Sistema HLA y Trasplantes€¦ · Antígenos leucocitarios – HLA – MHC Aglutinación •Walford...

Gisselle C. Gil Z. PhD.

Sección de Inmunogenética - Instituto de Inmunología

Facultad de Medicina – Universidad Central de Venezuela

Sistema HLA y Trasplantes

[email protected]

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Tipos de trasplante – Diferencias genéticas

Trasplante

Trasplante:

Donante Receptor

Antígeno Anticuerpo

• Autólogo dentro del mismo individuo

• Xenogénico individuos de diferentes especies

• Singénico individuos isogénicos

• Alogénico individuos de la misma especie

consiste en la transferencia de células, tejidos u órganos de un individuo a otro

Autológos = Singénico > Alogénico > Xenogénicos

Aceptación o rechazo basado en las diferencias genéticas

Tipos de trasplante – Órgano o tejido trasplantado

Trasplante

2005

1968

1987

281

Venezuela

(2013)

7

8

-

-

154

57

148

Venezuela

(2014)

-

-

-

-

63

29

1978

Tipos de trasplante – Barreras y limitaciones

Trasplante

Antígenos de histocompatibilidad

• Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH): Aloantígenos que inducen respuestas más enérgicas de rechazo

• Antígenos de histocompatibilidad secundarios o menores

Respuesta

inmunológica

• Disponibilidad de órganos • Controlar el rechazo • Disparidad genética entre el donante y el receptor

Historia del descubrimiento del HLA

Grupo ABO

•Karl Landsteiner 1901 → Primeros estudios de sistemas polimórficos. Aglutinación de glóbulos rojos

Premio Nobel 1930

•Landsteiner 1901 → Primeros estudios de sistemas polimórficos. Aglutinación de glóbulos rojos

Grupo ABO


Antígeno A Antígeno B

Antígeno AB Ausencia de Antígeno

Sangre tipo A Sangre tipo B

Sangre tipo AB Sangre tipo O

Nobel 1930

•Landsteiner 1901 → Primeros estudios de sistemas polimórficos. Aglutinación de glóbulos rojos

Grupo ABO


Nobel 1930

Antígenos leucocitarios – HLA – MHC

Aglutinación


• André y col. 1954 Leucemia

• Lehndoff, 1951 Neutropenia

• Goudsmit y Van Loghem, 1953 Anemia hemolítica

• Otros

•1950s → Los trabajos de aglutinación con glóbulos rojos

son extrapolados a estudios con leucocitos


Aglutinación


•Formación de agregados.


•Miescher y Fauconnet 1954 Primer reporte de presencia de anticuerpos contra leucocitos.

“Se comenzó a usar el término Grupo Leucocitario”

•Dausset 1954 Demuestra que las transfusiones inducen la aglutinación de los leucocitos

•Van Loghem y col 1956 Al retirar la capa de blancos se evita la NHTR “Non-haemolytic

transfusion reactions”

•Van Rood y Payne 1958 Demuestran que mujeres multíparas producen anticuerpos contra

leucocitos

•Van Rood y Van Loghem 1963 Análisis computarizado de patrones de reacción de múltiples

sueros contra un panel de células (Bw4 y Bw6)

•Payne 1964 Descubre otro sistema asociado con el Bw4 y Bw6

Antígenos de Histocompatibilidad


Aglutinación •Walford y col., 1964 Citotoxicidad mediada por complemento

•Terasaki y Mc Clelland 1964 Microlinfocitotoxicidad

•1 ml de suero = 1 ensayo por aglutinación

•1 ml de suero = 1000 ensayos

•Bernard Amos 1964 Organiza el 1er Workshop

•Bach y Voynow, 1966 reconocimiento y proliferación de

linfocitos (Cultivo mixto de linfocitos)

•Sood, Pereira y Weissman, 1981 Primer gen HLA clonado

•1990s Desarrollo de tipaje HLA (SSP, SSO)

•2005 Tecnología de secuenciación de próxima generación


Complejo Mayor de Histocompatibilidad

Características del MHC

•Están ubicados en el brazo corto

del cromozoma 6

•Se expresan de forma autosómica

•Son codominantes

•Es un sistema poligénico y

polimórfico

•Se encuentran en desequilibrio de

enlace

•Se heredan en bloque de acuerdo

con un sistema mendeliano simple



Wiley J. y Ltd S., Immunology, 150, 127–138 (2016)

•La distribución de los genes HLA y las frecuencias de los distintos alelos y haplotipos varía entre los

distintos grupos étnicos.

