Gerardo Jiménez Muñiz

Elena Jorge de Castro

Maite Ledo Varela

Juana Marín Gómez

Estrella Maroto Quintana

Laura Mª Primoy Rodríguez

Ricardo Sánchez Sánchez

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ÍNDICE

1. Introducción pág. 3

2. Cromatografía de fase enlazada pág. 5

3. Cromatografía de cambio iónico pág. 7

4. Cromatografía de par iónico pág. 9

5. Cromatografía de exclusión pág. 10

6. Cromatografía en fluidos supercríticos pág. 13

7. Fundamentos de electroforesis pág. 18

8. Electroforesis capilar pág. 22

9. Bibliografía pág. 26

3

INTRODUCCIÓN

La separación de compuestos con el propósito de identificar, cuantificar o

purificar es uno de los aspectos desafiantes de la química analítica. En este trabajo se

consideran algunos tipos de cromatografía, los cuales se encuentran entre los más

poderosos métodos de separación.

Así, la cromatografía se puede definir como el método y la técnica usada para

separar y analizar mezclas de sustancias químicas, basados en la diferente absorción o

adsorción de éstas por otros compuestos y disolventes. Normalmente se emplean

columnas cargadas con adsorbentes sólidos y pulverizados en las que la fase móvil es

un líquido o un gas y la fase estacionaria es comúnmente un líquido que recubre la

superficie de partículas sólidas. A veces las partículas sólidas mismas pueden servir

como fase estacionaria. En cualquier caso, el reparto de solutos entre las fases móvil y

estacionaria es la causa de la separación de solutos. Así el soluto que tenga mayor

afinidad por la fase estacionaria se moverá con mayor lentitud a lo largo de la columna.

En la práctica, la cromatografía se divide en varias clases:

1. Cromatografía de adsorción: en la que se utiliza una fase estacionaria

sólida y una fase móvil líquida o gaseosa. El soluto puede adsorberse en la

superficie de las partículas sólidas. El equilibrio entre el estado adsorbido y

la solución es la causa de la separación de las moléculas de soluto.

2. Cromatografía de reparto: en esta técnica, una fase estacionaria forma una

película delgada en la superficie del soporte sólido. El soluto se equilibra

entre este líquido estacionario y una fase móvil líquida o gaseosa.

3. Cromatografía de intercambio iónico: en este tipo de cromatografía

aniones y cationes se unen covalentemente a la fase estacionaria sólida, por

lo común una resina. Los iones de soluto, de carga opuesta a los de la fase

estacionaria, son atraídos por esta última mediante una fuerza electrostática.

La fase móvil es un líquido.

4. Cromatografía de exclusión molecular: en la que la fase móvil líquida o

gaseosa pasa a través de un gel poroso. Los poros son suficientemente

pequeños para excluir las moléculas grandes de soluto, pero no las pequeñas.

Así, la corriente de moléculas grandes pasa sin penetrar en el gel y las

pequeñas requieren más tiempo para pasar a través de la columna porque

entran en el gel.

4

5. Cromatografía por afinidad: se utilizan interacciones altamente específicas

entre un tipo de moléculas de soluto y otras moléculas que se unen

(inmovilizan) covalentemente a la fase estacionaria.

También se hablará en este trabajo de otra técnica, utilizada en esta caso para la

separación de proteínas, denominada electroforesis, prestando una atención especial a

la electroforesis capilar, sus métodos y sus aplicaciones.

5

CROMATOGRAFÍA DE FASE ENLAZADA

También se la conoce con el nombre de “cromatografía unida químicamente”.

Junto con la cromatografía líquido-líquido forman lo que se conoce con el nombre de

“cromatografía de reparto”. La diferencia entre estas técnicas radica en las formas en

que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas soporte del relleno; en este caso,

la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte.

