"Pruebas de laboratorio para el diagnstico de Sfilis"Bioq. Mnica DazCentro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisin SexualDepartamento de BacteriologaInstituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS Dr Carlos G. Malbrn

Pruebas de deteccin de T. pallidum

SerologaDiagnstico de sfilis en el laboratorioCultivo: T. pallidum no es cultivable in vitro

Microscopa de Campo Oscuro (CO)

Prueba Directa con Anticuerpos Fluorescentes (DFA-TP)Amplificacin de DNA (PCR)

Prueba de Infectividad en conejo (RIT)Gold standard para evaluacin de pruebas, por ser altamente especfica y la ms sensible para diagnstico de sfilis.Compleja, cara y lenta (h/ 90 das para resultados)Pruebas para la deteccin de T.pallidum

Microscopa de Campo Oscuro (CO) De eleccin cuando el paciente tiene lesiones hmedas y cuando las muestras pueden ser examinadas inmediatamente para visualizar organismos mviles.

Diagnstico de sfilis 1, 2, congnita temprana, recada de estado 2.

No usar sobre lesiones de boca (x treponemas no patgenos)

Pruebas para la deteccin de T.pallidum

Colocar condensador de CO

Colocar una gota de aceite s/ condensador

Levantarlo y contactarlo con el portaobjeto de control (raspado gingival)ObjetivoX10Cerrar diafragma (centralizar) Abrir y enfocar ObjetivoX40Buscar espiroquetas del control Tomar la muestra. Colocar el porta con la muestraObjetivoX100 de inmersinColocar una gota s/cubre objeto Ajutar el iris del diafragma del obj.Pruebas para la deteccin de T.pallidumMicroscopa de Campo Oscuro (CO)

Lesiones Hmedas : Genitales externos Mucosas Anal/Cervical / vaginal/ Condilomas Lata Lesiones secas: Papulaescamosas

Fluido seroso sin eritrocitosNdulos linfticosAspirado del fludo T. pallidumEspiroqueta, inderformableLong.6-20m : 0,15 mTranslacin en linea recta suaveRotacin en su lugarFlexin suave Si el primer portobjeto en negativo, insistir con otras dos muestras Pruebas para la deteccin de T.pallidumMicroscopa de Campo Oscuro (CO)

Interpretacin

La demostracin de treponemas con morfologa y motilidad caractersticas del T. pallidum constituye un diagnstico positivo de sfilis en cualquiera de sus fases, independientemente del resultado de la reaccin serolgica.La imposibilidad de encontrar el organismo no excluye un diagnstico de sfilis. Microscopa de Campo OscuroPruebas para la deteccin de T.pallidum

Alternativa cuando los extendidos no pueden ser examinados Inmediatamente

nica prueba estandar para bsqueda de Tp en lesiones de la cavidad bucal Prueba Directa con Anticuerpos Fluorescentes (DFA-TP)

Reactivo: Ig anti T. pallidum subspecies pallidum conjugado con FITC absorbidas con Treponemas cepa ReiterPruebas para la deteccin de T.pallidum

Amplificacin de DNA (PCR)

Muestras: Lesiones, sangre entera, suero, LCR, Lq. Amnitico y tejidos (Ej: placenta)Pruebas para la deteccin de T.pallidumTarget de Amplificacin

Gen Pol A ( 377pb)

Gen 47 kDa (260pb)

En las pruebas microscpicas un resultado negativo no descarta la infeccin Pruebas para la deteccin de T.pallidumSensibilidad y Especificidad

Prueba CODFA-TPPCRSensibilidad74-86%73-100%91%Especificidad85-97%89-100%99%CategoraEstandarEstandarInvestigacinCosto promedio ($)1,21545

El diagnstico serolgico de sfilis requiere dela deteccin de dos tipos diferentes de anticuerpos: No Treponmicos y TreponmicosPRUEBAS NO TREPONMICAS detectan anticuerpos, las reaginas, que se generan por los antgenos que contienen cardiolipinas liberadas de los treponemas y de las clulas daadas por la infeccin del huesped.Los anticuerpos no treponmicos son indicadores de infeccin activa y usualmente declinan con el tratamiento o con el tiempo.

PRUEBAS TREPONMICAS detectan anticuerpos dirigidos contra los componentes de T. Pallidum y permanecen de por vida en individuos tratados o sin tratamiento.

