REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE BIOANALISIS CATEDRA: ANALISIS INSTRUMENTAL

Cromatografa lquida de Alta Resolucin HPLC

Cromatografa Es

un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla y en algunos casos identificar estos si es que no se conoce su composicin.

Cromatogrma Es

una grfica u otro tipo de presentacin de la respuesta de un detector, la concentracin de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentracin en el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo.

Trminos BsicosTiempo de Retencin

Platos tericos

Es el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce la mezcla y el instante en que se detecta la seal propia del componente en su mxima intensidad. Los tiempos de retencin no son reproducibles, ni siquiera en una misma columna cromatogrfica.

Se utiliza como una medida de la eficiencia de la columna, este directamente relacionado con la varianza, por ello resulta convenientemente medir la eficiencia de la columna en los trminos de varianza y longitud de la columna.

Trminos BsicosResolucin

Selectividad

Es el parmetro que expresa el grado de separacin que se puede obtener en un sistema cromatogrfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatogrfico para dos componentes.

Muestra las diferencia de afinidad por los solutos de las fases involucradas, indica el potencial de separacin de esos solutos en el sistema, pero no mide la separacin real.

Trminos BsicosEficiencia

Elucin

Es el procedimiento en el que la fase mvil se pasa de forma continua a travs o a lo largo del lecho cromatogrfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequea cantidad en un tiempo breve.

Trminos BsicosFase Estacionaria

Es la que recubre la columna cromatogrfica, interiormente sin desplazarse. La fase estacionaria consiste en partculas, generalmente slidas, pequeas y con una superficie micro porosa, de forma que presenta un amplio desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa.

Fase mvil

Puede ser un lquido o un gas que recorre la columna cromatogrfica transportando los componentes de la mezcla a travs de dicho sistema.

ELUYENTE

Es aquella sustancia que se pone en contacto con la fase estacionaria y permite que se desplace la muestra.

Fundamento de la cromatografaExisten dos tipos de fundamento:

Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades fsicas o fsico qumicas de los analitos: solubilidad, adsorcin (tendencia a ser retenidos en slidos finamente divididos), volatilidad, tamao, carga, reactividad qumica o bioqumica,

Fundamento prximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades fsicas o fsico - qumicas frente a un sistema cromatogrfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeas, se basa la separacin cromatogrfica.

Cromatograma

Componentes de un instrumentos de cromatografa HPLC

Bomba: Enva al solvente a travs de caos de dimetro pequeo, generalmente de acero inoxidable.

Tipos de Bombas: Bombas reciprocas Bombas de desplazamiento Bombas neumticas

Componentes de un instrumentos de cromatografa HPLC

Vlvula Inyectora: Consiste en una vlvula de seis vas que permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Se producen pequeas cantidades de muestra (0.1-100L) Columnas: Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de dimetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. Estas ultimas solo se utilizan a presiones menores de unos 600 psi. Existen diversos tipos: columnas analticas, precolumnas, columnas termostatizadas.

Componentes de un instrumentos de cromatografa HPLCDetector

Registrador integrador

Produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de materia y esa seal es enviada al registrador. Deben de tener un volumen interno pequeo para reducir el ensanchamiento de pico. Basados en una propiedad de la fase mvil (refraccin, densidad etc.) y en una propiedad del soluto (absorbancia en UV, fluorescencia etc.)

Realiza un grfico de intensidad en funcin del tiempo (cromatograma) que idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. Este que El integrador calcula adems el rea correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia

Componentes de un instrumentos de cromatografa HPLC

Cuadro comparativo de Detectores

Cromatografa de fase normal y de fase inversa

Fase normal: se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta el tiempo de retencin.

La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de inters, sino tambin en factores estricos de forma que los ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin. Cayo en desuso debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el estado de hidratacin de la silica o almina de la cromatografa.

Cromatografa de fase normal y de fase inversaFase inversa: consiste en una fase inmvil apolar y una fase mvil de polaridad moderada. El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicos. La cromatografa de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificacin adicional. La cromatografa de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unin del compuesto a la fase estacionaria es la disminucin del rea del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofbico est dominado por la disminucin de la energa libre de la entropa asociada con la minimizacin de la interfase compuesto-disolvente polar. Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales.

Separacin isocrtica y separacin con gradiente

Parmetros que afectan la resolucin de la columna Dimetro

de la partcula: La mayora de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partculas esfricas de silica. Estas partculas pueden tener diferentes medidas, siento las de 5\mum de dimetro las ms utilizadas. Partculas ms pequeas ofrecen una mayor superficie y una mejor separacin, pero la presin que se requiere por obtener una velocidad lineal ptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del dimetro de la partcula. Esto significa que disminuir la medida de las partculas a la mitad, aumentara la resolucin de la columna, pero a la vez, aumentara la presin necesaria en un factor de ocho.

Parmetros que afectan la resolucin de la columna

Longitud de la columna: El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y tambin influye en su sensibilidad. La resolucin aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos disfuncionales, disminuyendo por tanto la resolucin.

Parmetros que afectan la resolucin de la columna

Dimetro de la columna: El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y tambin influye en su sensibilidad. Las columnas de dimetro interno ms grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificacin de compuestos para su utilizacin posterior. En cambio, las columnas de dimetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el anlisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimizacin del consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango analtico y normalmente estn asociadas a un

Caractersticas del solvente (fase mvil). Es un solvente lquido, el cual puede ser

puro o una mezcla de solventes. El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicos. El lquido, se obliga a pasar a travs del slido bajo presin o bien se deja percolar a travs de l, por efecto de la gravedad.

Anlisis cualitativos y cuantitativos en HPLC

Aplicacin de la HPLC en anlisis Diversos

Compuestos inicos, como aminocidos, sales inorgnicas, cidos orgnicos, etc. Compuestos de alto peso molecular, como polmeros, hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc. Compuestos termolbiles y no voltiles, como vitaminas, pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y un producto muy grande de otros productos farmacuticos. Anlisis de compuestos vitamnicos es posible en corto tiempo. Determinaciones de constituyentes de cidos nucleicos (nucletidos, nuclesidos) por cromatografa de intercambio inico. Determinacin de esteroides. El anlisis de medicamentos (determinacin de los componentes activos de una tableta analgsica, anlisis de barbitricos, anticonceptivos, etc).

Aplicacin de la HPLC en anlisis DiversosEn separaciones segn el tipo qumico, ya que su finalidad no es la separacin de compuestos individuales, sino de grupos diferentes de sustancias presentes en las mezcla. La identificacin y cuantificacin aproximada de azcares (separacin de ismeros de las aldohexosas que son difciles de separar con otras tcnicas cromatogrficas) aunque est restringido a laboratorios que puedan hacer frente a los altos costes que esta tcnica tiene. Los edulcorantes a granel al igual que los azcares se determinan por HPLC (en refrescos y alimentos), como el aspartamo o la sacarina. Tambin se emplea para la determinacin de vitaminas, como es el caso de la vit. B2 (riboflavina), vit. E, vit. D, vit. A y carotenoides. Y para el anlisis de residuos de pesticidas en frutas y verduras, adems de la observacin de cidos