Sandra Suárez Ordóñez Santiago de Compostela, 27 Mayo 2010

Introducción §LMA: entidad heterogénea. Curso clínico, pronóstico diferentes.

§Conocimientos leucemogénesis:

Øadquisición secuencial lesiones moleculares: proliferación inadecuada y capacidad indefinida de autorrenovación

ØMayor conocimiento etiopatogénesis

ØIdentificación diferentes entidades diagnósticas características

ØEstrategias terapéuticas

ØNuevas dianas terapéuticas

CITOGENÉTICA

CARIOTIPO FISH

BIOLOGÍA MOLECULAR

diagnóstico pronóstico estrategias tto

etiopatogenia diagnóstico pronóstico monitorización estrategias tto dianas tto dirigido

Mutaciones puntuales Cariotipo Normal (CN)

RESUMEN DE LA CLASIFICACIÓN DE LA OMS 2008

LMA con anormalidades genéticas recurrentes. ­ LMA con t(8;21)(q22;q22); RUNX1­RUNX1T1. ­ LMA con inv(16)(p13q22) o t(16;16)(p13;q22); (CBFβ/ MYH11). ­Leucemia promielocítica aguda (LMA con t(15;17)(q22;q12)); (LMP/RARα) y variantes. ­LMA con t(9;11) (p22;q23); MLLT3­MLL ­LMA con t(6;9) (p23;q34); DEK­NUP214 ­LMA con inv(3)(q21q26.2) o t(3;3)(q21;q26.2); RPN1­EVI1 ­LMA(megacarioblástica) con t(1;22)(p13;q13); RBM15­MKL1 ­LMA con mutación de NPMM1 ­LMA con mutación de CEBPA

LMA relacionada con cambios mielodisplásicos.

LMA y SMD, relacionado con la terapia.

LMA no clasificada en otro grupo.

Sarcoma mieloide

Proliferaciones mieloides relacionadas con Sd Down

Neoplasia de células blásticas plasmocitoides dendríticas.

Citogenética GRUPO DE RIESGO FAVORABLE

GRUPO DE RIESGO INTERMEDIO

GRUPO DE RIESGO ADVERSO

Translocaciones balanceadas t(15;17)(q22;q12) t(8;21)(q22;q22) Inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22)

Cariotipo normal

Translocaciones balanceadas

t(9;11)(p22;q23)

Reordenamientos no balanceados

del(7q) del(9q) del(11q) del(20q)

Alteraciones numéricas

­Y+8 +11 +13 +21

Cariotipo complejo

Translocaciones balanceadas

inv(3)(q21q26)/ t(3;3)(q21;q26)

t(6;9)(p23;q34) t(6;11)(q27;q23)

t(11;19)(q23;p13)

Reordenamientos no balanceados del(5q)

Alteraciones numéricas

­5 ­7 MK

Citogenética

Citogenética: t(15;17) §t(15;17) (q22;q21) ; reordenamiento PML/RARα

§Determina un tratamiento y pronóstico específicos. §Tto con efectos diferenciantes del ácido transretinoico

§Resulta en la producción de una proteína de fusión que incluye RARA

§Otras traslocaciones del receptor pueden producir variantes LPA :

Øt(11;17)(q23;q21) PLZF/RARA §No resp ATRA. § Morfología hipogranular, núcleo regular, No bastones Auer. Pelgueroides

Øt(17;17)(q11;q21)STAT5B/RARA Resistencia ATRA Ø t(5;17)(q35;q21) NPM/RARA

§Sensible ATRA. §Morfología mixta: formas hipergranulares e hipogranulares. No bastones Auer.

Øt(11;17)(q13;q21) NUMA/RARA

§Morfología: citoplasma hipergranular, núcleo irregular. MPO+/ LMA M3 FAB

§Factor independiente de Pronóstico favorable

Citogenética: t(8; 21) §t(8;21) (q22;q22)

§Reordenamiento de fusión: RUNX1 =AML1=CBFα (21q22) // RUNX1T1 = ETO (8q22)

§5­12% LMA, una de las traslocaciones recurrentes más frecuentes

§Morfología: maduración granulocítica. LMA­M2 de la FAB

§Pronóstico favorable. §Buena respuesta tto, alta tasa RC, larga SLE §(ARA­C a altas dosis)

§Mutación c­KIT (exón 17) y expresión CD56 parecen aumentar riesgo recaída

§70% otras alts cromosómicas: ­y; ­x; del(9q) §20­25% mutaciones c­KIT

Citogenética: inv 16 §inv (16) (p13q22) ó t (16;16) (p13;q22)

§Gen CBFβ (16q22; subunidad beta del CBF) se fusiona con el gen MYH11 (16p13) reordenamiento CBFB/MYH11

