* esanchezlopez@ub.edu

Departamento de Farmacia, Tecnología Farmacéutica y Fisicoquímica

Sección de Fisicoquímica

Sistemas nanoestructurados en el

tratamiento de enfermedades

neurodegenerativas

SEMINARIS DE RECERCA 2018

Elena Sánchez López*, Miren Ettcheto, Ana López, Marta Espina,

Amanda Cano, Jaume Folch, Eliana B Souto, Ana C. Calpena, Antoni

Camins, Maria Luisa García

IntroducciónMateriales y

métodosResultados Conclusiones Agradecimientos

ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

Pérdida progresiva de la estructurao funciones neuronales

Enfermedadesneurodegenerativas

Enfermedadde Alzheimer

Glaucoma

ELAEnfermendadde Parkinson

Enfermedad de Hungtinton

Enfermedadesneurodegenerativas

Enfermedadde Alzheimer

Glaucoma

ELAEnfermendadde Parkinson

Enfermedad de Hungtinton

Mayor frecuencia

de glaucoma en

pacientes de EA

ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (EA)

Cada enfermo de Alzheimer cuesta 30.000 €/año

ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (EA)

Se caracteriza por un inicio gradual y un deterioro cognitivo continuo

ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (EA)

TRATAMIENTO ACTUAL EA

Donepezilo

Rivastigmina

Memantina

Galantamina

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Antagonista del

receptor NMDA

Inhibidores de la

acetilcolinesterasa

GLAUCOMA

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

2040

111 millonesSegunda causa de ceguera en el mundo (OMS)

GLAUCOMA

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Enfermedad ocular

Humor vítreo

Humor acuoso

➢ Pérdida de visión: daño en el nervio óptico

➢ Aumento de la presión intraocular

ACUMULACIÓN HUMOR ACUOSO

OBTURACIÓN TRABÉCULO

TRATAMIENTO ACTUAL

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

presión intraocular Láser

Trabeculectomia

NINGÚN TRATAMIENTO ACTUAL RESULTA TOTALMENTE EFICAZ

Ensayos clínicos de fase III mostratron

que los efectos no eran signiticativos

Glaucoma

MEMANTINA

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Antagonista no competitive del receptor de NMDADisminución excitotoxicidad asociada a exceso de GLU

• Prostaglandinas (PGs)

• Prostaciclina: PCI2

•Tromboxano A2

Leucotrienos

Fosfolipasa A2

Acido araquidónico

AINEs

Fosfolípidos

Ciclooxigenasa

Lipooxigenasa

DEXIBUPROFENO

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

BARRERAS: BHE Y BHR

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

TRANSPORTE DE FÁRMACOS AL CEREBRO

Estrategias para el transporte de fármacos al cerebro

Técnicas invasivas Técnicas NO invasivas

Disrupción BHE Liberación directa

Inyección

intraventricularInyección

intracerebal

Métodos químicos Métodos biológicos

Modificaciones

químicas del

fármaco

Liberación

intranasal

Immuno

targeting

Sistemas

nanoestructurados

Terapia

génica

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Introducti

onObjectiv

esMaterials and

experimental

Conclusio

ns

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

BARRERAS – GOTAS OCULARES

Película lagrimal

Barrera

corneal

Barrera

hematoacuosa

Barrera

hematoretiniana (BHR)

Humor vítreoHumor acuoso

Retina

SISTEMAS NANOESTRUCTURADOS

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

NPs lipídicas

NPs poliméricas

Sistemas nanoestructurados de liberacióncontrolada de fármacos (2017SGR1477)

BiocompatibleBiodegradableNo toxico

HidrofilicidadMucoadhesividadPaso a través de la BHE y BHR

Poly(ethylene glycol)(PEG)

Ácido poli-(D,L)-láctico-co-glicólico(PLGA)

SISTEMAS NANOESTRUCTURADOS

Cc.

del

act

ivo

d1

Efecto tóxico

d2 d3 d4

Formulación

convencionalNanopartículas

Rango terapéutico

Ineficacia

Tiempo

Actividad farmacológica

Biodisponibilidad

Proteínas

Enzimas

Película lagrimal

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Dexibuprofen (DXI)

