Vectores lentivirales

Lic. Saumel Pérez Rodríguez

Centro de Inmunología Molecular

Septiembre 2010

Virus como parásitos intracelulares obligados han desarrollado en su evolución mecanismos muy eficientes para la entrada de su material

genético (DNA/RNA) a una célula blanco

Virus recombinantes

Adenovirus Retrovirus

Lentivirus

Ventajas de los vectores lentivirales

Capacidad de infectar una amplia variedad de tipos celulares, en proliferación o no, altamente diferenciadas o no.

Integración al genoma

Expresión estable y a largo plazo

Muy baja frecuencia de inducción de mutagénesis insercional

No exacerban tumorigénesis in vitro y no existen observaciones de oncogénesis en animales tratados con vectores lentivirales in vivo o por lentitransgénesis

Ventajas de los vectores lentivirales

Physiol Genomics 31: 159–173, 2007.

Eficiencia de lentitransgénesis

Science. 2002 Feb 1;295(5556):868-72. 80% efficiency

Cows

70% efficiencyEMBO Rep. 2003 Nov;4(11):1054-60

Pigs

EMBO Rep. 2004 Jul ;5 (7):728-33 . Genesis. 2004 Jun;39(2):94-9.

Chickens

4 to 45 % germ line transmission46 % efficiency

Rats

Biol Reprod. 2004 Aug;71(2):405-9100% efficiency

Monkeys

Nature. 2008 Jun 12;453(7197):921-4 100 % efficiency

Mice

Estructura partícula viral

Arch. Immunol. Ther. Exp. 2010

Ciclo de vida viral

1. Unión cubierta viral al receptor celular

2. Fusión membranas

3. Pérdida cubierta viral y liberación del núcleo viral al citoplasma

4. Síntesis DNA viral y transporte activo del núcleo viral al núcleo de la célula

5. Integración al genoma celular del DNA viral

6. Expresión genes virales, empaquetamiento RNA viral full lenght y ensamblaje partícula viral

7. Maduración viriones

Arch. Immunol. Ther. Exp. 2010

Genoma viral

Deleción 80% genoma viralSolo se mantienen los genes que codifican para las proteínas

estructurales y reguladoras y elementos cis imprescindibles para la generación de los viriones recombinantes

GenesGag: proteínas estructurales

Pol: enzimas con ssRNA

Env: proteínas cubierta viral

Elementos cis

1. LTR: elementos flanqueantes con varias funciones. - 3´LTR actúa como terminador de la transcripción y señal de polyA.- Permiten la integración al genoma.- Deleción en el 3´LTR impide que el 5´LTR actúe como promotor de la

RNA pol II para evitar silenciamiento génico por metilación.2. RRE: secuencia que interactúa con Rev facilitando la exportación nuclear

del RNA viral full lenght.3. WPRE: aumenta la estabilidad del transcripto y por tanto la expresión del

gen de interés.3. cPPT: es necesario para el importe nuclear del complejo de

preintegración.4. Ψ: señal para el empaquetamiento del RNA viral específico en los

viriones formados.

Physiol Genomics 31: 159–173, 2007. Curr Gene Ther. 8(6): 483–488, 2008;.

pLWenhproC D69890 bp

potenciador mCD4

wpre

hCD6

5´ LTR

3´ LTR

pptrAmp

RRE

pbla

promotor hCD4

ori

SmaI (2339)

XmaI (2337)

EcoRV (3556)

NcoI (2344)

NcoI (4739)

NcoI (6919)

BamHI (2109)

BamHI (3560)

BamHI (4155)BamHI (5740)

BamHI (6335)

Producción de los vectores virales

CaPO4 method PEI method

87-95% of green cells

Promotores usados en vectores lentivirales

1. Promotores ubicuos:- Human ubiquitin C (UbC)- Fosfoglicerolquinasa (PKG)

>69% ratón, rata, cerdo, ganado F0, >92% ratón F1

Science 295: 868–872, 2002; Genesis 39: 94–99, 2004; Genesis 45: 177–183, 2007; Transgenic Res 16:661–664, 2007.

- CMV- Chicken β actina con un enhancer de CMV (CAG)- Factor de elongación 1-α

>94% cerdo y 100 % F0 ratón, >50% F1 ratón

Blood 103: 580–582, 2004; FEBS Lett 571: 233–236, 2004; Physiol Genomics 31: 159–173, 2007

2. Promotores tejido específico:

-K14 específico de keratinocitos basales en cerdos (13% F0)-miogenina-lck de linfocitos T

Science 295: 868–872, 2002 ;EMBO Rep 4: 1054–1060, 2003.

-Sinapsina 1-Pigmento rojo (RG)-Rodopsina (Rho)-K12 específico del epitelio de la córnea

Mol Ther 8: 666–673, 2003; J Neurosci Methods 152: 1–9, 2006.

