Sesion 10. Tecnologia Enzimatica y Microencapsulacion

8/12/2019 Sesion 10. Tecnologia Enzimatica y Microencapsulacion

http://slidepdf.com/reader/full/sesion-10-tecnologia-enzimatica-y-microencapsulacion 1/146

SESION 10. TECNOLOGIAENZIMATICA Y

MICROENCAPSULACION

M Sc HUBERT ARTEAGA MIÑANO

FACULTAD DE INGENIERIA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3

H U B E R T A R T E A G A M I Ñ A N O 2 0 1 3

1



CONTENIDOS

• Tecnología Enzimática de productosagroindustriales. Inmovilización. Sustratos. Ventajas.Microencapsulación

CAPACIDAD

• Analiza las ventajas de uso de tecnología enzimáticaactual para el procesado y mejora cualitativa ycuantitativa de productos agroindustriales

INDICADORDE LOGRO

• Discuten y sustentan las ventajas del empleo de latecnología enzimática en el campo agroindustrial

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


2



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


3

Una reacción química en la que, a partir de unas moléculas se obtienen unos

productos diferentes, siempre implica una redistribución de enlaces. La organizaciónde los átomos que componen los reactivos es distinta de la de los productos y en lasmoléculas, los átomos se unen entre sí mediante enlaces. Cuando, por ejemplo,representamos una reacción como A+B→ C+D, estamos indicando implícitamente unbalance de materia, es decir, que los átomos presentes en A y B se encuentrantambién en C y D, aunque, evidentemente, están distribuidos de forma diferente.



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


4



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


5

Una reacción química puede considerarse tanto desde una perspectivatermodinámica como desde un punto de vista cinético. En el primer caso, lo másinmediato es indicar el cambio de energía libre que se produce al transcurrir lareacción. Por ejemplo, si la reacción A B C D transcurre en condiciones estándar, lavariación de energía libre es ΔGº .Evidentemente, el valor de esta magnitud no representa la variación real de energíalibre, ya que raras veces se dará la reacción en condiciones estándar, es decir, contodos los reactivos y productos a concentración 1 M. Pero sí aporta un dato valioso:un valor de ΔGº negativo, por ejemplo, indica que la reacción tiende a producirse deizquierda a derecha, aunque las condiciones actuales puedan obligar a lo contrario.



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


6

Para introducir un nuevo concepto, vale la pena citar ahora un ejemplo, del que luegose hará más uso.En las reacciones de hidrólisis ΔGº es siempre negativo: el aumento de entropía queimplica la escisión hidrolítica de un compuesto químico es responsable de ello. Losaceites comestibles, por concretar, son triésteres de glicerol con ácidos grasos, luegopara su hidrólisis ΔGº< 0. Si se mezcla el aceite (A) con agua (B), necesariamente setendrá ΔG<0. La reacción de hidrólisis, en principio, debe producirse con una granliberación de energía, pero todos tenemos experiencia de que al mezclar aceite conagua, el aceite permanece inalterado durante mucho tiempo. La razón de esta

aparente paradoja estriba en que en una reacción química, para que los reactivos seconviertan en productos es preciso pasar por un estado intermedio, el estado detransición. Como se esquematiza en la figura 2, en el estado de transición ni se hanterminado de romper los enlaces que hay en A y B, ni se han acabado de formar losque han de aparecer en C y D.El estado de transición representa, pues, una situación inestable, de modo que, para

pasar de A B a C D, es necesario comunicar a los reactivos la energía necesaria paraque alcancen el estado de transición. Esta energía se denomina energía de activación,y se representa con el símbolo ΔG‡ (Fig. 2). Es evidente que la existencia de un estadode transición implica una dificultad al progreso de la reacción y que cuanto mayor seael valor de ΔG‡, tanto más difícil será que la reacción se produzca.



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


7

La consideración de una reacción desde un punto de vista cinético es fácil si se tratade una reacción elemental.Por ejemplo, para una reacción A B, la velocidad,

será proporcional a la concentración de A, es decir:

La constante de proporcionalidad, k , recibe el nombre de constante cinética y, enprimera aproximación, mide la facilidad intrínseca con que los reactivos se

convierten en productos. Si la reacción elemental, como la de la figura 1, implica dosmoléculas, es evidente que la velocidad dependerá de la concentración de ambas demodo que .



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


8

Las consideraciones elementales anteriores, sobre cinética y termodinámica dereacciones no son independientes.

Intuitivamente se ve, por ejemplo, que debe existir una relación entre ΔG‡ y k , demodo que una energía de activación grande, al implicar un mayor obstáculo al avancede la reacción, se correlaciona con una constante cinética pequeña. Por otro lado, estambién evidente —y se puede comprobar con un rápido examen de la figura 2 — que el valor de la energía de activación no tiene ningún efecto sobre el balanceenergético de la reacción. Independientemente de cuál sea la magnitud de ΔG‡, ΔGº

permanece invariable. En el transcurso de la reacción, la energía de activación quehay que comunicar a los reactivos para que alcancen el estado de transición, esdevuelta al pasar desde éste a los productos.



