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“SILENCIAMIENTO DE POSIBLES GENES ANTIVIRALES EN Litopenaeus vannamei Y SU EFECTO EN LA
SUSCEPTIBILIDAD AL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV)”
TESIS DE GRADO
Elaborado por: Mirabá Guerrero Mariuxi Morán Castillo Aida
ESCUELA SUPERIOR DEL LITORALFACULTAD DE INGENIERÍA MARÍTIMA
Y CIENCIAS DEL MAR
La charla de hoy
I. Introducción:• Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV)• ARN de interferencia (ARNi) • Efectos de inyectar dsRNA en camarón L. vannamei
II. Métodos
III.Resultados:• Bioinformática• Fenotipos encontrados
IV. Conclusiones
• Identificar, de entre 54 genes candidatos, genes potencialmente involucrados en la respuesta antiviral de L. vannamei usando la técnica de silenciamiento genético (RNAi, siglas en inglés) mediante la inyección de ARN bicatenario (dsRNA, siglas en inglés).
• Determinar las posibles proteínas codificadas por cada uno de los genes evaluados mediante análisis bioinformático de la base de datos genéticos (NCBI, National Center for Biotechnology Information).
Objetivos
Introducción La industria camaronera representa una de las actividades
comerciales de mayor importancia para la economía del Ecuador.
El Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) ha causado en el país grandes mortalidades en cultivos de camarón L. vannamei ocasionando pérdidas económicas sustanciales.
Exportaciones Ecuatorianas de Camarón Anual. Fuente: Datos tomados del CNA (Cámara Nacional de Acuicultura).
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
0
20,000,000
40,000,000
60,000,000
80,000,000
100,000,000
120,000,000
140,000,000
Año
White Spot Syndrome
Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV)
Familia, Nimaviridae
Género Whispovirus
ADN circular de doble cadena y envoltura lipídica exterior a la nucleocápside
275 nm de longitud y 85 nm de diámetro
Fuente: Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on the Taxonomy Viruses
Núcleo -capsideVirión
Morfología de WSSV
Aparición de manchas blancas en la cara interna de la cutícula de los crustáceos
Manifestación de signos de estrés Letargia Coloración rojiza Anorexia Natación en superficie Muerte en horas o en unos pocos días
Mortalidades altas en cultivo
Enfermedad es atenuada a temperaturas altas
Transmisión Horizontal
Descripción de la Enfermedad
Tejido sano Tejido infectado (WSSV)
Tejido hematopoyetico teñido conAnticuerpos contra WSSV
Manchas Blancas
Reacción +
anticuerpo
Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV)
ARN mensajero degradado Bloqueo de ciclo
de vida viral
ARN de Interferencia (ARNi) : mecanismo antiviral
en camarón
21 a 23 nucleótidos
Efectos de inyectar dsRNA en camarón L. vannamei
dsRNA
Respuesta inmune innata
dsRNA Homólogo
Silenciamiento (ARNi)
Criterios para la selección de genes candidatos
1. Expresión aumenta en respuesta a una inyección de dsRNA.
2. Expresión aumenta en respuesta a infección con WSSV.
3. Genes importantes para el sistema inmune del camarón
HIPOTESIS:
Para genes importantes en la respuesta antiviral de L. vannamei, la inyección de un dsRNA homólogo a los genes candidatos resulta en una respuesta inmune deficiente en comparación con dsRNAs usados como controles en este estudio.
Genes candidatos
54 genes candidato
s
Salina (control)
dsRNA ARNm aislado de branquias 0, 6, 16, 30 h post-inyección
ADNc Fluorescent
e
Microarray
ARNm aislado de branquias 0, 6, 16, 30 h post-inyección
Cuantificación de niveles de expresión,identificación de genes con expresión más abundante en animales inyectados con dsRNA
ADNc Fluorescente
Extracto SPF
(control)
WSSVARNm aislado de hepatopáncreas 48 h post-inyección
ADNc Fluorescent
e
ADNc Fluorescent
e
ARNm aislado de hepatopáncreas 48 h post-inyección
Cuantificación de niveles de expresión, identificación de genes con expresión más abundante en animales infectados con WSSV
Microarray
Síntesis de ARN de doble cadena (dsRNA)
• ADN purificado kit QIAquick (QIAGEN)
• dsRNA sintetizado in vitro con ARN polimerasas T3 y T7
•400 ug dsRNA (260/280=1.9-2.1)
•dsRNA inyectado 4 ug/ind.
Transcripción
ARN polimerasa T7
3’ 5’5’5’ 3’
3’
5’ 3’3’ 5’
3’
3’ 5’
5’
Transcripción
Hibridación de las dos cadenas
ARN de doble cadena
ARN polimerasa T3
3’
3’ 5’
5’ADN
5’
Sistema de Bioensayo: Diseño Experimental
Sistema de desafíos individuales
CONTROL POSITIVO
(WSSV)
CONTROL NEGATIVO
(Sol. Salina)
CONTROL RESP.
ANTIVIRAL (dsRNA-Inespecífico)
CONTROL ESPECÍFI
CO (dsRNA-Sal)
dsRNA-WSSV
Tamaño de la muestra= 40Animales ≈ 1 gr.
CONTROLES TRATAMIENTOS
Estrategia de Análisis: Bioinformático
Busca el contig (porciones de un genoma completo) en L. vannamei.
Busca todos los EST que poseen similitud con el contig.
Ensambla todos los EST encontrados y forma un nuevo contig.