RNA interferencia

1. Utilización de promotores de la RNA pol III: H1 y U6.

-Ubicuos

-Expresión eficiente de shRNA

-Promotor U6 más fuerte que H1

2. Eficiencia 13-23% en ratones fundadores

3. Posible letalidad embrionaria debido al knockdown de un gen esencial

Curr Gene Ther. 8(6): 483–488, 2008

Utilización vectores lentivirales en transgénesis

1. Microinyección en el espacio perivitelino

2. Remoción de zona pelúcida

3. Transferencia nuclear usando células somáticas o embrionarias modificadas

4. Modificación de espermatozoides

5. Modificación de spermatogonial stem cells (SSC)

30-50% eficiencia transducción en SSC murinas con establecimiento de colonias espermatogénicas en 100% ratones

50% progenie transgénica en ratas

Desventajas

1. Nivel de seguridad BSL2

2. Límites de tamaño del vector viral

- Backbone vector viral 2.2 kb, promotor-gen <10 kb

1. Mosaicismo genético

- Proceso de integración dura aproximadamente 48 h o más

- T1/2 largo de los viriones en el espacio perivitelino

- Persistencia del complejo de preintegración en el citoplasma

4. Modificaciones epigenéticas:

Presencia de KRAB en sistema tet inducible provoca silenciamiento

total si no hay doxycyclina en los primeros días de desarrollo del

embrión.

Metilación promotores y genes en islas CpG internas (PKG)

Metilación del promotor por efecto de posición

5. Toxicidad vector

-VSVG tiene propiedad fusogénica

-Determinar dosis viral

Bioseguridad

1. Deleción 3´LTR garantiza partículas virales deficientes de replicación.

2. Separación de elementos cis y trans.

3. Deleción 80% genoma viral

4. Eliminación vectores con detergentes suaves, bleach o hipoclorito, seguido de lavado con etanol

Lentivectores en terapia génica

1. Células hepatocarcinoma humano transducidas con lentivectores con un gen de suicidio bajo el promotor de alfa feto proteína resultó en una destrucción específica de estas células malignas.

Cancer Gene Ther 10:689–695, 2003

2. Erradicación específica de células cancerosas in vitro y en un modelo tumoral murino con lentivectores conteniendo el gen de la toxina A diftérica bajo el promotor de PSA

Science 314:126–129, 2006

Seudotipaje de los lentivectores

1. VSVG: amplio rango de tipos celulares

2. Uso glicoproteínas virales tejido específicas

3. Ingeniería genética de los dominios de unión al receptor de proteínas de cubierta existentes para restringir, ampliar o cambiar laespecificidad viral.

4. Fusión de proteínas virales de cubierta a ligandos naturales.

5. Sistema de proteínas virales de cubierta del virus del sarampión:

-F: fusión de membranas

-H: mutación de residuos de unión y unión covalente a ligandosnaturales (EGF) o single chain antibody (anti CD20)

Mol Ther 16:1427–1436, 2008

ObjetivoObtener un BALB/c GFP transgénico como prueba de concepto de

lentitransgénesis en este background genético

Resultados

Baja toxicidad de la preparación viral:

- 60% embriones BALB/c y 66% FVB/n

Eficiencia transgénesis:

- total: 58% BALB/c y 48% FVB/n

- Activa: 20% BALB/c y 22% FVB/n

No interferencia GFP en el desarrollo y reproducción

Expresión de GFP por 6 generaciones

B

A. Identificación macroscópica de una cría BALB/ GFP+ entre crías controles bajo luz ultravioleta. B. Análisis de Southern Blott para determinar número de copias integradas. Carriles 1 y 2: ratones BALB/c GFP positivos. Carriles 3, 4 y 5: ratones BALB/c no transgénicos. Carriles 6 y 7: DNA no añadido. Carril 8: vector de transferencia LTRcPPT- EF1a-GFP-WPRELTR. ** Fragmentos mayores de 7 Kb. * Fragmento de 7 Kb.

c-f: Expresión de GFP en secciones de músculo (c), intestino (d), bazo (e), y nodos linfáticos (f) contrateñido con DAPI. Intensidad alta de fluorescencia GFP está asociada con el esqueleto fibroblástico-estromal de la pulpa blanca (*), y elementos vasculares incluyendo la arteriola central esplénica(**), y las vénulas de endotelio alto en el nodolinfático (***).

Caracterización de un ratón BALB/c GFP+

Perfil de distribución celular de la intensidad de fluorescencia de GFP en sangre periférica. Izquierda: Dot plot que identifica poblaciones celulares por morfología. Centro: Distribución de la intensidad de fluorescencia GFP. Se definen 3 grupos celulares por su intensidad de fluorescencia R1 (baja), R2 (media) y R3 (alta). Derecha: Dot plotdonde se muestran las poblaciones R1 (gris claro), R2 (gris oscuro) y R3 (negro).

Caracterización de un ratón BALB/c GFP+

Ratones BALB/c quimerasCaracterización de un ratón BALB/c quimérico de médula ósea

Caracterización de un ratón BALB/c quimérico de médula ósea

Aplicaciones de este modelo BALB/c GFP+

Formación de tumores

Diseminación células tumorales

Homing y recirculación de linfocitos

Estudios de poblaciones celulares ex vivo

Vectores lentivirales

Lic. Saumel Pérez Rodríguez

Centro de Inmunología Molecular

Septiembre 2010