Exposición Grupo 6 Mutagenesis de ADN Clonado SEGUNDO PARCIAL
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SECCIÓN I - INTRODUCCIÓN
Facultad de Medicina
Genética – 1er Curso
Tema 1. TÉCNICAS BÁSICAS DE GENÉTICA MOLECULAR
Facultad de Medicina
1TEMA 1
TÉCNICAS BÁSICAS DEGENÉTICA MOLECULAR
Genética – 1er Curso
1.1 Tecnología del ADN recombinante.1.2 Enzimas de restricción.1.3 Hibridación de ácidos nucleicos. PCR. Secuenciación del ADN.
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1.1 Tecnología del ADN recombinante
Apartados
Clonación de ADN
Fago lambda ()
Vectores de clonación
Vectores de expresión
Cósmidos
Aplicaciones de la clonación de ADN
Clonación de ADNTecnología del ADN recombinante
EcoRI EcoRI
Tetr Strepr/Sulfr
EcoRIEcoRI
EcoRI EcoRI
ADN Ligasa
Diagrama esquemático delprimer experimento de
clonación por Boyer y Cohen
Tetr/Strepr
Transformarbacterias
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Vectores de clonación
Plásmido pBR322, donde se aprecian:
Tecnología del ADN recombinante
(a) Sitios de restricción(b) Genes de resistencia a antibióticos(c) origen de replicación
Vectores de clonación
Clonación de ADN foráneo
Tecnología del ADN recombinante
mediante los extremoscohesivos del sitioPstI de pBR322.
Notar que el ADN foráneorompe el gen de resistencia
a ampicilina
Tetr/Amps
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Vectores de clonaciónTecnología del ADN recombinante
pUC18
pUC19
Estructura del plásmido pUC18/19, mostrando detallesDe los sitios de clonación multiple (Polilinkers)
Los MCSs mantienen la pauta de lectura del gen de la -galactosidasa
Vectores de expresiónTecnología del ADN recombinante
MCS
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Vectores de expresiónTecnología del ADN recombinante
GFP “reporter” en ratones adultos
lacZ “reporter” en un embrión de ratón de 11.5 días
Fago lambda ()
Bacteriófagos: virus queinfectan bacterias. Constande un genoma de ác.nucleicos dentro de una
l d
Tecnología del ADN recombinante
envoltura proteica deprotección llamada cápside.
Ciclos de infección.
Ha sido adaptado parausarlo como vector declonación.
Ventaja: el tamaño de los Ventaja: el tamaño de losfragmentos que puedenclonarse es mayor que en losplásmidos (10-20kb)
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Cósmidos
Estos vectores combinancaracterísticas de plásmidos -sitio de clonación multiple yresitencia a antibióticos- así
d f
Tecnología del ADN recombinante
como de fagos –secuencias cos,responsables del empaqueta-miento del fago en la cápside-.
Pueden clonarse 40-50kb.
YACYAC
YAC:
Tecnología del ADN recombinante
“Yeast Artificial Chromosome”
Cromosoma artificial de levadura
Pueden clonarse 300kb-1Mb.
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Aplicaciones
Importantes contribuciones a muchas áreas de investigación:
identificación de genes implicados en enfermedades
Tecnología del ADN recombinante
construcción de mapas genómicos
producción de proteínas recombinantes
creación de organismos modificados genéticamentecreación de organismos modificados genéticamente.
1.1 Tecnología del ADN recombinante (I)Objetivos
Clonaciónde ADN
Esta técnica permite aislar y copiar secuencias de ADN individuales a partir demezclas complejas permitiendo el análisis detallado y la manipulación. El ADN aclonar se recombina con un vector y se introduce en las células huésped dondese copia. El vector recombinante se purifica de cultivos de células huésped y elADN clonado puede recuperarse para su análisis.
Son moléculas de ADN circular pequeñas encontradas en bacterias y que seusan como vectores de clonación. Los plásmidos se purifican fácilmente yconfieren resistencia a antibióticos al huésped permitiendo la fácilidentificación de recombinantes. Otro sistema de selección consiste en laruptura del gen lacZ por inserción de ADN extraño.
Vectores deexpresión
Se han desarrollado muchos vectores que permiten la expresión de genesdentro de insertos clonados mediante transcripción regulada por un fuertepromotor en el vector. En algunos casos, p. ej. utilizando vectores deexpresión T7, una gran proporción de la proteína total en las células E.colipuede consistir en el producto deseado
Vectores declonación
Fago lambda () El bacteriófago , que infecta E. coli, ha sido adaptado como unvector de clonación. La porción central se reemplaza con ADN ajeno.El ADN recombinante del fago se empaqueta in vitro en cápsides queinfectan E. coli produciendo áreas claras en las placas de agar. Seutilizan para construir librerías genómicas
puede consistir en el producto deseado.
