• In Metodologías Analíticas para el Control

y la Evaluación de la Fortificación de Azúcar con Vitamina A

Ornar Da! y, Ph D GuIllermo Arroyave, Ph D

Con la colaboracIón de Hernando Flores, Ph O Flonsbela A C S Campos Maria Helena e B Llns

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, SEGUNDA EDICION

MANUAL PARA LA FORTIFICACION DE AZUCAR CON VITAMINA A

PARTE 3

CONTENIDO

AGRADECIMIENTOS

PROLOGO GENERAL

I INTRODUCCION

11 PROPIEDADES DEL RETINOL y DEL COMPUESTO DE VITAMINA A USADO EN LA FORTIFICACION DE AZUCAR

III PRINCIPIOS PARA LA DETERMINACION DE RETINOL EN PREMEZCLAS y EN AZUCAR FORTIFICADA A Metodo espectrofotometnco B Metodo colonmetrlco

IV DETERMINACION ESPECTROFOTOMETRICA DE RETINOL EN PREMEZCLAS A ReferenCia B Prmclplo C Puntos cntlcos y precauciones D EqUipo y matenales E ReactiVos F Procedimiento G Calculos

V DETERMINACION ESPECTROFOTOMETRICA DE RETINOL EN AZUCAR FORTIFICADA A ReferenCia B Prmclplo C Puntos cntlcos y precaucIOnes D EqUIpo y matenales E ReactiVos F Procedimiento G Calculos H Venficaclon de la recuperaclon del metodo

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VII

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3

7 7 8

9 9 9 9

10 10 10 11

13 13 13 13 14 14 14 15 17

VI DETERMINACION COLORIMETRICA SEMI-CUANTITATIVA DE PALMITATO DE RETINOL EN AZUCAR FORTIFICADA 19 A Referencias 19 B Pnnclplo 19 C Puntos cntlcos y precaucIOnes 19 D Matenales 20 E Reactivos 20 F Procedimiento 21

VII METODO VOLUMETRICO PARA LA DETERMINACION DE PEROXIDOS EN ACEITES 23 A Referencia 23 B Prmclplo 23 C Puntos CrItlCOS y precauciones 23 D Equipo y materIales 23 E Reactivos 24 F Procedimiento 25 G Calculos 26

VIII METODOS PARA LA DETERMINACION DE RETINOL EN SANGRE 27 A Introducclon 27 B Toma y manejo de las muestras 28

IX DETERMINACION ESPECTROFOTOMETRICA DE RETINOL SANGUINEO POR DESTRUCCION ULTRA VIOLETA DEL RETINOL 31 A Referencias 31 B Prmclplo 31 C Puntos cntlcos y precaucIOnes 31 D EqUIpo y matenales 32 E Reactivos 33 F Procedimiento 33 G Calculos 35 H Venficaclon de la reproduclblhdad del metodo 36 1 VertficaclOn de la recuperaclon del metodo 36 J Vanantes 37

X DETERMINACION DEL RETINOL SANGUINEO POR CROMA TOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC) 39 A ReferenCias 39 B Prmclplo 39 C Puntos cntlcos y precaucIOnes 40 D EqUIpo y matenales 40 E Reactivos 41 F Procedimiento 44 G Calculos 46 H Venficaclon de la recuperaclon del metodo 47

II

XI METODOS PARA LA DETERMINACION DE RETINOL EN LECHE HUMANA 49 A IntroduccIOn 49 B Toma y manejo de las muestras de leche 50

XII APLICACION DEL METODO ESPECTROFOTOMETRICO POR DESTRUCCION ULTRAVIOLETA PARA LA DETERMINACION DE RETINOL TOTAL EN LECHE HUMANA 51

XIII DETERMINACION DE RETINOL EN LECHE HUMANA POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC) 53 A Referencia 53 B Pnnclplo 53 C Puntos cntlcos y precaucIones 53 D EqUIpo y matenales 54 E ReactIVos 54 F ProcedImIento 57 G Calculos 59 H Venficaclon de la recuperaclon del metodo 60 1 Vanantes 61

XIV CONTROL DE CALIDAD DEL LABORATORIO 63 A Cntenos para el control de calIdad 63 B Rutmas del control de cahdad 65 C Cahbraclon del eqUIpo 67

xv LECTURAS SUGERIDAS 71

ANEXO 3 1 CONSTRUCCION DE UNA CAMARA DE IRRADIACION ULTRAVIOLETA 73

ANEXO 32 SUGERENCIAS PARA EL CUIDADO Y LAVADO DE LA CRISTALERIA y DE LAS CELDAS DE ESPECTROFOTOMETROS 77

ANEXO 33 PROVEEDORES, EQUIPOS, Y MATERIALES DE LABORATORIO 79

TABLAS

Tabla 3 1 Factores de Correclon de la Absorbancla del retmol a DIferentes LongItudes de Onda Cuando se usa Fuente de Luz VIsIble 8

FIGURAS

Figura 3 1 Estructura QUlmlca del Retmol y Derivados Figura 32 Grafica de Control de Cahdad de Azucar Fortificada Figura 3 3 AbsorbencIa del Retmol por TIempo de IrradlacIOn Anexo Figura 3 la Camara de Irradlaclon Anexo Figura 3 1 b Camara de IrradlacIOn (plano de construccIOn)

111

3 66 70 74 75

AGRADECIMIENTOS

Este manual se basa en la expenencIa de la fortlficaclOn de azucar del Instltuto de NutnclOn de Centro Amenca y Panama (lNCAP) Muchas personas han partIcIpado en este programa durante los ultlmos 25 años, y este manual representa el esfuerzo y el trabajo de todos ellos, qwenes son tantos que sería ImposIble mencIOnarlos mdlvldualmente

Los autores desean marufestar que el contemdo y presentaclOn de las partes 1, 2 Y 3 de este de este manual mejoro sensIblemente debIdo a las correccIOnes y sugerencIas de sus reVisores, a qwenes presentan un smcero agradeCImiento Fueron ellos Dra Frances R Davldson y Dr TImothy Qwck, de la AgenCia InternaCIOnal para el Desarrollo de los Estados Umdos de Amenca (USAID), Dr Juan R Agwlar, de UNICEF, Pero, Dr Jose O Mora, del Instltuto InternaCional de CIenCIa y Tecnologla (ISTI), Dr Lws MeJla, de la compañIa Kellogg para Latmoamenca,Ing Alberto Ntlson, de la compañIa Hoffman-La Roche para Latmoamenca, Dr Kenneth Brown, de la Umversldad de Callforma en Davls, Ing Leonardo De Leon, del INCAP, Dr Jean Humphrey y Dr Esse Yamem, de la Umversldad Johns Hopkms, y espeCIalmente la Dra Penelope Nestel, del programa "Opportunttles for MIcronutnent Interventlons" (OMNI)

La parte 2 de este manual, que trata sobre la descnpclon del proceso de fomficaclon, reune el conOCtm1ento y la expenenCla colectlva de vanas personas que han perfeccIOnado la tecnologla de la fortlficaclOn de azucar en Centro Amenca durante los ultImos dIez años Merecen espeCIal menclOn las slgwentes personas Ing Leonel Anleu, de la ASOClaClon de Azucareros de Guatemala (ASAZGUA), Dr Oscar Pmeda, ex-funclOnano del INCAP y actual consultor en mlcronutnentes, Guatemala, Dra Vllma Estrada, Dra Dons Chmchtlla, Ing Plutarco Munllo, e Ing Vlctona Sarat BeJarano, de Honduras, y Dr Manuel de GraCIa y Dr Ennque Munllo, de Panama

La parte 3 de este manual, que reune metodologlas analltlcas para la determmaclon de retmol, se escnblo con base en las contnbuclOnes, modIficacIones y mejoras que en este campo han proporcIOnado mIembros del Laboratono de Qwmtca y Bloqwmlca (LQB) del INCAP, entre qwenes deben menCIonarse a los slgwentes profeSIOnales Carolma Martmez, Dora Ines Mazanegos, Mana Elena Estrada de Sandoval, Esmeralda Morales, Momca Guamuch y Gerardo Pmr

El manual fue tradUCIdo al mgles por Mantza Mendez de OlIva y Carlos Clpnaru Oddette Sanabna de Osono se encargo de la elaboraclOn de las figuras Ingnd Cabrera, Hazel de Orellana y Ana Ruth de Burckhard realIzaron la labor secretanal para prodUCIr la verslOn en español, y, LIsa Sherbume y Pamela Cubberly dtagramaron y revIsaron la edlclon en mgles El trabajO de todas estas personas merece nuestro agradecImIento

ActIVIdades de apoyo, realIzadas en los años de 1992-94, y que en parte han servido de base a esta pubhcaclon fueron finanCiadas por ROCAP/AID mediante el proyecto 596-0169

V

PROLOGO GENERAL

En muchos paIses, la deficIenCIa de VItamma A es un problema generalIzado y no necesanamente lImItado a comurndades o poblacIones especIficas Entre las IntervencIOnes dlspombles, la fortIficaclon de alImentos es un medIo amplIamente aceptado y dIfundIdo en los paIses desarrollados, y que ha probado ser eficaz para el SUffilmstro de los nutnentes deseados a la poblaclOn En esos paIses, alImentos tales como leche en polvo, marganna y manteqUllla, alImentos InfantIles, y cereales para el desayuno estan normalmente fortIficados con rntcronutnentes, Incluyendo la vItamIna A Los alImentos mencIOnados, SIn embargo, no son consumIdos regularmente por la mayona de las personas de los paIses en desarrollo, especIalmente aquellos con el mayor nesgo de sufnr la defiCIenCIa de vltamma A Una excepCIOn es el azucar, alImento que puede ser fortIficado con vltamma A La fortlficaclon de azucar es practIca porque no reqUIere el cambIO de los habltOS alImentanos de la poblacIOn objetIvo, m el estableclmtento de un SIstema de dlstnbuclon especIfico y costoso La fortlficacIOn SImplemente reqUIere de la eXIstenCIa de un sIstema de produccIOn y comerclalIzaclOn del azucar que permIta el agregado uruforme del compuesto fortIficante y la supervlsIOn del proceso La fortlficaclon de azucar con vItamIna A es una de las mtervenclones mas seguras, eficaces y de mejor costo­efectIvIdad para preverur y controlar la defiCIenCIa de rucho rntcronutnente

Con el fm de SIstematIzar y faclhtar la Instauraclon y ejecuclon de programas de fortIficacIOn de azucar con VItamtna A, se ha elaborado este manual, el cual esta mtegrado por tres partes La parte 1, tItulada GUlas para el Desarrollo, OperaclOn y EvaluaclOn de un Programa de FortificaclOn de Azucar con VItamina A, ofrece pautas generales y baslcas para el establecImIento de un programa de este tIpo En esta se dIscuten las estrategIas eXIstentes para prevemr y redUCIr la defiCIenCIa nutncIOnal de la vltamma A, y se detallan los elementos baslcos que deben tenerse en conslderaclon para establecer un programa adecuado de fortlficaclon de azucar con vltamma A Ademas, ofrece una VlSlon general de todo el programa, para proveer, partIcularmente a los funclOnanos de los sectores pnvado y pubhco con funCiones de coordmacIOn y gerencIa, los conOClmtentos y elementos necesanos que aseguren su adecuado funCIOnamIento TOpICOS tecmcos de ese documento tamblen son de utIlIdad para el personal espeCIalIzado Involucrado en etapas espeCIficas del proceso de fortlficaclon, tales como operaCIOnes necesanas para llevar a cabo la fortlficacIOn del azucar, determmando tanto la efiCIenCIa como la eficaCIa de la mtervenclon, y gUlas para estImar los costos del programa

La parte 2, GUIa Tecnzco OperatIva para la PreparaclOn de la Premezcla y el Azucar Fortificada con VItamina A, esta dmglda espeCIalmente al personal tecruco encargado de ejecutar el proceso de fortlficacIOn El capItulo 1 cubre generalIdades del proceso de la fortlficaclon, el capItulo 11 presenta una seCCIOn espeCIfica que descnbe la fabncacIOn de la premezcla, y el capItulo 111 descnbe el procedlmtento para el agregado del compuesto VltamtmCO al azucar Ademas, esta parte mcluye una descnpclOn detallada de las actIVIdades de control de calIdad

La parte 3, Metodologzas Analztlcas para el Control y la EvaluaclOn de la FortificaclOn de Azucar con Vztamlna A presenta metodos de laboratono y de campo para estImar el contemdo

Vl1

de VItamIna A en la premezc1a y en el azucar fortIficada Este documento tamblen provee detalles para la determmaclOn de la VItamma A en muestras blOloglcas, lo que es mdlspensable en la evaluaclon de Impacto del programa de fortlficaclOn Esta parte esta dmglda fundamentalmente al personal de laboratono a cargo de determmaclOnes analltIcas

La lectura de los tres documentos descntos antenormente (partes 1, 2 Y 3) que conforman este manual revela que, ocasIOnalmente, se repIte cIerta Informaclon y algunos conceptos Estas repetIcIOnes no son el resultado de descwdos edltonales smo, por el contrano, se hacen a proposIto para resaltar su nnportancIa y confenrle a cada parte IndIVIdual una relatIva autosuficiencia en los aspectos más baslcos Sm embargo, la sltuaclon Ideal, y es 10 que aqUl se recomienda, es que las tres partes se conSIderen una urudad teonca y practIca y que sean utIlIzadas en conjunto para asegurar su papel complementano

La mveStIgaclon para la fortlficaclOn de azúcar con vltamma A pnnclplo en el InstItuto de Nutnclon de Centro Amenca y Panama (lNCAP) en los años sesenta, baJO el lIderazgo de GUIllermo Arroyave con el apoyo del Dr M Forman de USAID El desarrollo de esta tecnologla neceSIto aproxunadamente 10 años FInalmente a partIr de 1974, Costa RIca, Guatemala, Honduras y Panama legIslaron que el azúcar debla fortIficarse con vltamma A Con el apoyo de USAID, el INCAP demostro en forma concluyente que la foruficacIon de azucar con VItamIna A es eficaz y costo-efectiva El respaldo de USAID a este programa, reCIentemente a traves del proyecto OMNI, ha contInuado durante los años, esta ayuda ha contnbwdo a que la foruficacIOn de azucar haya mejorado en Centro Amenca, y ha estimulado su adopcIOn por otros paIses en Latlnoamenca

El estableCImIento de un programa eXItoso de fortlficaclon de azucar refleja el esfuerzo conjunto de la InlCIatIva pnvada, funcIOnanos publIco s, mvestIgadores y entidades de cooperacIon mternacIOnal El proposIto de este documento es compartIr las expenencIas de Centro Amenca, para que asI otros paIses puedan plamficar y establecer este tipo de programas con la finalIdad de controlar y prevenIr la defiCIencIa nutncIOnal de vItamma A

Frances DavIdson Oficma de Salud y NutncIOn, USAID Washmgton, D C

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Hernan Delgado INCAP/OPS Guatemala

l. INTRODUCCION

El laboratono es mdIspensable para la correcta operacIOn de un programa de fortIficacIOn de azucar con vItamma A Se reqUIeren metodologIas anahtIcas para venficar la concentracIOn de retmol tanto en la premezcla como en el azucar fortIficada Ademas, la determmacIOn de los ruveles de retInol en especImenes de suero sangUIneo y leche humana es esencIal para la evaluacIOn del efecto bIOlogICO de esta mtervencIOn

Los USuarIOS de este manual deben tener en cuenta que los laboratonos donde se llevan a cabo deterrnmacIOnes de retmol deben tener un area sm luz solar dIrecta o Ilummaclon muy fuerte El area de trabajo debe Ilummarse con tubos mcandescentes de luz amanlla SI estas condIcIOnes no son factibles, o aun como una precauCIon adIcIonal, los tubos de ensayo y recIpIentes que contienen solucIOnes de retmol pueden cubnrse con una tela negra en todo momento en que el procedImIento lo permIta Otra faCIlIdad que deben poseer estos laboratonos es la presenCIa de campanas de laboratono para redUCIr los nesgo s asOCIados con el uso de solventes volatIles e mflamables

Esta parte del manual pnncIpIa descnbIendo las propIedades generales del retmol y del preparado de retmol que se usa en la fortlficacIOn de azucar, con el proposIto de dar las bases sobre las que se fundamentan las meto do lOgIas anaIItICas SeguIdamente, aparecen seCCIOnes que descnben los metodos de laboratono,1 para determmar el conterudo de retmol en (a) premezcla y azucar fortIficada (mcluyendo la determmacIOn de permados en el aceIte vegetal, que se usa en la preparaCIOn de la premezcla), (b) en sangre, y (e) leche humana Cada una de estas seCCIOnes presentan generalIdades sobre los pnnCIpIOS y procedImIentos comunes de los metodos, descnpcIOn de sus ventajas y lImItaCIones, y gUIas para la toma y manejo de las muestras Una ultIma seCCIOn descnbe procedImIentos para control de calIdad de los metodos anaIItICOS Los anexos presentan la descnpcIOn y calIbracIOn de una camara de madIacIOn con luz ultraVIOleta, sugerencIas para el lavado y crudado apropIado de la cnstaIena dellaboratono, y un lIstado y dIreCCIOnes de los proveedores de los eqUIpos y reactIVOS necesanos para los ensayos anaIItICOS

1 A menos que sea especfficamente seftalado, los métodos que se mcluyen aquí son los que actualmente están en uso en el Laboratono de QuímIca y BIoquímIca del InstItuto de NutncIón de Centro Aménca y Panamá (INCAP)

1

11. PROPIEDADES DEL RETINOL y DEL COMPUESTO DE VITAMINA A USADO EN LA FORTIFICACION DE AZUCAR

El retmol es la forma actIva de la vltamma A, presente en los tejidos y fluidos del orgarusmo arumal pero no en plantas 2 En la naturaleza, el retmol se encuentra predommante estenficado con aCldos grasos, siendo el palmltato el ester mas comun Se encuentran ademas den vados del retmol con funCiones blOqU1mICas especificas, tales como el retmal y el aCldo retmOlco, en los cuales el radical a1cohohco pnmano (-OH) se ha oXidado a radIcal aldehIdo (-CHO) yacIdo (-COOH), respectIvamente La estructura qU1mICa del retInol y otros denvados se muestra en la figura 3 1

Figura 31 ESTRUCTURA QUIMICA DEL RETINOL y DERIVAD0S

CH2 0H M.W:D6.5

~

.,0 G.. H

M.W 2&4.5

~oftIIaaI

,,0 'OH

M.W 301.5

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° • e -C<ll.2>14 ~ M.W 524 ..

