Sedimentacion

La sedimentación en la purificación de componentes celulares

• Introducción• Fuerza centrífuga relativa• Velocidad o tasa de sedimentación• Coeficiente de sedimentación• Tiempo de sedimentación• Centrifugación diferencial• Densidad de flotación• Gradientes de densidad y sus aplicaciones

La sedimentación en la purificación de componentes celulares

Sedimentación

Centrifugación

En función de la velocidad:

Centrifugas “normales”

Ultracentrifugas

Rotores y tubos propios

FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (RCF)

Permite comparar la fuerza a la que está sometida una partícula

centrifugada en distintos rotores

RCF=rw2/gRCF=rw2/gr = radio en mmw = velocidad angular en radianes por segundo g = aceleración de la gravedad (9807 mm/s2)(1 revolución =2π radianes; w=2πrpm/60 ó w=0,10472xrpm)

RCF=1,12r(rpm/1000)2RCF=1,12r(rpm/1000)2


ROTOR RPM RCF

GSA 10000 10240g

SS-34 10000

7796g


¿ A qué fuerza centrífuga relativa centrifugamos una muestra

en el rotor JA 18.1 si seleccionamos 10000 rpm?

Radio=105,3 mm

RCF=1,12x105,3x(10000/1000)2=12000g (aprox.)

FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (RCF)Determinación del radio

Rotor de

ángulo fijo

Tubo lleno

(cerrado,

tapón)

Rotor TLA 100.3

(ultracentrifuga)


rmin

Tubo no lleno:

Varian el rmin

y el rmedio

El rmax es invariable

para un determinado

rotor

rmedio

Rotor de

ángulo fijo


Rotor

Basculante


Rotor vertical

Usos más restringidos


Rotores de ángulo fijo:

Sedimentación más rápida (recorrido entre rmin y rmax menor)

Partículas sedimentan contra pared externa del tubo y deslizan

formando pellet en el fondo del tubo

Muy empleadosRotores basculantes:

Recorrido mayor que en el caso anterior, más tiempo de sedimentación

Muy empleados

Gradientes

Rotores verticales:

usos más restringidos

Características de los rotores de ultracentrifugas Beckman

“Nomograma”: permite relacionar

condiciones de centrifugación en

distintos rotores

Se traza una recta entre dos puntos

conocidos (radio, RCF o RPM) en

dos de las columnas.

El tercer valor

corresponde a la intersección de

la recta con la tercera columna

VELOCIDAD O TASA DE SEDIMENTACIÓN

La velocidad o tasa de movimiento de una partícula en un campo centrífugo está en función de una serie de factores.


– F centrífuga mw2r– F boyante

w2r x masa de solvente desplazado

w2r x volumen de la partícula (mv) x densidad del solvente (ρ)

– F de fricciónmv=volumen de la partícula

v= volumen parcial específico

(inverso densidad)

m=masa de la partícula

ρ=densidad del solvente

f=coeficiente de fricción

v=w2rm(1-vρ)

f

v=w2rm(1-vρ)

f

v=w2rm- w2rmvρ

f

v=w2rm- w2rmvρ

f


Se incrementa con:– Su tamaño/masa– Su densidad– El campo centrífugo (w2r)

y disminuye con:–La viscosidad y densidad del medio–El grado con el cual su forma se desvía de la forma esférica

v=w2rm(1-vρ)

f

v=w2rm(1-vρ)

f

COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN S

S=v/w2r, es igual a dr x 1dt w2r

S=v/w2r, es igual a dr x 1dt w2r

Segundosv=velocidad (cm/s)

w=velocidad angular (rad/s)

r=distancia al eje de rotación (cm)

COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN

S =Svedberg 1S = 10-13 s 100S = 10-11 s

S=v/w2rS=v/w2rv = w2 rm(1-vρ)

f

v = w2 rm(1-vρ)

f

S =m(1-vρ)

f

S =m(1-vρ)

f

El coeficiente de sedimentación da información sobre

la masa y la forma de la partícula

El valor del coeficiente de sedimentación depende de la densidady viscosidad de la solución en la que se hace la centrifugación

S20,w valores estándares (muestra en agua a 20 ºC)

Coeficiente de sedimentación (ejemplos)