En la actualidad, los métodos de fase unida químicamente son los que

predominan debido a las desventajas de los sistemas líquido-líquido, siendo la más

importante la pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase móvil, lo que hace

necesario un recubrimiento periódico de las partículas del soporte.

En cromatografía de reparto, los soportes para casi todos los rellenos de fases

unidas químicamente, se preparan con sílice rígida o composiciones constituidas

básicamente por sílice. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente

resistentes, porosas y uniformes. La superficie de la sílice, totalmente hidrolizada, está

constituida por grupos silanol químicamente reactivos. Es decir:

OH OH OH OH

O O O

Si Si Si Si

Los recubrimientos de fase unida químicamente más utilizados son los

siloxanos, que se forman por reacciones de la superficie hidrolizada (por calentamiento

con HCl 0.1 M) con un organoclorosilano. Por ejemplo:

CH3 CH3

Si OH + Cl Si R → Si O Si R

CH3 CH3

donde R es un grupo alquilo o un grupo alquilo sustituido.

Por lo general, el grupo R del siloxano en estos recubrimientos es una cadena C8 (n-

octilo) o una cadena C18 (n-octadecilo)

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Los rellenos de las columnas en la cromatografía de fase unida químicamente se

clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no

polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares.

Los más usados son los de fase inversa, en los que la fase estacionaria es no polar,

tratándose con frecuencia de un hidrocarburo, y la fase móvil es la relativamente polar.

Aplicaciones en alimentos:

Separación de mezclas de:

∗ edulcorantes artificiales

∗ antioxidantes

∗ aflatoxinas

∗ aditivos

Una aplicación característica de la cromatografía de fase unida químicamente es

la determinación de aditivos en bebidas refrescantes, usando una columna rellena con

fase unida químicamente polar (nitrilo). Se obtiene la identificación de cuatro picos

correspondientes a: vitamina C, sacarina, cafeina y benzoato de sodio.

7

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

La cromatografía de intercambio iónico está basada en la atracción entre

iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de

intercambiadores aniónicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria

atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados

negativamente que atraen cationes del soluto.

Las resinas son partículas amorfas de material orgánico. Las resinas de

poliestireno, usadas en intercambiadores iónicos, se obtienen por copolimerización de

estireno y divelbenceno. Los anillos de benceno se pueden modificar produciendo una

resina de intercambio catiónico, si contienen grupos sulfonato (-SO3-), o una resina de

intercambio aniónico, si contiene grupos amonio (-NR3+).

Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles.

Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas, en

cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4, y pierden su

capacidad de intercambio catiónico. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario (

que en realidad no son básicos) siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los

intercambiadores aniónicos básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en

disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad.

Las resinas de intercambio iónico se usan en aplicaciones en las intervienen

moléculas pequeñas (Pm = 500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina.

Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que las macromoléculas

muy cargadas, como las proteínas, se pueden enlazar irreversiblemente a ellos. Los de

celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. Los geles de

intercambio iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos

nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean

intercambiadores iónicos inorgánicos.

Las resinas cuando tienen poco entrecruzamiento se hinchan de agua, disminuye

la densidad de los puntos de intercambio iónico y la selectividad de la resina respecto a

distintos iones. Las resinas más entrecruzadas se hinchan poco, mayor capacidad de

intercambio y de selectividad.

8

Selectividad del intercambio iónico

Consideramos la competencia de Na+y Li+ por los puntos activos de una resina de

intercambio catiónico R-: R- Na+ + Li+ R-Li+ + Na+

La constante de equilibrio se llama coeficiente de selectividad, porque mide la

selectividad de la resina.

El equilibrio entre los iones en disolución y los iones dentro de la resina se llama

equilibrio de Donan.