Ibdaol poo1m1tooIe

% ~ 'il C-01:3

D3 M.W 328.5

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2 En el remo vegetal no se encuentra retmol prefonnado, pero abundan los compuestos estructuralmente relacIOnados conocIdos como carotenoldes Solamente 50 de aproxImadamente 600 carotenOldes naturales dan ongen a retmol en el organISmo anImal y por eso se le reconoce como carotenOldes actIVOS precursores de vItarnma A De estos, el más actIVO es el beta-caroteno, lo cual lo hace el más Importante desde el punto de VISta nutrIcIOnal

3

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Manual para la Fortificac/On de Azucar Parte 3

En la sangre el retmol es transportado por una protema especIfica denommada la protema lIgadora de retmol En la leche, el retmol aparece estenficado con vanos aCIdos grasos Para la determmaclOn de retInol en suero (o plasma), las muestras se tratan con una mezcla etanolIca alcalma con el proposlto de lIberar el retmol del complejO y precIpItar las protemas En la leche, el retInol debe ser separado de sus esteres medIante sapomficaclOn

En la actuahdad, el retmol dlspomble comercialmente para usos farmaceutIcos o

mdustnales es smtetlco Sus presentacIOnes son en forma de ésteres, comúnmente palmltato y acetato, los cuales tIenen una mayor estabIlidad y son de más facd manejO El retmol y sus esteres son solubles facdmente en solventes orgánIcos y grasas, e InSolubles en agua Por esta razon, no pueden utIhzarse directamente para fortificar alimentos que se mezclen o disuelven con agua Sm embargo, la mdustna allInentICla ha producido preparaciones de vltamma A que son secas y InlscIbles en agua, tales como Inlcroencapsulados de esteres de retInol Esto ha permItIdo el desarrollo de tecnologIas para la fortlficaclon de allInentos de base seca o ludrosoluble, mcluyendo el azucar

El prototIpo de mIcro encapsulado de palmltatO de retmol utIlIzado en la fortIficacIOn de azucar es el compuesto 250-CWS 3 En este, el palmltatO de retmol se encuentra en una matnz de gelatma que contIene sustanCIas antIOXIdantes que le confieren gran estabIlIdad, asl como componentes que 10 hacen dIspersable en agua El compuesto 250-CWS es un polvo de partlcula esfenca, de color amanllo palldo y olor caractenstlco Su establhdad y otras caractenstlcas fislcas lo hacen altamente adecuado para su uso como fortIficante en el azucar blanca Como ya se dlJo antenormente, el retInol es lIposoluble y por 10 tanto es facllmente extrmble con solventes orgamcos En la forma mlcroencapsulada, sm embargo, es necesano que pnmero la mlcrocapsula se dIsperse en agua para lIberar el palmltatO de retmol de las otras SUstanCIas acompañantes

Una vez extrmdo el retmol o sus esteres, otras de sus caractenstIcas se mamfiestan mas claramente La conslderaclon de algunas de estas caractenstIcas es Importante para el dIseño y eJeCUCIOn de los metodos de laboratono para determmar retmol Entre estas se mcluyen

• DestrUCCión por luz UV El retInol se destruye cuando es IrradIado con luz ultraVIOleta Esta propIedad permtte determtnar con gran espeCIfiCIdad los mveles de retmol en las muestras, Inldlendo la absorbancla del retmol antes y despues de su destruccIOn selectIva con luz ultraVIOleta Esta propIedad, sm embargo, demanda que el retmol sea protegIdo de la exposlclon a la luz dIrecta durante su manejO en el laboratono

3 ProdUCido por las compaiUas Hoffman-La Roche y BASF

4

Metodolog/as Analltlcas para el Control y la Evaluac/On de la Fortificac/On de Azucar con Vltamma A

• AbsorclOn de energla electromagnetlca en la zona de UV y vIsIble cercano DebIdo a los dobles enlaces conjugados que presenta la estructura del retmol, este absorbe energIa radIante alrededor de los 325 nm Esta propIedad es la que se utIlIza generalmente para determmar cuantItatIvamente el retmol, mIdIendo su absorbancIa a la longItud de onda de maxlma absorcIOn, la que puede vanar un poco segun el solvente y el denvado de retmol

• OxldaclOn El retmol facIlmente mcorpora OXIgeno en enlace peroxldo en su estructura, reaCCIOn cuya velocidad depende de la temperatura Por lo tanto muestras y solUCIOnes que contIenen retmol deben protegerse del contacto prolongado con el OXIgeno del arre y guardarse a temperaturas mfenores de 10°C

s

111. PRINCIPIOS PARA LA DETERMINACION DE RETINOL EN PREMEZCLAS y EN AZUCAR FORTIFICADA

El retmol en premezcla o azucar fortificada puede deterrmnarse cuantItatIvamente por medIo de un metodo espectrofotometnco o semi-cuantItatIvamente utIlIzando una reacclon cromogemca

A Método espectrofotométrlco

Las etapas del meto do espectrofotometnco son las slgwentes

1 Toma y manejo de la muestra Como rnmImO, se recomIendan 5 g de premezcla y 50 g de azucar Las muestras deben almacenarse en frascos opacos de VldnO o plastIco hermetIcamente cerrados, y transportarlas protegidas de exposlclon a la luz, calor y humedad Una vez en ellaboratono, las muestras se almacenan en un lugar fresco y seco PrevIo a pesar la muestra para el analIsls, la premezcla o el azucar deben mezclarse completamente

2 DlsperslOn de las mlcrocapsulas de palmltato de retInol Para asegurar la completa dlsperslOn en agua del 250-CWS es recomendable emplear agua a 50-60°C y, en lo posible, mantener la soluclon a dicha temperatura por 15 mmutos

3 ExtracclOn El palmltatO de retmol es extrrudo del medio acuoso con un solvente orgaruco El solvente mas apropiado es el hexano Por el contemdo tan alto de palmltato de retInol en la premezcla, la extraCClOn es mnecesana, basta con dIlwr previamente la soluclOn acuosa con 2-propanol

4 DetermInaCIOn de la concentraclOn de retInol La determmaclOn del retInol se basa en su absorbancla a 325 nm, utilIzando se un espectrofotometro En el caso de la premezcla y el azucar fortIficada, por su alto contemdo de retmol, puede utIlIzarse una longItud de onda mayor, pero siempre por debajo de 350 nm En estas crrcunstanclas, la exactItud y la sensIbilIdad son menores, requmendose mtroducrr un factor de correCClon, que puede obtenerse mediante el cociente que resulta de dlvldrr la absorbancla a 325 nm de una soluclOn de retInol, en un espectrofotometro de referencIa, entre la absorbancla de esa mIsma soluclon a la otra longItud de onda La tabla 3 1 presenta factores de correclon para dIferentes longitudes de onda determmados en los laboratonos del INCAP

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Manual para la FortificacIón de Azucar - Parte 3

Tabla 31 Factores de Correción de la Absorbancla del retmol a Diferentes Longitudes de Onda Cuando se usa Fuente de Luz Vlslble4

Longitud de onda (nm) Factor de correcclon

325 1 007

330 1066

335 1177

340 1360

345 1622

350 2030

5 Incremento de la especificzdad analítzca Cuando los matenales por analIzar contienen cantidades slgmficatlvas de substancias mterferentes, se hace necesano mcrementar la especlfidad del meto do Esto puede lograrse de dos maneras Pnmero, utlhzando una columna cromatografica de alta resoluclon (HPLC) para separar el retlnol de otras sustanCias que absorben energla radiante de longitud de onda Igual o cercana al retlnol o, segundo, midiendo la absorbancla de los extractos antes y despues de destrurr selectlvamente el retmol por expOSIClon a luz ultravIoleta La dIferencIa en absorbancla entre el extracto no IrradIado y el IrradIado es debida especlficamente al retmol y en este dato se basa el calculo de la concentraclOn de retmol en la muestra Este procedimiento se utlhza en el anallsls de la premezcla En el caso del azucar fortificada, el extracto orgamco esencialmente carece de sustanCias mterferentes, por lo que basta con restar a las lecturas de absorbancla de las muestras la absorbancla de un blanco de reactivos

B Método colorlmétrlco

El otro metodo para determmar los mveles de retmol en azucar fortificada es el colonmetnco,5 este es mas rapIdo y no requiere un espectrofotometro, pudIendo ser adaptado a procedtm1entos de campo El metodo se basa en la reaCClOn de Carr-Pnce, la cual se basa en la formacIon de anludroretmol al mezclar el retmol con un reactIVO cromo geno que contlene aCIdo tncloroacétlco y dIclorometano En este reactIVO, el anludroretmol se protona transltonamente, generandose una coloracIon azul proporcIonal a la concentracIon de retmol en la muestra Este metodo es menos exacto y preCISO que el espectrofotometnco, por lo cual se recomIenda venficar penodlcamente la valIdez de los resultados contra datos obtemdos con una mIsma muestra por el metodo espectrofotométnco

4 El valor de referenCia utIlIZalldo una fuente de radiaCión ultravioleta a 325 nm es 1 000 S Este método no es lo sufiCientemente exacto para ser utilIZado en el control de calidad de la premezcla

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IV. DETERMINACION ESPECTROFOTOMETRICA DE RETINOL EN PREMEZCLAS

A Referencla6

B Prmclplo

Este metodo consIste en la solublhzaclón de la mlcrocapsula lndrodlspersable de palmltato de retmol en agua calIente, seguIda por dlluclOn en 2-propanol La concentraclOn de retmol presente como palrnltato de retmol, es deterrnmada por su absorbancla a 325 nm

e Puntos críticos y precauciones

Se necesIta un espectrofotometro con capacIdad de lectura cercana a 325 nm Por la ImportancIa del espectrofotometro en cuanto a la exactitud y confiabIhdad de los anallsls, este debe calIbrarse frecuentemente, para ello, deben seguuse las mstruCClOnes que generalmente se mcluyen en los manuales del fabncante que VIenen con el eqUIpo, espeCIalmente para venficar que el monocromador esta bIen ajustado La callbraclOn debe hacerse penodlcamente y no solo cuando se mstala una lampara nueva 7

Tamblen se reqUIere una camara de rrradtacIon con luz ultravioleta, en la cual se destruye el retmol Esta camara puede conSIsm SImplemente en una fuente de luz ultravioleta y una cortma que proteja a los tecmcos analistas de la exposlclon a dIcha Irradlaclon Lo Importante es establecer con exactitud la dIstanCia apropiada entre la fuente de luz UV y las soluclOnes, aSI como el tiempo optImo de IrradlaclOn Se recomIenda confirmar la efiCIencIa de la camara de rrradlaclOn penodlcamente (cada tres meses, pe) y SIempre que se mstala una nueva lampara El anexo 3 1 presenta un ejemplo de camara de IrradIacIon y de un prOCedImIento de callbraclOn

Una vez que el azucar se ha solubIhzado en 2-propanol, el analIsIs no debe mterrumpuse

De acuerdo a la expenencIa con este metodo en los laboratonos del INCAP, SI la vanabIhdad entre los duphcados de una mIsma solucIon es tal que estos se apartan de su promedIo en mas del 3%, se rechazan los resultados y se repIten las lecturas Los resultados de dos submuestras de la mIsma muestra pesadas mdependlentemente no deben apartarse de su promediO en mas de 8%, en caso contrano es necesano repetu el anallsIs completo

6 Basado en un procedlDllento descnto por Pmeda O (1989) FortificaclOn de azucar con vltamma A manual de operacIOnes DIVISión de Nutnclón y Salud, inStituto de Nutnclón de Centro Aménca y Panamá (INCAP) 23 p

7 La sección XIV e 1 descnbe un procedlDllento para calIbrar espectrofotómetros slDlples, los que comunmente son utIhzados en química clfmca

9

Manual para la FortificacIón de Azucar - Parte 3

D Equipo y materiales

AgItador tipo Vortex Balones volumetncos o probetas de 100 mL Baño de agua (50-60°C) Camara de rrradIacIon con luz ultravIoleta (descnta en el anexo 3 1) Celdas para el espectrofotometro (prefenblemente de cuarzo) Espatulas de pesada Espectrofotometro UV NIS Papel de alumInlo PIpetas graduadas serologIcas PIpetas volumetncas Tubos de ensayo de 20 mL Tubo de VIdnO de 10 x 75 mm transparentes a luz U V Vanllas de VIdnO Vasos de precipitar (beaker) de 200-250 mL

E ReactiVos

1 2-Propanol p a «CH3CH(OH)CH3), pureza=99 7%, PM=60 10, d=O 78 g/mL)

F Procedimiento

1 Homo~emce la muestra mezclandola vanas veces

2 ~ en duplIcado aproxImadamente 1 g de la muestra, regIstrando el peso exacto en nulIgramos, y dIsuelva en 80 mL de agua destIlada a 50°-60°C en un vaso de precIpItar o Erlenmeyer UtIlIce una vanlla de V1dnO para dIsolver completamente la muestra

3 Incube en baño de agua a 50-60°C por 15 nun DeJe en reposo a temperatura ambIente hasta que la soluclon se enfhe Transfiera a un balon volumetnco o una probeta de 100 mL ~ vanas veces el vaso de precIpItar con pequeñas porcIones de agua destIlada y transfiera los lavados al balon o probeta Lleve a volumen con agua destilada y mezcle Esta soluclOn es de apanenCIa lechosa

4 En un tubo de ensayo de 20 mL !llli.Y! 2 mL de la SolUCIon del paso 3 y ªKTe~ue 8 mL de 2-propanol (esto da una dIlucIon 2 10) Mezcle vIgorosamente con el agItador Vortex

5 En otros tubos de ensayo de 20 mL mida 1 mL de la soluclOn del paso 4 y ªKTe~ue 9 mL de 2-propanol (esto da una dIluclOn 1 10) Mezcle con el agitador Vortex

10

MetodologulS Analmcas para el Control y la Evaluac/On de la Fortificac/On de Azucar con Vltamma A

6 Se.pare cerca de 1 mL de la soluclOn de la etapa 5 y pon2ala en un tubo de ensayo transparente a luz UV IrradIe esta soluclOn en la camara de Irradlaclon por 35 mm (o el tIempo necesano segun las efiCienCia de la camara de madlaclon)

7 AJUste el cero del espectrofotometro con 2-propanol Lea la absorbancla de las solucIOnes Irradiadas y no madladas a 325 nm8 en celdas de cuarzo de 1 cm de paso de luz

G Cálculos

La concentraclOn de palmltato de retmol en las muestras de premezcla se calcula segun la ecuaclOn siguiente

en donde

Palmltato de retmol(mg/g) = (Abs - Abs ) V

o Irrad X _' X FD x FC € P esp

Abs = o

Abstrrad= absorbancla sm madlaclon absorbancla despues de madlaclOn

Los parametros de la ecuaclon son los slgUlentes

Parametro Exphcaclon

e CoefiCiente de absortlvldad del palmltato de retlnol (mg 1

cm 1 mL)

VI Volumen de la soluclon iniCial de la muestra (mL)

Valor

940

100 O

P Peso de la muestra (g) (etapa F 2) dato de pesada

FD Factor de dlluclon 500

FCes!! Factor de correcclon del espectrofotometro,9 Idealmente 1 000

UtIlIzando estos parametros, y expresando los resultados como retmol no estenficado (multIplIcando por la relaclon de pesos moleculares retmollpalrnttato de retmol 286 46/524 84 = O 546), la ecuaclon antenor se SImplIfica a

2904 Retmol (mg/g) = (Abso - Abs,rrad ) x --- x FCesp p

8 SI no se dlSpone de un espectro fotómetro con luz ultraVIoleta, puede leerse en un espectrofotómetro de luz VISIble que alcance longItudes de onda mfenores a 350 nm (ver tabla 3 1)

9 Ver SeccIón XIV e 1

11

V. DETERMINACION ESPECTROFOTOMETRICA DE RETINOL EN AZUCAR FORTIFICADA

.. -----------------------=~.-A Referencia

Arroyave G Y Funes C de 1974 EnnqueClrrllento de azucar con vItamma A Metodo para la determmacIOn cuantItatIva de retmol en azucar blanca de mesa Arch Latmoamer Nutr 24 147-153

B Prmclplo

Este metodo es una adaptaclOn del metodo propuesto por Arroyave y Funes (1974) El procedIrntento como esta descnto aqw utIhza 5-10 veces menos cantIdad de reactIvos que el ongmal, tIene una exactItud y recuperacIon semejantes, y su precIsIon, aunque un poco menor, es muy satlsfactona ConsIste en la extraccIOn del palmltato de retInol en hexano La concentracIOn de retmol es deterrntnada por su absorbancIa a 325 nm El metodo usualmente no requIere la destruCCIOn del retmol por IrradIacIOn con luz ultraVIOleta, porque la absorbancIa a 325 nm del extracto orgamco es debida esencialmente al retmol presente en el azucar

e Puntos críticos y precauciones

Se necesita un espectrofotometro con capacIdad de lectura cercana a 325 nm Por la Importancia del espectrofotometro en cuanto a la exactItud y confiabIhdad de los anahsIs, este debe calibrarse frecuentemente, para ello, deben segUIrse las InstruCCIOnes que generalmente se mcluyen en los manuales del fabncante que VIenen con el eqwpo, especialmente para venficar que el monocromador esta bien ajustado La calIbraclon debe hacerse penodlcamente y no solo cuando se mstala una lampara nueva 10

TambIen se reqwere una camara de madIacIon con luz ultravIoleta, en la cual se destruye el retmol Esta camara puede consIstIr sImplemente en una fuente de luz ultravIOleta y una cortIna que proteja a los tecrucos analIStas de la expOSlCIOn a dIcha madIaclon Lo Importante es establecer con exactItud la dIstanCIa apropIada entre la fuente de luz UV y las SolUCIones, asI como el tIempo optImo de madIaclOn Se recomIenda confIrmar la efiCIencIa de la camara de madIacIon penodIcamente (cada tres meses, pe) y SIempre que se mstala una nueva lampara El anexo 3 1 presenta un ejemplo de camara de IrradIacIon y de un procedimIento de calIbracIon

Una vez que el palmItato de retmol se ha extrrudo en hexano, el anahsIs no debe mterrumpIrse

10 La sección XIV e 1 descnbe un procedlDllento para calibrar espectrofotómetros slDlples, los que comunmente son utilIZados en qumuca clmlca

13

Manual para la FortificacIón de Azucar Parte 3

De acuerdo a la expenenCIa con este metodo en los laboratonos del INCAP, SI la vanabIlIdad entre las replIcas de una mIsma solucIOn de azucar es tal que estas se apartan de su promedIo en mas del 5%, se rechazan los resultados y se repIten las extraccIOnes La recuperaCIOn del meto do es por lo menos 91 %

