Seminario N°1Antígenos-Inmunización

Inmunología Clínica

2010

INMUNIZACION: el proceso de inducción de inmunidad artificial frente a una enfermedad..... (def. médica)

• PASIVA: adquisición de Ac de una fuente externa.

• ACTIVA: producción local de Ac.

¿Qué es un adyuvante?

• Son sustancias o preparados químicos que, incorporados al antígeno o inyectados simultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta inmune.

• Con su empleo se logra una economía de antígeno y de tiempo, asícomo un mayor nivel de anticuerpos específico

• Mecanismo de acción: El antígeno libre normalmente difunde con mucha rapidez desde los tejidos locales que rodean el sitio de inoculación, y una de sus funciones importantes es crear un reservorio o depósito del antígeno de larga vida. Por otro lado todos los adyuvantes activan o estimulan los macrófagos; éstos cuando son activados estimulan la respuesta inmune por un incremento de la cantidad de antígeno expresado en la membrana celular y de la eficiencia de su presentación a los linfocitos. El macrófago también libera factores solubles estimulantes, que amplifican la proliferación de los linfocitos.

Adyuvantes emulsiones usados en inmunología experimental

Completo de Freund Respuesta de Ac y C.T. Muy tóxico

Incompleto de Freund Respuesta humoral

• Elevada eficacia, amplio espectro de aplicación, fácil manipulación y disponibilidad comercial.

• El adyuvante completo de Freud (FCA): • Producción de antisueros en animales• cantidades limitadas de antígenos • presentan una baja inmunogenicidad. • Toxicidad• En la investigación pueden utilizarse, además, • los compuestos de aluminio• "Syntex-1" (SAF-1): treonil análogo del dipéptido

murámico, • polímeros no iónicos en bloque (NBP)• saponinas, • bromuro de dimetil dioctadecil amonio (DDA), • lipopéptidos,

Consideraciones:

• Bienestar animal: la extracción de los anticuerpos del animal se realiza de una manera no invasiva, minimizando el sufrimiento del animal, así como también permite la reducción en el número de animales necesarios para obtener una cantidad de anticuerpos determinada.

• Científicas: permite el uso de estas inmunoglobulinas en sistemas de investigación y diagnóstico, permitiendo la obtención de anticuerpos contra antígenos mamíferos muy conservados filogenéticamente.

• Económicas: reducción de costos en la producción de anticuerpos policlonales, ya que la cantidad de inmunoglobulinas que pueden obtenerse a partir de la yema de huevo de las aves es similar a la producida por animales grandes, mientras que el costo de mantenimiento de una gallina es similar al de un animal pequeño.

Ratón Rata Cobayo Conejo caballo

Oral 0,5-1ml

/sonda gástrica

1-2ml 1-2ml 5-7ml

ID 0,1ml piel

lomo

0,1ml 0,1ml 0,1ml

SC 0,5- 1ml piel

laxa lomo

1-5ml 1-2ml 1-5ml

IP 1ml lateral

abdomen

5ml 10ml 20ml

IM 0,05ml muslo

posterior

0,1ml 0,1ml 0,2ml

IV 0,2ml vena

lateral cola

0,5ml 0,5ml vena

metatarsiana

0,5ml vena

marginal de la

oreja

Extracción de

sangre

0,3ml vena de

la cola- seno

orbital-

punción

cardiaca

0,3ml 5ml Vena de

la oreja- vena

metatarsiana

15ml vena

marginal de la

oreja

30- 50ml

VIAS DE ADMINISTRACIVIAS DE ADMINISTRACIÓÓN N

Formas de introducir una vacuna al organismo

Oral

Intramuscular

Subcutánea

Intravenosa

Intradérmica

SITIOS DE APLICACISITIOS DE APLICACIÓÓNN

� Lugar anatómico seleccionado para que el daño tisular vascular sea mínimo

� Induzca la respuesta inmune deseada

� Provoque el menor daño local y sistémico

Tipo de respuesta inmune según la vía de infección del patógeno

Bacterias no invasivas (Vibrio cholerae, ETEC) → epitelios no permeables a las Igs séricas → ruta tópica de vacunación → sIgA producida localmente

Patógenos invasivos (Chlamydias, H. pylori, virus como herpes simple) →protección mediada por células CD4+ o por CTLs y células NK

Patógenos de la mucosa respiratoria o urogenital → mas permeable a las Igs séricas → una ruta parenteral de vacunación puede ser también efectiva.

Patógenos entéricos que invaden la mucosa o proliferan en los tejidos linfoides de la submucosa (S.typhi) y luego se expanden por el organismo → una ruta parenteral de vacunación puede ser también efectiva

¿Las Igs producidas atraviesan placenta?

• Vaca, cabra , cerdo y caballo mayor permeabilidad en el intestino: se absorben los Ac del calostro pero no atraviesan la placenta.

• Hombre, mono y cobayo atraviesan la placenta pero no se absorben en intestino los anticuerpos de la leche.

.

Inmunización con Cándida. Antígeno?

• Mezcla de extracto crudo: fácil de obtener, gran número de antígenos, dificil de estandarizar y reacción cruzada ( bacterias y otros hongos).