Aplicaciones

1.- Separación de aminoácidos: se realiza en un columna de resina de poliestireno

sulfonado. Inicialmente el pH de la fase móvil es bajo, por lo que los aminoácidos,

cargados positivamente, se verán atraídos pro los grupos SO3-. Conforme se va

aumentando el pH del tampón los aminoácidos se eluyen diferencialmente al disminuir

su carga positiva y ser menos atraídos por el anión. A pH 3.5 los aminoácidos con un

grupo ácido extra, en su cadena lateral, tendrán muy poca afinidad por la resina y serán

los primeros en salir de la columna, mientras que los que tengan un grupo extra

ionizable capaz de transportar una carga positiva (Lys, His) serán retenidos fuertemente

por la resina.

Las interacciones no iónicas entre los aminoácidos y la resina también influyen en la

secuencia de elucción, por lo que la Tyr y la Phe se retrasan al intercambiar su anillo

hidrofóbico con la resina.

2.-Desionización de agua: se pasa agua través de una columna de intercambio

aniónico en su forma OH- y de una columna de intercambio catiónico en su forma H+.

3.- Interconversión de sales

4.- Concentración de trazas: de una disolución y alcanza así un nivel suficiente para

poder hacer un análisis.

9

CROMATOGRAFÍA DE PAR IÓNICO

Técnica cromatográfica en la cual se mezclan dos tipos de cromatografías: de

fase inversa y de intercambio iónico, antes mencionadas.

El método consiste en hacer pasar una fase móvil a través de una fase

estacionaria compuesta por grupos de C-18 unidos a una matriz de sílice. La fase móvil

será una disolución de tampón ácido, disolvente orgánico (como por ejemplo el

metanol) y un compuesto iónico que aporta el contraión que es lo que caracteriza a esta

cromatografía.

El contraión es un ión que se combina con una especie que tenga naturaleza

contraria a la suya dando así una especie neutra presente en la fase estacionaria. Es a

esta especie neutra a la que se la denomina "par iónico o pareja de iones".

En esta cromatografía existen dos tipos de contraiones:

- Los que se utilizan para separar analitos catiónicos ➾ "Surfactante aniónico"

- Cuando el analito es aniónico ➾ "Tercbutilo"

Cuando ya está presente la pareja iónica en la fase estacionaria se hace pasar el

analito produciéndose así el intercambio iónico entre el ión que estaba unido al

contraión y nuestro analito. Los dos tienen la misma naturaleza pero uno presenta mas

afinidad por el contraión que el otro. Ambos quedan unidos por fuerzas electrostáticas.

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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN

La cromatografía de exclusión molecular, también llamada cromatografía de

filtración en gel o cromatografía de permeación en gel, se basa en la diferencia de

penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la

separación obtenida depende del tamaño de la molécula. El tiempo de elucción es

proporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con

compuestos de alto peso molecular. Este tipo de separación por tamaño difiere de las

demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicas o químicas

entre el analito y la fase estacionaria. Es una técnica bastante suave, reproducible,

escalable y rápida.

La fase fija (o “malla molecular”) está formada por partículas poliméricas o de

sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las

moléculas de pequeño tamaño. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente

(no penetran en los poros) y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeño

tamaño tienen acceso a todo el volumen poroso y son las últimas que se eluyen; de esto

se deduce que el volumen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las

grandes. Por lo tanto, las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente:

• Las moléculas más grandes del tamaño medio de los poros no penetran en ellos,

sino que siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la

columna: migran a la velocidad de la fase móvil.

• Las moléculas más pequeñas pueden penetrar en los poros, por lo que quedan

retenidas la mayor parte del tiempo.

La siguiente ecuación: Vr = V0 + KVs

donde: Vr = Volumen de retención

V0 = Volumen de la fase móvil (Volumen de la fase intersticial)

Vs = Volumen de fase estacionaria

K = Coeficiente de reparto (cociente entre la concentración de soluto en

la fase estacionaria y concentración en la fase móvil)

podemos escribirla como: K = Vr – V0 / Vs

El coeficiente de reparto promedio es proporcional a K : Kpr = Vr – V0 / Vt – V0

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1. Para las moléculas grandes que no penetran en el gel: Vr = Vo y Kpr = 0.