D EqUipo y materiales

Agitador tipo Vortex Balones volumetncos o probetas de 100 mL Baño de agua (50-60°C) Bulbos de asplraClOn para pIpetas Pasteur y pipetas serologlcas Celdas para espectrofotometro (prefenblemente de cuarzo) Espatulas de pesada Espectrofotometro UV N IS PIpetas graduadas serologIcas PIpetas Pasteur PIpetas volumetncas Tubo de ensayo de 20 mL, con tapon esmenlado o de rosca Vanllas de vldnO Vasos de preCIpItar (beaker) de 200-250 mL

E ReactiVos

1 Etanol absoluto p a «C2HsOH), pureza=99 8%, PM=46 07, d=O 79 g/mL)

2 Hexano p a «C6HI4), pureza=99%, PM=86 18, d=O 66 g/mL)

3 Htdroxldo de sodIo-O 1 N

DIsuelva 4 g de ludroXIdo de sodIo «NaOH, pureza=97%, PM=40 O) en 1 L de agua destIlada Guarde en botella de pohetIleno o pohproplleno

F Procedimiento

1 Homo~emce la muestra de azucar mezclandola vanas veces

2 ~ aprOXImadamente 20 g de azucar, regIstrando el peso exacto en mIlIgramos, y dIsuelva con 60-80 mL de NaOH-O 1 N en un vaso de preCIpItar de 200-250 mL Mezcle con una vanlla de VldnO para dIsolver completamente

14

Metodologfas Ana/ltlcas para el Control y /a Evaluación de la Fortificación de Azucar con Vitamina A

3 Incube en baño de agua a 50-60°C por 15 mm Deje en reposo a temperatura ambIente hasta que las solucIOnes se enfnen Transfiera cuantItatIvamente a un balon volumetnco de 100 mL Lave vanas veces el vaso de precIpItar con pequeñas porciones de NaOH-O 1 N Y transfiera los lavados al balon Afore a 100 mL NaOH-O 1 N Y mezcle

4 Transfiera 4 mL de la soluclon preparada en el paso (3) a cada uno de tres tubos de vldnO de 20 mL (con tapon esmenlado o de rosca) con el proposlto de anahzar cada soluclOn por tnphcado Prepare en tnphcado un blanco de reactivos solamente con NaOH-O 1 N Y llevandolo a traves de los mIsmos pasos del procedImiento que las muestras

5 Agregue 4 mL de etanol absoluto a cada tubo Mezcle en agItador tIpo Vortex por 5 segundos

6 MIda 5 mL de hexano y agregue a cada uno de los tubos del paso (5) Tape cada tubo rnmedlatamente y agIte con sufiCIente mtensldad en el agItador tIpO Vortex por 30 segundos, para asegurar la extracclOn completa del palmltato de retmol Destape hgeramente los tubos para alIViar la preslon de los gases

7 PermIta la separaclOn de fases La fase orgamca es la supenor

8 A la mayor brevedad pOSible, transfiera con una pIpeta Pasteur la fase orgamca a una celda de espectrofotometro de 1 cm de paso de luz, y ~ su absorbancla a 325 nm 11 AJUste el cero del mstrumento con el hexano antes de cada lectura

G Cálculos

La concentraclOn de palmltato de retmol en las muestras de azucar se calcula segun la ecuaclOn sIguIente

Palmltato de retznol (JJ.g/g) = Aba corregida X Vh X VI X Fe E Vaz p esp

11 SI no se dispone de un espectro fotómetro con luz ultraVioleta, puede leerse en un espectrofotómetro de luz VISible que alcance longitudes de onda mfenores a 350 nm

15

Manual para la FortificacIón de Azucar - Parte 3

en donde

AbScorregtda = Absmuestra - Absb1anco

Absb1anco es el promedIo de tres lecturas, y que debena ser menor de O 050

Los parametros de la ecuaclOn son los slgwentes

Parametro Exphcaclon Valor

e CoeficIente de absorllvldad del palmltato de retlnol en 0092 hexano (J.lg 1 cm 1 mL)

Vh Volumen de la fase orgamca (mL) 50

Vaz Volumen de la altcuota anahzada de la soluclon de 40 azucar (mL)

VI Volumen de la soluclon Imclal de la muestra (mL) 100 O

p Peso de la muestra (g) (etapa F 2) dato de pesada

FCese Factor de correcclon del espectrofotometro12 Idealmente 1000

UtIlIZando estos parametros, y expresando los resultados como retmol no estenficado (multIphcando por la relaclOn de pesos moleculares retmol/palmltato de retmol 286 46/524 84 = O 546), la ecuaclOn antenor se SImplIfica a

741 85 Retlnol (J.1glg)= Absco,.,.eglda x x FC e8p

p

12 Ver SeccIón XIV el

16

MetodologulS Analitlcas para el Control y la EvaluaclOn de la FortificacIón de Azucar con VItamIna A

H Verificación de la recuperaclon del método

Se recomIenda venficar la efiCIencIa de la extraCClOn por medIO del sIgUIente procedImiento 13

1 Prepare una muestra "control" con azucar sm fortrficar, y siga las etapas (F 1) a la (F 4) del procedlIDlento En este punto, agregue a 2 de los 3 tubos de ensayo, 3 mL de etanol absoluto y luego 1 mL de una soluclOn en etanol de palmltato de retmol de concentraclon conocIda (aproxlIDadamente 20 nucrogramos de palmltato de retmol por mlhhtroI4), los "controles" Al tercer tubo (el "blanco"), agregue 4 mL de etanol absoluto Contmue con el procedtnuento descnto a partIr de la etapa (F 6) Lea la absorbancla de los "controles" y de su "blanco" Sustratga la absorbancla del "blanco" al promedIo de las absorbanclas de los "controles", esta es la absorbancla debIda al palnutato de retmol agregado (s)

2 Por aparte, pr~are una soluclOn de palmltatO de retmol en la SIguIente forma MIda 1 mL de la nusma Soluclon de palnutato de retmol que fue usada en la etapa antenor en un balon volumetnco de 5 mL y afore con etanol Lea la absorbancIa de esta SolucIon, y multIphqye por O 98, para compensar por la mayor absorbancIa del palnutato de retmol en etanol que en hexano Este producto (t) es la absorbancIa teonca que debla haberse encontrado SI la recuperaClOn fuera 100% efiCiente

3 Calcule la recuperaClOn (R) asI

s R = - x 100

t

13 Nótese que este ensayo de recuperación se hace con referencia a pahmtato de retmol puro en vez de la fonna mlcroencapsulada (250-CWS) Sm embargo, la expenencla de los laboratonos del INCAP mdlca que los resultados son prácticamente los mismos

14 Preparada a partrr de una solución madre de 100 J.1g1mL de palmltato de retmol en etanol, almacenada a -20°C baJO atmósfera de mtrógeno y en frasco oscuro La solución de 20 J.1g1mL debena tener una absorbancla cercana de 2 O a 325 nm en contra de etanol absoluto

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VI. DETERMINACION COLORIMETRICA SEMI­CUANTITATIVA DE PALMITATO DE RETINOL EN AZUCAR FORTIFICADA .. ----------------------~~~.

A Referencias

Arroyave G, Pmeda O y Funes C de 1974 Ennqueclmtento de azucar con vItamIna A Metodo rapldo para la facll mspeCCIOn del proceso Arch Latmoamer Nutr 24 155-159

Bayfield R F Y Cole E R 1980 Colonmetnc deterrmnatIon of vltam.m A WIth tnchIoroacetIc aCId En McCornllck D B Y Wnght L D ,Eds Methods m Enzymology, Parte F Vztamms and Coenzymes, Vol 67 New York Academtc Press pp 189-195

B Prmclplo

El metodo aqU1 descnto es una modIficacIOn del propuesto por Arroyave, Pmeda y Funes (1974) Este metodo se basa en la formacIOn de anludroretmol al mezclarse el retInol con un reactivo cromo geno que contIene aCIdo tncloroacetIco y dlclorometano Se genera un compuesto de color azul cuya mtensldad puede medIrse por comparacIOn Visual contra una escala de solucIOnes de sulfato de cobre El color es transltono por lo que la comparaclon debe hacerse dentro de 10 segundos despues de haber agregado el reactIvo

e Puntos crítiCOS y precauciones

Es preCISO preparar el reactivo cromogeno con sufiCIente frecuencIa, ya que es mestable Se sugIere utilIzarlo dentro de cmco dIas SI se guarda a 25°C y dentro de 14 dIas SI se guarda en refrIgeracIOn En este ultImO caso, el reactivo debe sacarse del refrIgerador de dos a tres horas antes de ser utIlIzado, SI se forman cnstales deben dIsolverse con mOVImlentos rotatIvos Para venficar la calIdad del reactivo, se recomIenda analIzar un control de azucar con concentracIon conocIda de retmol y cerciorarse de que la mtensldad del color azul comcIda con la esperada segun la escala

El reactIvo cromogeno es muy corrOSIVO, por 10 que debe manejarse con precaUCIOn y solo por personal adecuadamente capacItado Pocos rnmutos antes de utIlIzarlo, la cantidad necesana debe decantarse en un vaso de preCIpItar para que sea mas facd tomarlo con una Jennga Se utIlIza una Jennga en vez de pIpeta para asegurar el agregado VIgoroso y rapldo del reactIvo sobre la soluclOn de azucar El reactIvo tiende a enturbIarse al contacto con la humedad del ambIente No debe regresarse el reactIvo sobrante del vaso de preCIpItar al envase ongmal

19

Manual para la Fortificación de Azucar Parte 3

o Materiales

Frasco de plastlco de 50 mL Frasco de vl(mo de boca ancha (para descartar los desechos) Frasco de 500 mL o termo (para transportar el agua destIlada) Frasco oscuro con tapon de VldnO esmenlado Guantes desechables de goma Jennga de VldnO de 5-10 mL con punta de pohettleno de 3 cm en el extremo PIpetas graduada de 10 mL SolucIOnes de sulfato de cobre (escala colonmetnca), ver descnpcIon mas adelante Tubos de ensayo de 15 x 100 mm con una marca al mL y otra al mvel del volumen que

ocupan 10 g de azucar del tIpO que se va a analIzar Vasos de precIpItar (beaker) de 50-100 mL

E ReactiVos

1 ReactIvo cromogeno aCIdo tncloroacetIco /dIclorometano

DIsuelva 120 O g de aCIdo tncloroacetIco en 80 O g de dIclorometano (60 6 mL) Para dIsolver por completo, entIbIe la mezcla en baño de agua a 50-60°C, agitando constantemente Almacene en un frasco ambar con tapon esmenlado, prefenblemente en remgeracIon El reactIvo hecho de esta manera alcanza para 25-30 muestras

2 Escala colonmetnca

A partIr de una solUCión "madre" de sulfato de cobre pentahIdratado (CUS04 5H20) mpare las sIgwentes dIlUCIones

30 60 90

120

EqUivalencia aprox de concentraclon (¡.Jg/g retmol en azucar)

5 10 15 20

MIda 4 mL de cada una de las solucIOnes patron de sulfato de cobre en el mIsmo tipO de tubos de ensayo en los que se analIzaran las muestras Tapelos hermétIcamente para eVItar evaporacIon Rotule cada tubo con su respectIvo numero de IdentIficacIOn, que mdIca el color aprOXImado que produce una muestra de azucar con esa concentracIon de retmol en J.1g/g Estas solucIOnes son estables mdefimdamente a temperatura ambIente

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MetodologlOs Analltlcas para el Control y la Evaluac/On de la Fort¡ficac/On de Azucar con Vitamina A

F Procedimiento

1 Homogemce la muestra de azucar mezclandola vanas veces

2 En el frasco de 50 rnL, ponga 10 g de azucar (o con uno de los tubos de ensayo con memsco marcado, tome el volumen equIvalente)

3 Agregue 10 rnL de agua a 50-60°C, prefenblemente destIlada DIsuelva el azucar, SI necesano calentando la solucIOn

4 Dele la solucIOn en reposo a temperatura ambIente hasta que se enfue

5 Transfiera solucIOn de azucar a un tubo de ensayo hasta el mvel marcado a 1 rnL

6 VIerta la cantIdad estImada del cromogeno que se utIlIzara en un vaso de preCIpItar

7 UtIlIzando la Jennga, agregue a cada Soluclon de azucar 3 rnL del reactIvo cromogeno y mezcle mmedIata y vIgorosamente UtIlIce guantes desechables para eVItar el contacto aCCIdental del reactIvo cromogeno con la pIel

8 Compare el color azul de la muestra con los patrones de la escala colonmetnca Efectue esta comparaCIOn antes de que hayan transcurndo 10 segundos de haber agregado el reactIvo, ya que el color se mantIene por un corto tIempo

9 EstIme el ruvel de retmol en el azucar (flg/g) con base en el patron cuyo color es el mas sImllar al desarrollado por la muestra En la mayona de los casos, la mtensIdad del color azul cae entre dos de los tubos de referenCIa La concentracIOn de retmol, por lo tanto, debe Informarse dentro de este rango Por ejemplo, SI la mtensIdad del color cae entre los ruveles 30 y 60 gIL de sulfato de cobre, el conterudo de retmol es entre 5 y 10 flg/g

10 Deseche los reSIduos del reactIvo cromogeno, mcluyendo el que se ha hecho reaCCIOnar con el azucar, dentro del frasco de vIdnO para desechar, y llevelo al laboratono para su deposIcIon final

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VII. METODO VOLUMETRICO PARA LA DETERMINACION DE PEROXIDOS EN ACEITES

A Referencia

AssocIatlOn of OfliCIal AnalytIcal ChesmIst 1984 Officlal Methods 01 Analysls 01 the AssoczatlOn olOfficlal Analytlcal Chemlsts 14a ed Arlmgton, V rrgIrua

B Prmclplo

Este meto do se aplIca para deterrmnar el ruvel de permados en los aceItes que se usan en la preparaClOn de la premezcla de VItamma A Los peroXIdos y productos sImIlares prOVIenen de la oXIdacIOn de las grasas y aceItes Los peroxIdos OXIdan al yoduro de pOtasIO a yodato, el cual se mIde cuantItatIvamente por su reaCClOn redox con tIosulfato de sodIo La reaCClOn se lleva a cabo en medIO lIgeramente aCIdo y en presencIa de un exceso de IOnes yoduro DebIdo a la naturaleza hIdrofobIca del aceIte, la tItulaclOn se lleva a cabo en una mezcla de aCIdo acetIco/cloroformo

e Puntos crítiCOS y precauciones

Es recomendable que los reactIvos se mantengan lIbres de OXIgeno, por lo que se sugIere burbuJearlos con un gas merte (C02 o N2)

o EqUipo y materiales

AgItador magnetIco

Balones volumetncos de 500 y 1000 mL

Bureta

Erlenmeyers de 250 mL, de preferenCia con tapon esmenlado

Espatulas de pesada Frasco gotero Probeta de 1000 mL Vanllas de VldnO

Vasos de precipitar (beaker) de 100 y 400 mL

23

Manual para la Fort¡ficaclón de Azucar - Parte 3

E Reactivos

1 ACldo aceoco/cloroformo

Mezcle 3 volumenes de aCldo aceoco glacial «CH3COOH), pureza=99 7%, PM=60 05, d=1 05 g/rnL, con 2 volumenes de cloroformo USP «CH3CI3») Prejlare sólo la canodad necesana para su pronto uso, y coloquelo en frasco de vldnO

2 SolucIOn mchcadora de ahmdon-l %

En un vaso de precipitar de 100 rnL a~elWe O 5 g de alnudon p a y 5 rnL de agua desolada cahente Mezcle y a~elWe con agltacIOn constante 45 rnL de agua desolada HIerva por unos pocos nunutos, enfne y filtre Guarde en frasco gotero por no mas de una semana

3 Tlosulfato de socho-O 1 N

DIsuelva aprOXImadamente 25 g de oosulfato de sodIO p a «Na2S20 3 5H20), pureza=99 5%, PM=248 18), en un lItro de agua destIlada Lleve a ebulhcIOn y lu.erva suavemente por 5 mmutos Guarde en un frasco oscuro lavado prevIamente con mezcla cromlca y enjuagado con agua hervIda Almacene en un lugar oscuro y fresco La solucIOn es estable por cerca de 6 meses Descarte SI se enturbIa Esta solucIOn debe estandanzarse antes de su uso (ver seCCIOn de ProcedImIento mas adelante) DIlUCIOnes de esta soluClon se preparan con agua desolada hervIda, Justo antes de su uso

4 Yoduro de pOtasIO «(KI), PM=166 01) hbre de yodato

5 ACldo clorludnco-l N

En un balon volumetnco de 1000 rnL, contemendo 300 rnL de agua desolada, agreGue lentamente 828 rnL de aCldo clorlu.dnco concentrado «Hel), 37%, PM=36 46, d=l 2 g/mL) ~ a temperatura ambiente y lleve, a la marca de 1000 rnL con agua destIlada Guarde en frasco de vldnO bIen tapado, eVItando su contacto con vapores o mechos alcalmos

6 Dlcromato de pOtasiO «(K2Cr207), pureza=99 O, PM=294 19)

24

Metodologws Anal¡lIcas para el Control y la Evaluac¡on de la FortificaclOn de Azucar con Vltamma A

F Procedimiento

1 Estandarización de la solución de tlosulfato de sodio

Cada vez que se corre un lote de muestras, todo el procedimiento siguIente se hace en tnphcado,

a Pese entre O 2000 a O 2300 g de dIcromato de pOtasIO, secados prevIamente por 2 horas a 105°C y guardado en una desecadora, re~Istre el peso exacto Transfiera a frasco Erlenmeyer de 250 mL

b AlUeflue cerca de 80 mL de agua desttlada, 2 g de yoduro de pOtasiO y, con agItaclOn constante, 20 mL de HC1-l N Deje en reposo por 10 mmutos en la oscundad

c AgItando constantemente con el agItador magnettco, tItule con ttosulfato de sowo-O 1 N, hasta que el color amanllo Casi haya desaparecIdo En ese punto, agregue 10 gotas de SolucIon de almIdon-1 % como mdlcador Contmue la tItulaclOn con un goteo lento El punto fmal es mdlcado por la desapancIon brusca del color azul Anote el volumen final de la soluclOn de tIosulfato que fue requendo para llegar al punto final

La normalIdad de la solUClOn de ttosulfato se calcula asI

SImplIficando se tIene

25

Manual para la FortificacIón de Azucar Parte 3

2 Titulación de las muestras

Cada muestra se corre en duphcado

a Pese 500 ± O 05 g de muestra (grasas o aceItes) en un Erlenmeyer de 250 mL con tapon esmenlado

b AlW'iue 30 mL de la Soluclon de aCldo acettco/cloroformo y mezcle suavemente para dIsolver

c A~e~ue 1 g de yoduro de pOtasIO y dIsuelva DeJe reposar por un mInuto

d A~re~ue 30 mL de agua desolada y 10 gotas de solucIOn de alrnIdon-l % TItule lentamente con tIOsulfato de SOdIO-O 1 N con agItacIOn fuerte para lIberar el yodo (12) de la fase de cloroformo El punto final es Indicado por la desapancIOn brusca del color azul SI la otulaclon consume menos de mediO mIlilItro de oosulfato de sodiO-O 1 N, rebaje la normalidad de la soluclon a O 01 N (dIlucIOn 1 10) con agua desolada hervida y repita la otulacIOn