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


9

Un ejemplo concreto puede ayudar a fijar mejor las ideas que se acaban de exponery, al propio tiempo, a introducir el concepto de catálisis. Por seguir con la línea arribaapuntada, el ejemplo será la hidrólisis de un éster. En este caso, A y B son el éster y elagua, mientras que C y D representan al ácido y al alcohol resultantes. En la figura 3b,el átomo de oxígeno del agua se ha coloreado, para expresar gráficamente cómo esteátomo acaba incorporado al ácido. En el estado de transición, que aparece en laparte central de la figura, el desplazamiento parcial de los electrones p del enlaceC=O hacia el oxígeno hace posible que un par de electrones libres del agua realice un

ataque nucleofílico al carbono del éster. Como consecuencia, aparece un enlaceparcial entre el átomo de carbono, que pasa a ser tetraédrico, y el oxígeno del agua.Pero éste queda con una carga parcial positiva y esta es la causa principal de lainestabilidad del estado de transición, ya que el oxígeno es un elementoelectronegativo. De hecho, esta inestabilidad puede implicar una energía deactivación tan elevada que en muchos casos —como el del aceite antes

mencionado — la reacción de hidrólisis de ésteres, pese a ser exergónica, no seproduce al mezclarlos con agua.



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


10



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


11

No obstante, la Química Orgánica enseña que en presencia de sosa concentrada síse produce la hidrólisis de los ésteres. Desde tiempo inmemorial se ha empleadoeste procedimiento para fabricar jabones sólidos —sales sódicas de los ácidosgrasos— a partir de grasas y aceites. Este proceso precisamente ha dado elnombre, saponificación, a la reacción de hidrólisis de ésteres en presencia de unabase fuerte como la sosa. ¿Cuál es el motivo por el que una base facilita la reacciónde hidrólisis? En la figura 3c la base se ha representado como :X-; hay que advertirque lo esencial de una base es que posea un par de electrones libres capaces decaptar un protón. Que posea —como en el caso del ion hidroxilo, OH-— carganegativa o no la posea es irrelevante. Pues bien, la base puede ceder parcialmente

sus electrones libres a la molécula de agua reactiva, de modo que compense lacarga negativa que poseería de otro modo el oxígeno en el estado de transición. Enconsecuencia, la inestabilidad del estado de transición —y, con ella, la energía deactivación— disminuye. Por lo que se ha comentado antes, la reacción se aceleraen presencia de la base.Pero el examen de la figura 3c permite añadir otro detalle: al término de la

reacción, los productos formados son los mismos que si la base no hubiera estadopresente y, lo que es más importante, la base se recupera en el mismo estadoinicial. De este modo, la base acelera la reacción sin consumirse en ella. Este es elrasgo fundamental de un catalizador químico: facilitar cinéticamente las reaccionessin gastarse.



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


12



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


13

Una única molécula de catalizador puede participar así en la transformación de unnúmero muy elevado —en teoría, indefinido — de moléculas de reactivos. En lafigura 4 se puede observar cómo un catalizador, aunque estabiliza el estado detransición y rebaja, por tanto, la energía de activación, no altera el balancetermodinámico de la reacción. El valor de ∆Gº no se afecta y, como ,el estado final de la reacción, el estado de equilibrio termodinámico, no se afectapor la presencia de un catalizador; simplemente, se alcanza más rápidamente.Una consideración más a propósito del mecanismo descrito en la figura 3c. No hayque olvidar que la reacción transcurre en disolución, y que las moléculas, por tanto,poseen libertad de movimiento. Teniendo presente esta circunstancia, es razonable

pensar que la estabilización del estado estacionario es un suceso sumamenteimprobable. En efecto, exige la concurrencia de tres moléculas, la del éster, la deagua y la base con una disposición espacial concreta. No basta que la molécula deagua se acerque a la del éster; es preciso que lo haga de modo que uno de los paresde electrones libres del oxígeno quede orientado hacia el carbono para poderrealizar el ataque nucleofílico. Y la base debe acercarse a la molécula de agua de

forma que sus electrones libres queden en proximidad de uno de los átomos dehidrógeno del agua. Por este motivo, en las reacciones de saponificación se empleasosa muy concentrada: la abundancia de iones OH- aumenta la probabilidad de laformación de este complejo.



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


15

Las enzimas, son los catalizadores que emplean los organismos vivos. En primer lugar,llama la atención que las enzimas son catalizadores mucho más eficaces que cualquiercatalizador químico. Una experiencia común permite apoyar este aserto. Se acaba dehablar de la saponificación de los ésteres.

Pues bien, para completar la reacción de hidrólisis de una grasa en presencia de NaOHconcentrada (p. ej., 1M) hacen falta unas 3 h a 100°C aproximadamente. Sin embargo,la digestión de las grasas en el organismo, que implica su hidrólisis, se completa enmucho menos tiempo y a 37º C, gracias a la actuación de unas enzimas, las lipasas. Y,como se ve en la tabla I, hay otras enzimas capaces de acelerar las reacciones por unfactor cercano a 10 18 . Esto es algo absolutamente impensable para un catalizador

químico, cuya eficacia no pasa de 106 o 10

7 veces. Además, las enzimas poseen otrapropiedad de la que carecen los catalizadores químicos: la especificidad. La catálisis

que ejerce la sosa, puede emplearse para la hidrólisis de cualquier éster, pero tambiénpara la hidrólisis de amidas, de anhídridos, etc. e incluso para otras reacciones nohidrolíticas. Sin embargo, una hidrolasa —una enzima que cataliza reacciones dehidrólisis— no es capaz de catalizar otro tipo de reacciones. Más aún, las enzimas no

sólo poseen especificidad de reacción, sino también de sustrato. Una lipasa nohidroliza —al menos, no lo hace con eficacia— un éster distinto de un triacilglicerol, niuna amida, etc. Y la asparaginasa, enzima que hidroliza el enlace amida de laasparagina, no cataliza apenas la hidrólisis de la glutamina, que sólo difiere de laasparagina en poseer un átomo de carbono más.



