Reviviendo una enzimaPara 1950, los cientficos se haban dado cuenta de que el ADN contena el cdigo que permita la sntesis de protenas. Sin embargo, como una cadena de aminocidos formaba una completamente funcional protena, con su estructura tridimensional, segua siendo un misterio. Un mecanismo deba existir para asegurar la formacin adecuada de la protena. Pero de donde vino esa informacin? En 1957, Christian Anfinsen publico la primera evidencia de que la informacin para la correcta formacin de la protena se encontraba dentro de ella misma.AntecedentesLas protenas estn conformadas por la combinacin de 20 aminocidos que luego se organizan en estructuras complejas. A la cadena de aminocidos desenrollada o simplificada se le denomina estructura primaria. Para tener una actividad biolgica, la protena debe doblarse para formar correctamente tanto la estructura secundaria como la terciaria. Estas estructuras se mantienen unidas mediante interacciones qumicas entre la cadena de aminocidos, incluyendo puentes de hidrogeno, interacciones hidrofobicas, y a veces, enlaces covalentes. Como se forman estas estructuras ha sido un misterio durante un largo tiempo. Acaso la protena se dobla correctamente a medida que es sintetizada o se requiere la accin de otras protenas para doblarla? Puede doblarse correctamente sola de manera espontnea?En la dcada de 1950, Afinsen era un bioqumico interesado en la correcta formacin y doblamiento de las protenas. Especficamente, estaba investigando la formacin de los puentes bisulfuro, los cuales son enlaces covalentes entre cadenas laterales de cistena que sirven como una de las anclas ms relevantes que mantienen en su lugar la estructura de las protenas. El crea que la protena en si contena toda la informacin necesaria para su correcto moldeamiento. Propuso la hiptesis termodinmica, que plantea que la estructura biolgicamente activa de una protena era tambin la ms estable termodinmicamente bajo condiciones en vivo. En otras palabras, si las condiciones intracelulares pudieran ser reproducidas en un tubo de prueba, entonces una protena tendera a moldearse en su conformacin activa. Comenz su trabajo en una enzima secretada, bovina ribonucleasa pancretica, y estudio sus habilidades para moldearse correctamente fuera de una clula. El experimentoLas protenas cumplen una gran variedad de funciones en una clula. Sin importar su funcin, una protena debes estar moldeada correctamente para cumplir su funcin biolgica. Para estudiar el moldeamiento de las protenas es mejor estudiar una enzima cuya actividad biolgica pueda ser monitoreada fcilmente al ponerla in vitro. Anfinsen escogi una pequea protena secretada, la ribonucleasa, con la cual poda monitorear un moldeamiento correcto al ensayar su habilidad para catalizar la escisin del ARN.La ribonucleasa, una protena secretada, es activa bajo condiciones oxidantes in vitro. La estructura terciaria de la ribonucleasa activa se mantiene unida por cuatro puentes bisulfuros. Adicionando un agente reductor, el cual reduce el enlace bisulfuro entre dos cadenas opuestas de cistena a dos grupos libres de sulfhdrico, se puede interrumpir esta interaccin covalente. La desnaturalizacin completa de la ribonucleasa requiere el tratamiento con un agente reductor. Anfinsen monitoreo la reduccin de la ribonucleasa midiendo el nmero de grupos libres de sulfhdrico presentes en la protena. En el estado oxidado, no existen grupos libres de sulfhdrico en la ribonucleasa debido a que cada residuo de cistena est comprometido en un puente bisulfuro. En el estado completamente reducido, por otro lado, la ribonucleasa contiene ocho grupos libres de sulfhdrico. Anfinsen aprovecho esta diferencia para acceder a la extensin de la reduccin al utilizar ensayos espectrophotometico para valorar el nmero de grupos sulfhdricos.Para estudiar el moldeamiento de una protena fuera de la clula, uno debe en primer lugar, desnaturalizar la protena. Las protenas son fcilmente desnaturalizadas por altas temperaturas, interrupciones mecnicas como agitar, y tratamiento qumico. Las protenas con puentes bisulfuro necesitan una cantidad de tratamientos adicional con un agente reductor para romper estos enlaces covalentes. Para desnaturalizar la ribonucleasa, Anfinsen primero redujo los puentes disulfuro con cido thioglicolico. Luego desnaturalizo la protena al usar una alta concentracin de urea e incubando la solucin a temperatura ambiente. Demostr que este tratamiento haba sido efectivo para inactivar la enzima al mostrar que la ribonucleasa era ahora incapaz de catalizar la escisin de RNA. Usando el espectrofotomtrico de ensayo, mostro que la ribonucleasa contena ocho grupos sulfhdricos, los que correspondan a los cuatro puentes disulfuro rotos. Con una protena completamente desnaturalizada y reducida en su mano, Anfinsen ahora se poda preguntar; Puede una enzima desnaturalizada moldearse in vitro y volverse activa nuevamente?Para encontrar la respuesta. Anfinsen permiti que una solucin de ribonucleasa reducida y desnaturalizada se oxidara. Removi la urea de la enzima desnaturalizada por decantacin. A continuacin re suspendi la ribonucleasa desnaturalizada y libre de urea en una solucin amortiguadora y la incubo por dos a tres das. La exposicin a oxigeno molecular en la atmosfera oxido los residuos de cistena. Luego comparo la actividad de la ribonucleasa re naturalizada con la actividad de la enzima natural. En los primeros experimentos, 12-19% de la protena previamente inactiva pudo catalizar la escisin nuevamente. Las protenas estaban agregadas en grandes concentraciones, lo que haca difcil el volver a moldearse de manera adecuada. Al reducir la concentracin de ribonucleasa en solucin, Anfinsen mostro que hasta el 94% de la protena poda ser nuevamente moldeada (ver tabla). La enzima haba vuelto a su forma activa fuera de la clula, demostrando asi que la informacin necesaria para que la protena se organice en su posicin activa esta ya contenida en ella misma.Discusin:A travs de experimentos cuidadosos, Anfinsen demostr que la informacin requerida para la correcta organizacin de la protena est contenida en su estructura primaria. Su cuidadoso anlisis de la qumica de este proceso respondi a una pregunta fundamental en biologa. Demostr luego el reordenamiento de otras enzimas fuera de la clula, incluyendo protenas que no contenan puentes disulfuro. Mientras que es posible ordenar un numero de protenas fuera de la maquinaria natural dentro de la clula, este proceso es tremendamente acelerado in vivo por un numero de enzimas. Anfinsen contino estudiando el problema de la organizacin espacial de las protenas. Aunque la hiptesis termodinmica no aplica para todas las protenas, la demostracin de Anfinsen de los reorganizamientos proteicos de ribonucleasa fuera de la clula dejo una marca en el campo de la bioqumica. En 1972, recibi el Premio Nobel de Qumica por su trabajo.