El yodo (12) Intermedian o formado es soluble en la fase orgamca, por lo que la desapancIOn del color (amanllo pnmero, y azul cuando ya se ha agregado el almIdon) debe observarse en esa fase

3 TitulaCión del blanco

En cada comda, obtenga un blanco reploendo el procedImiento antenor SIn agregar muestra (debena necesitarse menos de O 1 mL de la soluclon de tlosulfato de sodio) SustraI~a el volumen de tItulante usado para el blanco de los volumenes de tltulacIOn de cada muestra

G Cálculos

Los mtheqUlvalentes de permados por ktlogramo de muestra se calculan asI

Vol 82°3 en mL Perox (meq/lcg) = ------ X 82°3 (eq/L) x 1000 (meq/eq)

g muestra

El mvel maxuno de permados en el aceIte vegetal debe ser 5 meq/kg

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VIII. METODOS PARA LA DETERMINACION DE RETINOL EN SANGRE

A Introducción

La evaluaclon del 11llpacto nutnclOnal de un programa de fortlficaclOn de azucar con VitamIna A reqUIere la medlclon de mveles de retmol en sangre, antes y despues de la mtervenclOn

En este capitulo se presentan dos metodos para la determmaclon del retmol sangumeo El pnmero es una adaptaclOn del metodo espectrofotometnco claslco de Bessey y colaboradores (1946) (ver secclon IX) La especificidad de este metodo se basa en la destrucclon selectIva del retmol lIbre o estenficado presente en la muestra, por rrradIaClon con luz ultraVIOleta El segundo metodo reqUIere un aparato de cromatografía lIqUIda de alta resoluclOn (HPLC), para separar el retmol lIbre de otras sustanCias, lo cual lo hace mas espeCifico y sensible (ver secclon X) El metodo espectrofotometnco, sm embargo, tIene la ventaja de que su costo es menor, y ademas permIte analIzar dos a tres veces mas muestras durante el mIsmo penodo de tiempo Su relatIva 111llltaclOn de no permltrr diferenCiar el retmol lIbre de sus esteres tIene Importancia solo en poblaCIOnes con mgesta muy alta de retInol en condiCIOnes postprandIales, SItuaClOn que no ocurre en los paises en los que la defiCIenCIa de VItamIna A es un problema de salud publIca

La selecclon entre uno u otro meto do depende, pues, de los proposltos del estudIO y de los recursos dIspombles MIentras que el metodo de HPLC es mdudablemente mas exacto y preCISO, ambos metodos son sufiCIentemente InformatIvos para propOSItOS de evaluaclOn

La determmaclOn de retmol en suero (o plasma) o en leche SIgue las SIgUIentes etapas de laboratono

1 Tratamiento con álcaliS Teoncamente, este resulta en la hIdrohsIS de los esteres de retInol presentes en las muestras En el metodo espectrofotometnco dicha hIdrohsIS no es completa, pero esta hmItaclOn no afecta la utIhdad del metodo para el fin que se propone En el caso del suero o plasma este tratamIento es neceSarIO para romper el complejO del retmol con su protema transportadora, preCIpitando las protemas sencas, lIberando el retmol y elImmando SUStanCIas mterferentes

2 Extracclon El retInol y sus esteres no hIdrolIzados son extraIdos con un solvente orgamco En la deterrntnaclOn espectrofotometnca se prefiere una mezcla de X11eno-keroseno, mIentras que en la determmaclon por HPLC se utIlIza hexano u otro solvente de facd evaporaclOn

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Manual para la FortificaCIón de Azucar Parte 3

3 Determznacwn de la absorbancza Tanto en el metodo espectrofotometnco como en el de HPLC, la absorbancIa del retmol a 325 nm se usa para su determmacIOn cuantItatIva

4 Destruccwn selectzva del retznol Como ya se menCIOno antenormente, para asegurarse de que la absorbancla sea debIda solo al retInol, esta se determma en los extractos de las muestras antes y después de destruIr selectIvamente el retmol por IrradIacIón con luz ultraVIoleta El metodo de HPLC no requIere esta etapa, ya que prevIo a la medlclon de la absorbancla del retmol, este se separa cromatograficamente de otras sustanCIas acompañantes, mcluslve de sus esteres

8 Toma y manejo de las muestras

El retmol sangumeo puede medIrse en suero o en plasma Se prefiere suero SI las muestras de sangre se toman en un lugar fiJO y se procesan dentro de un penodo no mayor a 6 horas SI esas condICIOnes no se logran, como es comun en muchas encuestas, se recomIenda utIhzar plasma, ya que ha SIdo demostrado que se reduce el nesgo de hemohsls Usando plasma puede demorarse la centnfugaclon de las muestras hasta 24 horas sIempre que se conserven refngeradas

La sangre puede obtenerse por punclon venosa o, SI ellaboratono emplea mtcro­adaptaCIOnes de los meto dos analItICOS, por pmchazo de la yema del dedo SI se usa puncIOn venosa, pueden extraerse 3 a 5 mI de sangre de una de las venas del antebrazo, tomando las precaUCIOnes rutlnarlas de hIgIene y segurIdad AgUjas # 21 o # 22 pueden utIhzarse en ruños preescolares, y # 20 en adultos Cuando se aphca un torruquete en el antebrazo, este debe qUItarse tan pronto como la sangre empIeza a t1wr, con el proposlto de eVItar hemohsls Se sUgIere tomar dIrectamente la muestra dentro de tubos "vacutamer" forrados con una camIsa de papel de alumtruo Estos tubos deben rotularse tanto sobre sus paredes de VldnO como sobre la camIsa de papel de alUmIruO SI se encuentra que la extraCCIon de sangre venosa con "vacutamer" es dIficultosa, se sugIere utllIzar una Jennga y luego trasladar por myeccIon a un tubo "vacutamer" Para eVItar esta doble mampulacIOn de la muestra, un procedImIento alternativo, aunque un poco mas costoso, es utIhzar los tubos-Jennga de Sarstedt (TIpO Luer­Monovette), en los que la Jennga se conVIerte en el tubo de transporte y procesamIento una vez que su embolo es ehmtnado Tubos "vacutamer" conteruendo geles separadores de suero o plasma ayudaran a preverur hemohsls, sIempre que la sangre sea centnfugada antes de ser transportada

La muestra de sangre debe protegerse de exposlcIon al arre, a la luz solar dIrecta y al contacto con el hIelo Las muestras deben acondlCIOnarse de una forma tal que se mtmmlce su mOV1mIento durante el transporte SI la muestra entra en contacto con el arre, se recOImenda desplazarlo, sm agItar la muestra, con una comente de gas merte por 30-60 segundos y luego tapar el tubo hermetIcamente

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MelodologÚlS Anallllcas para el Control y la Evaluaclon de la Forlificac/On de Azucar con Vllamlna A

El suero debe separarse del coagulo sangumeo por centnfugacIOn a 2,500-3,000 rpm durante 15 mmutos SI el suero no es claro, el sobrenadante se transfiere con una pIpeta Pasteur a otro tubo de centnfuga, y la centnfugacIOn se repIte El suero debe guardarse congelado a -20°C o temperaturas mfenores dentro de VIales de tamaño adecuado, de tal forma que el espacIO lIbre entre la superficIe de la muestra y la tapadera sea rnmImo, aunque suficIente para permItIr la expansIon de la muestra al congelarse

El plasma se separa de las celulas sangumeas medIante un procesamIento sImIlar, con la vanante de que el tIempo de centnfugacIOn puede reducIrse a 10 mmutos Estas muestras deben manejarse y almacenarse de la mIsma forma que las muestras de suero Una vez que las muestras hayan sIdo congeladas se recomIenda descongelarlas solo hasta el momento de su anallsls BaJO estas condICIones, las muestras permanecen sm cambIO al menos por un año

SI es necesano transportar las muestras de suero (o plasma) de un SItIO a otro debe asegurarse que se mantengan congeladas todo el tIempo Deben utIlIzarse cantIdades sufiCIentes de hIelo seco o mtrogeno hqUldo para eVItar que se descongelen

Cuando las muestras se tomen por medIo de pmchazo de la yema del dedo, se recomIenda utIhzar lancetas automatIcas, que provocan una henda de profundIdad fija, y menos dolorosa al pacIente Es Importante recalcar que la sangre no debe obtenerse presIOnando ("ordeñando") el dedo La cantIdad de sangre que fluye por la henda puede aumentarse, SI antes de realIzar la puncIOn se solIcIta a la persona agItar vIgorosamente la mano haCIa amba y haCIa abajo La muestra puede colectarse en un "mIcrovacutamer",13 el cual puede ser centnfugado Despues de la centnfugacIOn, el suero o plasma debe ser transfendo a un VIal y almacenado como se explIco antenormente

Con el proposIto de venficar que las muestras no se han detenorado durante el almacenamIento, allCUOtas de controles de suero o plasma con ruveles conOCIdos de retmol deben ser almacenados baJO las mIsmas condICIOnes y analIzados sImultaneamente con las muestras

Ellaboratono debe preparar mstructIvos especIficos sobre los prOCedImIentos para la toma, preparacIOn y transporte de los espeCImenes blOloglcos colectados en el campo Los tecmcos responsables deben ser ngurosamente adIestrados, creando en ellos conCIenCIa de la ImportancIa de que las muestras lleguen allaboratono en perfectas condICIOnes para no afectar la valIdez de los resultados ana11tICOS Personal profeSIonal dellaboratono debe penodIcamente hacer VISItas de mspecclon al trabajO de laboratono de campo para cerCIOrarse de que todo marcha bIen y dIscutrr pOSIbles problemas que se presenten

13 "Mlcrovacutamer" con labIO faclhtará dmgrr el flUJO de sangre haCIa su mtenor

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IX. DETERMINACION ESPECTROFOTOMETRICA DE RETINOL SANGUINEO POR DESTRUCCION ULTRAVIOLETA DEL RETINOL

A Referencias

Bessey O A , Lowry OH, Brock M J Y Lopez J A 1946 The deterrmnatIOn of vItamm A and carotene m small quantItIes of blood serum J BIOI Chem 166 177-188

ArauJo e R e y Flores H 1978 Improved spectrophotometnc vItamIn A assay Clm Chem 24386

B Prmclplo

El procedIrnlento descnto es una adaptacIOn del metodo de Bessey el al (1946) Este conSIste en la precIpItacIOn de protemas, con una solucIOn de potasa alcohohca, y la subsecuente extraCCIOn del retmol y sus esteres en una mezcla de keroseno-xIleno La sapomficacIOn, aunque mcompleta, facIhta la extraccIOn de retInol, y ehmma SUStanCIas mterferentes El retmol en el extracto es destruIdo selectivamente por expOSICIon a luz ultraVIoleta La dIferencIa entre la absorbancIa a 328 nm 14 antes y despues de la rrradIacIOn es atnbwble y proporcIOnal al retmol total

e Puntos crítiCOS y precauciones

Se neceSIta un espectrofotometro con capacIdad de lectura cercana a 325 nm Por la ImportanCia del espectrofotometro en cuanto a la exactItud y confiabIhdad de los analIsIs, este debe calIbrarse frecuentemente, para ello, deben segwrse las mstruCCIOnes que generalmente se mcluyen en los manuales del fabncante que VIenen con el eqwpo, espeCIalmente para venficar que el monocromador esta bIen ajustado La cahbracIOn debe hacerse penodIcamente y no solo cuando se mstala una lampara nueva IS

TambIen se reqwere una camara de rrradIaclOn con luz ultraVIOleta, en la cual se destruye el retmol Esta camara puede COnsIstIr Simplemente en una fuente de luz ultraVIOleta y una cortma que proteja a los tecmcos anahstas de la exposlcIOn a dicha IrradlacIOn Lo Importante es establecer con exactItud la dIstanCia apropIada entre la fuente de luz UV y las solUCIOnes, asI

14 Longitud de onda de máxlDla absorbancla del retmol en una mezcla de keroseno-xlleno 15 La sección XIV e 1 descnbe un procedlDllento para cahbrar espectrofotómetros slDlples, los que comunmente

son utIlIzados en quúmca clínica

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Manual para la Fortrficaclon de Azucar - Parte 3

como el tIempo optnno de rrradlacIOn Se recoIDlenda confirmar la eficIencIa de la camara de rrradtacIOn penodlcamente (cada tres meses, pe) y sIempre que se mstala una nueva lampara El anexo 3 1 presenta un ejemplo de camara de rrradlaclon y de un procedImIento de cahbracIOn

Una vez que el retmol se ha extratdo en la fase orgamca el anahsls no debe mterrumplrse

De acuerdo a la expenenCIa con este método en los laboratonos del INCAP, los resultados de dos submuestras de la tnlsma muestra anahzadas mdependlentemente no deben apartarse de su promediO en mas de 10% SI su concentración es Igual o supenor a 30 J..1g/dL, o en mas de 15% SI su concentraclon es entre 15 y 30 J..1g/dL En caso contrano, el anahsls de la muestra se repite completamente Muestras para las que se calcule una concentraclon de retmol menor de 15 J..1g/dL deben mformarse como contemendo <15 J..1g1dL La recuperaCIOn del metodo es de 93% o mas

D EqUipo y materiales

Agitador tipO Vortex Baño de Agua (56°C)

Bulbos para asprracIOn con pipetas Pasteur y pipetas serologlcas

Camara de rrradlacIOn con luz ultraVIOleta (eJemplo en anexo 3 1)

Celdas de cuarzo con paredes negras de 1 mL o menor capaCidad CentrtfUgarefingerada

Cronometro

Espectrofotometro UV Nls

Frascos de vldnO oscuro

Pipetas graduadas serologlcas

Pipetas automatlcas tlpo Eppendorf

Pipetas Pasteur

Probetas de vldnO

Tubos de Vldno de 10 x 75 mm transparentes a luz U V

Tubos de vldnO de 12 x 75 mm Vanllas de vldno

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MetodologulS Ana/illcas para el Control y la Evaluaclon de la FortificacIón de Azucar con VItamIna A

E Reactivos

1 Potasa alcohohca

Combine 10 volumenes de etanol absoluto p a ,«C2HsOH), pureza=99 8%,PM=46 07, d=O 79 g/rnL, con 1 volumen de lndroxldo de pOtaslO-11 O N (KOH, PM=56 11) Mezcle 50 veces con una vanlla de VldnO Centnfu~ue a 3,000 rpm por 15 rnmutos Despues de la centnfugaclOn puede observase un pequeño precipitado blanquecino o una fase separada en el fondo del tubo, esto es causado por la presencia de carbonato de pOtasIO que eXlste en algunas preparaClOnes de KOH La soluclOn sobrenadante clara debe emplearse dentro de 60 minutos despues de preparada

2 KerosenolXtleno 1 1 v v

Mezcle inmediatamente antes de su uso las cantidades necesanas de keroseno (fracclon 206-216°CI6 destilada en vIdnO) y Xlleno (fracclOn 138-143°CI6

destllada en VldnO) A~lte hasta que la soluclon se torne clara Tanto los solventes indiViduales como su mezcla deben almacenarse en frascos de VldnO oscuro

F Procedimiento

1 SI las muestras han estado en congelaclon, descon~elelas a temperatura ambiente (20-25°C) y mezclelas perfectamente en un agitador tipo Vortex Centnfu~ue a 2,500 rpm por 10 mmutos, prefenblemente en una centnfuga refrIgerada, para elIrnmar cualqUIer mterferencla debida a la formaclon de fibnna

2 A tubos de vldnO de 12 x 75 mm transfiera respectivamente en duphcado O 5 rnL de cada suero (o plasma)

3 Prepare en duplIcado un blanco de reactIvos con O 5 rnL de agua destIlada Ademas, prepare dos tubos con O 5 mL de sueros control con ruveles de retmol conOCIdos

16 Estas temperaturas deben corregirse de acuerdo a la preslón amblental a dlferentes altltudes sobre el Olvel del mar, así

To co"egltia = To re! - (273 + To reO 060 - mmH~ lu~ar) 10000

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Manual para la Forllficaclon de Azucar Parle 3

4 Agre~ue O 5 mL de potasa alcohohca a todos los tubos Mezcle en un agItador tIpO Vortex por 10-20 segundos

5 ~ los tubos con tapones de hule e mcube en baño de agua a 56°C por 20 mInutos

6 ~ a temperatura ambIente AgreJ:ue 1 O mL de la mezcla kerosenoholeno 1 1 Mezcle en agItador tIpo Vortex por 30 segundo medIdos con cronómetro La agItacIOn debe ser sufiCIentemente VIgorosa para asegurar una completa extraCCIOn 17

7 Centnfullue a 3,000 rpm por 10 mmutos en centnfuga, prefenblemente refngerada

8 Se.pare con pIpeta Pasteur la fase orgaruca y transfierala a una celda espectrofotometnca ~ CUIdado de no acarrear fase acuosa ~ la absorbancIa de la fase orgamca a 328 nm contra la mezcla de keroseno/xIleno

9 Con una pIpeta Pasteur, transfiera la fase orgamca de la celda espectrofotometnca a un tubo de 10 x 75 mm que sea transparente a la luz ultraVIOleta IrradIe con luz ultraVIOleta por 35 mmutos, o lo que se haya determmado que es necesano para destrUIr preferencIalmente al retmol (ver anexo SeCCIon XIV e 2)

10 Entre muestra y muestra, ~ completamente el reSIduo dejado dentro de la celda espectrofotometnca, utIlIzando una pIpeta Pasteur conectada a un SIstema de VacIO ~ las celdas con la mezcla xIleno-keroseno cada 15 lecturas

11 l&s! la absorbancla a 328 nm de cada uno de los extractos IrradIados contra la mezcla de keroseno/xtleno

17 La relaCIón de los volumenes de suero potasa alcohóhca xdenofkeroseno en el procedllmento como está descnto es 1 1 2 SI se desea mcrementar la senslblhdad del método se puede (a) aumentar el volumen de suero (o plasma) y proporCiOnalmente el de potasa alcohóhca (mantemendo la relaCIón 1 1) sm vanar el volumen de keroseno/xIleno, en cuyo caso el tamafio de los tubos de ensayo debe adaptarse para que éstos acepten mayores volumenes, o (b) dlsmmurr el volumen de keroseno/xIleno mantemendo malterados los volumenes de suero y potasa alcohóhca En estos casos debe conSiderarse la neceSIdad de adaptaCIones para asegurar que en la cámara de rrradlaclón la expOSICión de los extractos a la luz ultraVioleta es extensa y completa Tómese en cuenta que cualqUier vanaClón en la relaCIón de volumenes de suero a xIlenolkeroseno conlleva un dIferente factor de dIlUCión en la ecuacIón para los cálculos