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


16

¿Cuáles son las bases moleculares de una acción tan eficaz y específica? La clavepara contestar esta pregunta la dio el trabajo de Leonor Michaelis (1875-1949) yMaud Menten (1879-1960). El primero era un joven profesor de la Universidad deBerlín; la segunda, una, aún más joven, doctora de origen canadiense.

Sus nombres han pasado a la historia de la Bioquímica, hasta el punto que se puededecir que la Enzimología comienza realmente con ellos.Michaelis y Menten se interesaron por la reacción catalizada por la invertasa, unaenzima que cataliza la hidrólisis de la sacarosa para producir glucosa y fructosa,reacción que se podría abreviar como:

donde E representa a la enzima y P a los productos de la reacción. Como ésta esirreversible, a simple vista, la velocidad de la reacción vendría dada por v k[ S], en laque k sería la constante cinética. Esta ecuación implicaría que, al representar v enfunción de [S], se debería obtener una línea recta, que pasaría por el origen y cuyapendiente sería k. No obstante, la representación era muy diferente. Como ya habíaobservado Victor Henri en 1903 (1), se obtenía una curva de pendientecontinuamente decreciente, que tendía asintóticamente a un valor de velocidadque no se podía superar por mucho que se elevara la concentración del sustrato.Pero Henri no acertó a comprender la razón de este resultado que, por el contrario,

fue el punto de partida del modelo de Michaelis y Menten.



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


17

Supusieron estos autores que, para que el sustrato se convirtiera en producto, unrequisito esencial era que se uniera previamente a la enzima, formando uncomplejo. La propuesta de Michaelis y Menten se esquematiza pues:

Efectivamente, si el sustrato debe formar un complejo con la enzima —lo que,posteriormente, se ha llamado el complejo de Michaelis — , la velocidad de lareacción, es decir, la velocidad de aparición del producto, vendrá dada por v k2[ ES].Y es evidente que la concentración de complejo ES no puede superar el valor de laconcentración total de enzima, lo que justifica que la velocidad tiendaasintóticamente a un valor máximo al aumentar la concentración de sustrato.



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


18



La enzima disminuye la energía

de activación

Tiempo de la reacción

E + S

E + P

Sin enzimaCon enzima

• La Ea de la hidrólisis de la ureabaja de 30 a 11 kcal/mol con laacción de las enzimas,acelerando la reacción 10 14 x

• El aumento de temperatura necesario para producir lareacción no catalizada seria de529ºC

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


20



Enzima - Catalizador• Tanto la enzima como el catalizador aceleran la

velocidad de una reacción química.

• Una enzima puede transformar 1000 moléculas de

sustrato/ segundo• Las enzimas tienen 3 propiedades que los

catalizadores NO tienen• Especificidad por el sustrato

• Se inactivan por desnaturación• Pueden ser reguladas

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


21



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


22



Las enzimas cumplen su papel catalítico gracias a:• Fijación estereoquímicamente complementaria

del substrato• Transformación catalítica del mismo

En ambas funciones participan:

• Cadenas laterales de los aminoácidos• Grupos o moléculas no proteicas:

Grupos prostéticosIones metálicosCofactores

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


24



Los siguientes hechos:• Especificidad de la reacción enzimática

• Carácter heterogéneo de la catálisis enzimática

Nos llevan a postular la existencia de un Centro Activo en la

molécula de enzima, capaz de:

• Fijar específicamente al substrato• Transformarlo catalíticamente.

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


25



Enzima

Sitio activo

Sustrato 2 8

/ 1 0 / 2 0 1 3


26



• Complementariedad geométrica

• Complementariedad de cargas, uniones iónicas

• Modelos:

Encaje inducido

Llave – cerradura.

Estado de transición

La unión del sustrato es muy

específica 2 8

/ 1 0 / 2 0 1 3


27



Teorías de la acción enzimática, 1Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)

Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica,

de la misma manera que una llave se ajusta a sucerradura.

Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy seconsidera insuficiente al no explicar algunos fenómenosde la inhibición enzimática

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


28



Teorías de la acción enzimática, 2Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)

Tanto la enzima como el substrato sufren una alteraciónen su estructura por el hecho físico de la unión.

Está mucho más de acuerdo con todos los datosexperimentales conocidos hasta el momento.

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


29



Teorías de la acción enzimática, 3

La teoría del Ajuste Inducido se amplía en la actualidaddefiniendo la acción enzimática como

Estabilización del Estado de Transición

Según lo cual, el Centro Activo enzimático es en realidadcomplementario no al substrato o al producto, sino alestado de transición entre ambos.

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


30



Una enzima puede unir dos sustratos en su sitio activo

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


31



Clasificación y nomenclatura de enzimas

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


32



EC 2.7.1.1

Número Enzyme Commission :

EnzymeComission

Grupo Subgrupo

Nombre común (sustrato+”asa”):

Hexokinasa

Clasificación y nomenclatura

ATP: hexosa fosfotransferasa

Nombre sistemático:

Donador Aceptor

Grupo transferido

Tipo de reacción catalizada

Gruposquímicos

Enzimas

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


33



EC 1.x OxidorreductasasEC 2.x TransferasasEC 3.x Hidrolasas

EC 4.x LiasasEC 5.x IsomerasasEC 6.x Ligasas

Clasificación de enzimas por Grupos


2 8 / 1 0 / 2 0 1 3

H U B E R

T A R T E A G A M I Ñ A N O 2 0 1 3

34



Grupo 1: OxidorreductasasCatalizan reacciones deoxidorreducción , en que átomos deoxigeno ó hidrogeno son trasladados entre moléculas:

En las reacciones redox, siempre tienen que estar presentes ala vez el aceptor y el dador electrónico.