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1.1 Tecnología del ADN recombinante (y II)
Objetivos
Cósmidos Son similares a los plásmidos, pero contienen secuencias cos de fago posibilitando empaquetarse en cápsides Los cósmidos infectan E coli y seCósmidos
Aplicaciones de laclonación de ADN
posibilitando empaquetarse en cápsides . Los cósmidos infectan E. coli y sereplican. Pueden acoger ADNs largos de 40-50kpb.
Esta técnica ha hecho importantes contribuciones a muchas áreasde investigación en biología.: identificación de genes implicados enenfermedades; construcción de mapas genómicos; producción deproteínas recombinantes, creación de organismos modificadosgenéticamente.
1.2 Enzimas de restricción
Apartados
Endonucleasas
Extremos cohesivos
Electroforesis en gel de agarosa
Secuencias de reconocimiento
Mapas de restricción
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Enzimas de restricción
Endonucleasas Las endonucleasas de restricción se identificaron en los años 60-
70. Fue el paso clave para poder clonar ADN.
Los sistemas de restricción-modificación se dan en muchasbacterias, constituyendo un mecanismo de defensa contra laintroducción de ADN extraño Consta de dos componentes:introducción de ADN extraño. Consta de dos componentes:- endonucleasa de restricción reconoce una secuencia cortasimétrica de ADN y corta el ADN en cada hebra en un sitioespecífico dentro de esa secuencia.- metilasa añade un grupo metil a una base C o A dentro de lamisma secuencia de reconocimiento en el ADN celular. Estamodificación convierte al ADN en resistente a la degradación porendonucleasas
Secuencias de reconocimiento Los enzimas reconocen una secuencia palindrómica entre 4-8 pb,
dando lugar a fragmentos de restricción de doble cadena conextremos salientes en 5’/3’ o romos Extremos cohesivos
Los extremos con salientes son cohesivos, de modo que puedenligarse diferentes ADNs si presentan los mismos extremos
caccgtgGAATTCacgaacaagtggcacCTTAAGtgcttgtt
acaacgaGAATTCctttatctgttgctCTTAAGgaaatag
EcoRIEcoRI
Secuencias de reconocimiento y Extremos cohesivosEnzimas de restricción
acaacgaG AATTCctttatctgttgctCTTAA GgaaatagP
OH
HO
P
EcoRI
caccgtgG AATTCacgaacaagtggcacCTTAA GtgcttgttP
OH
HO
P
EcoRI
l P
caccgtgGAATTCctttatcgtggcacCTTAAGgaaatag
ligasa + ATP
acaacgaGAATTCacgaacaatgttgctCTTAAGtgcttgtt
ligasa + ATP
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caccgtgG AATTCacgaacaagtggcacCTTAA Gtgcttgtt
DNA pol
Extremos romosEnzimas de restricción
DNA pol+ dNTPs
ligasa + ATP
caccgtgGAATT AATTCacgaacaagtggcacCTTAA TTAAGtgcttgtt
caccgtgGAATTAATTCacgaacaagtggcacCTTAATTAAGtgcttgtt
ligasa + ATP
Secuencias de reconocimientoEnzimas de restricción
De Sphaerotilus species
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Electroforesis en gel de agarosaEnzimas de restricción
Electroforesis en gel de agarosaEnzimas de restricción
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Electroforesis en gel de agarosa
La agarosa es un polisacáridoderivado de algas marinas, que formaun gel sólido cuando se disuelve ensoluciones acuosas a concentraciones
Enzimas de restricción
-
soluciones acuosas a concentracionesentre 0.5 y 2% (w/v).
Aplicando un campo eléctrico al gel enuna solución conductora deelectricidad, los fragmentos de ADNmigran a través del gel hacia elelectrodo positivo, dependiendo deltamaño y forma.y
El ADN se tiñe con bromuro de etidioy se visualiza por luz UV como unabanda naranja.+
-
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Electroforesis en gel de agarosaEnzimas de restricción
1086
43
21.5
6
4
3
2
1.0
1.51.4
0.7
0.50.4
0.3
0.2
1.0
1.51.4
0.7
0.5
+
0.7
0.5
0.1
0.05
3% 0.6%
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Mapas de restricciónEnzimas de restricción
6 kb 11 kb 5 kb 12 kbH
9 kb 8 kb
12 kb5 kb
PstI
PstI
4 kb 5 kb
7 kb1 kb
1 kb
7 kb5 kb
HindIII-B 6 kbHindIII-A 11 kb PstI-B 5 kbPstI-A 12 kb
PP
H
P
H
7 kb 4 kb 5 kb 1 kb 7 kb 5 kb 4 kb 1 kb
4 kbP H
MAPA FÍSICO DE UN ADN DESCONOCIDO
1.2 Enzimas de restricciónObjetivosEndonucleasas
S i
Son enzimas bacterianos que cortan (hidrolizan) ADN en determinadosfragmentos y de modo reproducible. En la bacteria forman parte delmecanismo de defensa restricción-modificación contra ADN extraño.Son los instrumentos básicos de la clonación génica.