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Metodolog¡as Anailtlcas para el Control y la EvaluacIón de la FortificacIón de Azucar con Vltamma A

G Cálculos

1 ComJa la absorbancIa de cada muestra antes de Irrachar restando la absorbancIa del blanco no IrradIado Haga lo mIsmo con las fraccIOnes Irradiadas, utIlIzando el blanco Irradiado Notese que en ocasIOnes la absorbancla del blanco de reactIvos es negatIva, por lo que debe sumarse esta lectura en vez de restarse

2 DetermIne la absorbancla espeCIfica debIda al retInol restando las lecturas corregIdas de los tubos IrradIados de las de sus correspondIentes no Irrachados, y comJa por el "factor" de efiCIenCIa de la camara de machaclOn (ver Secclon XIV C 2)

3 Calcule la concentraclOn de retInol con la ecuaclon sIgUIente

[Retzno/] (llgldL)

en donde

AbSRetlnol X Vs X 106

e x Vm

AbsretlDol es la absorbancIa de cada muestra determInada como se explIca en la etapa G 2, amba

Los parametros de la ecuaclon son los sIgUIentes

Parametro Exphcaclon Valor

e CoefiCiente de absortlVldad (g 1 cm 1 dL) del 1570 retlnol en la mezcla de keroseno/xlleno a 328 nm

Vs Volumen de la fase organlca (mL) 1 O

Vm Volumen de la muestra (mL) 05

UtilIzando estos parametros, la ecuaclOn antenor se SImplIfica a

[ Retznol ] (Jlgldl) = Absrett"ol x 12739

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Manual para la Fortificación de Azucar - Parte 3

H Verificación de la reproduclblhdad del metodo

Con el propOSItO de venficar la reproducIbIhdad del meto do a traves de comdas mdependtentes, se recomIenda preparar un pool de suero y deterrnmar su concentracIOn exacta de retmol Prepare una sene de VIales con 1 5 rnL de este suero control, tratando de que se deje el mInlmo espaCIO lIbre entre la superficIe de la muestra y la tapadera del tubo Desplace el aIre de los tubos con un gas merte (p e rutrogeno) y tape hennetlcamente Mantenga estos tubos congelados a -20°C o temperaturas mas bajas Incluya en cada comda rutmana el análISIS de este control Con los valores encontrados después de 10 o mas comdas del control, calcule el coefiCIente de vanaClOn mterensayo del metodo

VerificaCión de la recuperación del método

Se aconseja venficar penodtcamente la recuperaCIOn de la extraccIOn Para ello, se sugIere el SIguIente procedImIento

1 IrradIe una muestra control de plasma o suero con luz ultravIoleta por 1 hora Luego, separe dos porcIones A una de las porCIOnes (el "control") aireguele 10 mlcrohtros de una solucIOn de retmol-50 J.1g1rnL en etanol absoluto18 por cada mIlIhtro de muestra A la segunda porCIOn (el "blanco") aireguele 10 mlcrohtros de etanol por cada mIlIlItro de muestra Trate ambas porCIOnes como muestras mdependlentes sigUIendo el procedimiento de analIsls a partIr de la etapa F 2

2 Calcule la absorbancla debida al retmol agregado asl

Abs retmol = ( Abscont - Absbk - Abscont" + Absbklrr )

en donde Abscont y Abscontur son la absorbancla del "control" antes y despues de llTadlacIOn, respectivamente, y Absbk y Absbkur son las absorbanclas del "blanco" antes y despues de llTadlacIOn, respectivamente

El resultado de este calculo es la absorbancla debida al retmol agregado (s)

18 Una dilUCión 1 10 de la solUCión de retmol-50 /lglmL deberla tener una absorbancla cercana a O 9 cuando es leida a 325 nm en contra de etanol

36

Metodologzas Anal,t,cas para el Control y la El'aluaclOn de la FortificacIón de Azucar con Vltamma A

3 Por aparte, en un balon de 10 rnL, ~ 50 flL de la m.1sma soluclOn de retmol (50 flg/rnL) Y lleve a volumen con la mezcla de keroseno/xlleno Lea la absorbancla de esta soluclon a 328 nm en contra de la mezcla de keroseno/xIleno, y multlphguela por O 99, que es la relaclon entre esta dIluclOn y la dIluclon que ocurre durante el ensayo de recuperaclon (200/202) Este producto (t) es la absorbancla teonca que debla haberse encontrado SI la recuperaclon fuera 100% eficIente

4 Calcule la recuperaclOn (R) asl

s R = - x 100

t

J Variantes

SI se contara con un espectrofotometro que pueda leer con exactItud celdas de menor capacIdad, los volumenes de muestra y reactIvos pueden reducIrse proporcIonalmente, hacIendo las adaptacIones necesanas en el tamaño de los tubos de ensayo y tubos de IrradIar, asl como en la camara de IrradlaclOn

Tanto con el metodo descnto antenormente como con mlcrometodos, se recom.1enda que antes del uso de un espectrofotometro se venfique su capacIdad para leer celdas pequeñas Para ello, prepare dIlucIOnes 1 100, 2 100, 3 100, 4 100 Y 5 100 de una soluclon de retmol-50 flglrnL en etanol Lea la absorbancla de estas solucIones a 325 nm utIhzando celdas de cuarzo normales (3 rnL), Y compare la absorbancIa con celdas de cuarzo sem.1-m.1cro (1 rnL) o mIcro (menos de 1 rnL) La lectura con las ultImas celdas debena comcldIr con aquella de las celdas normales Se espera que las dlluclOnes de retmol señaladas amba tengan absorbanclas en el mtervalo de O 100 aO 500

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x. DETERMINACION DEL RETINOL SANGUINEO POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)

------------~~ ---.st:....,..,...-

A Referencias

Bankson D D , Rusell R M Y SadowskI J A 1986 DetennmatIon of retmyl esters and retInol m serum or plasma by normal-phase hqwd chromatography method and apphcatlOns Clm Chem 3235-40

Bien J G , Tolhver T J Y Catlgnam G L 1979 SImultaneous determmatlOn of «x-tocopherol and retmol m plasma or red cells by htgh pressure hquld chromatography Am J Clm Nutr 322143

DeRuyter M G M Y DeLeenheer A P 1976 DetennmatlOn ofserum retInol (vltamm A) by htgh­speed hqwd chromatography Clm Chem 22 1593-1595

Packer L 1990 Methods m Enzymology Retmouls Part A Molecular and metabollc Aspects Vol 189 75-76, 155-167, 170-175 New York AcademIc Press

B Prmclplo

Este es un metodo muy selectIvo y preCISO, que no reqwere de blancos ru de la Irradlaclon de los extractos que contienen el retmol La muestra no necesita saporuficaclOn, ya que el metodo se destma a medir solo el retInol lIbre SI se deseara detennmar los esteres de retmol, el metodo puede adaptarse con tal proposlto

El suero o plasma es dllUldo 1/2 con una soluclOn de acetato de retmol en etanol El acetato de retInol srrve de control mterno y el etanol precipita las protemas y lIbera al retmol, que luego se extrae con hexano El extracto se evapora baJO un atmosfera de rutrogeno y el resIduo se resuspende en metanol El retmol se separa por medIO de cromatografia hqUlda de alta resoluclOn, uuhzandose una fase estaclOnana apolar (C1S) y metanol al 95% como fase movIl El retmol se detecta con un detector ultraVIoleta a 325 nm, y su concentraclOn se determma con base en la relaclOn del area del pICO del retmol con la del acetato de reUnol

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Manual para la FortificacIón de Azucar - Parte 3

e Puntos críticos y precauciones

Se necesIta un espectrofotometro con capacIdad de lectura cercana a 325 nm Por la ImportancIa del espectrofotometro en cuanto a la exactItud y confiablhdad de los anallsls, este debe calIbrarse frecuentemente, para ello, deben seguIrse las InStruCCIOnes que generalmente se mcluyen en los manuales del fabncante que vIenen con el eqwpo, especIalmente para venficar que el monocromador esta bIen ajustado La cahbraclOn debe hacerse penodlcamente y no solo cuando se mstala una lámpara nueva 19

Una vez que el retmol se ha extratdo en la fase organtca, el anahsls no debe mterrumplrse

DebIdo a que tanto el patron de retmol como el control mtemo de acetato de retmol no son completamente puros, debe estImarse su pureza medIante el porcentaje del area del pICO correspondIente a cada uno de estos analItos con relaclOn al area total de los pICOS del cromatograma

SI se carece de agua grado HPLC obtemble comerCIalmente, esta puede prepararse en el laboratono con agua bldesttlada, sometIendola a desmmeralIzaclOn, filtrado y ebulhclOn

De acuerdo a la expenenCIa con este meto do en los laboratonos del INCAP, los resultados de dos submuestras de la mtsma muestra anahzadas mdependIentemente no deben apartarse de su promedIo en mas de 10%, en caso contrano el anallSIS de la muestra se repIte completamente La recuperaclon del metodo es mayor de 95%

o EqUipo y materiales

AgItador tIpo Vortex

Balones volumetncos de 10 y 100 mL Bulbos para aspIraclon con pIpetas Pasteur y pIpetas serologIcas

Celdas de cuarzo para espectrofotometro

Centnfuga refrtgerada

Columna MIcropak SP-18-5 de 150 x 4 (D 1) mm

Cromatografo hqwdo con detector UV

Cronometro

Espectrofotometro UV NIS

19 La secCIón XIV e 1 descnbe un procedmuento para calIbrar espectrofotómetros SImples, los que comunmente son utIlIZados en qUÍDuca cUmca

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Metodologias Analmcas para el Control y la EvaluacIón de la FortificaclOn de Azucar con VitamIna A

Frascos de VIdnO oscuro

Membranas Mtllpore para filtros de 45 J..lm

PIpetas automatIcas tIpO Eppendorf

PIpetas graduadas serologIcas

PIpetas Pasteur

Tubos comcos para centrífuga (9 x 76 mm)

Tubos mIcrocentnfuga ambar (500 J..lL)

Vasos de precIpItar (beaker) de 10 rol

E ReactiVos

1 Etanol Absoluto p a ((C2HsOH), pureza=99 8%, PM=46 07, d=O 79 g/rol)

2 Hexano grado HPLC ((C6H14), pureza=95%, PM=86 18, d=O 66 g/rol)

3 Metanol grado HPLC (CH30H), pureza 100%, PM=32 04, d=O 79 g/rol)

4 Gas Nltrogeno (pureza=99 5%)

5 Control Interno de acetato de retInol

a SolucIOn "concentrada" (=500 J..lg/roL)

En un vaso de precIpItar de 10 rol ~ O 056 g de acetato de retInol de la mas alta pureza (pM=328 5, pureza=90%) y dIsuelva con etanol absoluto Transfiera a un balon volumetnco de 100 rol Lave el vaso de precIpItar con VarIas porCIOnes de etanol absoluto, y transfiera los lavados al balon AfUe211e aprOXImadamente O 002 g de BHT (3,5-bIs-(t-butd)-4-htdroxI­tolueno) Afore a 100 rol con etanol absoluto Guarde la solucIOn en congelacIOn (-20°C) en un frasco de VIdnO oscuro con tapon de rosca La concentracIon de esta solUCIOn se estIma por calculo a partIr de la concentraclOn de la SolUClon "ruJa"

b SolucIOn "madre" (=50 J..lg/roL)

En un balon volumetnco de 10 rol ~ 1 rol de la solucIOn "concentrada" a 10 rol con etanol absoluto Guardela como se IndICa para

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Manual para la Fort¡ficaclOn de Azucar - Parte 3

la solucIOn "concentrada" y estime la concentracIOn de retmol a partir de la concentracIOn de la solucIOn "ruja"

C SolucIon "ruja" (=0 5 J.lglmL)

En un balon volumetnco de 50 mL, dIluya O 5 mL de la SolucIon "madre" a 50 mL con etanol absoluto Guárdela refngerada Descártela al termmar de utIlIzarla

Determme la concentracIon de acetato de retmol en la Soluclon "ruja" en un espectrofotometro como SIgue

1 AJUste el cero del mstrumento con etanol absoluto Lea en tnplIcado la absorbancIa de la solucIOn "ruja" de acetato de retmol a 325 nm

11 DIvIda el valor promedIo de la absorbancla entre O 15620 Y multIplIQue por el grado de pureza del reactivo (area del acetato de retmol/area total de todos los pICOS del cromatograma) El resultado obterudo es la concentracIOn en J.lg/mL de la solucIOn "ruja"

El ruvel de retmol de las solUCIOnes "madre" y "concentrada" en J.lglmL se obtIene multIplIcando ese valor por 100 Y 1000, respectivamente

6 SolUCIOnes patron de retmol

a SolucIOn "concentrada" (=500 J.lglrnL)

En un vaso de precIpItar de 10 mL pese O 071 g de retmol de la mas alta pureza (pM=286 5, pureza=70%) y dIsuelva con etanol absoluto Transfiera a un balon volumetnco de 100 mL Lave el vaso de precIpItar con vanas porCIOnes de etanol absoluto, y transfiera los lavados al balón Am¡we aproxunadamente O 002 g de BHT ~ a 100 mL con etanol absoluto Guarde la solucIOn en congelaclon (-20°C) en un frasco de Vldno oscuro con tapon de rosca La concentracIon de esta solucIOn se estIma por calculo a partrr de la concentracIOn de la SolucIon "ruja"

20 Este valor es el coefiCIente de absortlvIdad (J.1g I cm 1 mL) del acetato de retmol en etanol a 325 nm

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Melodologzas Anallllcas para el Control y la EvaluaCIón de la ForlificaclOn de Azucar con Vllamlna A

b SolucIOn "madre" (:::: 50 ~g/mL)

En un balon volumetnco de 10 mL dlluya 1 mL de la solucIOn "concentrada" a 10 mL con etanol absoluto Guardela como se mdIca para la solucIOn "concentrada" y estIme la concentraclOn de retmol a partlr de la concentracIOn de la solucIón "ruja" de mayor concentracIón

C SolucIones "luJas" (::::1-10 JlglmL)

En balon volumetnco de 25 mL, dlluya 5 mL de la SolucIon "madre" a 25 mL con etanol absoluto, esta es la solucIOn "luJa" de 1 O ~glmL Dlluya con etanol absoluto esta solucIOn "luJa" para obtener por lo menos 10 mL de 5 solucIOnes de retmol de dIferente concentraclOn dentro del rango de 1 a 1 O ~glmL Guarde las solucIOnes "luJas" refngeradas Descartelas al tennmar de utlhzarlas

Detennme en un espectrofotometro, la concentraclOn de retmol de la solucIOn luJa de mayor concentraclOn como SIgue

1 Ajuste el cero del mstrumento con etanol absoluto Lea en tnplIcado la absorbancla de la solucIOn "luJa" de retmol-l0 ~g/mL a325 nm

11 DIVIda el valor promedIo de la absorbancla entre O 184521 y multIphQue por el grado de pureza del reactlvo (area del retmollarea total de todos los pICOS del cromatograma) El resultado obtemdo es la concentracIOn en ~glmL de esta Soluclon "luJa" Calcule la concentracIOn de las otras solucIOnes "luJas", dIVIdIendo el valor obtemdo entre los respectIvos factores de dllucIOn

El mvel de retmol de las solucIOnes "madre" y "concentrada" en JlglmL se obtlene multlphcando el mvel de retmolla soluclOn "luJa" de mayor concentraclOn por 5 y 50, respectlvamente

21 Este valor es el coefiCiente de absortlvldad (Jig I cm I mL) del retmol en etanol a 325 nm

43

Manual para la Fortificación de Azucar Parte 3

F PrOCedimiento

1 Obtención de la curva de calibración

a En balones volumetncos de 10 rnL, ponga O 1 rnL de la solucIOn "madre" de acetato de retmol (:::: 50 JlglrnL), Y 1 O rnL de cada solucIOn "luJa" de retmol Lleve a volumen con metanol grado HPLC

b Ftltre cada solUCIOn a traves de una membrana Mtlhpore de 45 Jlm AnalIce cada una de las solUCiones preparadas en la etapa antenor en el eqwpo de HPLC

C Trace una grafica de las concentraciones de retInol de las SolUCIones "luJas" en Jlg/rnL (x) versus el producto de la concentracIOn del control mtemo de acetato de retmol por la razon de las areas de los piCOS de elUCIOn del retmol sobre el del acetato de retmol (y) Calcule la ecuaCIOn de la lmea de regresIOn con los valores obterndos, esta le servua para calcular los rnveles de retmol de las muestras Esta curva es del tIpo

y=m x+b

en donde

y = [Acetato de retInol (JlglrnL)] x (Area pICO de retmol/Area piCO de acetato de retmol)

x = ConcentracIOn de retmol (JlglrnL)

m = PendIente (y/x)

b = Intercepto en la ordenada

Se recomIenda calcular esta lmea de regresIOn cada qumce dIas para confirmar que las condicIOnes analItIcas permanecen mvanables Sm embargo, en cada comda debe analizarse por lo menos un control de retInol para confIrmar la valIdez de la curva de cahbracIOn

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MetodologUlS Analztlcas para el Control y la EvaluacIón de la Fortificac/On de Azucar con VItamIna A

2 Extracción

Una sola extracclOn es suficIente para plasma y suero ya que se procesa un mayor numero de muestras y se mtroducen menos errores

a SI las muestras han estado en congelaclOn, descon~elelas a temperatura ambIente (20-25°C) y mezclelas perfectamente en un agItador tIpo Vortex SI se usa plasma, centnfu~ue a 2,500 rpm por 10 mmutos para ehmmar cualqU1er mterferencIa debIda a la formaclon de fibnna

b A tubos comcos para centnfuga de 9 x 76 mm, transfiera en duplIcado 025 mL de suero (o plasma)

c Agregue O 25 mL de la soluclon "ruja" del control mterno (acetato de retmol) Mezcle en un agItador tIpo Vortex por 1 mmuto

d Agreirne O 5 mL de hexano, y mezcle vIgorosamente en agItador tIpo Vortex por 1 mmuto

e Centnfu~ue a 2,000 rpm 2 mmutos, prefenblemente en una centnfuga refngerada

f Transfiera con pIpeta Pasteur la fase orgamca a un tubo mlcrocentnfuga ambar

g Evapore utIlIzando una comente de rutrogeno, dentro de una campana para solventes orgamcos

h Resuspenda el extracto con ° 25 mL de metanol grado HPLC Mezcle en agItador tIpo Vortex por 1 mmuto