AH2 + B A + BH2


Ared + Box Aox + Bred 2 8

/ 1 0 / 2 0 1 3

H U B E R


35



Nombre : Dador:Aceptor oxidorreductasa

Nombre común:Glucosa oxidasa

b-D-Glucosa : O2 1-oxidorreductasa

Dador Aceptor

EC 1.1.3.4


Grupo 1: Oxidorreductasas

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3

H U B E R


36



Nomenclatura del subgrupo en oxidorreductasas:EC 1.1.x - Deshidrogenasas

EC 1.2.x - OxidasasEC 1.3.x - PeroxidasasEC 1.4.x - OxigenasasEC 1.5.x - Hidroxilasas

EC 1.6.x - Reductasasetc.


Grupo 1: Oxidorreductasas

Aplicaciones: Ensayos de diagnostico clínico (glucosa oxidasa y colesterol oxidasa

Deslignificación ó Bioblanqueamiento

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3

H U B E R


37



A-X + B A + B-X

Grupo 2: TransferasasCatalizan reacciones de transferencia de átomos ógrupo de átomos entre moléculas:

Dador: Aceptor Grupo transferido - transferasa

ATP: D-Hexosa FosfotransferasaEC 2.7.1.1 Nombre común: hexokinasa


2 8 / 1 0 / 2 0 1 3

H U B E R


38



Clasificación de subgrupo de las transferasas:EC 2.1.x - Grupos monocarbonados

EC 2.2.x - Grupos aldehido o cetoEC 2.3.x - AciltransferasasEC 2.4.x - GlicosiltransferasasEC 2.5.x - Alquil- o AriltransferasasEC 2.6.x - Grupos nitrogenadosEC 2.7.x - Grupos fosfatoEC 2.8.x - Grupos sulfatoEC 2.9.x - Grupos selenio


Grupo 2: Transferasas

Aplicaciones: Síntesis de oligosacáridos

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


39



Grupo 3: HidrolasasCatalizan reacciones de hidrólisis y también su reverso. Sonlas más comunes en el dominio de la tecnología enzimática:

A-B + H2O A-OH + H-B

No se suelen utilizar nombres sistemáticos en las

hidrolasas. Muchas de ellas conservan el nombrePrimitivo. Ejemplo: Quimosina EC 3.4.23.4.


2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


40



Clasificación de las hidrolasas:3.1.-.- Esterasas (carboxilesterasas, fosfoesterasas, sulfoesterasas)3.2.-.- Glicosidasas3.3.-.- Éter hidrolasas3.4.-.- Péptido hidrolasas3.5.-.- Acil anhídrido hidrolasasetc.

Grupo 3: Hidrolasas


Aplicaciones: Lipasas → Síntesis de tensioactivos Proteasas → Fabrico de quesos

Glicosidasas → Clarificación de jugos; liberación de aromas en losvinos; aplicaciones textiles

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


41



Caso particular Péptido hidrolasas: clasificación común (nosistemática)

I. Según la situación del enlace atacado:- Exopeptidasas (extremos de la cadena) (Peptidasas)- Endopeptidasas (interior de la cadena) (Proteinasas)

II. Según el mecanismo catalítico:

- Serin proteinasas- Tiol proteinasas- Aspartil proteinasas- Metaloproteinasas

Grupo 3: HidrolasasClasificación y nomenclatura

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3

H U B E R T A R T E A G A M I Ñ A N O 2 0 1

3

42



Grupo 4: LiasasCatalizan reacciones reversibles de remoción de grupo deátomos del sustrato (este grupo no incluye las hidrolasas):

A-B A + B


Ejemplo Nombre sistemático:

Histidina amonio-liasa (EC 4.3.1.3)

Nombre común:Histidasa

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


43



Clasificación de las liasas:

4.1.x - Actúan sobre enlaces C-C4.2.x - Actúan sobre enlaces C-O4.3.x - Actúan sobre enlaces C-N4.4.x - Actúan sobre enlaces C-S4.5.x - Actúan sobre enlaces C-Haluro (S-, Cl-, Br -, I- At-)

4.6.x - Actúan sobre enlaces P-O4.99.x - Otras liases


Aplicaciones: Pectato liasa – Remueve los compuestos indeseables (ceras,pectinas, proteínas) en fibras en la industria textil – “bioscouring ”

Grupo 4: Liasas

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


44



Grupo 5: IsomerasasCatalizan reacciones de isomerización moleculares


A BEjemplo:Glucosa isomerasa (EC 5.3.1.5)

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


45



5.1.x - Rasemasas y Epimerasas5.2.x - cis-Trans-Isomerasas5.3.x - Oxidoreductasas Intramolecular5.4.x - Transferasas Intramoleculares (mutases)

5.5.x - Liasas Intramoleculares 5.99.x - Otras Isomerasas

Grupo 5: Isomerasas


Clasificación de las isomerasas: 2 8

/ 1 0 / 2 0 1 3


46



Grupo 6: LigasasCatalizan la unión de dos grupos químicos a expensasde la hidrólisis de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.).