§Morfología: diferenciación monocítica y granulocítica +/­ eosinofilia. §LMA M4Eo de la FAB

§Pronóstico favorable en niños y adultos. §RC y larga SLE con ARA­C altas dosis

§Pacientes c­KIT (exón 8): alto riesgo recaída §Pacientes c­KIT (exón 17): SG más corta §Trisomía 22 empeora el Px

§10­12% LAM

inv(16)(p13q22) t(16;16)(p13;q22)

§ 40% asociadas alteraciones 2ª (+22 específica,+8 no específica) § 30% mutación c­KIT

Citogenética: t(11q23) §5­6% de LMA. LMA niño (9­12%) y LMA 2ª tto inhibidores topoisomerasa II

§Morfología: diferenciación monocítica y mielomonocítica. M4 y M5 de la FAB

§Gran heterogeneidad: >50 parejas fusión diferentes determinan: diferentes Px y entidades (MLLT2: LLA)

§LMA niño: t(9;11)(p22;q23)MLL/AF9

§En LMA de novo 30 parejas: MLL/AF6; MLL/AF9; MLL/AF10; MLL/ELL; MLL/DPT

§Px intermedio según pareja fusión

§Histona metiltransferasa de complejos proteicos implicados en transcripción

§t(9;11) asociada +8 sin cambios Px

§>1/3 precisa técnicas moleculares Dx

Citogenética: MK “Monosomal Karyotype in Acute Myeloid Leukemia: A Better Indicator of Poor Prognosis Than a Complex Karyotype” Dimitri A. et al. J. Clin Oncol, 2008

ØDefinición MK: ”LMA no CBF con al menos 2 monosomías autosómicas ó 1 monosomía autosómica en combinación con al menos 1 alteración estructural”

ØConclusiones: factor de pronóstico precario independiente de:

§Edad, §cariotipo complejo, §otras alteraciones mal Px

§Estudio: n=1975 pacientes LMA (15­60 años) recogidos entre 1987 y 2004

§Controversias del Cariotipo Complejo: definición, resultados,…

Biología Molecular §Limitaciones estudio citogenético: mutaciones puntuales, CN

§Implicaciones del conocimiento de las alteraciones moleculares: Øetiopatogenia Ønuevos factores pronósticos Øimplicaciones en el tto: ­estrategias tto adaptadas al riesgo

­dianas terapéuticas moleculares Ømonitorización (NMP1?)

§Dos tipos de alteraciones moleculares:

ØMutaciones Clase I:

ØMutaciones Clase II: bloquean la diferenciación/ factores transcripción

aumentan la proliferación y disminuyen la apoptosis/ factores transducción

CEBPA,NPM1 ó p53, WT1

FLT3, c­KIT, K­RAS

Alteraciones Moleculares Schlenk R et al. N Engl J Med 2008

Mutaciones Clase I: FLT3 §Codifica un R de mb tirosín quinasa tipo III, implicado en proliferación y diferenciación celular.

§Se expresa en progenitores hematopoyéticos y blastos de LMA

§Es la más frecuente. En 1/3 LMA (incluyendo de CN) y en los SMD §Se asocia a: § progresión de SMD a LMA § LPA, LMA­CN, t(6;9)(p23q34)

§Vías de señalización que activa FLT3:

Øras/quinasa mitógena­activada (MAPK) Øquinasa Janus 2 (JAK2) / STAT5 Øquinasa fosfatidilinositol 3/AKT

§Su mutación produce la activación constitutiva del R.

Mutaciones Clase I: FLT3 Dos tipos de mutación:

Ø 75­80%: mutación en el dominio yuxtamembrana: duplicaciones interiores en tandem (FLT3­ITD) con variaciones en su longitud:

Ø 20­35%: mutación del dominio TK (FLT3­TDK):

§20­27% LMA adultos // 5% LMA niños <5 años §Factor de mal Px independiente. Alto RR y baja OS §Ratio alelo mutado/alelo normal §Tamaño del segmento DTI §Morfología: variante microgranular (M3v) del LPA e hiperleucocitosis

§D835 y D836 (2º dominio TK) §5­7% LMA §No claro valor Px

Etiopatogenia:

Se expresa en progenitores M y L Pierde su expresión durante la maduración Modelos murinos:

FLT3 ITD induce mieloproliferación FLT3 TKD induce enf linfoide oligoclonal Ninguno induce leucemia por sí mismo

Probables eventos secundarios cooperantes

Factor Pronóstico

§No claro el valor pronóstico de FLT3 TKD §FLT3 ITD implican peor Px en LMA­CN ØMutación per­sé o carga mutacional ØPunto de corte de la ratio

Implicaciones tto:

Inhibidores TK:

FLT3

PKC­412 CEP­701 MLN518 SU11248

Mutaciones Clase I: c­KIT

§Dos tipos de mutaciones: ØLocalizadas en exón 8 extracelular ØMutaciones bucle de activación, codón 816 del exón 17

§Baja frecuencia, en algún subgrupo más elevado: LMA con t(8;21) Inv(16) / t(16;16)

§Morfología: 70% de LMA c­KIT: LMA M2 de FAB

ØLMA en niños: no claro su valor pronóstico

LMA­CBF con c­KIT (en codón 816 y exón 8): alta incidencia recaída.