• Antígenos recombinantes: en huésped procariota, fácil de estandarizar y se eliminan las reacciones cruzadas.

• Péptidos sintéticos

¿Levadura completa?

• Microorganismo entero muerto por calor, acetona, formol, etanol.

• A partir de cultivos en medios enriquecidos, se selecciona la colonia y se transfiere a caldo enriquecido, se incuba 6-8hs a 37ºC y se calienta a 100ºC 2hs.

• Preservar con 0,5ml de formol al 10%

¿Concentración del inoculo?

• Concentración 109 /ml ¿Cómo ajusto la concentración?

• Tubo 3 del nefelómetro de Mac Farland (0,3ml ClBa 1%+ 9,7ml H2S4Al1%)

• Leer a 660nm (previamente una curva (Abs. 700 correlaciona con 10000000)

• Contar en cámara de Neubauer.

Pared celular de C. albicans:•quitina N-acetilglucosamina (rojo) (componente fibrilar)•ß-1,3-D-glucano (verde)•ß-1,6-D-glucano (azul)•mananos (D-manosa) (negro) •proteínas (naranja)

¿Antígeno purificado?

Hongos Hongos

Nature Reviews Immunology 4, 11-24 (January 2004)

InteracciInteraccióón n

PAMPPAMP--TLRTLR

The yeast cell wall is made of ~25% helical β(1-3) and β(1-6)-D-

glucans and ~25% oligo-mannans, ~20 % protein, ~10% lipids,

and some chitin. The protein component exists predominantly

as a mannoprotein complex. Covalent linkages are reported to

exist as β(1-4)-linkages between the reducing ends of chitin and

the nonreducing end of b(1-3)-glucans as well as among

glycoproteins, β(1-6)-glucans, and β(1-3)-glucans.

Colonización vs Infección

• Colonización comensal de la sup de mucosas. Individuos normales tienen anticuerpos. Falsos positivos

• Infecciones oportunistas en inmunocomprometidos baja producción de anticuerpos. Falsos negativos

H. UNICELULARH. UNICELULAR(levadura)(levadura)

Blastoconidio

Tubo germinal

Pseudomicelio

Invasión

• Penetración: secresión de enzimas hidrolíticas como SAPs ( proteasa), Plbs (fosfolipasa), Lips (lipasa) que digieren la sup. epitelial

• Endocitosis por cél. Epitelial ( Als3 . Proteina de adhesión anclada a GPI)

Antígenos específicos de la forma hifal

• La transformación a la forma hifal es un factor de virulencia, asociado con una fase invasiva:

• Hyr1; proteina reguladora hifal glicoproteina de la pared del tubo germinal

• Ece1: proteina de elongación de la célula• Als3: glicoproteina de la pared celular similar a

aglutinina implicada en la adhesión a la superficie del húesped

• Hwp1: glicoproteina expresada en la superficie de la pared hifal relacionada con la adherencia y factor de virulencia

Enzimas

• Enolasa: enzima glicolítica inmunodominante presente en el citoplasma y en la pared interna de Cándida Albicans en ambas formas.

• Proteinasa aspartil secretada: Pt secretadas por Cándida sp. Considerada un antígeno inmunodominante y factor de virulencia asociado con adherencia e invasión a tejidos y diseminación.

Proteínas Recombinantes

• Sistema de expresión: bacterias, hongos, baculovirus-cél de insectos: elección del vector( plásmido) y el húesped. Considerar: tamaño del inserto, sitios de restriccìón, estrategias de purificación, resistencia a antibioticos para selección

• DNA constructor• Data base genoma de Cándida (CGD)• http// www.candidagenome. org• Importante conocer estado y sitios de glicosilación,

uniones disulfuras,modificaciones postraslacionales, estabilidad de la proteina

• Ej. Bacteriofago T7 en E.Coli ( pt no glicosiladas)

Fuentes naturales de proteínas

Bajos rendimientos

Impurezas

Técnicas de ADN recombinante

Permiten la síntesis y la expresión autónoma, en un huésped determinado, de un híbrido formado por la

combinación de moléculas de ADN de orígenes diferentes

Proteína heteróloga

Estrategia para la obtención de una Proteína Heteróloga

�Clonado

�Sistema de Expresión

•Estabilidad

•Solubilidad

•Tamaño

•Modificaciones Post-traduccionales

�Aplicaciones

•Antígeno (alta cc, fácil purificación)

•Estudio de la función biológica

(mantener la actividad)

•Estudios estructurales (solubilidad)

Aspectos Técnicos1- Selección del ADN de interés

Dónde buscarlo ?

Qué expresamos ?

Cuánto necesitamos ?

2- Selección del vector Expresión en eucariotas

Expresión en procariotas

3- Digestión, Ligación del vector y del inserto y transformación

4- Clonado y Expresión de la proteína

Plegamiento de la proteína

5- Purificación6- Detección (SDS-PAGE)

Confirmación de identidad (WB/secuencia de ADN)

Selección del ADN de interés

Conocida cADN PCR(Gene Bank)

Desconocida(DNA library)

Qué porción del gen vamos a expresar ?Inserto Compatible con el

del vector

Proteína Entre 20- 100 kDa

Tener en cuenta:hidrofilicidad/hidrofobicidad

Secuencia

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