2. Para las pequeñas que penetran libremente en el gel: Vr ≈ Vt y Kpr ≈ 1.

(Vt = Volumen total de la columna).

3. Para las moléculas de tamaño intermedio, que pueden penetrar en algunos poros

del gel pero no en otros, Kpr se situará entre 0 y 1.

V0 es el volumen de elución que se determina haciendo pasar por la columna una

molécula grande e inerte, generalmente colorante azul de dextrán 2000.

Vt se determina a partir de las dimensiones de la columna.

Los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamaño del

poro, el tamaño de la partícula y el flujo de elución.

Los diferentes tipos de partículas usadas deben cumplir unos requisitos:

estabilidad mecánica, estabilidad química, bajo contenido en grupos iónicos,

uniformidad de poro y tamaño (pero con una gran variedad donde elegir el tamaño que

queramos).

Los compuestos se dividen en cuatro grupos: derivados de dextranos (Sephadex),

derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P.) y esferas de

vidrio. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño de partícula,

mayor resolución y menor gasto en la columna.

• Cromatografía de exclusión: se emplean geles de filtración como el Sephadex. El

eluente empleado es agua o soluciones amortiguadoras. Los geles aumentan su

volumen cuando se ponen en contacto con el eluente e impiden el paso de

moléculas grandes a través de sus poros: por eso se separan primero.

• Cromatografía de permeación: se emplean polímeros que se disuelven en

solventes orgánicos.

La cromatografía de exclusión se utiliza para separar moléculas de distinto peso

molecular en distintas mezclas, como puede ser separación de proteínas de un

determinado alimento, determinación de glucosa, fructosa... de zumos de frutas, etc...

También es utilizada para determinar el peso molecular de una determinada sustancia:

para cada fase estacionaria hay un intervalo en el cual existe una relación logarítmica

entre el peso molecular y el volumen de elución. Por lo tanto, si comparamos el

coeficiente de reparto promedio de la sustancia problema con el coeficiente de reparto

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promedio de una serie de patrones, se puede estimar el peso molecular de dicha

sustancia.

13

CROMATOGRAFÍA DE FLUÍDOS SUPERCRÍTICOS

Definición

Es una técnica híbrida entre la cromatografía de líquidos y gases, y además corresponde

a otro tipo de cromatografía en columna (junto a la cromatografía de gases y líquidos).

Este tipo de cromatografía permite la separación y determinación de compuestos:

- No volátiles o térmicamente lábiles, a los cuales no se les puede aplicar la

cromatografía de gases.

- No contienen grupos funcionales y por ello no son detectables mediante técnicas

espectroscópicas o electroquímicas de la cromatografía de líquidos.

Como Fase Estacionaria presentan especies orgánicas enlazadas a una superficie sólida

y como Fase Móvil utilizan un fluido supercrítico. Además el tipo de equilibrio que se

da, es una distribución entre un fluido supercrítico y una superficie enlazada.

Propiedades de los fluidos supercríticos

Los fluidos supercríticos son aquellos que presentan temperaturas y presiones próximas

a la temperatura y presión crítica. La temperatura crítica de una sustancia es aquella por

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encima de la cual no hay fase líquida. Se forman manteniendo una presión superior a la

del punto crítico e incrementando la T ª (de manera que las propiedades físicas del

fluido están próximas a las de los gases) o manteniendo constante una T ª superior a la

del punto crítico y aumentando la Presión, (de manera que el comportamiento del fluido

es similar a un líquido).