SEROLOGA

SEROLOGA: PRUEBAS NO TREPONMICASTcnica: Floculacin de liposomasAntgeno: Solucin alcohlica de cardiolipina, colesterol y lecitinaDetectan: Reaginas IgG e IgM anti material lipdico Mtodo: Cualitativo (screening) y cuantitativo (seguimiento)

Suero LCRVDRL (Venereal Disease Research Laboratory) Inactivacin de suero a 56C. Micros-cpica

Placa

Plasma SueroUSR( Unheated Serum Reagin). Sin inactivacin por Cl de colina. Estable (EDTA)RPR:(Rapid Plasma Reagin)Tarjetas con crculos de 18mmMacros-cpica

TarjetaTRUST:Toluidine Red Unheated Serum Test

Preparacin del suero: Calentar a 56 C en bao de Mara durante 30 minutos. Los sueros que se analicen despus de 4 hs del primer perodo de calentamiento, deben volver a calentarse a 56 C durante 10.

VDRL: El Antgeno se prepara en el momento de realizar la pruebaRotar las placas durante 4 minutos a 180 2 rpm sobre un rotador mecnico.

Procedimiento:En un anillo de 14 mm de la placa, depositar con pipeta 50 l de suero calentado.Aadir 1 gota de suspensin de antgeno (previamente resuspendida) sobre cada suero, con una aguja no descartable calibrada sin bisel de calibre 18 GSEROLOGA: PRUEBAS NO TREPONMICAS

Leer la reaccin al microscopio con ocular de 10X y objetivo de 10XVDRL y USRNegativoReactivo DbilReactivoSEROLOGA: PRUEBAS NO TREPONMICAS

Diagrama de placa para la reaccin cuantitativaSEROLOGA: PRUEBAS NO TREPONMICAS

Informe de resultados de la reaccin cuantitativa (CDC)VDRL y USRSEROLOGA: PRUEBAS NO TREPONMICAS

Suero no diludoDiluciones de sueroResultado1:11:21:41:81:161:32RDNNNNReactivo, no diluido, 1 dilRRDNNNReactivo, 2 dilsRRRDNNReactivo, 4 dilsDDRRDNReactivo, 8 dilsN(Rugoso)DRRRDReactivo, 16 dilsDNNNNNDbil reactivo, no diluido, 1 dils

RPR 18mm Prueba en tarjeta:USR: Antgeno listo para usarEstable (EDTA), no necesita inactivacin del suero(Cl de colina)Procedimiento similar a la VDRL

Aguja: 20GRotacin 100 2 rpm SEROLOGA: PRUEBAS NO TREPONMICAS

Toda reactiva debe ser confirmada por una prueba treponmicaPueden ser negativas en sfilis primaria y tardaFenmeno de prozona en sfilis secundaria (1/16)Falsas reactivas: Enfermedades Agudas: virus, parsitos, Enfermedades Crnicas: Colgenopatas, lepra, cancer, autoinmunesEmbarazoVejezDrogas (adictos a drogas IV)Vacunacin

SEROLOGA: PRUEBAS NO TREPONMICASInconvenientes

FALSOS POSITIVOSElevada temperatura ambiente (> 29C)Reactivo muy sensible (lecitina)VDRL: reactivo vencido (> 8 hs)Suero turbioError de lectura (microscpica)

FALSOS NEGATIVOSBaja temperatura ambiente (< 23 C)Reactivo poco sensibleVDRL: falla en preparacin de emulsin del AgDefecto en mezcla suero-Ag (rotacin manual)Lectura macroscpica en VDRL o USRSEROLOGA: PRUEBAS NO TREPONMICASCausas de Error

Costos por determinacinUSR: $ 0,05VDRL: $ 0,07RPR: $ 0,57 0,86SEROLOGA: PRUEBAS NO TREPONMICASSensibilidad y Especificidad Bulletin of the World Health Organization June 2004, 82 (6)

PruebaSensibilidad (%) por estado de sfilis no tratada (rango)Especificidad (%) No-sfilis (rango)Comple-jidadPrimarioSecundarioLatenteTerciarioVDRL78 (74-87)10096 (88-100)71 (34-94)98 (96-99)FcilRPR86 (77-99)10098 (95-100)7398 (93-99)FcilUSR80 (77-8610095 (88-100)-99Fcil

FTA-Abs Absorcin de Anticuerpos Treponmicos FluorescentesTPHA Hemaglutinacin

TPPA Aglutinacin de partculas

Utilidad: verificar una prueba reactiva no treponmica. Confirmar una sfilis latente o terciaria.ELISA IndirectoAg. Sonicado de T. pallidum(Captia Syphilis G)Western BlotIgGDe ejecucin ms fcil que la FTA-Abs y con menos variables. Sensibilidad similar, salvo para sfilis primaria. Suero y plasma