A + B + ATP A-B + ADP + Pi


Ejemplo: Glutationa sintasa (EC 6.2.2.3)

Nombre sistémico:G-L-glutamilo-L-cisteina:glicina ligase

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


47



Grupo 6: Ligasas


Clasificación de las ligasas:

6.1.x - Forman enlaces C-O6.2.x - Forman enlaces C-S6.3.x - Forman enlaces C-N6.4.x - Forman enlaces C-C6.5.x - Forman enlaces ésteres fosfóricos 6.6.x - Actúan sobre enlaces N-metal

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


48



Cinética Enzimática

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


49



Cinética Enzimática

La cinética enzimática es el análisis cuantitativo delefecto de cada uno de los factores que intervienen en laactividad enzimática , que se evalúa a través de lavelocidad de la reacción catalizada .

Las variables más importantes son:• Concentración de enzima, sustratos y

productos (incluyendo inhibidores y/oactivadores)

• pH

• Temperatura

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


50



Ella está basada en la medición de la velocidad de reacción. Así en lareacción:

Se tendrá:

Como se observa en la figura, la velocidad de reacción (pendiente)disminuye continuamente a partir de un valor máximo inicial. Esto se puededeber a:

Desaturación de la enzima con sustrato, por disminución de la

concentración del sustratoInactivación de la enzima por su inherente inestabilidad

Inhibición por el producto

Desplazamiento del equilibrio, si la reacción es reversible

dt

ds

dt

dpv

ES P

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


51



dt

t

s

p[ ]

Concepto de velocidad inicial

d[P]v = , t 0

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


54



E + S ES E + Pk +1 k -1

k +2

Una cinética hiperbólica implica un procesosaturante :

Hay un número limitado de sitios en la enzimapara fijar substrato; una vez que están ocupadostodos, por mucho que aumente la concentración

de substrato, la velocidad permanecerá constantetendiendo a un valor asintótico

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


55



El sistema de ecuaciones diferenciales que describe la dinámicdel sistema

E + S ES E + Pk +1

k -1

k +2

SistemaNo admite solución analítica.

- Simulaciones numéricas

- Hipótesis que lo simplifiquen

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


56



Hipótesis de Michaelis - Menten

E + S ES E + Pk

+1

k -1 k +2

- La primera parte del mecanismo,

E + S ESk +1

k -1 Tiene lugar mucho más rápidamente que la segunda:

ES E + Pk +2

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


57



K

E S

E S

e s

x

e x s

xm 0

xe s

K sm

0

vk e s

K sm

2 0

k e V 2 0 m ax

vV s

K sm

m a x

Hipótesis deMichaelis-Menten

Equilibrio rápido

v k x 2

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


58



A partir de las suposiciones de Michaelis-Menten yEstado estacionario, llegamos a la ecuación

K m + sv =

Vmax * s

La única diferencia radica en el significado de K m:

K m = k -1/k +1 en mecanismo de M.M.

K m = (k -1 + k +2)/k +1 en mecanismo de E.E.

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


61



Significado de la constante K m 1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES

(en condiciones de equilibrio rápido)

2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato(en condiciones de equilibrio rápido)

3. Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido)

4. Concentración de substrato para la que la velocidad se haceigual a la mitad de la máxima (s 0.5)

5. Se define para una pareja enzima-substrato

6. Se mide en unidades de concentración

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


62



Significado de la constante Vmax = k +2 e0

1. Velocidad asintótica para s

2. Directamente proporcional a la concentración deenzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzimapor k +2)

3. Mide función de transformación catalítica

4. Se expresa en unidades de velocidad

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


63



Relación entre Km y VmaxMichaelis y Menten

Concentración de Sustrato [S]

V e

l o c

i d a d

d e

l a r e a c c

i ó n

( v )

Km

Vmax

Vmax/2

La Km es la concentración de sustratodonde se obtiene la mitad de la Vmax

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


64

V



Concentración de Sustrato [S]

V e l o c

i d a

d d e

l a r e a c c

i ó n

( v )

Km

Vmax

Vmax/2

A mayor Km , menor es la afinidad de la enzima por elsustrato

A menor Km mayor es la afinidad de la enzima por elsustrato

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


65



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


66



R e p r e s e n t a c i ó n d i r e c t a

s

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

v

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

K m

Vmax

vV s

K s

m x

m

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


67



Representación de Eadie-Hofstee



v /s0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6

v

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

v K v

sV m m x

Vmax Representación de Eadie Hofstee

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


70



Métodos de linealización para determinación parámetroscinéticos

Método Eje Y Eje X InterceptoEje Y

InterceptoEje x

Pendiente

Lineweaver-Burke

1/v 1/s 1/V -1/K K/V

Hanes s/v s K/V -K 1/V

Eadie-Hofstee

v v/s V V/K -K

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


71

Definición Actividad



Definición ActividadEnzimática• Es el número de moles de sustrato que reaccionan

para formar producto, por mol de enzima y porunidad de tiempo. Esto supone que la enzima estáplenamente saturada con sustrato y por tanto quela reacción se efectúa con su máxima rapidez

• El índice de recambio muestra la eficienciaimpresionante de la catálisis enzimática

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


72



A fin de normalizar la medición de la actividad, se ocupa el valorde la velocidad inicial de reacción, donde eses factores sondespreciables. Así,

Esta velocidad inicial no se espera que sea observada en unproceso enzimático donde, debido a los elevados tiempos de

operación, es razonable suponer que esos factores ejercerán suinfluencia.