•Algunos genes HLA están restringidos a poblaciones específicas.

•Estas variaciones podrían ser el resultado de procesos adaptativos a presiones ambientales.





Tomado de: http://hla.alleles.org/

•1990

•1986

Proyecto Genoma

PCR (Kary Mullis)

http://hla.alleles.org/



HLA Gen Alelos Proteínas Nulos

Clase I

A 5.266 3.552 286

B 6.537 4.494 232

C 5.140 3.359 236

Clase II

DRA 7 2 0

DRB 3.171 2.266 124

DQB1 1.718 1.151 72

DPB1 1.449 960 75

DRB1 2.581 1.834 78

DRB3 304 233 15

Clase III MICA 109 82 3

MICB 47 30 2

Alelos HLA Totales (2019) 26.329 (2019)

26.889 (2020)

Tomado de: http://hla.alleles.org/

http://hla.alleles.org/

Características del MHC - Nomenclatura


Prefijo HLA

Gen

Separador

(Biología Molecular)

Grupo

alélico

Proteína HLA

especifica

Sustitución en región

no codificante

Codón sinónimo

(Sustitución en la región

codificante del ADN)

HLA-A A * 24: 02: 01: 02 L Sufijo que indica

cambio de expresión

MHC

•Son el objetivo principal de las respuestas inmunes a los Trasplantes alogénicos

•Son elementos esenciales para las respuestas a estímulos antigénicos

•Se les implica en la susceptibilidad genética a padecer enfermedades

El rechazo – Papel de las células T


•Moléculas MHC alogénicas

•Péptidos alogénicas

•Molécula MHC propia

•Péptidos alogénicas

Complejo Mayor de Histocompatibilidad y Trasplante

Rechazo

•Moléculas MHC alogénicas

•Péptidos propio

•Molécula MHC propia

•Péptidos alogénicos

Complejo Mayor de Histocompatibilidad y Trasplante

Rechazo

Rechazo mediado por mHAgs

Antígenos menores de histocompatibilidad

Descubrimiento


Spierings, E. (2014). Tissue Antigens, 84(4), 374–360

1976

•Problemas clínicos posteriores

a trasplantes de MO entre

hermanos HLA-idénticos

•Experimentos in vitro mostraron distintos

grados de actividad celular entre donante y el

receptor

•20 años después se caracterizo el primer

antígenos menores de histocompatibilidad

(mHAgs)

Spierings, E. (2014). Tissue Antigens, 84(4), 374–360

•Son epítopos de células T derivados de

proteínas polimórficas

•Los péptidos menores de

histocompatibilidad son presentados por

varias moléculas MHC clase I y clase II

•El complejo MHC/mHAgs puede actuar

como un barrera en el trasplante alogénico

HLA/idéntico de células madre

hematopoyéticas y en trasplante de

órganos sólidos

Características antígenos menores de histocompatibilidad


Rechazo

Trasplante

Tipos de rechazo

Trasplante

Hiper-agudo Agudo

Crónico Humoral Temprana Tardío

Tiempo 24 horas Días a meses Días a

semanas

Después del

primer año Años

Causa Ac. pre-existentes

contra el donante

Ac. pre-existentes

contra antígenos

leucocitarios (HLA)