Tienen propiedades intermedias entre sólidos y líquidos, como el coeficiente de difusión

y la viscosidad (que son función de la presión y la temperatura)

Gas Fluido supercrítico Líquido

Densidad (g/cm3) (0,6-2) x 10-3 0,2-0,5 0,6-2

Coeficiente de difusión

(cm2/s)

(1-4) x 10-1 10-3-10-4 (0,2-2) x 10-5

Viscosidad (g cm-1s-1) (1-3) x 10-4 (1,3) x 10-4 (0,2-3) x 10-2

- Debido a la menor viscosidad y la mayor velocidad de difusión, de la fase móvil, la

CFS es más rápida junto la cromatografía de gases, que la cromatografía de fluidos.

- Las temperaturas y presiones de los fluidos supercríticos están dentro de los márgenes

de trabajo de HPLC.

-Tienen una alta capacidad de disolver moléculas grandes y no volátiles debido a su

elevada densidad Ej. : el CO2 supercrítico disuelve n-alcanos e hidrocarburos

aromáticos poli cíclicos.

Variables Instrumentales y experimentales

Las presiones y las temperaturas necesarias para originar los fluidos supercríticos, están

dentro de los límites experimentales del HPLC, de tal manera que la instrumentación de

los fluidos supercríticos es semejante a la del HPLC. Se diferencian ambas técnicas en

la utilización de:

- Horno en columna termostatizado parecido al utilizado en cromatografía de

gases cuya función es controlar la temperatura de la fase móvil (al aumentar la

temperatura disminuye la densidad, de modo que se varía de esta manera la retención

de solutos de la fase móvil).

- Restrictor o dispositivo de contrapresión para mantener la presión supercrítica

de la fase móvil a un determinado valor, a lo largo de la columna y convertir el

efluyente (la nueva fase móvil añadida en la columna) del fluido supercrítico en gas

para ser conducido al detector. ESQUEMA DE UN CROMATÓGRAFO DE FLUÍDOS SUPERCRÍTICOS

Efecto de la Presión

La variación de presiones modifica el factor de capacidad k’ como

aumento de la densidad de la fase móvil correspondiente al aumento d

Al aumentar la densidad, aumenta la fuerza de elución (la capacidad

la fase móvil, disminuyendo por tanto el tiempo de elución (el tiempo

las especies. Ej. : al variar la presión del dióxido de carbono supercríti

disminuye el tiempo de elución del hexadecano de 25 a 5 min.

Fase Estacionaria

Se emplean columnas capilares o de relleno aunque se emplean

(parecidas a las columnas de sílice fundida).Las columnas capilares ti

de 10-20 m, un diámetro interno de 0,05-0,10 mm y un espesor de la

µm.

Las columnas de relleno son similares a las de los líquidos de reparto.

BOMBA

HORNO

REGISTRO

COLUMNA

RESTRICTOR

INYECTOR

DETECTOR

15

consecuencia del

e la presión.

de transportar) de

de transporte) de

co de 70 a 90 atm.

más las capilares

enen una longitud

película de 0,05-1

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Fase Móvil

La más utilizada es el dióxido de carbono ya que es un excelente disolvente de

moléculas orgánicas, transmite las radiaciones ultravioletas, es inodoro, no tóxico, de

fácil obtención y con un coste no muy elevado. El dióxido de carbono presenta una

presión crítica de 72,9 atm y una temperatura crítica de 31º C.

Otras posibles fases móviles son etano, pentano, diclorofluorurometano, óxido nitroso,

etc.

Comparación con otros tipos de cromatografía

- Una ventaja de la CFS con respecto al HPLC, es la utilización de detectores de

ionización de llama (utilizados en la cromatografía de gases) los cuales tiene una

respuesta muy amplia a los compuestos orgánicos además de no presentar mucha

dificultad en el mantenimiento y manipulación. También se pueden utilizar detectores

de la cromatografía de líquidos en la CFS éstos son detectores de absorción ultravioleta

y de infrarrojo, de emisión por fluorescencia, termoiónico, fotométrico de llama.

- La velocidad en el análisis de la CFS y de GC es mayor que la de CL, ya que la

densidad de la fase móvil es menor y de esa manera se pueden emplear caudales de la

fase móvil más elevados.