1 Centnfu~ a 2,000 rpm 5 mmutos

45

Manual para la F07'lificaclon de Azucar Parte 3

3 Cromatografía

a Con una Jennga, tome la cantIdad apropIada de muestra de acuerdo a la capacIdad del equIpo e myectela al SIstema de HPLC baJO las condIcIOnes anahtIcas especIficadas Un ejemplo es el sIgUIente

Fase movll

FlUJO

Detector

Atenuaclon Integrador

Velocidad del papel

Volumen de Inyecclon

Tiempo de eluclon

95% metanol/5% agua

16 mUmln

UV a 325 nm con sensibilidad de 0002 UAlmV

4

1 cm/mJn

100 ~L

Retlnol 2 5 mln

Acetato de retlnol 4 5 mJn

b Al finalIzar el trabajO del dIa, lave el SIstema por lo menos por 30 mmutos a un flUJO de O 5 mL/mm con una mezcla de 95% metanol/5% agua, y despues con metanol al 100% por 15 mmutos

G Cálculos

1 Calcule la razon del area del pICO de retmol sobre el de acetato de retmol de cada muestra, y luego mulnphquela por la concentracIOn de la Soluclon "ruja" de acetato de retInol

2 La concentracIón de retmol en las muestras se calcula utIlIzando dIrectamente la curva de callbracIOn

3 Para mformar los ruveles de retmol en las muestras en JlgldL, multIphque los valores estlmados en el paso antenor x 100

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Metodologuzs Analltlcas para el Control y la Evaluaclon de la F ortificac/On de Azucar con Vltamma A

H Verificación de la recuperación del método

Aunque no es Imprescmdlble para los calculos, se aconseja venficar trImestralmente la recuperaCIOn del metodo Para ello, se sugIere el slgUlente procedtmlento

1 IrradIe una muestra de plasma o suero con luz ultravIOleta por 10 menos 1 hora Luego, separe dos porCIOnes A una de las porcIones agre~e 10 mlcrolItros de la soluclon "madre" de retmol de 50 llg/rnL por cada mtlIlItro de muestra ("control") 22 A la segunda porCIOn ("blanco") agregue 10 ffilcrohtros de etanol por cada ffilhhtro de muestra Trate ambas porcIOnes como muestras mdependlentes sigUIendo todo el proceso cromatografico

2 Usando la curva de callbracIOn, calcule el mvel de retmol para las dos porCIOnes Sustrruga el mvel de retmol calculado para el "blanco" del ruvel calculado para el "control" El resultado de este calculo es la cantIdad de retmol recuperada (s)

3 Por aparte, en un balon de 10 rnL, ~ O 1 rnL de la solucIOn "madre" de retmol de 50 J..lglrnL, 01 rnL de la soluclOn "madre" del control mtemo (acetato de retmol) y lleve a volumen con metanol grado HPLC Anahce esta solucIOn en el sIstema de HPLC

4 EstIme el ruvel de retmol usando la curva de callbracIOn, y dlvldalo entre 1 01 (ajuste por la dllucIOn hecha de la solucIOn "madre" de retmol en la muestra "control") Este valor (t) es el mvel teonco de retInol que debla haberse encontrado SI la recuperaCIOn fuera 100% efiCiente

5 Calcule la recuperaCIOn (R) asl

s R = - x 100

t

22 Una dtluclón 1 10 de la solUCIón "madre" de retmol deberla tener una asborbancla cercana a O 9 cuando es leida a 325 nm en contra de etanol

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XI. METODOS PARA LA DETERMINACION DE RETINOL EN LECHE HUMANA

A Introducción

La evaluaclOn delnnpacto nutnclOnal de un programa de fortIficaclOn de azucar con vltamma A puede hacerse rrudlendo los ruveles de retmol en leche humana, antes y despues de la mtervenclOn

Dos meto dos para la determmaclOn del retmol en leche humana se presentan aqUI El pnmero es una adaptaclOn del metodo espectrofotometnco ClasICO de Bessey y colaboradores (1946) (ver seCClOn XII) La especIficIdad de este metodo se basa en la destrucclOn selectIva del retmol hbre o estenficado presente en la muestra, por IrradlaclOn con luz ultravIoleta El segundo metodo reqUIere un aparato de cromatografia hqUIda de alta resoluclOn (HPLC), para separar el retmol hbre de otras sustanCIas, lo cual lo hace mas espeCIfico (ver seCClOn XIII) El metodo espectrofotometnco, sm embargo, tIene la ventaja de que su costo es menor, yademas permite analIzar dos a tres veces mas muestras durante el mIsmo penodo de tiempo

La selecclOn entre uno u otro meto do depende pues de los proposItos del estudIo y de los recursos dlsporubles MIentras que el meto do de HPLC es mdudablemente mas exacto y preCISO, ambos metodos son sufiCIentemente Informativos para proposltos de evaluaclOn

La determmaclOn de retmolleche humana SIgue las SIguIentes etapas de laboratono

1 SaponzjicaclOn Las muestras son tratadas con potasa alcohohca para hldrohzar los esteres de retmol La mayor parte de la Vltarruna A esta en forma de esteres en la leche, por lo que es necesano hldrohzarlos para obtener retmol hbre En el metodo espectrofotometnco, la saporuficaclOn tamblen mejora la exactItud de la deterrrunaclOn al eVItar errores debIdos a dIferencIas en proporCIones de extraCClOn de las dIferentes formas en las que aparece el retmol

2 ExtracclOn El retmol y sus esteres no hIdrolIzados son extraldos con un solvente orgaruco En la deterrrunaclon espectrofotometnca se prefiere una mezcla de xdeno-keroseno, rruentras que en la determmaclOn por HPLC se utIlIza hexano u otro solvente de facd evaporaClOn

3 DetermmaClOn de la absorbanclO Tanto en el metodo espectrofotometnco como en el de HPLC, la absorbancIa del retmol a 325 nm se usa para su determmaclOn cuantitativa

49

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Manual para la Forlificaclon de Azucar Parle 3

4 DestrucclOn selectiva del retmol Para asegurarse de que la absorbancIa sea debIda solo al retmol, esta se detenruna en los extractos de las muestras antes y despues de destruir selectivamente el retmol por IrradIaclOn con luz ultravIoleta El meto do de HPLC no reqUIere esta etapa, ya que preVIO a la medIcIon de la absorbancla del retmol, este se separa cromatograficamente de otras sustanCIas acompañantes, mclusIve de sus esteres

B Toma y manejo de las muestras de leche

Las muestras de leche deberían Idealmente ser representativa del conterudo total extraIdo de un pecho, que no haya SIdo utilIzado durante por lo menos 2 horas, porque la concentraclOn de algunos componentes de la leche, espeCIalmente grasas y sustanCias solubles en grasa como la vItamma A aumentan durante el penodo de amamantamIento Sm embargo, en encuestas epldeml010gIcas esto es generalmente lffipractIco, por 10 que se recomIenda tomar 10 mL del pecho lleno que no ha SIdo utIbzado durante por lo menos una hora Es esenCIal que el prOCedImIento segwdo sea claramente documentado y consIstentemente segUIdo

La leche puede obtenerse en forma manual o utIlIzando una bomba, vrrtIendola dentro de frasco de 20 a 30 mL con boca ancha y tapadera de rosca Este frasco puede ser de VldnO o de pohproptleno (e g Nalgene) Las muestras deben protegerse de expOSlClon al aIre, la luz solar, la luz bnllante y temperaturas elevadas Se recomIenda que alICUOtas de cada muestra sean puestas en VIales separados tan pronto como sea pOSIble despues de la recolecclOn Se aconseja que SI las muestras van a permanecer congeladas por penodos largos de tiempo, la atmosfera amba de la superfiCIe de la muestra sea llenada con rutrogeno, reemplazando la atmosfera ongmal con una comente de este gas durante 30 segundos, despues de las cuales el frasco se CIerra lo mejor pOSIble Las muestras deben ser congeladas tan pronto como sea pOSIble, y no descongelarse hasta el momento de su anallSIS Antes de su anallsIs, las muestras de leche deben ser completamente homogeruzadas, prefenblemente por soruficaclOn

SO

XII. APLICACION DEL METODO ESPECTROFOTOMETRICO POR DESTRUCCION ULTRAVIOLETA PARA LA DETERMINACION DE RETINOL TOTAL EN LECHE HUMANA

A pesar de que el metodo descnto en la seCCIOn IX fue ongmalmente propuesto para la detenrunacIon espectrofotometnca de retmol en suero o plasma, este puede ser aplIcado facIlmente a leche humana El pnnCIpIO del metodo, asl como el eqwpo, matenales y reactivos necesanos son los mIsmos

AlIcuotas de las muestras de leche cwdadosamente homogeruzadas son tratadas y analIzadas exactamente como las de suero o plasma El tamaño de las allcuotaS es Igual, ya que los rangos de concentracIOn de retmol en estos flwdos es muy slmIlar El calculo de los resultados se basa en las mIsmas ecuaCIOnes

Debe notarse que este metodo mIde VItamIna A preformada total y no dIferencIa entre retmol lIbre y sus esteres DebIdo a que la leche contlene vanos esteres de retmol, la exactItud de los resultados en termmos estnctos de retmol hbre es un poco mfenor a las de suero sangumeo, ya que la saporuficacIOn no es completa y los reSIduos de esteres no hIdrolIzados pueden comportarse en forma lIgeramente dIferente durante el paso de extraccIOn del analIsIs Esta relativa lImItacIon, sm embargo, se ve amphamente compensada por la gran praCtlcabIhdad y baJO costo de este metodo, caractenstIcas que lo hacen el mas recomendable en encuestas epldemIologlco-nutncIOnales para la evaluacIOn del Impacto de mtervencIOnes con VItamIna A En efecto, para este propOSltO lo que mteresa fundamentalmente es el conterudo de retmol total en la leche materna (lIbre mas sus esteres) o sea su actIvIdad de vltamma A preformada, pues eXIste abundante eVIdencIa de que este parametro refleja el estado nutncIOnal de vItamma A de las mUjeres lactantes

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XIII DETERMINACION DE RETINOL EN LECHE HUMANA POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)23

A Referencla24

8 Prmclplo

El retmol en leche humana se encuentra en su mayor parte estenficado con aCldos grasos El enlace ester debe ser sapornficado para obtener retmol hbre El denvado de retmol conocIdo como acetato de 3,4-dIdeh1droretmol, puede ser utIhzado como un estandar mtemo, agregando se a las muestras de leche prevIo a la sapornficacIon Despues de la sapornficaclOn, tanto el retmol como el dIdeh1droretmol son extraIdos y analIzados por HPLC utIlIzando una columna de fase reversa del tIpo C18, y una fase movd de metanol/agua

e Puntos críticos y precauciones

Se necesIta un espectrofotometro con capacIdad de lectura cercana a 325 nm Por la ImportancIa del espectrofotometro en cuanto a la exactItud y confiablhdad de los analIsIs, este debe calIbrarse frecuentemente, para ello, deben segUIrse las mstruCClones que generalmente se mcluyen en los manuales del fabncante que VIenen con el eqUIpo, especIalmente para venficar que el monocromador esta bIen ajustado La callbraclOn debe hacerse penodIcamente y no solo cuando se mstala una lampara nueva 2S

Una vez que el retmol se ha extrmdo en la fase orgarnca, el anallsls no debe mterrumpIrse

En los casos que no se pueda obtener agua grado HPLC, esta puede prepararse en el laboratono con agua bIdestdada, sometIendola a desmmeralIzaclOn, filtrado y ebullIclOn

De acuerdo a la expenenCla con este metodo en el departamento de BlOqUlmlca y BlOfislca de al Uruversldad de Iowa, los resultados de dos submuestras de la misma muestra

23 Esta seCCIón fue escnta por Sherry TanwDlhardJo, del departamento de BlOqulDllca y BIofisIca de la UDlversIdad del Estado de Iowa

24 Este método se basa en el procedmllento desarrollado por S TanwDlhardJo y J A Olson del Departamento de BIoquÍlDlca y BlOfisIca de la UDlversIdad del Estado de Iowa

25 La seCCIón XIV e l descnbe un procedunIento para calIbrar espectrofotómetros sunples, los que comUIlDlente son utIlIzados en qUÍlDlca clÍlllca

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Manual para la FortificacIón de Azucar - Parte 3

analIzadas IndependIentemente no deben apartarse de su promedIO en mas de 10%, en caso contrano el analIsIs de la muestra se repIte completamente

D EqUipo y materiales

AgItador tIpo Vortex

Balones volumetncos de 25 mL Bulbos para aspuacIOn con pIpetas Pasteur y pIpetas serologIcas

Celdas de cuarzo para espectrofotometro

CentnfUgarefilgerada

Columna de fase reversa "Water Resolve" 5 /lm CI8

Cromatografo lIqUIdo con detector UV Cronometro

Espectrofotometro UV NIS

PIpetas automatIcas tIpo Eppendorf

PIpetas graduadas serologIcas

PIpetas Pasteur

Tubos de 10 mL con tapon de rosca

Tubos de ensayo de 7 mL con tapon de rosca

E ReactiVos

1 Etanol Absoluto p a «C2HsOH), pureza=99 8%, PM=46 07, d=O 79 g/mL)

2 2-propanol p a «CH3CH(OH)CH3), pureza=99 7%, PM=60 10, d=O 78 g/ml)

3 HldrOXldo de pOtasIO 50 50 p/v en agua (KOHlH20)

4 Agua punficada

5 Hexano grado HPLC «C6HI4), pureza=95%, PM=86 18, d=O 66 g/mI)

6 Metanol grado HPLC «CH30H), pureza=100%, PM=32 04, d=O 79 g/mI)

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Metodolog/OS AnalUrcas para el Control y la Evaluac/On de la Fort¡ficac/On de Azucar con Vltamma A

7 Dlc1oruro de etIleno grado HPLC «CICH2CH2CI), pureza=99 8%, PM=98 96, d=l 25 g/mI) o dlc1oruro de metIleno grado HPLC «CH2CI2), pureza=99 9%, PM=84 94, d=l 32 g/mI)

8 Nltrogeno o argon (pureza=99 5%)

9 Control mterno de acetato de 3,4-dldelndroretmol (ADR)26 (C22H3002,PM=326)

El ADR es una excelente opClOn para utIlIzar como control mterno por las siguientes razones

a El ADR puede agregarse a la leche antes de que empiece el anallsls y exponerse a todas las etapas del proceso hasta su detecclOn en HPLC

b El ADR se encuentra como ester, y por 10 tanto puede servtr como un modelo para segurr la saporuficaclOn

c PermitIendo la eluclOn de sustanCias de la columna de HPLC por penodos mas largos de 10 usual puede deterrnmarse la efiCienCia de la saporuficaclOn en cada labora tono

d El ADR es facIlmente separable y dlferencIable del retmol durante el anallsls de HPLC

La soluclOn de ADR se prepara como sigue

Tome 10 J.ll de la solUClOn patron de ADR (35 mM en aceite de maIZ) y mezcle con 25 mL de 2-propanol en un balon volumetnco Esta es la soluclOn "madre" de ADR

26 CantIdades pequetlas de este reactIvo disuelto en aceite de maíz pueden sohcltarse a la Umversldad del Estado de Iowa cubnendo los costos de envio

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Manual para la FortificacIón de Azucar Parte 3

10 SolUCIOnes patron de retmol

a SolucIOn "concentrada" (<:=500 J.1g/mL)

En un vaso de precipitar de 10 mL pese O 050 g de retmol de la mas alta pureza (PM=286 5, pureza = 70%) Y disuelva con etanol absoluto 27

Transfiera a un balón volumétnco de 100 mL Lave el vaso de preCipItar con vanas porCIOnes de etanol absoluto, y transfiera los lavados al balon Agregue aproxunadamente O 002 g de BHT (3,5,-blS-(t-butd)-4-htdrOXl­tolueno) Afore a 100 mL con etanol absoluto Guarde la SolucIon en congelacIOn (-20°C) en un frasco de VldnO oscuro con tapon de rosca La concentraclon de esta solucIOn se estIma por calculo a partIr de la concentracIOn de la solucIOn "ruja"

b SolucIon "madre" (<:= 50 J.1g/mL)

En un balon volumetnco de 10 mL dIluya 1 mL de la solucIOn "concentrada" a 10 mL con etanol absoluto Guardela como se mdlCa para la SolucIon "concentrada" y estIme la concentracIOn de retmol a partIr de la concentraclon de la SolucIon "ruja" de mayor concentracIOn

C SolUCIones "rujas" (<:= 1-10 J.1g/mL)

En balon volumetnco de 25 mL, dIluya 5 mL de la SolucIon "madre" a 25 mL con etanol absoluto, esta es la SolucIon "ruja" de 10 J.1g/mL DIluya con etanol absoluto esta SolucIon "luJa" para obtener por lo menos 1 O mL de 5 solucIOnes de retInol de dIferente concentraclon dentro del rango de 1 a 10 J.1g/mL Guarde las solucIOnes "rujas" refrIgeradas Descartelas al termmar de utilIzarlas

Determme en un espectrofotometro, la concentracIOn de retmol de la Soluclon ruja de mayor concentraclon como SIgue

27 SI retmol de alta pureza no se encuentra en el mercado, éste puede preparse con los siguientes métodos (a) RedUCCión del retmaldehldo (que es quúmcamente más estable que el retmol) con borohldruro de sodiO (NaBH4), (b) sapomficaclón del acetato de retmol con una mezcla alcohólica de hidróxido de pOtasiO (KOH), y (c) punficaclón del retmol comercial en el aparato de HPLC y colectando el piCO de retmol que eluye de la columna.