Memantine (MEM)

OBJETIVOS

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Elaboración

Optimización

Interacciones fármaco-polímero

Comportamiento biofarmacéutico

Estabilidad

Liofilización y esterilización

Citotoxicidad

Eficacia terapéutica

PLGA-PEG

Acetona

PVA (H2O)

DXI

ELABORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS

Difusión disolvente PVA

EA

Agitaciónmagnética

PVA 0,3%

+

H2O

W/O/W

PLGA-PEG

Fase

acuosa 1

(W1)

Fase orgánica

MEM

+

H2O

AE + PLGA-PEG

W/O

PLGA-PEG

PVAFaseorgánica

PVA

+

H2O

W/O/W

Fase

acuosa 2

(W2)

Fase acuosainterna

MEM

Método de

desplazamiento

de solvente

Método de doble emulsión

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

TAMAÑO DE PARTÍCULA Y CARGA SUPERFICIAL

Tamaño promedio (Zav) ≤ 200 nm

Carga superficial (potencial zeta, ZP) ≈ -25 mV

Índice de polidispersión (IP) ≤ 0.1

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

EFICIENCIA DE ASOCIACIÓN

HPLC-UV/visHPLC/MS/MS

EE (%)=𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑓á𝑟𝑚𝑎𝑐𝑜 −𝐹á𝑟𝑚𝑎𝑐𝑜 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒

𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑓á𝑟𝑚𝑎𝑐𝑜

Fármaco libre

Dexibuprofeno (DXI)Memantina (MEM)

XIC of +MRM (2 pairs): 180.300/163.200 Da from Sample 76 (D_FREE_11) of 20140225.wiff (Turbo Spray) Max. 3.2e6 cps.

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0Time, min

0.0

2.0e5

4.0e5

6.0e5

8.0e5

1.0e6

1.2e6

1.4e6

1.6e6

1.8e6

2.0e6

2.2e6

2.4e6

2.6e6

2.8e6

3.0e6

3.2e6

Inte

ns

ity

, c

ps

3.53

Elaboración

Optimización

Interacciones fármaco-polímero

Comportamiento biofarmacéutico

Estabilidad

Liofilización Y esterilización

Citotoxicidad

Eficacia terapéutica

Diseño factorial (DoE)

PARÁMETROS DE SONICACIÓN

VARIABLES INDEPENDIENTES

VARIABLES DEPENDIENTES

-1.68 -1 0 +1 +1.68

Amplitud de onda (%) 21.6 25 30 35 38.4

Tiempo 1a sonicación (s) 13 20 30 40 47

Tiempo 2a sonicación (s) 79 120 180 240 281

Amplitud de onda (%)Tiempo 1a sonicación (s)Tiempo 2a sonicación (s)

Tamaño promedio (nm)Índice de polidispersión (PI)Carga superficial (ZP, mV)EE (%)

OPTIMIZACIÓN

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Amplitud Tiempo 1a sonic Tiempo 2a sonic Tamaño

promedio

(nm)

PI ZP (mV) EE (%)Coded level

(%)Coded

level(s)

Coded level

(s)

