Talasemias Dra. Silvia Varas [email protected] Talasemias II.
Seminarios Talasemias - Blog de Química Biológica … · Amplificación de Sondas dependiente de...
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Seminarios Talasemias
Dra. Silvia Varas
Fundamentos Tcnicas:
MLPA
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Amplificacin de Sondas dependiente de Ligamiento Mltiple
Uso Primario: Deteccin mltiple de cambios pequeos nmeros de copias de
secuencias ADN/RNA, por ejemplo deleciones/duplicacin de exonesde un gen
Fue descrito por primera vez en 2002: Schouten JP et al. Nucleic Acids Res.
Mas de 750 articles publicados con diferentes usos de MLPA Mas de 1.000.000 reccciones de MLPA son llevadas a cado cada ao Se aplica a estudios en gentica humana citogentica investigacin en cancer
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Instrumentos
Un termociclador y un sistema de electroforesis tipo de secuencia son requeridos para MLPA
Los resultados son obtenidos en 24 hs.
Mas de 96 Ms pueden ser procesados en un experimento
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Mix-Probes
MLPA probes consiste de 2 oligonucleotidos:
La sonda oligonucleotido izquierda(LPO) (7) y la sonda oligonucleotido derecha(RPO) (8)
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Cada oligo a su vez contiene 2 partes:
El LPO contiene en su extremo 5 el F y en su extremo 3
La secuencia de la sonda de hibridizacin izquierda (LHS).
El RPO contiene en su extremo 5 la sonda de hibridizacin derecha (RHS) y el primer R en su extremo 3
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Protocolo tpico de MLPA
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Caracterstica General
La amplificacin es de las sondas de MLPA, no de las muestra de ADN.
El pattern de los picos son generadas sobre la muestras de un paciente y una muestra de ADN de referencia. Se compara la altura relativa de los picos. Las diferencias reflejan los cambios en el nmero de copias detectados por las probes de MLPA.
Mas de 50 probes estn presentes en una reaccin de MLPA
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MLP versus otras tcnicas
Secuenciamiento, DHPLC, SSCE y otras tcnicas para la deteccin de mutaciones no pueden detectar cambios en el numero de copias de exones completos
FISH no puede detectar pequeas mutaciones
Southern Blot son extremadamente laboriosos
PCR en tiempo real es menos sensible a pequeos cambios en el numero de copias y no es una tcnica de amplificacin mltiple
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VENTAJAS de MLPA:
Deteccin de nmero de copias de 40-50 secuencias de ADN genmicos en una simple reaccin, basada en PCR
Requiere nicamente 20 ng de ADN humano (3.000 clulas/0,5 ml de fluido amnitico).
Discrimina secuencias que difieren en SOLO un nucletido.
MLPA puede ser usado sobre Ms de ADN parcial-mente degradadas tales como ADN extrado de tacos de tejidos parafinados.
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PROBLEMAS de MLPA:
MLPA es mas sensible a las impurezas en la muestras que una PCR ordinaria.
Disminucin de la seal de una sonda puede ser debido a un SNP/polimorfis_ mo raro. Deleciones detectadas por una nica sonda requiere confirmacin independiente
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Deleciones