Algunos estudios de c­KIT en codón 17: SG y SLR inferior

§Glicoproteína transmembrana de 145 KD. De la familiaTirosín Kinasas III

§Implicada en varias patologías tumorales no hematológicas

Mutaciones Clase II: NPM1

Øimplicada en la respuesta apoptótica al estrés ØParticipa en ciclo celular ØChaperona que impide la agregación proteica en nucleolo

§Fosfoproteína nucleolar codificada por el gen de la nucleofosfamida (5q35)

§Multifunción:

§30% de LMA adulto de novo. El 50% de LMA­CN. §Aumenta su prevalencia con la edad y en sexo femenino

§Mutación exón 12 (70­80% mut A): Øalteración en región C­terminal Øpérdida triptófanos posición 288 y 290 Øganancia NES: exporta del núcleo Fosfoproteína nucleolar B23 o numatrina

§Hasta 40 variantes de mutación descritas.

§En el 40% coexiste con mutación FLT3

Mutaciones Clase II: NPM1

§Pronóstico favorable en función de FLT3: ØNPM1 con FLT3 negativo: Buen pronóstico y respuesta tto ØNPM1 con baja carga mutacional de FLT3: dudoso ØLMA niños: menos frecuente, menos estudios sobre Px

§Implicaciones tto: ØDianas terapéuticas: ATRA ØSu mutación confiere buen pronóstico (si FLT3 no mutado) y condiciona estrategia terapéutica en grupo de riesgo intermedio

§Morfología: Blastos de núcleo hendido. LMA M4, M5 y M5b de FAB. §Fenotipo: presenta baja expresión de CD34

§Etiopatogenia: localización aberrante en citoplasma células leucémicas. Alteración ciclo celular y apoptosis (alteración actividad y estabilidad p53)

§Inmunohistoquímica: detecta la proteína aberrante en citoplasma blastos

Mutaciones Clase II: NPM1

NPM1

Etiopatogenia

Alteración del ciclo celular y de la apoptosis

Factor Px

Favorable en función de FLT3: ØNPM1+ y FLT3­: buen Px ØNPM1+ y FLT3+: mal Px ØNPM1+ y baja carga FLT3¿? ØEn niños: pocos estudios ¿?

Implicaciones tto

Establece Subgrupos en Riesgo intermedio

EMR

Alt molecular más cte

No consenso actual

Mutaciones Clase II: CEBPα §Factor de transcripción localizado en crom 19q13. §Diferenciación progenitores a neutrófilos maduros (inhibe expresión c­MYC). § Presente en las células mielomonocíticas.

§Su mutación bloquea maduración progenitores a neutrófilos sin afectar otras líneas celulares

§Morfología: LMA M1 y M2 de la FAB

§Dos tipos de mutaciones: ØN­terminal: impide expresión proteina ØC­terminal: dificulta su unión al ADN o inhibe su dimerización

§Pronóstico: ØEn ausencia FLT3: Buen Px ØEn LMA­CN: Px similar a grupo de Bajo Riesgo (SG y SLE favorable) ØCoexistencia otras mutaciones: no claro valor Px

§15% LMA adultos con CN (<60 a) / 5% LMA niños

ADN

cremallera

Mutaciones Clase II: CEBPα

Factor Px

§Mutación simple: no alteración Px §Mutación doble (bialélica): Px favorable

§Fármacos dirigidos

CEBPα

Etiopatogenia

ØAlteración diferenciación celular (favorece el proceso leucémico por bloqueo de la diferenciación en línea mielomonocítica)

Tratamiento

§En su mutación bialélica establece un subgrupo de bajo riesgo en LMA­CN

Mutaciones Clase II: WT1

§El papel de gen WT1 o tumor de Wilms (11p13) aun no ha sido clarificado en la hematopoyesis pero su sobreexpresión se detecta en varios tipos de leucemia, por lo que se podría utilizar como marcador de enfermedad residual.