Los enzimas de restricción cortan el ADN simétricamente en
Extremoscohesivos
El t f i
Secuenciasde reconocimiento
ambas cadenas en secuencias de reconocimiento palindrómicas,dejando libres un 5’-P y un 3’-OH. Dejan extremos romos osobresalientes.
Los extremos de cadena simple producidos por las enzimas de restricción soncohesivos, ya que pueden volverse a unir por emparejamiento de bases acualquier otro fragmento con extremos complementarios.
Los geles de agarosa separan el ADN lineal en base a su tamaño porElectroforesis engel de agarosa
Los geles de agarosa separan el ADN lineal en base a su tamaño, pormigración del ADN a través de su matriz bajo la influencia de uncampo eléctrico.
Mapas derestricción
Mediante restricción con endonucleasas solas o en combinación, se puedeconstruir un diagrama, mapa de restricción, de la molécula indicando los sitiosde corte y los tamaños de los fragmentos
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1.3 Hibridación de ácidos nucleicos. PCR. Secuenciación del ADN
Hib id ió l d d d Hibridación: proceso por el que dos cadenas de ácidos nucleicos que son complementarias se unen para dar una molécula bicatenaria.
La hibridación puede ser ADN-ADN, ADN-ARN.
Desnaturalización térmica
Hibridación de ácidos nucleicos
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Renaturalización
• La renaturalización tiene lugar enfriando la solución deADN
Hibridación de ácidos nucleicos
• Enfriamiento rápido sólo permite la formación deregiones locales de doble cadena formadas por la unión deregiones cortas complementarias
• Enfriamiento lento permite la complementariedadcompleta de las cadenas de ADN, ya que da tiempo a quecada cadena encuentre a la otra
• La renaturalización de regiones complementarias entrecadenas de ácidos nucleicos diferentes se llama hibridación
Hibridación de ácidos nucleicos
Esta fue la primera técnica analíticabasada en la hibridación de ácidosnucleicos, desarrollada por Ed Southern(Oxford).
Se utiliza para analizar la estructura delos genes.
pocillos paraCargar la muestra
Fragmentos de ADNSeparados por tamaño
Gel de agarosa
electroforesis Southern
Pasos:1 – extracción de ADN2 – Digestión con enzimas de restricción3 – Electroforesis4 – Transferencia5 – Hibridación6 - Autorradiografía
papel
mecha
membranaGel
transferencia
hibridación autorradiografíamembrana
híbridos(emiten radiación)
Bandas correspondientesa los fragmentos hibridados
Película de rayos X
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SouthernHibridación de ácidos nucleicos
SouthernHibridación de ácidos nucleicos
ADN teñido con bromuro de etidio
Autorradiografía con una sonda hibridada
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PCR
Apartados
Principio
Cómo trabaja
Aplicaciones
Componentes
PrincipioPCR
Copiar y amplificar secuencias específicas de ADN
miles de millones de veces en una
simple reacción enzimática.
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ComponentesPCR
Cuatro componentes fundamentales:
1) ADN molde conteniendo la secuencia de ADN a seramplificada
2) cebadores oligonucleótidos: “forward” y “reverse”
3) ADN polimerasa: Taq polimerasa
4) dNTPs: dATP dCTP dGTP dTTP4) dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Cómo trabajaPCR
Ver animación “PCR”.
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AplicacionesPCR
Detección de alteraciones genéticas que causanenfermedades.
Procesos de clonación del ADN Procesos de clonación del ADN.
Secuenciación de ADN.
Cualquier procedimiento que requiera mayor cantidad de ADNespecífico que la que es posible obtener del material departida.
RT-PCR: ADN complementario.
Cuantificación de la expresión de un gen: RT-PCR + PCR-Q.
ADN complementario Existe un tipo de virus cuyo genoma está formado únicamentepor ARN. Para propagarse ha de transcribirse en sentidocontrario: ARN ADN. Son los retrovirus. Posteriormente elADN li tú ld ARN í i L
AplicacionesPCR
ADN se replica y actúa como molde para nuevo ARN vírico. Laenzima que cataliza la reacción de ARN a ADN se denominatranscriptasa inversa. Esta enzima es importante en biologíamolecular, porque permite aislar rápidamente las regionescodificantes de un gen.