00

0

t t

t

dt

ds

dt

dpva

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


73



Número o Índice de



Número o Índice deRecambio• Es útil definir una constante de velocidad más

general, k cat , para describir la velocidad limitantede cualquier reacción enzimática a saturación

• kcat

x Et= V

máx

• V0 = kcat x Et x [S] / KM + [S];• Kcat es una constante de velocidad de 1 er orden con

unidades de tiempo -1, también llamada Número

de Recambio

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


75



1. Sobre la fijación del substrato al centro activo:- Grupos disociables de la enzima- Grupos disociables del substrato

2. Sobre la transformación catalítica del substrato

3. Sobre la estructura de la proteína enzimática

Efecto del pH

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


77



En el efecto de la temperatura hay dos componentes:

1. Aceleración de la reacción según la ecuaciónde Arrhenius

k = A exp (-Ea/RT)

2. Desnaturalización térmica de la proteína

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


78



Efecto de la temperatura en la ENZIMA

Cada enzima tiene una temperatura óptima.

Temperatura

15º 40º 75º

Aumento de lavelocidad

Desnaturaciónpor calor

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3

H U B E R T A R T E A G A M I Ñ A N O 2 0

1 3

79

O GA S OS Ó OS



ORGANISMOS TERMÓFILOS• Son organismos que viven a altas tº y realizan sus

reacciones enzimáticas a estas altas tº• Ejemplos son los que viven en las aguas termales

• Es tema de investigación el aislamiento de lasenzimas de estos organismos para desarrollarprocesos industriales en condiciones más extremas

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3

H U B E R T A R T E A G A M I Ñ A N O 2 0

1 3

80

C i



Coenzimas• Las coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas, que se unen

a la enzima.• Las coenzimas colaboran en la reacción enzimática recibiendo

transitoriamente algún grupo químico: H + , OH, CH3 .• La enzima sin la coenzima recibe el nombre de APOENZIMA

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


81

El NAD i d H



El NAD es una coenzima aceptora de H

Sustratooxidado

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


82

Al i i l j



Algunas enzimas requieren metales para mejorar suactividad

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


83



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


84

I i I i



Isoenzimas o Isozimas • Son formas moleculares diferentes de una misma

enzima• Catalizan la misma reacción• Ejemplo: Lactato deshidrogenasa• Lactato + NAD ==== Piruvato + NADH• M4, M3H1, M2H2, M1H3 y H4 • Se diferencian por su movilidad electroforética• Usadas en clínica: sueros normales y sueros con

alguna patología

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


85



Así esta actividad corresponde al máximo potencialcatalítico que las enzimas poseen para undeterminado conjunto de condiciones ambientales.Luego, estas deben ser consideradas en lasexpresiones matemáticas representativas del procesoenzimático.

Existen situaciones (sustratos heterogéneos) dondela velocidad inicial de reacción no es representativadel real potencial catalítico de la enzima.

Se asume que la velocidad inicial de reacción esproporcional a la concentración de proteínaenzimática.

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


86



Inhibición enzimática

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


87

Inhibidor:



Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de

interacciones con el centro activo u otros centros específicos(alostéricos).

Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan ala enzima a través de desnaturalización de la moléculaenzimática

De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:

I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo

II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de lamolécula, causando un cambio conformacional con

repercusión negativa en la actividad enzimática.

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


88



Inhibición enzimática isostérica

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


89

L i hibid i é i d d d i



Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidorreversible : establece un equilibrio con la enzimalibre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:

E + I EI

2. Inhibidorirreversible : modifica químicamente a la enzima:

E + I E’

ES + I ESI

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


90

Inhibición reversible



Inhibición reversible

(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,impidiendo la fijación del substrato:InhibiciónCompetitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de quelohaga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide lafijación del substrato a la enzima, pero sí impide la accióncatalítica:Inhibición No Competitiva

(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato

una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo

se conoce comoInhibición Anticompetitiva

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


91



Inhibición Competitiva

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


92

I hibid C titi



Inhibidores Competitivos • Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima• Se une solo a la enzima libre• Vmáx no se altera y KM cambia

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


93

Inhibición competiti a



Inhibición competitiva

Al aumentar la

cantidad deSUSTRATO elinhibidorcompetitivo esdesplazado y seforma producto

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


94



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


95

S



E ES

EI

IE + P

Características:- Las fijaciones de substrato e inhibidor sonmutuamenteexclusivas - A muy altas concentraciones de substrato desaparece lainhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es unanálogoquímico del

substrato .- El inhibidor es tanespecífico como el substrato

Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor:

K i =[E] [I]

[EI] 2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


96

En condiciones de equilibrio rápido llamandoy a la



En condiciones de equilibrio rápido, llamandoy a laconcentración del complejo EI, para la inhibición competitivaobtenemos el sistema de ecuaciones

vV s

K i

K s

m x

m

i

1

K e x y s

x

K e x y i

y

m

i

( )

( )

0

0

Que resuelto para x nos da

xe s

K i

K sm

i

0

1

De donde 2 8

/ 1 0 / 2 0 1 3


97



Por tanto, en la inhibición competitiva,

1. El efecto cinético del inhibidor es elaumento aparente dela

K m, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/K i)