Alorespuesta Alorespuesta Inmunológicas y no

inmunológicas

Mecanismo Células B,

complemento y

anticuerpos

Células B Células T Células T y

células B

Células T,

células B, inmunidad

innata, lesiones e

inflamación

Tratamiento

Mejor detección de

anticuerpos

preformados y

mejor

“emparejamiento”

del MHC

Eliminar los anticuerpos

donante específicos

(Inmunoabsorción,

inmunosupresión);

controlar la producción

de aloanticuerpos

Inmunosupresión Re-trasplante; Inducción

de tolerancia

Rechazo hiper-agudo: en las primeras 24 horas

Trasplante

Activación cascada complemento

↓

Necrosis endotelial, depósito de plaquetas

↓

Coagulación local

↓

Pérdida del órgano

Nankivell BJ, Alexander SI. N Engl J Med 2010;363:1451-62

Rechazo hiperagudo: en las primeras 24 horas

Trasplante

PM

N -

Glo

méru

lo

PM

N -

Ca

pila

res p

eri

tubu

lare

s


Rechazo hiperagudo: en las primeras 24 horas

Trasplante

C4d -

Glo

méru

lo

C4d -

Capila

res p

eritu

bula

res


Rechazo agudo: días o meses post-trasplante

Trasplante

Célula T



Trasplante

Rodamiento o Rolling - Adherencia estable

↓

Diapédesis - Migración

↓

Daño al tejido : Tubulitis

↓


Infiltra

do inte

rsticia

l de lin

focitos T

Túbulo

s r

enale

s



Trasplante

Rodamiento o Rolling - Adherencia estable

↓

Diapédesis - Migración

↓

Daño al tejido : Oclusión vascular

↓


Célu

las m

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ucle

are

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A

rterias

Mio

fibro

bla

sto

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Rechazo crónico: años post-trasplante

Trasplante

Rechazo crónico: años post-trasplante

Trasplante

Hip

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Rechazo y compatibilidad HLA

Trasplante

https://www.ctstransplant.org/public/newsletters/2002/gif/2002-1.html

Rechazo e Isquemia fría

Trasplante


Rechazo y presencia de Ac anti-HLA

Trasplante


Rechazo y presencia de Ac anti-HLA

Trasplante

Sypek, M. y col. American Journal of Kidney Diseases. 7:5, 720-731. 2019.

Trasplante de Médula Ósea

Trasplante

•Mieloablación del sistema hematopoyético

• se eliminan las células malignas

• se realiza una inmunosupresión

Tratamiento estándar de:

•Aplasia Medular Grave (Desarrollo incompleto grave de

la médula)

•Síndrome de Inmunodeficiencia Combinada

Congénito (Síndrome caracterizado por defectos en el

funcionamiento inmunitario de naturaleza congénita)

•Leucemia Aguda (leucemia caracterizada por el

aumento de granulocitos, una de las células que forman

parte de los glóbulos blancos, y que evoluciona

lentamente hasta el momento final)

•Leucemia Mieloide Crónica

•Mucopolisacaridosis

Tratamiento estándar:

Trasplante de Médula Ósea

Trasplante

El Donante:

•Obtención de células madre de medula ósea circulantes

•Movilización - Factores estimulantes (G-CSF)

•Cosecha - Aféresis

•Obtención de células madre de medula ósea por punciones cadera

•Aspirado de medula ósea

El receptor

•Quimioterapia o radio terapia

•Injerto - Infusión intravenosa

•2x106 células madre/Kg

Enfermedad de injerto contra huésped

Trasplante


Trasplante

•La EICH aguda: ocurre dentro de los primeros 6 meses después de un trasplante

•Dolor o cólicos abdominales, náuseas, vómitos y diarrea

•Ictericia (coloración amarillenta de la piel o los ojos) u otros problemas del hígado

•Erupción cutánea, picazón, enrojecimiento en áreas de la piel

•La EICH crónica: comienza más de 3 meses después de un trasplante y puede durar toda la vida.

•Resequedad en los ojos o cambios en la visión

•Boca seca, parches blancos dentro de la boca y sensibilidad a los alimentos picantes

•Fatiga, debilidad muscular y dolor crónico

•Dolor o rigidez en las articulaciones

•Erupción cutánea con áreas levantadas y decoloradas, así como endurecimiento o

engrosamiento de la piel

•Dificultad para respirar

•Resequedad vaginal

•Pérdida de peso

Trasplante de Médula Ósea – Seguimiento

Trasplante

Quimerismo: presencia de células linfohematopoyéticas que no son propias del receptor. Estas

células pueden derivar de transfusiones accidentales entre el feto y la madre, por transfusiones de

sangre o por transplante de células madre hematopoyéticas.