§Aporta peor Pronóstico a LMA con cariotipo normal:

ØPeor tasa de RC tras tto inducción en LMA­CN y FLT3­ITD ØSLE y OS disminuyen

¿ ¿ ? ?

Sobreexpresión génica ØMutaciones de los genes implicados en el ciclo celular y apoptosis

1­ la sobreexpresión de : BAALC, ERG, MN1 o EVI1, en ausencia de translocaciones, parecen tener importancia pronóstica.

2­ El gen BAALC (8q22) se expresa en progenitores hematopoyéticos. En LAM ­ CN se asoció a inferior SG, SLE en pacientes con FLT3­WT.

3­EL gen ERG pertenece a una familia de factores de transcripción implicados en la regulación de la diferenciación celular y apoptosis. En LAM ­ CN: su sobreexpresión se asoció a pronóstico adverso.

4­El gen MN1 y EVI1 se han asociado a pronóstico adverso §EVI1 (3q26) asociado o no a MDS1 implica pronóstico precario con muy mala respuesta al tratamiento

5­No punto de corte de la normalidad/sobreexpresión ni consenso actual

EMR

§Sobreexpresión génica: WT1 sobreexpresado en blastos Øno claro cut­point Øno consenso actual

§Alteraciones moleculares: NMP1 ??? Øvariabilidad inter e intra­individual Øno consenso actual

§Alteraciones citogenéticas: Øseguimiento mediante cariotipo­FISH­PCR: t(15;17); t(8;21)…

§Progresivamente + objetividad y sensibilidad:

§Detección de : 1. targets específicos de leucemia: Øgenes de fusión: PML­RARA; RUNX1­RUNXT1;CBPB­MYH11 Øo mutaciones: NPM1

2. sobreexpresión génica: WT1

morfología inmunofenotipo citogenética molecular

Tratamiento: dianas moleculares

FLT3 inhibidores

PKC­412 CEP­701 MLN518 SU11248

ØFase I y II: monoterapia en recaída o refractariedad §Respuesta en LMA con FLT3 activa y no activa mediante vías alternativas

ØEstudios in vitro: sinergia con QT §Fase III: CEP­70 + MEC o HiDAC en recaída PKC­412 + Ara­C y Daunorubicin / HiDAC en LMA de novo §Fase I/II MLN518 + Ara­C y daunorubicin en LMA de novo

Inhibidores farnesyl transferasa

R115777 (Zarnestra) Tipifarnib

ØIn vitro: Zarnestra inhibe proliferación, induce apoptosis

ØFase II: Tipifarnib monoterapia; mantenimiento en >2ª RC; tipifarnib + Ara­C e idarubicina

ØInhiben farnesilación Ras, inhibiendo su paso a mb

Tratamiento: dianas moleculares ØReexpresión genes supresores y proapoptóticos

Demetilantes ADN HDAC inhibidores

Moduladores transcripción ØDemetilantes:5­azacitidina y 5­aza­2’­deoxicitidina

ØHDAC i: MS­275; MG­0103; vorinostat; Ác valproico; depsipeptido(FK­228); fenilbutirato sódico

ØFase I/II: demetilantes+iHDAC

Moduladores multirresistencia­1

Oligonucleótido anti Bcl­2

Oblimersen ØDegrada ARNm de la proteina bcl­2 ØCombinado con Qt

Ø3ªG: especificidad P­gp, menos interacción CYP­3A4 XR9576(Tariquidar);

LY335979(Zosuquidar); R101933(Laniquidar) ONT­ 093:

1ªgeneración 2ªgeneración 3ªgeneración

Ø1ªG: Ciclosporina Ø2ªG: PSC­833 (Valspodar): poca eficacia y toxicidad

Øbcl­2: estabilizador mb mitocondria: antiapoptosis

§Gen resistencia multidrogas­1: 170 kD p­gp: “pump”

Conclusiones

5% MLL­PTD

t(15;17)/PML­RARA 11%

t(8;21)/RUNX1­RUNX1­T1 8% 3% INV(3)/T(3;3)/EVI­1

ADVERSE

12% FLT3­ITD/NPM1 wt

INTERMEDIATE 21% CEBPA mut(biallelic)/FLT3­ITD neg 3%

NPM1 mut/FLT3­ITD neg/WT1 wt 18%

FAVORABLE

14% otras

Inv(16)/t(16;16)/CBFB­MYH11 5%

ØCitogenética convencional (cariotipo) + FISH+ Biología Molecular

ØContinuos cambios subgrupos riesgo: estrategias terapéuticas

ØEMR: no consenso actual marcadores moleculares específicos y sensibles

ØBúsqueda alteraciones independiente simplifiquen algoritmo tto: MK?

ØTto dianas moleculares

Conclusiones