- La velocidad de difusión en CFS es mayor que en la CL pero menor que la CG por

tanto el ensanchamiento de la banda en CFS es mayor que en CL, pero menor que en

CG.

- La Fase Móvil de CFS y de CL transporta a las moléculas e interacciona con ellas,

influyendo sobre el factor de selectividad (α). Sin embargo en la CG sólo transporta a

los solutos la Fase Móvil.

-Cuando una molécula se disuelve en un FS, el proceso es parecido a la volatilización

pero como si ésta se llevara a cabo a una temperatura más baja de la que se utilizaría en

CG, de tal manera que moléculas de elevado peso molecular, especies térmicamente

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inestables, polímeros y moléculas grandes de interés biológico pueden ser eludías de la

columna a temperaturas relativamente bajas.

-Podemos modificar α al cambiar la fase móvil, a diferencia de lo que sucede en CG.

Aplicaciones en la Industria Alimentaria

El análisis de mezclas oligoméricas y compuestos termolábiles de volatilidad

restringida son algunas de las más interesantes aplicaciones.

Las sustancias analizadas o determinadas mediante CFS:

- Alimentos: análisis de mantequillas, aceites vegetales, quesos, café, tabaco,

manzanilla.

- Alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, ácidos grasos, lípidos, di y triglicéridos,

fosfolípidos, aminoácidos, carbohidratos y ésteres de sacarosa, vitaminas, cafeína...

18

FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS

Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con una carga eléctrica neta son

colocadas en una campo eléctrico, éstas experimentarán una fuerza de atracción hacia el

polo que posea carga opuesta.

Características:

-Las fuerzas puestas en juego son de tipo físico, fundamentalmente de naturaleza

electrostática.

-Se trata de una técnica con control de tipo cinético;

-La variable tiempo juega un papel definitivo

Así, si se deja transcurrir un cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente

se desplazarán hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se

desplazarán hacia el ánodo (el polo positivo). No se produce electrolisis (reducción en el

cátodo y oxidación en el ánodo) pues los electrodos están suficientemente separados.

El principal campo de aplicación de la electroforesis es la separación e

identificación de macromoléculas biológicas, en especial, las proteínas. También se ha

aplicado a especies bioquímicas más simples y, en menor extensión, a especies

inorgánicas. En Química Clínica su uso también es muy frecuente (lipidograma,

proteinograma) .

Antes de iniciarse la separación, es decir, antes de la adición de la muestra, el

sistema electroforético debe encontrarse en equilibrio termodinámico, lo que implica

que:

- la temperatura sea uniforme

- los potenciales químico y eléctrico sean los mismos en todo el sistema

- las fuerzas mecánicas estén equilibradas

El resultado final es un desplazamiento diferencial, según la carga, y a

diferente velocidad según las características de las especies cargadas, lo que provoca la

separacion, el objetivo primordial de la electroforesis.

19

Características de las especies cargadas

Fundamentalmente son dos:

- Carga. Cuanto mayor sea la carga, mayor será la movilidad; además, su carácter

catiónico o aniónico determinará la dirección del desplazamiento.

- Tamaño iónico. El tamaño del ión también es un factor decisivo: cuanto menor sea

un ión (a igualdad de cargas), mayor será su movilidad.

En el sistema electroforético pueden originarse diversos fenómenos que se

traducen en un transporte de materia, y que afectan de manera decisiva a la separación

electroforética. Serán:

- DIFUSIÓN. Esta provocado por la existencia de gradientes de concentración que

favorecen el transporte hacia las zonas de menor concentración de cada especie.

Afecta tanto a partículas cargadas como no cargadas. Las moléculas tienen a

moverse en forma aleatoria (movimiento browniano) debido a que poseen energía

cinética propia. Esto es lo que se denomina difusión. La energía cinética de las

moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión

- MIGRACIÓN. Es el movimiento de las especies producido por una fuerza externa

que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico y su intensidad.