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muyaltas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de

inhibidor

3. Cuanto más pequeño sea el valor de K i mayor será la potencia del inhibidor competitivo.

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


98



KmSininhibidor

Kmcon

inhibidor

Sin inhibidor

Con inhibidor

El inhibidor competitivoaumenta la Km

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


99



Ejemplo Inhibidor Competitivo



Ejemplo Inhibidor Competitivo • Ácido succínico + FAD == ácido fumárico + FADH2 • El inhibidor competitivo es elácido malónico• Es un análogo estructuralmente parecido al ácido succínico

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


101

Ácido Fólico y Sulfanilamida



Ácido Fólico y Sulfanilamida • La sulfanilamida es un análogo estructural delácido p - aminobenzoico (PABA)• PABA es el punto de partida para la síntesis de

ácido fólico en las bacterias• El ácido fólico es una vitamina esencial para la

proliferación (división) bacteriana• Sulfanilamida se usa en el tratamiento algunas

infecciones

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


102

Metotrexato y Dihidrofolato



Metotrexato y Dihidrofolato • El ácido fólico en sus formas de dihidro ytetrahidrofolato es coenzima de la reacción

catalizada por la dihidrofolato reductasa• Esta reacción es parte del metabolismo de los

nucleótidos para la síntesis de DNA• Metotrexato se usa en la terapia de algunos

cánceres, inhibiendo la síntesis de DNA

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


103

Inhibidor competitivo



Inhibidor competitivosu estructura es similar a la del sustrato

No se formaproducto

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


104



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


105



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


106



Inhibición No Competitiva

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


107

Inhibidor No Competitivo



Inhibidor No Competitivo • Se une a un lugar diferente del sitio activo la enzima• Se une a la enzima libre y también al complejo enzima-

sustrato• Por acción del inhibidor disminuye la Vm pero el valor de Km no

se altera

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


108

Inhibición NO competitiva



Inhibición NO competitiva

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


109

Inhibidor NO competitivo



Inhibidor NO competitivo

El inhibidor NO competitivo se une a la enzima en unsitio diferente del sitio activo

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


110



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3

H U B

E R T A R T E A G A M I Ñ A N O 2 0 1 3

111



E ES

EI

I

SE + P

I

ESIS Inhibición

No Competitiva

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3

H U B


112



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3

H U B


113



Inhibición Anticompetitiva o Incompetitiva

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3

H U B


114

Inhibidor Incompetitivo



Inhibidor IncompetitivoEn este tipo de inhibición el inhibidor se enlaza al centro activopero solo después de que el sustrato lo haya hecho y, por tanto,inhibidor y sustrato no compiten. De esta manera, aunque todoel sustrato esté saturando la enzima y toda la enzima esté comocomplejo ES, el inhibidor puede enlazarse produciendo uncomplejo inactivo ESI.

Como I solo se une a ES estimula la formación de ES y, por tanto,incrementa la unión del sustrato a la enzima, disminuyendo Km .Sin embargo, el complejo ESI no conduce a productos y Vm

disminuye.

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


115

Inhibidor Incompetitivo



Inhibidor Incompetitivo • Se une a un lugar diferente del sitio activo de la enzima• Se une sólo al complejo enzima-sustrato• Los efectos que tiene: disminuye el valor de Km y también el

de Vmáx 2 8

/ 1 0 / 2 0 1 3


116



Determinación de parámetros cinéticos de inhibición



Modelo Kap Vap

Inh comp Km(1+i/Ki) Vm

Inh no comp total Km Vm/(1+i/Ki)

Inh anticomp Km/(1+i/Ki) Vm/(1+i/Ki)

p

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


118

Inhibición Irreversible



- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo

químico de la enzima, modificándola covalentemente- Su acción no se describe por una constante de equilibrio K i,sino por una constante de velocidadk i:

E + I E’ - A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de losinhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación

del inhibidor.- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamentetóxicos.

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


119

Inhibidores Irreversibles



Inhibidores Irreversibles • Producen inactivación permanente de la actividad enzimática• Se interfiere con el normal desarrollo de una reacción o vía

metabólica• Ejemplos: p-cloromercuribenzoato, yodoacetato,

diisopropilfluorfosfato 2 8

/ 1 0 / 2 0 1 3


120

Algunos tipos de inhibidores irreversibles



g p

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


121



Inhibición enzimática alosterica

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


122

Enzimas Alostéricas



Enzimas Alostéricas • Son enzimas cuya estructura proteica está formada de

varias subunidades• No se rigen por la cinética de M - M• Además del sitio o centro activo tienen sitios alostéricos o

de regulación• Sitio activo/sustratos;• Sitio alostérico/moduladores o reguladores• La relación entre la velocidad de reacción y la

concentración de sustrato sigue cinética sigmoídea

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


123

Enzimas alostéricas



• Las enzimas alostéricas presentan estructuracuaternaria.