Aunque tienen alta sensibilidad, est afectada por variaciones de equipamiento, reactivos, e interpretacin. Suero y LCR471715,5Falsos positivos:Lupus Eritematoso Sistmicoy otras colagenopatas.Resolucin de casos dificultososSuero y LCRSueroSEROLOGA: PRUEBAS TREPONMICAS

REACTIVOS: Antgeno: Suspensin de TP fijado a portaobjeto.Absorbente: Extracto de TP cepa Reiter (no patgeno). Contiene Ag. treponmico de grupo.Conjugado: Globulina anti-Ig humana marcada con FITC.FTA-Abs :Absorcin de Anticuerpos Treponmicos FluorescentesProcedimiento1)Descomplementar las muestras 2)Absorber el suero con el absorbente 1/52) Incubar-Lavar3) Agregar el Conjugado4) Incubar- lavar5) Observar con microscopio de fluorescenciaTiempo de realizacin : 3hs

Precauciones para la FTA-Abs: Control de lectura de intensidad de fluorescencia 1+ , correcta dilucin del conjugado y apropiado ajuste del microscopio de fluorescencia.

SEROLOGA: PRUEBAS TREPONMICAS

Reactivos:Diluyente de muestraPartculas SensibilizadasPartculas No sensibilizadasReconstituyenteSuero control PositivoTiempo de realizacin: 2 HsSEROLOGA: PRUEBAS TREPONMICASTPPA: Aglutinacin de partculas

Ensayos rpidos treponmicosSangre entera, Suero o plasma10 a 50ul 5 a 20 minutosCosto: $ 3 7 La tecnologa de ADN recombinante permite producir antgenos para las pruebas de diagnstico. Ventajas: Independiente de animales. Mayor rendimiento.Mejor caracterizacin. Menor costoSEROLOGA: PRUEBAS TREPONMICAS

Sensibilidad y Especificidad SEROLOGA: PRUEBAS TREPONMICAS

Categora Provisoria/In-vestigacinSensibilidadEspecificidadCostoComplejidadPruebas rpidas85-97,7%92,8-98%$ 7,3FcilELISA indirecto82-98,3%70,2-99%$ 2,5ModeradoWestern blot90-100%99%-Complejo

Categora EstndarSensibilidad (%) por estado de sfilis no tratada (rango)Especificidad (%) No SfilisCostoComplejidadPrimarioSecundarioLatenteTerciarioFTA-ABS84 (70-100)1001009697 (84-100)$ 3,5ComplejoTPHA/TPPA76 (69-90)10097 (97-100)-99 (98-100)$ 3/ $ 6Moderado

Western Blot MarDx para la deteccin deAnticuerpos de T. pallidum

Pos Contrl

47 kD44.5 kD41 kD

37 kD

29 35 kD

24 kD

17 kD

15.5 kD

React

React

React

+

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React

React

React

Neg

Neg

Neg

React

Deteccin de IgM anti T. pallidumSEROLOGA: PRUEBAS TREPONMICASDiagnstico de sfilis temprana

Diferenciar una infeccin pasada de una reciente

Monitoreo de la eficacia de tratamiento

Ayuda en el diagnstico de sfilis congnita

SEROLOGA: PRUEBAS TREPONMICASDeteccin de IgM anti T. pallidumELISA de Captura IgMWestern Blot IgMVentaja: No requiere eliminar de la muestra el Factor Rematoideo (Falsos positivos) ni IgG (falsos negativos) como en la FTA- Abs 19S (IgM).Conservacin del suero: 2-8C: 4 das

SEROLOGA: PRUEBAS TREPONMICAS*Young, Sex. Transm.Inf.2000;76;403Sensibilidad y EspecificidadEn Adultos

CategoraProvisoriaSensibilidad (%) por estado de sfilis no tratada (rango)Especificidad (%) No SfilisComplejidadPrimarioSecundarioLatenteTerciario*ELISA de Captura IgM938564-97 (84-100)Moderado

En ausencia de contaminacin con sangre el VDRL tiene alta especificidad, pero es poco sensible (30 a 70%). Una VDRL reactiva es suficiente para diagnosticar neurosfilis, pero el negativo no la descarta.

FTA-abs en LCR, es muy sensible pero poco especfica. Si es negativa la neurosfilis es muy improbable, pero el resultado reactivo carece de valor, porque los anticuerpos de clase IgG responsables de la reactividad de esta prueba atraviesan la barrera hematoenceflica y adems una nfima cantidad de sangre contaminando el LCR es suficiente para dar un falso positivo.Diagnstico de Neurosfilis