- CONVENCIÓN. Se trata de un fenómeno no deseable en electroforesis. Consiste

en el transporte de todo tipo de especies, cargadas y no cargadas. Puede ser por flujo

hidrodinámico por diferencias de presión en los extremos de una columna, o por

capilaridad...

- FLUJO TERMICO. Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que

origina una resistencia dada, se produce calor. Por tanto, el sistema electroforético

no es isotérmico. En general, la fase líquida se mueve hacia las zonas de menor

temperatura, lo que origina un transporte de las partículas de interés no debido a la

migración.

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- FRICCIÓN. La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir, al

moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que están en su camino), lo

que genera una fuerza que se opone al movimiento.

La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una

manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar

de la solución, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura

aumentará con el tiempo.

Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las

moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. Una

forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de

muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz molecular que

dificulta el movimiento de los solutos.

Consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta,

pero el ensanchamiento del frente se verá reducido también. Si ahora aumentamos la

intensidad del campo eléctrico, podemos acelerar la migración molecular, pero no por

ello variará la difusión y nuestro frente migrará de un modo cada vez más compacto.

Así, podemos mejorar la definición del frente aumentando la diferencia de potencial

entre los polos y esto estará limitado tan sólo la capacidad de la solución para disipar el

calor generado por el paso de la corriente eléctrica. Esto último, debido a que si el calor

se acumula se puede hacer hervir a la solución, e incluso descomponer el gel y/o los

solutos.

La presencia del gel tiene una consecuencia adicional, ya que aquellas moléculas

de mayor tamaño hallarán mayor resistencia al avanzar a través de los poros del gel que

aquellas moléculas pequeñas. Por lo tanto, la fricción que se observa durante el

movimiento electroforético en un gel depende de la masa y la forma de la molécula, en

adición a su carga eléctrica.

21

22

ELECTROFORESIS CAPILAR

Es la técnica electroforética más reciente en el análisis químico. Al contrario que

en la electroforesis convencional, en la electroforesis capilar (CE) no es necesario el uso

de un medio de soporte y el análisis se realiza en disolución acuosa libre.

Esta técnica permite la separación de moléculas de distintos tamaños y cargas,

como son iones, péptidos, proteínas, carbohidratos y ácidos nucleicos. En ella se aplican

los mismos principios de la electroforesis convencional, pero tiene la ventaja de ser más

rápida debido a la automatización de la técnica y a que no es necesaria la preparación de

un gel-soporte con las desventajas e inconvenientes que ello conlleva (tiempo,

toxicidad).

Instrumentación y ventajas de la CE

El montaje de una CE es muy sencillo. Consta de un generador de corriente

eléctrica de alto voltaje de hasta 30 KV conectado a dos electrodos de platino que se

sumergen en dos recipientes con tampón. Luego se encuentra el tubo capilar de sílice

fundida, que tiene un diámetro interno de 20 a 200 micrometros y una longitud también

variable que suele oscilar entre 50 y 100 centímetros. Los extremos del capilar se

encuentran conectados con los recipientes de tampón antes mencionados. Las señales

son recogidas por un detector. Un ordenador conectado al detector permite almacenar,

interpretar y representar los datos.

Las ventajas de la CE son:

1. Evita el movimiento de convección del tampón. Esto es debido a la resistencia que

el propio capilar ejerce al movimiento del fluido en su interior.

2. Evita que se produzca un calentamiento excesivo del sistema fruto de las corrientes

de alto voltaje a las que está sometido. En este caso se debe a que al ser tan fino el

capilar se enfría rápidamente.

3. Rapidez y automatización.

23

Esquema de la Electroforesis Capilar

Fundamentos teóricos de la CE

La CE está basada en dos fenómenos:

• Migración electroforética. Los iones y moléculas cargadas migran a través del

gradiente creado por el campo eléctrico en función de sus fuerzas eléctricas.