Traduce la secuencia de nucleótidos en aminoácidos en todos los posibles ORF. Valor Expect (<10-6) ; Referencia del ORF correcto.Muestra el dominio funcional para determinar la posible proteína que codifica
DNA protein-translate ExPASy
InterProScan Sequence
Search
Marine Genomics
BIOINFORMÁTICA
Nucleotide Blast (NCBI)
CAP3 Sequence Assembly
Program
Blastx(NCBI)
Protein Blast (Blastp NCBI)
Dominio Funcional
Estrategia de Análisis: Estadístico
Si el valor de p > 0.05
dsRNA especifico-sal vs Neg.
FENOTIPOS DE GENES
Mortalidad de cada tratamiento
Si el valor de p ≤ 0.05ESENCIAL
dsRNA esp-WSSV vs dsRNA inesp-WSSV
I. sucp. +p > 0.05
SIN FENOTIPO
Índice de susceptibilidad
p ≤ 0.05
I. sucp. -
ANTI-VIRAL
PRO-VIRAL
Tabla de Contingencia
Resultados
Nº de Acceso del EST en NCBI
Dominio FuncionalFenotipo
Observado
CK725277 Ldla, CLECT lectina tipo C
ESENCIAL
CK570744 Granulinas
CK572129 Proteínas de choque térmicoHsp70
CK571978 Chaperonas
CK571718 Vigilin
CK570770 DnaJ o J-DnaJ/Hsp40
CK572639 WD40
CK571807 Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa
CK743206 ATP sintasa subunidad C
CK572496
Factor de crecimiento derivado de plaquetas PDGF; Factor de crecimiento endotelial vascular
VEGF
CK591644 Factor antilipolisacárido
Nº de Acceso del EST en NCBI
Dominio FuncionalFenotipo
Observado
CV468236 Sar1 Ras-Like GTPasa
ESENCIAL
MGID514847Histona de unión RBBP4 o subunidad C de complejos
CAF1
CV468041 Factor de iniciación eucariótico
CK571791 Proteínas transportadoras
MGID513560 Proteosoma C-terminal de la subunidad reguladora
CK739385 Helicasa con dominio DEAD
CK572488 ADN helicasa putativa
MGID515874 sin dominio funcional
MGID515663 sin dominio funcional
CK572424 sin dominio funcional
CK571864 sin dominio funcional
Resultados
Nº de Acceso del EST en NCBI
Dominio FuncionalFenotipo
Observado
CK571943 Tiolasa
SIN FENOTIPO
CK591675 Dominio de unión al ARN
CK591701 Cofactor tubulina vinculante C
CK571271 Peroxidasa hemo
CK572760 Catepsina D
CV133220 TB2/DP1 Familia HVA22
CK591002 Acetil-CoA-Crotonasa/enoil-coenzima A (CoA)
CK571502 Familia Peptidasa (M20, M25 y M40)
CK592593 Peroxirredoxinas, thiorredoxinas
CK572962 Dominios relacionados con el fibrinógeno
CV468320 Peptidasa C1A
CK572708 ATPasa
CK571517 Cadherinas
CK592250 Ribosomal L7Ae
CV468393 Mesd
Nº de Acceso del EST en NCBI
Dominio FuncionalFenotipo
Observado
CK572677 Dominio SWIB MDM2
SIN FENOTIPO
CK591233 Dominio SWIB MDM3
CK591012 Inositol polifosfato quinasa
CK591345 Dominio catalítico,alfa amilasa, alfa, alfa-phosphotrehalase
CK591327 sin dominio funcional
CK591655 sin dominio funcional
CK725284 sin dominio funcional
CK572442 sin dominio funcional
CK572120 sin dominio funcional
CK591121 sin dominio funcional
CK571145 sin dominio funcional
CK990141 sin dominio funcional
CK572416 sin dominio funcional
CK571262 sin dominio funcional
CK571457 sin dominio funcional
CK572105 sin dominio funcional
ResultadosNº de Acceso del
EST en NCBI Dominio Funcional
Fenotipo Observado
CK725515 Peptidasa C1A PRO-VIRAL
57%
41%
2%
Fenotipos Identificados
Sin Feno-tipoEsencial
Discusión-Conclusiones Uno de los 54 genes estudiados presentó un fenotipo de
potencial interés (posible gen pro-viral).
El 41% de los genes evaluados fueron esenciales para la supervivencia del camarón, aún en ausencia de infección experimental
Encontrar genes antivirales tiene aplicación en la selección de camarones más resistentes a enfermedades.
Identificar genes antivirales tiene relevancia para comprender a nivel molecular los mecanismos antivirales en el camarón.
Discusión-Conclusiones
El silenciamiento con dsRNA (ARNi) representa un método promisorio para la evaluación funcional de genes candidatos.
Recomendaciones En base a los resultados, se recomienda realizar
más bioensayos en busca de genes antivirales en L. vannamei realizando réplicas para cada tratamiento.
Confirmar los fenotipos identificados en este y en futuros trabajos mediante la cuantificación de los niveles de ARN de los genes bloqueados
Realizar análisis a nivel histológico de animales que presentaron alta mortalidad en ausencia de WSSV (fenotipo esencial).
Agradecimientos• FINANCIAMIENTO:
MUSC-USABIOGEMAR-EC
• ESPOL: Ph.D. Javier Robalino (Director de Tesis)
Ph.D. Marcelo MuñozPh.D. Washington Cardenas
• BIOGEMAR:Ing. Walter IntriagoMsc. Ricardo Cedeño
• CENAIM:Lcda. Irma Bentancourt
Ph.D. José Melena
Gracias =)