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Metodologias Analmcas para el Control y la Evaluac/On de la Fort¡jicaclón de Azucar con Vltamma A

1 AJUste el cero del Instrumento con etanol absoluto Lea en tnphcado la absorbanCla de la solucIOn "luJa" de retInol-l O J.1g/mL a325 nm

11 DIVIda el valor promedIO de la absorbancla entre O 184528 Y multIphque por el grado de pureza del reactIVO (area del retmollarea total de todos los pICOS del cromatograma) concentraclOn en J.1g/mL de esta soluclOn "ruja" Calcule la concentraclOn de las otras SolUCIones "luJas", dIVIdIendo el valor obterndo entre los respectIVOS factores de dlluclOn

El rnvel de retmol de las solUCIOnes "madre" y "concentrada" en J.1g/mL se obtiene multIphcando el rnvel de retmolla soluclOn "luJa" de 1 O J.1g/mL por 5 y 50, respeCtivamente

F Procedimiento

1 ObtenCión de la curva de cahbraclón

a En balones volumetncos de 10 mL, ponia 1 O mL de cada SolUCIon "ruja" de retInol Lleve a volumen con 2-propanol

b Flltre cada solUClOn a traves de una membrana Mllhpore de 45 J.1m Anahce cada una de las SolUCIones preparadas en la etapa antenor en el eqwpo de HPLC

c Haia una curva patron de retmol ploteando las areas de los pICOS del retmol versus la cantIdad de retmol myectada (ng) Determine la mejor lmea recta con una ecuacIon del tIpO

y=m x+b

en donde

y = Area del pICO de retino!

x = Masa Inyectada de retInol (ng)

28 Este valor es el coefiCIente de absortIvldad (~g I cm I mL) del retmol en etanol a 325 nm

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Manual para la Fortificac/On de Azucar - Parte 3

m = PendIente (Y/x)

b = Intercepto en la ordenada

Determme la masa de retmol en las muestras por medIo del area del pICO ya sea dIrectamente con la grafica o utIlIzando la relaclOn

_ (y-b) x ---

m

Se recomIenda calcular esta lmea de regreslOn cada qumce was para confirmar que las condIcIOnes analltIcas permanecen mvanables Sm embargo, en cada comda debe analIzarse por 10 menos un control de retmol para confirmar la valIdez de la curva de cahbraclOn

2 Sapomficaclón

a PIpetee O 5 mL de la leche a analIzar dentro de un tubo de centnfuga de 10 mL con tapon de rosca

b A~re~ue 40 J..I.L de la soluclOn "madre" de ADR (control mterno)

c Am~ue O 75 mL de etanol y mezcle en el agItador Vortex por 15 segundos

d Agre~ue O 4 mL de la soluclon KOHlH20 50 50 p/v Tape el tubo Mezcle en el agItador Vortex por 15 segundos

e Incube en baño de agua a 45°C durante 1 hora Mezcle en el agItador Vortex por 15 segundos cada 15 romutos

3 ExtraCCión

a Despues de la reaCClOn de sapomficaclOn, extral~a el retInol y el ADR con 1 mL de hexano Mezcle en el agItador Vortex por 30 segundos y luego centnfu~ue a 2,000 rpm por 30 segundos Usando una pIpeta Pasteur, transfiera la capa orgamca supenor dentro de un tubo de ensayo hmplo &mIta el procedtm1ento de extracclon con hexano dos veces mas Esto es, wewe el hexano, mezcle en el agItador Vortex y centnfu¡me

58

MetodologlOS Ana[¡tlCDs para el Control y la EvaluaclOn de la Fort¡ficaclOn de Azucar con VItamIna A

b Junte todas las fraccIOnes en el mIsmo tubo y evapore a sequedad soplando con mtrogeno o argon, dentro de una campana de laboratono apropIada para ser usada con solventes orgamcos

C Resuspenda el extracto con 1 00 ~l del solvente apropIado (p e 50 50 metanol dIcloruro de etIleno [o metIleno]) Mezcle en el agItador Vortex por 15 segundos, centnfugue, y mantenga a temperatura baja dentro de una melera hasta su myecclOn en el sIstema de HPLC

4 Cromatografía

a Con una Jennga, tome 25 ~l de muestra e myectela al sIstema de HPLC baJo las condICIOnes anahtIcas especIficadas Un ejemplo es el sIgUIente

Fase movll

FluJo

Detector

Atenuaclon Integrador

Velocidad del papel

Tiempo de eluclon

85% metanol/15% agua o 90% metanol/10% agua

10 mUmln

UV a 335 nm29 con sensibilidad de 0002 UAlmV

6

05 cm/mln

Retlnol 56 mln Dldehldroretlnol 4 6 mln

b Al fmalIZar el trabajo del dIa, lave el sIstema por lo menos por 15 mmutos a un fluJo de 1 O mL/mm con una mezcla de 50% metanoV50% dIcloruro de metIleno, y despues con metanol al 100% por 15 mmutos

G Cálculos

1 Determme la cantIdad de retmol (ng) de la muestra myectada utIlIzando la curva de cahbraclOn

29 Este es un punto mtermedlano entre la longItud de máxuna absorCIón del retmol, 325 nm, y la longItud de máxtma absorCIón del dldehldroretmol, 350 nm

59

Manual para la Forlif¡caclon de Azucar Parle 3

2 DIvida entre la cantidad de leche utilIzada (en este caso 125 J..I.L)

3 ComJa el valor de cada muestra dividendo entre la proporclOn de recuperaClOn del sIstema (ver seCClOn XIII H, adelante)

4 Para mformar los mveles de retmol en las muestras en J.!g/dL, multiplIque los valores estImados en el paso antenor x 100

H VerificaCión de la recuperaclon del método

Se sugiere el siguiente procedImtento

1 Diluya O 4 mL de la soluclOn "madre" de ADR a 1 mL con 2-propanol, e myecte en el sistema de HPLC

2 Espere a que el pICO del ADR eluya (cerca de 10 mmutos en una columna C18 de 15 cm de largo) DependIendo de la columna, los Isomeros Cls-trans pueden separarse De ser asI, sume el area de ambos piCOS, esta es el area SI el 100% del dldehtdroretmol fuera recuperado (1) despues de sapomficaclOn y extracclOn En una columna de fase reversa generalmente esto no sucede Sm embargo, cada laboratono debe venficar el comportarntento de su sIstema

3 Por aparte, a~re~ue 40 J..I.l de la soluclon "madre" de ADR sobre O 5 mL de agua Luego, ~ todo el procedImiento desde la etapa F 1 c hasta la F 4 a El area del pICO del dIdehtdroretmol es la cantidad extratda en el sistema (s)

4 Calcule la recuperaclon del dldehtdroretmol (R) asl

R s

t

Cada muestra tendra un valor especIfico para (s), y este debe ser corregido dIVIdIendo entre (R)

60

Metodologzas Analltlcas para el Control y la EvaluacIón de la Fort¡ficac/On de Azucar con VItamIna A

Variantes

Cuando se expresa la cantIdad de retmol por volumen, la coleccIon de las muestras de leche deben estar dIstnbUIdas durante todo el dIa, para asI poder compensar por la gran vanaClOn del conterudo de grasa de la leche SI esto no fuera posIble, el conterudo de la grasa de la leche puede estImarse factlmente utIlIzando el metodo del "crematocnto" Este metodo es utIl solo con muestras frescas, de no ser asI, tIene que emplearse un meto do qUImtCO para determmacIon de grasa 30

El procerumIento del metodo del crematocnto es el sIguIente

1 Coloque cerca de 751,11 de leche bIen mezclada dentro de tubos capIlares Selle uno de los extremos del tubo, y centnfu~ en una centnfuga de hematocnto

2 MIda la proporcIon del largo de la capa de crema sobre el largo total de la muestra, y determme la cantIdad de grasa con referencIa en una curva de calIbracIon estableCIda por medIO de un meto do qUImlco

3 Exprese la cantIdad de retmol por gramo de grasa

30 Vanos métodos químicos pueden encontrarse en Fems, A M Y Jensen R G 1984 Llplds m human mI1k A revlew 1 Samplmg, determmatIon, and content J Pedlatr Gastroenterol Nutr 3 108-122

61

XIV. CONTROL DE CALIDAD DEL LABORATORI031

A Criterios para el control de calidad

Todo metodo llene sus propIas caractensllcas mtnnsecas, las que determInan su optImO comportamIento en las mejores condIcIones operacIonales dellaboratono Esta seCCIon trata del control sIstemallco de la cahdad de las operaCIones de laboratono ms que de la determmacIon de la caractenstIca mtnnseca de confiabIhdad de cada metodo en partIcular CualqUIer prOCedImIento analItIco esta sUjeto a errores denvados de las condICIones bajo las cuales se lleva a cabo Estas mcluyen el "factor humano", factores ambIentales tales como la temperatura, la humedad, la exposIcIon a la luz, y las caractenstIcas del eqUIpo usado

Las dos caractenstIcas de los meto dos que mas comunmente son afectadas en grado Importante son la exactitud, o sea el grado al cual los resultados representan los valores verdaderos o reales, y la preCISlOn, o sea la reproduclblhdad de los resultados obterudos por los metodos baJO condICIones operacIonales rutmarIas

1 Determinación de la exactitud

Al montar un metodo, cada laboratono debe confIrmar la exactItud del procedimIento analItlco Idealmente esta debe ser Igual, o acercase, a la exactItud mtnnseca ongmal del metodo tal como se propone en la hteratura baJO optImas condiCiones operacionales El enfoque para determmar o venficar la exactItud baJO las condICIOnes de rutma dellaboratono puede VarIar de un meto do a otro La base general mas comun es la recuperaclOn de una cantIdad conOCIda del analIto que se trata de determInar En el caso del presente manual, cantIdades conOCIdas de retInol o de palmItato de retInol se agregan a una porclOn de la muestra Las muestras, con y sm el anahto añadIdo, se someten al anallsls tal como ordmarIamente se lleva a cabo en el laboratono en cuestlOn La cantIdad del analIto que se recobra expresada como porcentaje de la cantIdad añadida constItuye una expreslOn matematIca de la exactItud del metodo La validez de este ensayo se mcrementa SI se usan concentracIones del anahto que representen por lo menos las concentracIones de retmol "msuficIentes", "adecuadas" y "altas" que se espera encontrar en las muestras Por ejemplo, en el azucar fortrficada con vltamma A, estos ruveles podnan ser 5 Ilg/g, 15 Ilg/g, y 25 Il/g respectIvamente

Un enfoque alternatIVO mdIrecto para estImar la exactItud es analIzar controles certificados preparados por centros que se espeCIalIzan en la produccIon de los mIsmos, tales como el InstItutO NaCIonal de Estandares de los Estados Umdos Los valores que se obtengan debenan ser Iguales a aquellos mdlcados por ellaboratono ongmal

31 D 1 Mazanegos, INCAP, aportó slgmficatlVamente a la preparacIón de esta seccIón

63

Manual para la FortificacIón de Azucar - Parte 3

Una forma alternatIva para determInar la exactItud es comparar los resultados obterudos con un mIsmo grupo de muestras por un laboratono de referencIa Este metodo es conOCIdo como la valzdaclOn externa Se sugIere que un nurumo de 20 muestras, representatIvas de los ruveles de retmol que se esperan encontrar, sean analIzadas por ellaboratono en valIdaclOn y por ellaboratono de referencIa Los resultados deben presentarse en una grafica, colocando en el eJe­Xlos datos de laboratono de referenCIa, y en el eJe-Y aquellos dellaboratono que esta sIendo analIzado Idealmente, la pendIente de esta curva de regreslOn debena ser uno y el mtercepto

cero

2 Determinación de la precIsión

La preclslOn es la expreSlon de la reproduclblhdad del metodo La precIslOn tiene dos componentes vanaClOn "mtraensayo ", que es la vanaClOn aleatona entre replIcas en un mIsmo ensayo o comda, y la varlaClOn "mterensayo", que es aquella que ocurre entre ensayos mdependtentes A contmuaclon se presentan los enfoques para determmar estos parametros

Variación mtraensayo Se toman tres muestras control, a tres ruveles de concentraclon que abarquen el rango de trabajO del analIto de mteres ("msuficlente", "adecuado" y "alto") y se analIzan en la mIsma comda por 10 menos 10 veces La vanaClOn se reporta en termmos del coefiCIente de vanaClOn (CV) de acuerdo a la ecuaclon sIgwente

CV (%) = DeSVlaClOn estandar X 100 Medza

Vanaclon mterensayos Se toman los mIsmos tres controles y se analIzan en duphcado o con el numero de replIcas que rutmanamente se usan en ellaboratono Se deben hacer por lo menos 10 comdas en ocasIones dIferentes La vanaCIon se reporta en termtnos del coeficIente de vanaClon como en el caso antenor DebIdo a que este ensayo se efectua durante dIferentes penodos de tiempo se reqwere que los controles puedan preservarse sm alteraclOn, de manera que la concentraclon del anallto no vane durante el penodo de tiempo que cubre el ensayo

Error analítico total (EJ Este es la vanaClOn que resulta del efecto combmado de las vanaCIOnes descntas antenormente Esta se calcula con la SIgUIente ecuacIon

Por regla general, un buen metodo es aquel que posee un error anahtIco tnfenor al 5%, aunque en ocasIOnes, especIalmente cuando el metodo es muy compleJO, un error anahtIco del

64

Metodologias Analftlcas para el Control y la Evaluaclon de la FortificaclOn de Azucar con VItamIna A

10% puede ser aceptable Cada laboratono debe decIdIr el grado de exactItud y preclslOn aceptables para sus proposItos

B Rutinas del control de cahdad

Una vez que un meto do ha SIdo InIcIalmente valIdado, la confrrmaclOn rutInana, de su exactItud y preclSlon en el rango analltIco de trabaJo, es IndIspensable para garantIzar la confiabllIdad de los resultados En la practIca, se sugIere hacer vanas replIcas de cada muestra, por 10 menos duplIcados Se aceptan los resultados solo SI los valores de las muestras analIzadas no se apartan de su promedio en una magmtud mayor a dos veces la precIsIon Intraensayo del metodo En muy raras ocasIones en las que es ImpractIco analIzar por duplIcado todas las muestras, SIempre debe confrrmarse la reproducIbIlIdad del trabajO analizando replIcas de algunas muestras (10% p e), dIstnbUldas aleatonamente dentro de la comda Esta practIca debe ser excepCIonal, y debe aplIcarse solo cuando el numero de muestras es exceSIVO, la cantIdad dIspomble de cada muestra es lImitada, o cuando el ensayo es muy costoso para ellaboratono

La preclsIon y la exactitud de los resultados de las comdas dIanas se examIna Incluyendo en las mIsmas el analIsIs de controles a tres mveles del analIto ("InSUficIente", "adecuado", y "alto") La comda entera se repIte, SI los valores calculados para 2 de 3 de los controles, se apartan de la mema previamente determInada para esos controles en mas de dos veces la desvIaclon estandar SI solo se tiene dlspombIltdad de correr un control mano, este debe ser el del mvel "Insuficiente", ya que la mayona de los metodos para la determInaClOn de retInol tratan de IdentIficar muestras por debajO de un mvel cntIco Infenor

Con el proposIto de llevar un regIstro sIstematIco de la calIdad del trabaJO, se sugIere utIlIzar graficas de control de calIdad, en las que la abSCIsa (eje x) sea el numero de cada comda o la fecha de realIzacIon de la mIsma, y la ordenada (eje y) sea el valor del analIto calculado para los controles (ver figura 32) En esta grafica, lIneas paralelas al eje x IndICan la pOSICIon del valor promedIO, y los valores correspondIentes a una y dos deSVIaCIones estandar a cada lado del promedIO, calculadas con base en la vanaCIon Interensayos de cada uno de los controles

SI el metodo usa una curva de calIbraclOn con patrones, esta debe ser obtemda Idealmente para cada comda medIante el anallsls de por lo menos CInCO concentraCIOnes dIferentes del anahto, que abarquen todo el rango de trabajO del metodo El coefiCIente de correlaclon (r) de estas curvas de cahbraclOn debIera ser Igual o mayor a O 98 Las muestras que den una respuesta mas alta que el patron mas concentrado de la curva deben dIlUIrse y ser analIzadas nuevamente, mIentras que el resultado de aquellas muestras que sea Infenor a la del patron de menor concentraclon deben Informarse como que tIenen un mvel del anallto "menor que esa concentraclOn" Es IndebIdo extrapolar la curva de callbraclon afuera del rango expenmentalmente deterrnmado

65

0'1 0'1

-Q/)

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20

18

....... 16 .... o e " ~ Q)

~ 14

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---- --

O 30

Figura 3 2 GRAFICA DE CONTROL DE CALIDAD DE AZUCAR FORTIFICADA

~

.x.

~

>- Xx >< ~ X X X X .. ~ ~ X .... , "'X >< >< X >< X ~ XX .... ,

X

X ><

I - - -------~-

60 90 120 150 180 210

Olas de Anhllsis

+ 2 D S

+ 1 D S

k" Media

-1 D S ",.....

-2 D S

21,O 270

~ t l

1:>

i5" ~ :t 'S. 2 ~ ~

r ~ ... ~ ....