Si extraemos ARNm de un tejido, podemos sintetizar una cadenade ADN complementario (ADNc) mediante la transcriptasainversa ADNc es de cadena simple y puede obtenerse dobleinversa. ADNc es de cadena simple y puede obtenerse doblecadena mediante la PCR.
Este ADNc corresponde a los genes que estaban activos cuandose extrajo el tejido. Como el ARNm maduro sólo contieneexones, el ADNc equivale a los genes sin intrones.
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Secuenciación
Método de secuenciación de ADN mediante el protocolo de didesoxi nucleósido trifosfatos (ddNTP) (Sanger).
Secuenciación
base
HOHdNTP 2’3’
base
HHddNTP2’3’
base2’3’
5’ base2’3’
5’
dNTPHOH
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HOH23dNTP dNTP
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Basado en la reacción de la ADN polimerasa
Cuatro reacciones separadas
Secuenciación
Cuatro reacciones separadas
Cada mezcla de reacción contiene dATP, dGTP, dCTPy dTTP, uno de los cuales está marcado con P32
Cada reacción también contiene una pequeñacantidad de un didesoxinucleótido: ddATP, ddGTP,ddCTP o bien ddTTPddCTP o bien ddTTP
Método de terminación de cadena La mayoría de las veces, la polimerasa
utiliza nucleótidos normales y el ADN se
Secuenciación
utiliza nucleótidos normales y el ADN se sintetiza con normalidad
Ocasionalmente, la polimerasa utiliza un didesoxinucleótido, el cual se añade a la cadena inhibiendo la unión de más nucleótidos en esa cadenaL di ió l d dddd l ótidl ótid La adición al azar de dddd--nucleótidnucleótidoossdeja (idealmente) al menos unas pocas cadenas terminadas en cada posición de nucleótido
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Secuenciación de ADN por el método de Sanger
ADN molde (simple cadena) 3’-G A G T G G T C A T A C T G T A-5’
Secuencia ADN sintetizada (codificante) 5’-C T C A C C A G T A T G A C A T-3’
- - - AReacción 1 - - - - - - A
Secuenciación
+ddATP - - - - - - - - - A- - - - - - - - - - - - A- - - - - - - - - - - - - - A
- TReacción 2 - - - - - - - - T+ddTTP - - - - - - - - - - T
- - - - - - - - - - - - - - - T
R ió 3
3’
Reacción 3 - - - - - - - G+ddGTP - - - - - - - - - - - G
C- - C
Reacción 4 - - - - C+ddCTP - - - - - C
- - - - - - - - - - - - - C
5’
manualautomática
Secuenciación
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Secuenciador automáticoSecuenciación
La PCR permite copiar y amplificar secuencias específicas de ADN millones deveces en una simple reacción enzimática.
Objetivos
1.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR (I)
Principio
Cómo trabaja
Componentes Cuatro componentes fundamentales: ADN molde conteniendo la secuenciade ADN a ser amplificada; 2) cebadores oligonucleótidos; 3) ADNpolimerasa; 4) dNTPs
El ADN es amplificado en 20-40 ciclos de síntesis de ADN. Cada ciclotiene tres pasos que se llevan a cabo a diferentes temperaturas: 1)desnaturalización: 90-95ºC; 2) hibridación: 40-60 ºC; 3) extensión: 72ºC.Cada molécula de ADN sintetizada actúa como molde para las siguientesreacciones, de modo que ésta aumenta exponencialmente en los sucesivos
Aplicaciones
q pciclos.
Extensivamente para el estudio de genes. Ha contribuido mucho al estudiode enfermedades hereditarias y en la investigación del cáncer. Tambiéntiene aplicaciones prácticas como diagnóstico de enfermedades hereditaras,medicina forense y biotecnología.
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Virus cuyo genoma está formado únicamente por ARN. Para propagarse su ARNdebe transcribirse en sentido contrario: ARN ADN. Posteriormente el ADNse replica y actúa como molde para nuevo ARN vírico.
Objetivos
Retrovirus
1.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR (y II)
Enzima que cataliza la reacción de ARN a ADN. Esta enzima es importante enbiología molecular, porque permite aislar rápidamente las regiones codificantesde un gen.
Transcriptasa inversa
ADNc: Se sintetiza mediante la transcriptasa inversa a partir de ARNmextraído de un tejido. Es de cadena simple y puede obtenerse doblecadena mediante la PCR El ADNc equivale a los genes sin intrones
ADN complementario
cadena mediante la PCR. El ADNc equivale a los genes sin intrones.