• Electroósmosis, también llamada electroendósmosis. Ocurre en todos los procesos

de separación electroforética. Se puede definir como el movimiento relativo de un

líquido con respecto a una superficie cargada (como el capilar de sílice fundida)

provocado por un campo eléctrico. Este movimiento recibe el nombre de flujo

electroosmótico. Este flujo se evita utilizando un tampón cuya carga eléctrica sea de

igual valor y de signo opuesto a la del capilar.

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Variantes de la CE

Hay diversas técnicas de operación en CE. Las más importantes son:

➤ Electroforesis de zona (CZE). La columna y los recipientes de los electrodos se

encuentran rellenos de una sustancia llamada portador (del inglés “carrier”) que se

encarga de conducir la corriente eléctrica y de la capacidad tamponadora. La

electroforesis de zona puede realizarse de dos formas:

- Como un proceso de una sola fase en solución libre de portador;

- En combinación con un medio de soporte sólido (gel) o una segunda fase

líquida. En este caso, además de migración electroforética, también hay

separación por reparto entre dos fases.

➤ Isotacoforesis. Se realiza en un sistema de tampón discontinuo, formado por un

electrolito líder, que debe tener una movilidad electroforética mayor que las

movilidades de los componentes de la muestra, y un electrolito terminador, cuya

movilidad electroforética debe ser menor que las de los componentes de la muestra.

➤ Isoelectroenfoque. Se limita a la separación de sustancias anfóteras, ya que las

muestras no se separan en función de su movilidad electroforética como en los

demás casos, sino mediante sus puntos isoeléctricos (pI) (pH para el cual el anfolito

tiene carga neta 0). A pH = pI el compuesto estará en forma de zwitterion y no

migrará. A pH < pI el compuesto estará cargado positivamente y migrará al cátodo.

Y, finalmente, a pH > pI el compuesto estará cargado negativamente y migrará al

ánodo. La separación se hace en un gradiente lineal de pH generado mediante

anfolitos con distintos pI.

➤ MECK (micellar electrokinetic chromatography). Es similar a la cromatografía

líquida de fase inversa. Se basa en el uso de micelas que permiten que la muestra

quede unida a ellas y, en función de la carga neta final de la micela unida a la

muestra habrá un reparto o separación. Esta técnica permite la separación de

compuestos sin carga.

➤ Electroforesis capilar en gel. Combina la técnica de electroforesis con la de

cromatografía de reparto. Permite la separación en función de la migración

electroforética y también en función del peso molecular (Pm) de las muestras. Esto

se debe a que el capilar se encuentra relleno de una fase sólida que permite el

reparto en función del Pm.

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Aplicaciones al análisis de alimentos

La CE permite la separación de numerosos compuestos orgánicos e inorgánicos

con o sin carga. Así:

> Pequeñas moléculas o iones inorgánicos pueden ser separados por electroforesis

capilar de zona (CZE) en una sola fase libre.

> Carbohidratos aromáticos, ácidos nucleicos, vitaminas, antibióticos y barbitúricos

por MECK.

> Péptidos y proteínas como las enzimas por electroforesis capilar de zona (CZE).

> Carbohidratos no aromáticos por CZE en una sola fase libre y también por MECK.

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BIBLIOGRAFÍA

I. “Principios de análisis instrumental”

Skoog, Holler, Nieman

Ed. Mc Graw Hill 5ª ed

II. “Análisis Instrumental”,

Douglas A. Skoog y James J. Leary

4ª ed.Mc Graw Hill

III. “Capillary Electrophoresis: Principles and Practice.”

R. Kuhn, S. Hoffstetter-Kuhn. Springer Laboratory.

IV. “Capillary Electrophoresis: Theory and Practice.”

Patrick Camilleri et al. 2ª Ed.

V. “Análisis Químico Cuantitativo”

C. Harris, D. 2ª Ed. Reverte S.A. 2001