Laura V. Ceballos Naranjo

María Antonia Correa Saavedra

Tercer semestre

CANDIDA ALBICANS

Family: Debaryomycetaceae Genus: Candida Species: albicans

Dimorphic fungus that grows both as yeast and filamentous cells and one of the few species of the Candida that cause the infection candidiasis in humans C. albicans is a common member of human gut flora and is detectable in the gastrointestinal tract in 40% of healthy adults

INTRODUCTION CANDIDA ALBICANS It is usually a commensal organism, but can become pathogenic in immunocompetent individuals under a variety of conditions. Overgrowth of the fungus results (candidosis) Candidiasis is often observed in immunocompromised individuals, including HIV-infected patients

INTRODUCTION Heat Shock proteins

Heat shock proteins (HSPs) are proteins found in plant and animal cells

They originally were described in relation to heat shock but are now known to be induced by a wide variety of stresses, including exposure to cold, UV light, wound healing, tissue remodeling or biotic stresses

HSPs are essential components contributing to cellular homeostasis under optimal and detrimental growth conditions in prokaryotic and eukaryotic cells

INTRODUCTION Heat Shock proteins They are responsible for protein folding, assembly, translocation, and degradation during ordinary cellular growth and development HSPs also function in the stabilization of proteins and assist protein refolding under stress conditions Many chaperones, but by no means all, are heat shock proteins because the tendency to aggregate increases as proteins are denatured by stress Heat-shock proteins are named according to their molecular weight. For example, Hsp60, Hsp70 and Hsp90 (kDa)

INTRODUCTION

HSP90 ATP-dependent molecular chaperone which is essential in eukaryotes Hsp 90 assists other proteins to fold properly, stabilizes proteins against heat stress, and aids in protein degradation

It affects numerous physiological processes such as signal transduction, intracellular transport, protein degradation and also stabilizes a number of proteins required for tumor growth, whence it became an interesting target for cancer therapy

Hsp90 and C. albicans

The chaperone Hsp90 orchestrates

regulatory circuitry governing fungal

morphogenesis, drug resistance, and

virulence

Sgt1 physically interacts with Hsp90, and that it governs C.

albicans morphogenesis and

drug resistance

Genetic depletion of Sgt1 phenocopies

depletion of Hsp90, inducing yeast to

filament morphogenesis and

invasive growth.

global regulator of morphogenesis and

drug resistance, providing a new

target for treatment of life-threatening fungal infections

Objective The purposes of this study were to assess the expression

of Hsp90 gene in clinical and control isolates of C.

albicans obtained from different geographical regions

(Malaysia and Iran), different temperatures (25ºC, 37ºC

and 42ºC) and mice with candidiasis.

Métodos

Aislamientos fúngicos Objetivo: Evaluar la expresión del gen Hsp90 en

pacientes de Irán y Malasia que padecen candidiasis

sistémica Vs. pacientes sanos.

El estudio grupo estaba formado por 32 pacientes (16

varones y 16 mujeres) y 16 individuos de control

emparejados por sexo y edad (16 varones y 16

mujeres).

Media de edad: 35.9 años (pacientes entre 18 y 60

años).

Aislamientos fúngicos Los aislados clínicos se obtuvieron de la sangre de

pacientes inmunocomprometidos con candidiasis

sistémica, que representan los factores de riesgo tales

como:

cáncer, diabetes mellitus, antibióticos y tratamientos con

esteroides.

Los aislamientos de control fueron tomados de la piel

de las personas que eran inmunocompetentes.

El protocolo de estudio fue aprobado por los comités de ética de

University of Malaya Medical Center (UMMC), Malasia y la Universidad

de Tehran University of Medical Sciences, Irán. Un consentimiento

informado, se obtuvo de todos los sujetos antes de entrar en el

estudio.

Aislamientos fúngicos

1 • Cultivo de células de levadura en SDA a 37ºC durante 24 horas

• Cultivo de células de levadura en SDA a 37ºC durante 24 horas

2

• Identificación de levaduras basada en:

Prueba de germen de tubo, CRHOM agar, test de B-glucosidasa, test de ureasa, cornmeal Tween-80 para la producción de clamidosporas, fermetación de azúcares y pruebas de asimilación utilizando Rap ID Rap ID Yeast Plus System.

3

• Las células de Candida se cultivaron en SDA durante la noche a 25 ° C, y después se transfirieron a sabouraud dextrose broth (SDB) en dos tubos diferentes en un baño de agua con agitación a 110 oscilaciones por minuto a 25 ° C y 42 ° C por 45 min.

Después de la incubación, las células de Cándida fueron cosechadas por

centrifugación a 3000 × g para el paso subsiguiente.

Evaluación de la expresión

del gen Hsp90 en ratones Obejetivo: Investigar y comprender la expresión del

gen Hsp90 haciendo un comparativo entre humanos y ratones; estos últimos proporcioando un modelo in vivo.

48 ratones hembra BALB / C de 6 semanas de edad (25-30 g) se compraron en el Razi Institute, Karaj, Irán.

8 aislados clínicos y 8 cepas de control de C. albicans (4 cepas de Malasia y 4 de Irán c/u) fueron seleccionados en este estudio

Se consideraron tres ratones para cada aislamiento.

Evaluación de la expresión

del gen Hsp90 en ratones

Las levaduras se cultivaron en SDA y se incubaron a 37ºC

durante 24 h.

Las colonias de levadura se retiraron y se lavaron

dos veces con PBS.

La suspensión de levadura se ajustó

aproximadamente a 500 × 103 células / ml usando

un hemocitómetro.

Los ratones fueron infectados por

inoculación de 0,1 ml de suspensión de C. albicans a través de

la vena caudal.