TIEMPOS DE SEDIMENTACIÓN EN SOLUCIONES ACUOSAS

T = k/S , S en SvedbergsT = k/S , S en Svedbergs

Tiempo requerido para sedimentar una partícula en agua (no gradientes) a lo largo

de la longitud del rotor

k “clearing factor”: factor de clarificación para el rotor. El factor k de un rotor es una medida de la eficiencia de sedimentación del rotor (“rotor’s pelleting efficiency”)

Este factor depende del rotor y de la velocidad. Para un mismo rotor va disminuyendo a medidaque aumenta la velocidad.

k = ln(rmax/rmin) x 1013

w2 3600

k = ln(rmax/rmin) x 1013

w2 3600

(w en rad/s ó w=0,10472xrpm)

TIEMPOS DE SEDIMENTACIÓN EN SOLUCIONES ACUOSAS

Tiempo de sedimentación de la subunidad ribosómica 60S

Rotor TLA 100.3

80000 rpm

K=22

T = k/S=22/60=0,36 h

CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

Fuerza centrífuga

Tiempo de centrifugación

1 2 3 4

Las partículas se dirigen hacia el fondo del tubo según su tasa de sedimentación

Pellet o sedimento está enriquecido en las partículas que sedimentan más rápido

Método de enriquecimiento, no purificación

CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIALExtracto crudo

600 g, 3 min

Pelletnúcleos

Sobrenadante

Pellet (mitocondriascloroplastos, lisosomas yperoxisomas)

Sobrenadante

Sobrenadantecitosol

Pellet (Memb. Plasmáticafragmentos de Golgiy Ret. Endop.)

Sobrenadante

PelletSubunidadesribosómicas

6000 g, 8 min

40000 g, 30 min

100000 g, 90 min

Fraccionamiento subcelular:

fracciones enriquecidas en

determinados orgánulos

CENTRIFUGACIÓN ENGRADIENTES DE DENSIDAD

Densidad de flotación o

Posición isopícnica


Coeficientes de sedimentación

Densidades de flotación

Bandas de material bastante purificado

Gradientes más habituales: sacarosa y CsCl


Centrifugación zonal

coeficiente de sedimentación (tamaño, densidad, forma)

GradienteDe densidad

Muestra

gradientes de sacarosa (preformados) continuos o discontinuosmuestra se aplica en la parte superior del tuborotores basculantes (“swinging”)las partículas no alcanzan su densidad de flotación y a tiempos largos sedimentarían en el fondo

Aplicaciones: purificación de componentes

subcelulares


Centrifugación isopícnica

densidad de flotación

gradientes de CsCl gradiente se forma durante la centrifugaciónmuestra se mezcla con el CsClrotores fijos (o basculantes) las partículas alcanzan su densidad de flotación

Aplicaciones: purificación de DNA o virus


Densidades de flotación en sacarosa


Densidades de flotación en CsCl


APLICACIONESSeparación de RNAs ribosómicos o desubunidades ribosómicas de levaduras.Localización de 20S RNA (RNA vírico)

Extracto crudo de S. cerevisiaeA +fenol. RNAs ribosómicos

B –fenol. Subunidades ribosómicas

26S18S

60S40S

Gradiente de sacarosa del 10 al 40 %


APLICACIONES

+ - + -densidad

(3,4 Kb)

(1,6 Kb)

Localización de 20S RNA+ - + -

densidad

(2,5 Kb)


APLICACIONESLocalización subcelular de la proteína chs7

Memb. Plasm.

Ret. Endopl.

A. Golgi

Abajo(más denso)

Arriba(menos denso)

Gradiente de sacarosa del 10-65%


APLICACIONES

Determinación del Pm de una proteína encondiciones nativas.

Calibrado con marcadores de Pm conocido:Ovoalbúmina 45 kDaAldolasa 161 kDaCatalasa 244 kDa

Gradiente del 7 al 20% de sacarosa


APLICACIONES


APLICACIONES

Purificación de plásmidos mediante centrifugación isopícnica

en CsCl

Permite la separación del DNA genómico y plasmídico en función de su

distinta capacidad para unir el agente intercalante bromuro de etidio

La unión del bromuro de etidio baja la densidad del DNA

El DNA cromosómico une mayor cantidad lo que le confiere menor densidad

El DNA plasmídico une menor cantidad lo que le confiere mayor densidad


APLICACIONES

Purificación de un plásmido mediante centrifugación isopícnica

en CsCl ¡El CsCl no debe precipitar!Tener en cuenta:

Concentración de CsClVelocidad de centrifugaciónTemperatura de centrifugación

Curvas de precipitación del CsCl

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