Quimerismo total: es cuando hay un reemplazo completo de las células linfohematopoyéticas.

Se detecta un 100% de células del donante.

Quimerismo mixto: presencia de células del receptor y del donante. Las implicaciones varían

según la enfermedad y la fracción que presente el quimerismo (linfocitos, monocitos)

Quimerismo dividido: cuando una o más líneas celulares proceden en su totalidad del donante

y a su vez una o más líneas celulares proceden totalmente del receptor.

Microquimerismo: cuando tenemos <1% de células del receptor. Sólo se puede definir si se

usan técnicas de alta sensibilidad. Foseph H Antin y otros. 2001.

Tipificación de los antígenos HLA


• Serológica (sangre periférica y ganglios linfáticos)

• Biología molecular (sangre periférica, muestra bucal)

• PCR - SSP

Tipificación de los antígenos HLA por Serología


Distribución tisular de las moléculas de histocompatibilidad

Clase I en casi todas las células, menos en los

glóbulos rojos y las neuronas.

Clase II linfocitos B, monocitos, células dendríticas,

precursores de eritroides, células de Langerhans,

epitelio tímico, células de Kupffer y linfocitos T

activados.

Linfocitotoxicidad

Técnicas para fenotipaje del MHC

Tipificación

•Linfocitos T Clase I

•Linfocitos B Clase II

Sueros

•Sueros de mujeres multíparas

•Anticuerpos monoclonales

Granulocitos y Monocitos Falsos positivos

Linfocitotoxicidad


Tipos de muestra:

•Sangre periférica

•Ganglio linfático

•Bazo

Propiedades Extrínsecas:

•Expresión de marcadores en la superficie celular

•Capacidad fagocítica

Propiedades intrínsecas:

• Tamaño

• Densidad

• Viscosidad

• Adhesividad

• Granularidad

Linfocitotoxicidad


Linfocitos B

Columna de nylon >Adherencia a 20°C

< Adherencia a 4°C

Linfocitos T

Ficoll- Hypaque Polímero de sacarosa de alto peso molecular +

compuesto orgánico iodinatado. (densidad = 1,077 g/ml)

Plaqueta < Linfocitos = Monocitos < Granulocitos < Eritrocitos

Limpho-Kwik lisis diferencial utilizando anticuerpos monoclonales y complemento

•Limpho-Kwik®MN - Limpho-Kwik ®T/B - Limpho-Kwik ®T - Limpho-Kwik ®B - Limpho-Kwik ®TH

Perlas Magnéticas partículas recubiertas con anticuerpos monoclonales. (1 micra de diámetro)

•Linfocitos T Anti CD2 – receptor de rosetas E. (“Revelador”)

•Linfocitos B Anti CD19. (PBS/citrato)


Tipificación de los antígenos HLA por Serología

Montgomery, R.A. y col. Nature Reviews Nephrology. 14:9, 558-570. 2018

Linfocitotoxicidad


Principios

•Los anticuerpos anti-HLA son muy específicos para las determinaciones estructurales que