Factorial points

F1 -1 25.0 -1 20.0 -1 120.0 390.4 ± 2.2 0.213 ± 0.039 -6.73 ± 0.04 3.46

F2 1 35.0 -1 20.0 -1 120.0 249.7 ± 4.7 0.069 ± 0.022 -6.33 ± 0.49 9.59

F3 -1 25.0 1 40.0 -1 120.0 184.6 ± 0.7 0.125 ± 0.023 -6.43 ± 0.45 42.57

F4 1 35.0 1 40.0 -1 120.0 227.0 ± 2.6 0.057 ± 0.019 -6.72 ± 0.33 36.89

F5 -1 25.0 -1 20.0 1 240.0 243.0 ± 0.9 0.194 ± 0.012 -6.72 ± 0.24 7.43

F6 1 35.0 -1 20.0 1 240.0 248.1 ± 1.9 0.053 ± 0.037 -6.48 ± 0.15 14.69

F7 -1 25.0 1 40.0 1 240.0 258.7 ± 4.5 0.198 ± 0.011 -6.35 ± 0.33 22.63

F8 1 35.0 1 40.0 1 240.0 206.4 ± 1.2 0.061 ± 0.045 -6.67 ± 0.30 2.88

Axial points

F9 1.68 38.4 0 30.0 0 180.0 222.4 ± 2.4 0.033 ± 0.011 -5.63 ± 0.37 39.12

F10 -1.68 21.6 0 30.0 0 180.0 162.6 ± 0.4 0.262 ± 0.012 -6.83 ± 0.37 39.36

F11 0 30.0 1.68 47.0 0 180.0 226.7 ± 4.4 0.236 ± 0.011 -6.49 ± 0.25 19.94

F12 0 30.0 -1.68 13.0 0 180.0 196.8 ± 2.5 0.103 ± 0.056 -6.47 ± 0.55 43.10

F13 0 30.0 0 30.0 1.68 281.0 239.8 ± 0.7 0.056 ± 0.020 -5.77 ± 0.47 23.39

F14 0 30.0 0 30.0 -1.68 79.0 382.6 ± 5.2 0.221 ± 0.011 -5.93 ± 0.21 33.95

Center points

F15 0 30.0 0 30.0 0 180.0 220.1 ± 5.6 0.059 ± 0.019 -5.36 ± 0.03 24.01

F16 0 30.0 0 30.0 0 180.0 222.1 ± 3.6 0.062 ± 0.021 -5.36 ± 0.11 23.23

Amplitude (%)

PI0.000.040.080.120.160.200.240.280.320.360.400.44

1 st sonication time (s)

PI

Estimated Response Surface

21 24 27 30 33 36 39 1323

3343

530

0.1

0.2

0.3

0.4

Son necesarias amplitudes altas (≥ 38%) para obtener NPs pequeñas y

monodispersas

Tiempo 2a sonicación:180 s

La interacción entre la 1a y 2a

sonicación aumenta el

tamaño promedio

OPTIMIZACIÓN - QBD

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Tamaño promedio ≤ 200 nmPI ≤ 0.1

ZP - 25 mVEA 80-99%

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

CARACTERIZACIÓN

Elaboración

Optimización

Interacciones fármaco-polímero

Comportamiento biofarmacéutico

Estabilidad

Liofilización Y esterilización

Citotoxicidad

Eficacia terapéutica

Aumenta la Tg (Tg PLGA-PEG 47.30 OC)

No descomposición MEM

INTERACCIONES FÁRMACO-POLÍMERO

MEM NPs

25-350 oC10 oC/min

DSC

Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Perfil similar al del polímeroPequeños picos de DXI

0 10 20 30 40 500

20000

40000

60000

DXI

PVA

PLGA 5% PEG

DXI NPs

2 ()

Inte

nsi

ty (

a.u

.)INTERACCIONES FÁRMACO-POLÍMERO

DXI NPs

XRD

Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Elaboración

Optimización

Interacciones fármaco-polímero

Comportamiento biofarmacéutico

Estabilidad

Liofilización Y esterilización

Citotoxicidad

Eficacia terapéutica

Diálisis directa

LIBERACIÓN IN VITRO

Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

0 10 20 30 400

20

40

60

80 MEM NPsFree MEM

Time (h)

Cu

mu

late

d a

mo

un

t (m

g)

Free MEM MEM NPs

Bmax 60,51 ± 0,94 56,29 ± 0,94

Kd 0,38 ± 0,04 0,74 ± 0,05

r2 0,9905 0,9957

0 2 4 6 8 10 120

20

40

60

80

100

DXI NPs

DXI

Parameters DXI NSs Free DXI

Bmax (% ) 62.16 ± 1.11 110.40 ± 1.63

Kd (h) 0.64 ± 0.05 0.56 ± 0.04

R² 0.9249 0.9452

Sy.x 3.42 5.26

Time (h)

Cu

mu

lati

ve D

XI

rele

ase

d (

%)

LIBERACIÓN IN VITRO

Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Diálisis inversa

0 2 4 6

0

1 0

2 0

3 0

T im e (h )

Cu

mu

lativ

e M

EM

(%

/cm

2)