Luego de 3 días, los ratones fueron

anestesiados con cloroformo para retirarles

los riñones.

El tejido se trituró en suero fisiológico y 0,2 ml del filtrado se cultivaron en SDA a 37ºC durante

24 h.

Las células de Candida fueron

cosechadas a partir de medios de SDA.

Evaluación de la expresión del gen Hsp90

mediante

RT-PCR.

Experimentos realizados en base a la Ética de la

Investigación Veterinaria y este estudio fue aprobado sobre la

protección de la SPCA.

*PBS: Solución salina tamponada con fosfato; SCPA Sociedad de Protección

contra la Crueldad Animal.

PCR qRT Objetivo: Amplificación del RNA a través de la síntesis

previa de su cDNA (DNA copia), utilizando una

transcriptasa inversa, siguiendo varios ciclos de PCR

convecional.

Los aislados de C. albicans se utilizaron para el

aislamiento del ARN total según el protocolo del kit

seleccionado para el experimento (RNeasy Mini kit,

Qiagen, Hilden, Alemania).

PCR qRT

1

• Tres microgramos de ARN se trataron con DNasa I basándose en el protocolo Quanti Tect Reverse Transcription Qiagen Company (Hilden, Alemania)

• Se utilizaron para la síntesis de ADNc utilizando el Taq Man Reverse Transcription kit.

2

• La qRT-PCR se realizó en un volumen total de reacción de 25 l incluyendo PCR Master Mix 12,5 l power SYBR Green ®, 1 l de cebador directo (400 nM), 1 l de cebador inverso ( 400 nm), 5 l de ADN complementario (300 ng) como plantilla y 5,5 l de agua doblemente destilada en Micro Amp óptica de placas de 96 pocillos en un ABI 7300 Real-Time-PCR instrument.

3

• Las condiciones fueron las siguientes; ciclo 1 se repitió 40 veces: 95 ° C durante 10 min, 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min y el ciclo 2 que representa el nivel de disociación se llevó a cabo una vez: 95 ° C durante 15 s, 60 °C por 15s, 95°C por 15s.

PCR qRT

1

• Para mostrar las bandas de cDNA de los genes de la Hsp90 y el rRNA 18S, los productos de la PCR fueron puestos en gel de agarosa al 1.5% (w/v).

• Una escala de 1 kb de AND fue utilizada como marcador durante este procedimiento.

2

• Los datos para el gen Hsp90 se calcularon y se expresaron como una regulación en comparación con el gen rRNA 18S de referencia para cada condición de prueba, utilizando el método de la curva estándar de cuantificación.

3

• Las secuencias de los cebadores de genes de referencia se obtuvieron del estudio de Manolakaki et al. (Tabla 1)

• El ensayo de QRT-PCR se realizó de forma independiente por triplicado.

PCR qRT

Análisis estadístico Objetivo: Comparar la diferencia en los valores de la

expresión del gen Hsp90 medias de entre los grupos

analizados. Las diferencias se consideraron

significativas a P-valor <0,05.

El análisis de los datos se realizó utilizando el paquete

estadístico para Ciencias Sociales (SPSS, versión 17,

Chicago, IL, EE.UU.). Las pruebas t independiente y U

de Mann-Whitney fueron las seleccionadas.

Resultados

Resultados

Discussion Authors What they said Agree/Disagree

Swoboda et al.

Candida Hsp90 gene was heat

shock inducible and its expression

was strongly induced at higher

temperature, such as 45°C (about

nine folds), but a change in

temperature to 37°C had lower

effect on the level of Hsp90 mRNA.

Agree

O’Connor,

Essmann &

Larsen et al.

The expression of Hsp90 gene was

increased under treatment with 39°C

and 17-β-estradiol up to 50% and

75%, respectively.

Agree

Discussion

Authors What they said Agree/Disagree

Shapiro et al.

A medium induction of Hsp was

observed with changes in

temperature from 30°C to 37°C or

exposure to serum at 30°C, but a

higher stimulation was seen in

response to the combination of

serum and elevated temperature.

Agree

Carper, Duffy &

Gerner and

LaFayette et al.

Demonstrated the existence of

differences in the expression of C.

albicans Hsp90 gene between in

vitro (37°C) and in vivo (mice body)

in both systemic and non-systemic

isolates.

Agree

Discussion Authors What they said Agree/Disagree

Jenkins,

Schultz &

Matin et al.

The oxidative stress responses were

the most important factors in the

development of experimental

systemic infections.

Agree

Enjalbert et al.

Reported a reduction in virulence of

C. albicans by compromising of

Hsp90 function or expression in mice

with systemic candidiasis.

Agree

Hodgetts et al.

The over-expression of Hsp90 gene

in S. cervisiae increased the

virulence of this fungus and therefore

Hsp90 appears to be a virulence

factor of C. albicans .

Agree

Conclusions

1. Based on this study, it was possible to find out that hsp90 is not only

expressed at high temperatures but also under stress conditions that can

lead the gene expression encoding hsp90 in C. albicans.

2. Authors could confirm that hsp90 gene expression in C. albicans is

different in several geographical locations and with different temperatures.

With this finding it was possible to conclude that both, genetics and

environmental changes, play an important role in the expression of this

gene.

3. C. albicans has high adaptability even in different races, geography, pH,

nutrient availability and temperature because it can change its gene

expression in response to all these variables; although a previous study

showed that candidiasis is predominant in black populations by a 4: 1ratio. 4. This study compared the hsp90 expression in Malaysian and Iranian

patients and it found that gene expression was greater at higher

temperatures, which means hps90 gene expression in C. albicans can be

induced by heat shock.

Cmaptools

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