MetodologUlS Analitlcas para el Control y la Evaluac/On de la Fort¡ficac/On de Azucar con Vitamina A

Fmalmente, es nnportante recalcar que la aprobaclon de un meto do por el supervisor del laboratono depende de que se mantengan las caractensticas esperadas del mismo a traves del tiempo Con este proposlto, cada vez que se mtroduzcan cambIos (cantidades de reactIVOS y procedImIentos, nuevo personal, nuevo eqUIpo, pe), el metodo debe ser practicado lo suficIente hasta alcanzar valores aceptables de precIslOn y exactitud

C Cahbraclón del equipo

1 Calibración del espectrofotómetro

Espectrofotometros simples, pueden usarse SI previamente se calibran contra un espectrofotometro de referencIa Para ello, debe obtenerse pnmero el espectro de absorclon de una soluclOn de retmol en etanol o hexano Los espectros de ambos aparatos deben comclwr Luego, debe obtenerse la absorbancla a la longitud de onda del piCO de maxlma absorclOn, utIhzandose la mIsma soluclon de retmol en los dos aparatos El factor de correcClOn (F e ) del espectrofotometro en callbraclOn sera

Fe esp = AbsorbanClareferencl/AbsorbanClacallbracl6n

El rango hneal del espectrofotometro tamblen debe exammarse, utlhzandose para ello solucIOnes de retmol en etanol con concentracIOnes entre O 1 Y 5 O ).1g/mL (las absorbanclas debenan estar entre O 020 Y 1 000), que pueden obtenerse haciendo dIlUCIOnes apropiadas de una soluclOn de retmol-50 ).1g/mL en etanol (p e O 2 100, O 5 100, 1 100, 2 100, 5 100 Y 10 100) Se recomIenda hacer las lecturas utihzando celdas de cuarzo estandar (3 mL)

2 VerificaCión de la efiCienCia de la cámara de Irradiación

La efiCIenCia de la camara de trradlaclOn debe ser venficada penodlcamente SI se usa diana o muy frecuentemente, se sugiere que esta venficaclOn se haga por lo menos cada mes, y siempre que se mstalen nuevas lamparas de luz ultraVIOleta

Una soluclOn patron de palnutato de retmol o de retmol se prepara en el solvente que se emplea para la extraCClOn y/o dIluclOn de las muestras, con una concentraclOn de 5 J.lg/mL de retmol La absorbancIa de esta soluclOn debe ser aprOXImadamente de O 9 a 325 nm Debe preparese solamente la cantIdad necesana para el ensayo y protegerse de la luz dIrecta en todo momento

67

Manual para la Fortificaclon de Azucar - Parte 3

La umdad de uradlaclOn se cahbra deternunando el hempo requendo para la destrucclOn del retmol de la soluclOn patron Dos procesos son necesanos El pnmero sIrve para establecer que todas las pOSICIones de los tubos recIben la mIsma mtensldad de IrradIaclOn, y el segundo para deternunar el hempo optlmo de IrradlaclOn

El pnmer procedImIento se lleva a cabo llenando cada po SIC Ion de la gradIlla de la camara con tubos de solucIOn patron de retmol Despues de un tiempo fiJO de uradlaclón (15 - 25 mIn , pe) se detenmna la absorbancla de cada una de las solucIones IrradIadas SI hubIera pOSICIOnes en las cuales el retlnol es destruIdo en menor grado, estas deben ser marcadas y descartadas, estas pOSICIOnes estan usualmente a los extremos de la gradIlla

La determmaclOn del tIempo optlmo de IrradlaClOn se hace utlhzando la mIsma soluclOn patron, mIdIendo por tnphcado la absorbancIa que queda despues de dIferentes penodos de IrradIaclon, por ejemplo 0,5, 10, 15,20,25,30,35,40,45,50 Y 60 mmutos

El procedImIento es el SIgUIente

a Precahente la lámpara de IrradlacIon por lo menos 30 mmutos antes de su uso

b fQ.rum en cada tubo 1 mL de la soluclOn patron, e IdentIfiQue tres tubos por cada penodo de tIempo, en secuenCIa de acuerdo a los tIempos programados de IrradIaClOn CUIdese de que la marca de IdentIficaclOn quede a una altura donde no obstruya el paso de la luz ultravIoleta

c ~ los tubos con tapon de teflon o, en su defecto, de goma de buena calIdad (tIpo tapon de "vacutamer", pe) Señale con un laplz marcador el mvel del memsco del hqwdo en cada tubo ColOQue los tubos en la gradIlla

d ColOQue los 3 tubos correspondIentes al control no IrradIado (tIempo O) en la oscundad hasta el momento de su lectura

e Al fmal de cada penodo de tIempo, retire los tubos correspondIentes a ese punto y colÓguelos en la obscundad Junto a los controles

f Contmue la madIaclOn hasta completar la totalIdad del ensayo

g Revise el mvel del memsco en cada tubo y SI este ha bajado por evaporaCIon (ver paso c), añada solvente al mvel marcado y mezcle el

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Metodolog/OS Analillcas para el Control y la EvaluacIón de la FortificacIón de Azucar con Vllamma A

conterudo Con tubos tapados en la forma como se indICO, no debena haber evaporaclOn

h AJuste el cero del Instrumento con el solvente que haya usado para preparar los patrones MIda la absorbancla a 325 nm de todas las solucIOnes IrradIadas y de los controles no IrradIados, utIlIzando las mIsmas celdas espectrofotometncas y condIcIones en que se leen los extractos de las muestras

I Trace una grafica con los tIempos de madIaclOn (x) versus los promedIOS de la absorbancIa de cada punto (y) (ver Flg 33)

Se sugIere que el tIempo optlmo de madlaclOn sea aquel al cual 95-97% de retInol es destruIdo 32 Una vez determinado, dIcho tIempo debe ser el usado para la madlaclOn de los extractos de las muestras en los metodos que aplIcan este sIstema de IrradlaclOn Los resultados deben corregIrse por el "factor de eficIencIa" o sea el porcentaje de destrucclOn en el tIempo que se haya fijado Por ejemplo, del retInol SI se establece que en 35 minutos se destruye el 95% y ese tIempo se aplIca a los extractos, los resultados deben multIplIcarse por 1 053 (100/95)

32 La UTadIacIón no deberla prolongarse más allá de este punto por tres motIvos Pnmero, que sIendo la curva de destruCCIón de tendencIa logarítmICa, la destruCCIón de las ultImas trazas de retmol tomaria un tIempo demasIado largo, dIfícIl de definIr y controlar exactamente Segundo, que los extractos de muestras pueden contener SUStanCIas que no son retmol, que absorben a 325 nm y que se destruyen durante IrradIacIón muy prolongada afectando la especIficIdad y exactItud del análISIS Tercero, que nuevos compuestos mterferentes que absorben a 325 nm pueden formarse durante un tIempo de UTadlaclón muy prolongado, afectando Igualmente la caltdad del análISIS

69

105

90

15 -

~ 60

4')

30

1 .)

o

o

Figure 3 3 ABSORBENCIA DEL RETINOL POR TIEMPO DE IRRADIACION

Absorbancia el)

- ----- -------------------.--------f

-- -------------------------~

5 lO 15 20 2S 30 35 40 45 50 55 60

Tiempo (Minuto<l)

~ [ ~

9 S' ~ ::t ~ ~ g. ~

i 2 .. . ~ .. lit ...

xv. LECTURAS SUGERIDAS

--------------~~~~~ - -~-

Arroyave G , ChIchester C o , Flores H , Glover J , MeJla L , Olson J A , Sunpson K L , Y Underwood B A 1982 Bzochemlcal methodology lor the assessment 01 vltamm A status WashIngton, D C Grupo ConsultIvo InternacIonal de VItamIna A (IVACG) 88 p

Carey N y Garber C 1989 EvaluatIon of Methods En Kaplan L y Pesce A (Eds) Clzmcal chemlstry Theory, correlatzon and analysls 2a ed SaInt LOUlS, Mosby Company Capitulo 19, pp 290-310

Conacher H 1990 VahdatlOn of methods used m cnSIS Sltuanons task force report J Assoc Off Anal Chem 73(2) 332-334

Cornbleet J y Gochman N 1979 Incorrect least squares regresslOn coefficlents m method­companson anaIySlS Clm Chem 25 (3) 432-438

Assoclanon of OffiClal Analyncal Chemlsts 1988 GUldelmes for collaboranve study procedure to valldate charactensncs ofa method ofanalysls J Assoc Off Anal Chem 71(1) 161-173

RUlg W , Stephany R y DIJkstra J 1989 Cntena for the detecnon of analytes In test samples J Assoc Off Anal Chem 72(3) 487-490

71

Anexo 3.1 CONSTRUCCION DE UNA CAMARA DE IRRADIACION

ULTRAVIOLETA33

La urudad de rrradlacIOn (anexo figura 3 la) consIste en el montaje, en una estructura de madera, de dos lamparas de "luz negra" (emlslon de 350-390 nm) 34

Sus componentes son esenCIalmente una base de 70 x 21 cm sobre la cual se montan longltudmalmente y en forma eqUIdIstante dos paredes laterales de 70 x 14 cm (punto B, anexo figura 3 la) entre SI por 7 cm Estas paredes laterales tIenen en su parte central mfenor una ventana 10ngItudmal de 60 x 4 2 cm que permIte el paso de la luz emItIda por las lamparas haCIa los tubos de ensayo que contIenen las solUCIOnes de retmol (punto C, anexo figura 3 la) Cada una de estas paredes laterales tIene ademas en su lado mterno y en sus extremos, neles vertIcales para poder mOVIlIzar dentro de esta estructura baslca una espeCIe de gradIlla (punto D, anexo figura 3 la), tamblen de madera, espeCIalmente dIseñada para colocar los tubos de ensayo Esta gradIlla consta de dos pIezas de 70 x 4 9 cm En la pIeza supenor se perforan dos filas de agUjeros de dlametro un poco mayor de 1 cm, separados entre centro y centro por 2 cm Los agujeros de una fila son alternos a los de la otra fila En la pIeza mfenor se hacen solamente pequeñas depreSIOnes, correspondIentes a cada uno de los agUjeros de la parte supenor, para poder en ellos asentar la base de los tubos Estas dos pIezas estan urudas entre SI, en sus cuatro extremos, por 4 pIvotes que SIrven ademas de ensamble en los neles vertIcales de la estructura baslca ASI, la gradIlla puede colocarse o sacarse de la estructura facIlmente El dlametro de los agUjeros de la gradIlla puede vanarse SI se usan tubos de tamaño dIferente que el modelo descnto mas adelante

Las lamparas de luz UV se mstalan a cada uno de los lados de la estructura baslca por medIO de los soportes y demas accesonos electncos necesanos para su funCIOnamIento (punto E, anexo figura 3 la), estos son sus respectIvos transformadores y sus mIcladores ("starters") Ambas lamparas son operadas sImultaneamente por un mterruptor colocado afuera de la umdad (punto F, anexo figura 3 la) Todo el SIstema se cubre con una tapadera (punto A, anexo figura 3 la) tambIen de madera a la cual se le hace una pequeña abertura en un extremo para la salIda del cordon de coneXIOn electnca

La estructura de la umdad se detalla en el plano de construCClon de la anexo figura 3 1 b

33 Aparato dlsefiado por L MeJia y G Arroyave en el INCAP 34 La lámpara General Electnc F 20 T 12/BLB de 20 vatios ha probado ser apropiada

73 (J' \

Anexo Figura 3 1a CAMARA DE IRRADIACION

CAMARA CERRADA

cm

8 CAMARA ABIERTA

A • CUBIERTA DE MADERA B • GRADILLA PARA TUBOS C • PAREDES LATERALES D • VENTANA LONGITUDINAL E • MONTURA DE LA LAMPARA ULTRAVIOLETA F ., INTERRUPTOR

74

VISTA LATERAL (ln~en.or de la c:uara)

Anexo Figura 3.1 b

CAMARA DE IRRADIACION (Plano de construcción)

R1e~es vert1eales \

VISTA LATERAL ~!E=:;;===~:r;o~c; ... :;;;~;;~~?~~::;~ GRADIlLA ; •• . .... ~ ... - ...... -.. -................ .

VISTA LATERAL ,4 I ' 1

4 ~ '"0 U., ,4 1 3,1, (Pared lateral)

-t.I 1I f~ o+~ de aluIIm.o para sostm de l....-a

VISTA LATERAL S, c,",

(Montura de

~ ~ 1;,· lampara U V)

Altura de colcxaoc:n

VISTA SUPERIOR ?Dc,", (Ca.ara de f ... ,¡,rrad.acl.on)

11.1

~r-Paredes I

laterales Base TnIlSfQ( lIII!Idcres ~UV

75

Anexo 3.2 SUGERENCIAS PARA EL CUIDADO Y LAVADO DE LA

CRISTALERIA y DE LAS CELDAS DE ESPECTROFOTOMETROS

La hmpIeza de la cnstalena y de las celdas espectrofotometncas es un factor cntIco para la confiabIhdad de los anahsIs Las celdas espectrofotometncas deben ser cUIdadosamente lavadas y manejadas para eVitar rayarlas y mancharlas Los SigUIentes procedImIentos deben segUIrse para asegurar que tanto la cnstalena como las celdas no afecten los resultados

Cristalería

A RecOJa los reSIduos de muestras y reactIvos desechables en reCIpIentes apropIados para luego tratarlos en conjunto SI son solventes orgarucos deben mcmerarse o en casos especIficos recobrarse por destdaclOn SI son SUStanCIas solubles en agua e mocuas, vIertalas en el desague seguIdas de abundante agua Los desechos blOlogICOS, preVIO a su descarte, deben descontanunarse ya sea por dduclOn y remoJo en una SolUCIon de mpoc1onto de SOdIO durante 24 horas o por tratamIento en autoclave a 121°e por 30 mInutos

B SumeDa la la cnstalena en agua dentro de un recipiente de plastIco Lave cada pIeza de cnstalena grande con cepIllo y solUClOn al 2-3% de un detergente qUlmlco alcalmo (Extran o Teepol, pe) La cnstalena pequeña y aquella de calIbre angosto, tal como VIales o pIpetas, hIervala durante 15 mInutos en una soluclOn al 5% de detergente alcalmo

e En1Ua~ue con agua del chorro

D RemOJe en soluclOn de aCIdo rotnco al 10% durante la noche Matenal manchado puede ser tratado con una soluclOn al 50% de aCIdo rotnco

E Emuague 20 veces con agua del chorro y 10 veces con agua destIlada

F Seque en horno a 60 oC

G Almacene protegIendo de expOSlClOn al polvo o cualqUIer otro contammante

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11 Celdas de espectrofotometro

A Al finalIzar su uso, enJuaguelas en el solvente en el que estaban dIsueltas las muestras Luego. emuaguelas en una mezcla 1 2 1 de agua/etanol-95%IHCI concentrado

B SI las celdas se usan frecuentemente, guardelas en la mezcla antenormente mencIOnada

e SI las celdas no son usadas frecuentemente saquelas de la soluclOn antenor, desaguelas 5 veces con acetona, y seguelas soplando su mtenor con alfe filtrado a traves de algodon Nunca seque las celdas con calor dentro de un horno Guarde las celdas en un estuche cerrado

D inmediatamente antes de usar las celdas, remoJe su mtenor con el solvente en el que estan dIsueltas las muestras por analIzar y succIOne el reSIduo con vaclo

Como una practIca rutmana, especIficamente para detectar algun problema de las celdas (SUCIas, manchadas, rayadas), se aconseja venficar que la lectura de absorbancIa de las celdas en la pOSICIon de la muestra en contra de aquella en la pOSIClOn de referencIa, cuando llenas con la mIsma solucIOn, es esencIalmente la mIsma Algunas veces podnan encontrarse pequeñas dIferencias constantes entre celda y celda En este caso, estos valores basales deben utilIzarse como factores de correclOn de las lecturas de absorbancIa de las muestras

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Anexo 3.3

PROVEEDORES, EQUIPOS, Y MATERIALES DE LABORA TORIO

Proveedores

A ALDRICH

PO Box 355

MI1waukee, WI 53201-9358

USA

Tel (414) 273-3850

Fax (414) 273-4979

B BASF

6700 LudWlgfhafen-Rhem, LudWlngfhafen

Germany

Tel (049) 621-600

Fax (049) 622-525

C Beckman InstruInents Inc

2500 Harbor Boulevard

Fullerton, CA 92634

USA

Tel (714) 521-3700

Fax (714) (213) 691-0841

D Flsher SClenttfic

Headquarters

Plttsburgh 711 F orbes A venue Plttsburgh, P A 15219-4785 USA

Tel (412) 562-8300

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IntematlOnal Headquarters, Latm Amenca, MeXIco and Canbean

50 Fadem Road

Spnngfield, NJ 07081-3193

USA

Tel (201) 467-6400

Fax (201) 379-7415

Europe-Mld East/Afnca New Enterpnse House St Helen's Street

Derby, DE 1 3GY

Uruted Kmdgom

Te! (44) 332-200755

Fax (44) 332-296546

Asta and Pactfic

No 1 10 1 Thomson Road

16-05 Uruted Square

Smgapore 1130

Tel (65) 250-9766

Fax (65) 253-2286

E Hoffman-La Roche

CH-4002, Base!

SW1tzerland

Tel (061) 688-1111

Fax (061) 691-9600

F JT Baker

222 Red School Lane

Phtlhpsburg, NJ 08865

USA

Tel (908) 859-2151

Fax (908) 857-4318

80

G MIlhpore Intertech

PO Box 10

Marlborough, MA 01752

USA Tel (508) 624-8400

Fax (508) 624-8630

H Natlonal Instltute of Standards and Technology (NIST)

Bldg 202, Room 204

Gmtherburg, MD 20899

USA

Tel (301) 975-6776

Fax (301) 948-3730

1 Perlan Elmer Corporatlon

761 Mmn Ave, NorwaIk, CT 06859-0012

USA

Tel (203) 762-1000

Fax (203) 762-6000

Bodenseewerk Perlan-Elmer GmbH

Postfach 10 11 64, D-7770 Uberlmgen

Germany

Tel (075) 51-81-0

Fax (075) 51-1612

Perkm-Elmer Ltd

Post Office Lane, Beaconsfield, Bucks HP9 1 QA

England

Tel (0494) 676161

Fax (0494) 679333

J Sarstedt PO Box468 Newton, NC 28658-0468 USA

Tel (704) 465-4000

Fax (704) 465-4003

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K SIgma CheIDlcal Company PO Box 14508 St LOUlS, MO 63178-9916

USA Te! (314) 771-5750

Fax (314) 771-5757

L VARIAN Vanan AssocIates

Parts and supphes center

220 Humboldt Court

Sunnyvale, CA 94089

USA

Tel (408) 734-5370

Fax (408) 744-0261

11 Equipos (Ejemplos)

A Espectrofotometro UV NIS, V ARIAN DMS-l OOS o Perkm Elmer Lamda 3B

B Cromatografo LIqUIdo (HPLC), Vanan Chromatography 5500 con detector UV Este mcluye un Autosampler VIsta 9090, mterfase Vanan 11M-A, computadora DS-650, e nnpresora HP Thmlqet

C Columna para HPLC MIcropak Colurnn Sp-18-5 of 150 x 4 (DI) mm (Vanan 03-91204242)

D Tubos de ensayo 10 x 75 mm KImble KG-33

E Celdas enmascaradas para espectrofotometro Beckman, Product 533043

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111 Reactivos (Ejemplos de proveedores con número de catálogo)

A Determmaclon espectrofotometrlca de retmol en premezcla 2-propanol (p a) Merck Art 9634

B Determmaczon espectrofotometrlca de retmol en azucar fortificada Etanol absoluto (p a) Merck Art 983 25

Hexano (p a) Sigma Art H-9379

HldroX1do de sodio Sigma S-0899

C Determmaczon colorzmetrlca de retmol en azucar fortificada ACIdo tncloroacetlco Merck No 1839 DIchlorometano Merck No 1593 Sulfato de cobre FIsher SCIentIfic Company Art No 493

D PeróxIdos m aceIte ACIdo acetlco glacIal Sigma Art A-0808

Cloroformo, USP Aldnch 31,998-8

AlrnIdon (p a) Merck Art 1252

TlOsulfato de sodio (p a) Merck Art 6516 Yoduro de pOtasIO Merck Art 5043 KI ACIdo c1orhIdnco concentrado SIgma Art H-7020 Dlcromato de pOtasIO SIgma Art P-6435

E Determmaczon espectrofotometrlca de retmol en sangre y leche por dlstrucczon ultravIOleta Etanol absoluto (p a) Merck Art 983 25 HtdroxIdo de pOtasIO Aldnch Art 30,656-8 Keroseno desodonzado J T Baker Art P339-00 Xtleno (p a) J T Baker Art 9490-03

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F DetermmaclOn de retmol en sangre y leche por HP Le

Etanol absoluto (p a) Merck Art 983 25

2-propanol (p a ) Merck Art 9634

Hexano (grado HPLC) J T Baker Art 9303-3

Metanol (grado HPLC) J T Baker Art 9093

Dlcloruro de etlleno (grado HPLC) Slgma-Aldnch Art 27,056-3, o dlcloruro de metdeno (grado HPLC) Slgma-Aldnch Art 27,057-1

Acetate de retmol SIgma Art R-3513

BHT SlgmaArt B-1378

Reunol SIgma Art R-7632

G Cámara de lrradlaclOn Lamparas de lrradlaclOn General Electnc F20 T 12 BLB

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