0 1 2 3 4 5 6

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

T im e (h )

Cu

mu

lati

ve

ME

M (

%/c

m2

)

Corneal

Escleral

Células de diffusion de Franz

http://permegear.com/franz-cells/

PERMACIÓN CORNEAL Y ESCLERAL

Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Elaboración

Optimización

Interacciones fármaco-polímero

Comportamiento biofarmacéutico

Estabilidad

Liofilización Y esterilización

Citotoxicidad

Eficacia terapéutica

Luz emitida

Luz emitida

Transmisión (T)

Retrodispersión (BS)

=180°

=135°

TurbiscanLab®

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

ESTUDIOS DE ESTABILIDADFenómenos de Inestabilidad

Cambios Velocidad Migración Modificación del Tamaño

Sedimentación Creaming

Floculación(reversible con

agitación)

Coalescencia(irreversible)

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

1.00 6.00 11.00 16.00 21.00

Ba

cksc

att

erin

g (

%)

Height (mm)

MES 0

MES 1

MES 2

MES 3

MES 4

MES 5

MES 6

Month 0Month 1Month 2Month 3Month 4Month 5Month 6

Estables a 4 oC, 25 oC

ESTUDIOS DE ESTABILIDAD

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Sistemas termodinámicamente

inestables

4 oC

25 oC

38 oC

Elaboración

Optimización

Interacciones fármaco-polímero

Comportamiento biofarmacéutico

Estabilidad

Liofilización Y esterilización

Citotoxicidad

Eficacia terapéutica

ESTUDIOS DE LIOFILIZACIÓN

T (

ºC)

CONGELACIÓN

Tiempo (h)

SECADO PRIMARIO

(SUBLIMACIÓN)

SECADO SECUNDARIO

(DESORCIÓN)

Anillado

T (

ºC)

CONGELACIÓN

Tiempo (h)

SECADO PRIMARIO

(SUBLIMACIÓN)

SECADO SECUNDARIO

(DESORCIÓN)

Anillado

Vapor

de agua

Líquido Congelado Secando Seco Sellado

Vapor

de agua

Líquido Congelado Secando Seco Sellado

Sólido Líquido Gas

Fusión Evaporación

Licuefacción

S u b l i m a c i ó n

C o n d e n s a c i ó n

Congelación

Crioprotecor %

Mannitol 5,5

Fructosa 6,0

Sacarosa 10,5

Trehalosa 11,8

Mannitol

Trehalosa

SacarosaFructosa

ESTUDIOS DE LIOFILIZACIÓN

Osmolaridad

280 mOsm/l

Etapas Temperatura (oC) Presión (bar) Tiempo (h)Congelación -50 1 4 hSecado primario -34 354 16 hSecado secundario 25 354 2 h

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

CrioprotectorRATIO ANTES /DESPUÉS LIOFILIZAR

Tamaño (nm) PI ZP (mV)Mannitol 0.52 0.37 1.18

Sacarosa 0.98 1.11 0.97

Trehalosa 0.96 0.65 0.78

- 0.04 0.20 1.69

CrioprotectorRATIO ANTES /DESPUÉS LIOFILIZAR

Tamaño (nm) PI ZP (mV)

Manitol 0.20 0.04 0.95

Sacarosa 0.97 0.74 0.90

Trehalosa 0.96 0.80 0.98

- 0.03 0.06 1.16

ESTUDIOS DE LIOFILIZACIÓN

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

LIOFILIZACIÓN

Resuspensión

Tamaño, PI, ZP

Tamaño, PI, ZP

DXI NPs

MEM NPs

PLGA-PEG 5% termosensible -----> Calor y óxido de etileno

No varían las propiedades fisicoquímicas

ESTERILIZACIÓN

Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Tamaño, PI, ZP, EE

✓ Alto poder de penetración

✓ Baja reactividad química

✓ Bajos niveles de residuos

Elaboración

Optimización

Interacciones fármaco-polímero

Comportamiento biofarmacéutico

Estabilidad

Liofilización Y esterilización

Citotoxicidad

Eficacia terapéutica

0.5 1 5

10

15

0

20

40

60

80

100

120

M E M N P (2 4 h )

M E M (2 4 h )