caracterizan a los diferentes antígenos del sistema HLA

•Complejo antígeno-anticuerpo - Activación de complemento por la vía clásica

•Colorante vital o fluorocromo. Daño de la membrana



A1, A2, B8, B44, DR17, DR4

A1, A29, B8, B44, DR17, DR7

A3, A2, B7, B44, DR15, DR4

A3, A29, B7, B44, DR7, DR15

P1

P2

P3

P4

A1

B8

DR17

a

A2

B44

DR4

b

A3

B7

DR15

c

A29

B44

DR7

d

A1

B8

DR17

a

A3

B7

DR15

c

A2

B44

DR4

b

A29

B44

DR7

d



A1, A2, B8, B44, DR17, DR4

A1, A29, B8, B44, DR17, DR7

A3, A2, B7, B44, DR15, DR4

A3, A29, B7, B44, DR7, DR15

P1

P2

P3

P4

A1

B8

DR17

a

A3

B7

DR15

c

A2

B44

DR4

b

A29

B44

DR7

d

A2, A24, B44, B46, DR4, DR11

A1, A2, B7, B44, DR4, DR15

P5

P6

A1

B8

DR17

a

A2

B44

DR4

b

A3

B7

DR15

c

A29

B44

DR7

d

Cultivos Mixtos


• Cultivo de Mezcla de Linfocitos (CML) Ensayo in

vitro de reconocimiento y proliferación de linfocitos

• Se cultivan linfocitos de dos individuos

• Hay diferencias en el MHC: las células crecen,

sintetizan DNA y proliferan

• NO hay diferencias en el MHC: las células

permanecen en reposo

• Respuesta conformada por las

diferencias de antígenos Clase I y II

• Medida funcional de la inmunidad

celular

Cultivos Mixtos


•Células respondedoras Linfocitos T. No tratadas

•Células estimuladoras Monocitos y linfocitos B. Tratadas con un inhibidor de la síntesis de ADN

(Mitomicina C o Radiación)

CFSE

Cultivos Mixtos


•Manifestaciones. Las células se dividen y proliferan

•Actividad metabólica Incremento de proteínas y de síntesis de ARN y ADN

•Morfología Transformación de los linfocitos en blastoides “Incorporación de un precursor radioactivo

al ADN (3H)”

Biología Molecular

• Extracción de ADN.

• Determinación de la concentración de ADN.

• Reacción en Cadena de Polimerasa PCR.

• Electroforesis.


Biología Molecular

Ventajas y desventajas


Método Serología ADN: SSP/SSOP

Número de tipos

identificados.

A:21, B:43, Cw:10

DR:10, DQ:18

A:151, B:301, Cw:83 DR:282,

DQ:43

Muestras. 2 a 3 millones de

linfocitos vivos.

Pequeña cantidad de ADN.

(15-30 µg/ml)

Nivel de Resolución. Baja resolución. Baja y alta resolución.

Tiempo. 3 horas. 4 – 5 horas.

Otros factores. Viabilidad.

Expresión del HLA.

Calidad y cantidad de ADN.

Condiciones de trabajo.

Otras aplicaciones

Medicina forense

• Identificar a una persona. Base de datos de convictos. Virginia (USA) 2003.

• Excluir a sospechosos.1986. Declaran inocente a un sospechoso de homicidio.

• Asociar a víctimas y sospechosos con la escena del crimen.

• http://www.fbi.gov/hq/lab/codis/clickmap.htm

Diagnóstico e identificación de enfermedades

• Rastreo de Carcinoma. Errores de replicación. Jochen Raedle y otros. 1999.

• Fibrosis Quística. Microsatélites en intrones del gen regulador de la conductancia

transmembrana de la fibrosis quística. Alicia A. Visich y otros. 2001.

Estudios poblacionales

Monitoreo post-trasplante

Estudio de paternidad


Otras aplicaciones


Hispanos


Hispanos vs Asiático/Islas del Pacífico


Enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD)

Trasplante

"Esperemos que aquellos que durante años han introducido todo tipo de criterios

políticos, ultra-nacionales y religiosos en el trabajo científico se den cuenta de lo

perjudicial que es su actitud para una ciudad universitaria" (Speiser, 1961).


Trasplante

A1

B8

DR3

A1, A2, B8, B44, DR17, DR4

A1, A29, B8, B44, DR17, DR7

A3, A2, B7, B44, DR15, DR4

A3, A29, B7, B44, DR7, DR15


Características antígenos menores de histocompatibilidad

• Peter Goren 1930s y George Snell 1948 → Bases de histocompatibilidad en ratones

MHCa

MHCa

MHCa

MHCb MHCa/b MHCa/b MHCa

No

rechazo Rechazo Rechazo No

rechazo

No

rechazo Rechazo

MHCa

MHCb MHCa MHCb MHCa/b

Premio Nobel 1980: George Snell, Baruj Benacerraf y Jean Dausset


El rechazo – Papel de las células T

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