• Tienen diferentes sitiosactivos, unen mas de unamolécula de sustrato

• La unión del sustrato escooperativa

• la curva de velocidad presentauna forma sigmoidal

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


124



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


125

Concepto de Cooperatividad



Concepto de Cooperatividad

• La unión de los sustratos al sitio activo de unasubunidad produce un cambio conformacionalque por contacto físico se transmite a lassubunidades vecinas, facilitando las interacciones

• Modelos de unión: secuencial y concertado• Ejemplos: unión Hb-O2, enzimas alostéricas y sus

sustratos

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


126

Moduladores Alostéricos



Moduladores Alostéricos • También reciben el nombre de efectores y pueden serpositivos o negativos• Se unen al sitio alostérico que puede estar en la misma

subunidad que tiene al sitio activo o en las subunidadesregulatorias

• Su unión produce un cambio conformacional que afecta alsitio activo

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


127

Aspartato Transcarbamilasa



Aspartato Transcarbamilasa • Ác L-asp + Carbamil-P === Carbamil-asp + Pi . Primera reacciónen la síntesis de pirimidinas• Efector positivo: CTP Efector negativo: ATP• Tiene dos subunidades catalíticas para los sustratos y tres

subunidades regulatorias para los efectores 2 8

/ 1 0 / 2 0 1 3


128



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


129

RESUMEN



• Las enzimas son proteínas que catalizan las reaccionesbiológicas• Presentan especificidad por su sustrato• Cada enzima presenta dos parámetros importantes Vmax

(saturación de la enzima) y la Km (medida de la afinidad por elsustrato)

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


130

RESUMEN



• La actividad enzimática puede ser inhibida, por inhibidorescompetitivos (similares al sustrato) o por inhibidores nocompetitivos.

• La temperatura y el pH afectan a la enzima en su actividadcatalítica.

• Algunas enzimas requieren de coenzimas y/o cofactores parasu actividad.

2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


131



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


132



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


133



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


134

MICROENCAPSULACION

Que es y para que microencapsular



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


135

La microencapsulación es el proceso por el cual partículas individuales o gotas

de un material activo (core) se rodean por una cubierta (shell) para producircapsulas en el rango de micras a milímetros, conocidas como microcápsulas.Cuando las partículas poseen un tamaño inferior a 1 μm, el producto resultantedel proceso de encapsulación recibe la denominación de “nanocápsulas” (VilaJato, 1997).La microcápsula más simple posee una estructura que está compuesta por dos

elementos, el material activo y una delgada pared que envuelve al primero(Figura 1).

En el caso de microencapsulado de componentes alimenticios la función delencapsulado ofrece muy diferentes posibilidades:• Proteger los componentes alimenticios como harinas vitaminas o sales del



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


136

• Proteger los componentes alimenticios como harinas, vitaminas, o sales deloxígeno, el agua y la luz.• Mejorar el manejo de líquidos para convertirlos en polvos libres para que sepuedan incorporar en otras comidas.• Aislar durante el almacenaje ciertos componentes específicos de alimentos deotros componentes reactivos.

Caracterización de las microcapsulasLas microcapsulas deben ser caracterizadas y controladas de acuerdo con unos



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


137

p yensayos que aseguren su calidad y homogeneidad, así como su comportamientoen la liberación del material activo.Ensayos característicos que se suelen realizar a las microcapsulas son:a) Características morfológicas, tamaño de partícula, estructura interna,densidad.b) Rendimiento de producción.c) Eficacia de la encapsulación y contenido en material activo.d) Estudio de liberación del material activo.e) Estado físico e interacciones polímero-material activo.

Procesos para preparar microcápsulas.Como visión general de la microencapsulación, decir que existen algunos tiposde procesos que están basados exclusivamente en fenómenos físicos otros usan



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


138

de procesos que están basados exclusivamente en fenómenos físicos, otros usanreacciones químicas de polimerización para producir la pared de la cápsula, yotros combinan los métodos físicos y químicos. Como existen muchos tipos demicroencapsulación se van a clasificar de acuerdo con la bibliografía consultadaen dos grupos (Vilstrup, 2004):- Procesos de microencapsulación de Tipo A, basados en procesos químicos:Entre los procesos de microencapsulación de tipo A se encuentra: coacervacióncompleja, polímero-polímero incompatible, y proceso de inyección sumergido- Procesos de microencapsulación de Tipo B, basado en procesos físicos. Secadopor atomización (spray drying), enfriamiento tras atomización (spray chilling),recubrimiento en lecho fluidizado, disco giratorio con orificios múltiples.



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


139

Las principales ventajas del secado por atomización son:

1. Control de los parámetros de calidad del producto así como especificaciones



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


140

concretas.2. Los alimentos sensibles al calor, los productos biológicos, y los productos

farmacéuticos se pueden secar a presión atmosférica y a bajas temperaturas. Aveces, se emplea la atmósfera inerte.3. El secado por atomización permite la producción de grandes cantidades en laoperación continua y con un equipo relativamente simple.4. El producto entra en contacto con las superficies del equipo en condicionesanhidras, simplificando así los problemas de la corrosión y de selección de

materiales costoso en la construcción del equipo.5. Produce partículas relativamente uniformes, esféricas y con casi la mismaproporción de compuestos que en la alimentación líquida.6. Puesto que la temperatura de funcionamiento del gas puede extenderse de 150 a600 ºC, la eficacia es comparable a la de otros tipos de secadores directos.

Las desventajas del secado por atomización son:



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


141

1. Falla si se requiere un producto a granel de alta densidad.2. En general no es flexible. Una unidad diseñada para la atomización finapuede no poder producir un producto grueso, y viceversa3. Para una capacidad dada, se necesita generalmente una evaporaciónmayor que con otros tipos de secadores.4. Hay una alta inversión inicial comparada a otros tipos de secadorescontinuos.



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


142



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


143



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


144



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


145



2 8 / 1 0 / 2 0 1 3


Sesion 10. Tecnologia Enzimatica y Microencapsulacion

Documents

Transcript of Sesion 10. Tecnologia Enzimatica y Microencapsulacion