M E M N P (4 8 h )

M E M (4 8 h )

$$

C o n c e n tr a t io n ( M )

Ce

ll v

iab

ilit

y (

% o

f c

on

tr

ol)

*

* **

$ $$

$ $$$ $$ $ $$

** **

* **

* *** **

Células Y-79 (retinoblastoma)

MEM citotóxica ≥ 5 µMMEM-NP no citotóxicas

http://www.abpbio.com/product/cell-quant-alamarblue-cell-viability-reagent/

ESTUDIOS DE CITOTOXICIDAD

Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Alamar Blue

45% en la barrera

No causandisrupción de la BHE

bEnd.3 cells

Astrocytes

1 hora

TRANSPORTE IN VITRO A TRAVÉS DE LA BHE

Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Elaboración

Optimización

Interacciones fármaco-polímero

Comportamiento biofarmacéutico

Estabilidad

Liofilización Y esterilización

Citotoxicidad

Eficacia terapéutica

FÁRMACO LIBRE PLGA-PEG NPs

Ratones transgénicos APP/PS1

Ratones salvajes WT (C57Bl6)

8 h tratamiento40 h no tratadas

CONTROL

DXI

MEM

NPs DXI

NPs MEM

MODELO DE RATÓN PARA LA EA

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

6 días de entrenamiento

Séptimo dia: test

APP/PS1 MEM NPs: < 40s

Unt

reat

ed

MEM

MEM

NPs

0

10

20

30

40

50

60

70

*

APP/PS1 mice

Esc

ap

e l

ate

ncy (

s)

MORRIS WATER MAZE

Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

MODELO DE RATÓN PARA LA EA

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

PLGA-PEG NPs Fármaco libre No tratados

APP/PS1

MEM MEM NPs

IMMUNOHISTOQUÍMICA

No tratados

IMMUNOHISTOQUÍMICA

No tratados DXI DXI NPs

APP/PS1

Aplicación producto

HET-CAM test Draize test

Product Assay OII Classification

MEM HET-CAM 1.85 ± 0.15 Ligeramente irritante

Draize 4.00 ± 1.00

MEM NP

DXI

DXI NP

HET-CAM 0.13 ± 0.01 No irritante

No irritante

Draize

Draize

HET-CAM

0.00 ± 0.00

0.00 ± 0.00

0.00 ± 0.00

5 min

TOLERANCIA OCULAR

Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Hemorragia

Vasoconstricción

Coagulación

10 ratas /grupoSuero fisiológico

NPs MEM

OHT unilateral

Control negativo

2 gotas al díadurante 3 semanas

MODELO ANIMAL DE GLAUCOMA

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Modelo OHT

Inyección Suero salino hipertónico(venas episclerales)

Ratas

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5 O H T o n ly

O H T M E M N P

O H T c o -e y e

* * *

* *

$ $ $

$ $ $

T im e p o s t O H T (d a y s )

IO

P (

mm

Hg

)

No se observaron

diferencias significativas

EFICACIA TERAPÉUTICA EN EL GLAUCOMA

Presión intraocular (IOP)

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Naiv

e con

trol

OH

T o

nly

OH

T +

ME

M N

Ps

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

****

****

RG

C D

en

sit

y (

ce

lls

/mm

2)

RGC marcados con Brn3a(RGC specific nuclear-localized transcription factor)

Las NPs MEM son neuroprotectoras

EFICACIA TERAPÉUTICA EN EL GLAUCOMA

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Optimizado y desarrollado

sistemasnanoestructurados

Estables

Liofilizar

Liberaciónprolongada

Eficaces contra la enfermedad de

Alzheimer

Eficaces para el tratamiento del

glaucoma

Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones

UTADFaculty of Biology

Sistemas nanoestructurados de liberación controlada de fármacos

Facultad de Farmacia y Ciencias de la Alimentación, UB.

Departamento de Farmacología, Toxicología y Química terapéutica. Facultad de Farmacia y Ciencias de la Alimentación, UB.

Universidad de Tràs-os-Montes e Alto Douro. Vila Real. Portugal

Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, Portugal

Institute of ophthalmology, University College of London, United Kingdom.

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