se ha desarrollado a partir del estudio en
sangre de un grupo de miRNA un modelo denominado HIPARCO-score que
permitiría conocer a priori la respuesta de los pacientes a la CPAP y así,
identificar aquellos pacientes que van a necesitar intervenciones adicionales
para el control de la HTA
