CITOMETRA DE FLUJO aplicacin al estudio de losSINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS B.Bioqca. Mara Beln VenegasBioqca. Andrea Bender

Seccin Estudios Especiales:Citometra de Flujo

CITMETRO DE FLUJOEl citmetro de flujo es un aparato capaz de medirvarios parmetros celulares a partir de unasuspensin celular, mediante estudio de la dispersinde la luz y fluorescencia emitida cuando la clulaatraviesa un rayo de luz LASER.

SSC (granularidad)FL1FL2FL3FSC (tamao)Lserconvertidas en seal electrnicaProcesadas por unsoftwareSeales detectadaspor detectoresFL4Citmetro de flujo

FLUOROCROMOSSon molculas capaces de absorber energa yemitir luz fluorescente.

FLLASERFluorocromo1VIOLETAPacific Blue , V4502VIOLETAPacif icOrange, V5003AZULFITC4AZULPE5AZULPerCP-Cy5.56AZULPE-Cy77ROJOAPC8ROJOAPC H7

TIPOS DE MUESTRAS

CLULAS EN SUSPENSIN

Muestra ( s.p.)Tcnica estndar de marcacin de Antgenos de superficie con anticuerpos monoclonales Anticuerpos MonoclonalesLisis de GR50- 100ul/tuboAdquisicin

Anlisis de datosCOMPLEJIDAD

TAMAO

NEOPLASIAS HEMATOLGICAS Neoplasia de precursor linfoide Leucemia/Linfoma Linfoblstica B Leucemia/Linfoma Linfoblastica T Leucemia Mieloide Aguda. Leucemia aguda de linaje ambiguo. Neoplasias de Clulas B maduras. Neoplasias de Celulas T y Clulas Nk maduras. Sindromes Mielodisplsicos.

Los sndromes linfoproliferativos crnicos (SLPC)constituyen un grupo heterogneo deenfermedades caracterizadas por la expansinclonal de clulas linfoides de aspectomaduro que reflejan las caractersticas de distintassubpoblaciones normales de linfocitos maduros.Desde el punto de vista fenotpico yde acuerdo con su origen, los SLPC se clasifican enSLPC-B, T y NK

Neoplasia de Clulas B madurasLeucemia Linfocitica Crnica B/Linfoma de pequeos linfocitos BLeucemia Prolinfoctica de clulas B.Linfoma de zona marginal esplnico.Leucemia /linfoma esplnico inclasificable.Linfoma Linfoplasmoctico.Enfermedad de cadenas pesadas.Neoplasias de clulas plasmticas.Linfoma de zona marginal extranodal de tejido linfoide asociado a mucosa (MALT).Linfoma de zona marginal nodal.Linfoma Folicular.Linfoma centro folicular primariamente cutneo.Linfoma del Manto.Linfoma Difuso de Grandes Clulas B.Linfoma de Clulas B rico en Clulas T/histiocitos.Linfoma Plasmablstico.Linfoma de Burkitt.

Aplicaciones clnicas de la CF en Neoplasias hematolgicasDIAGNSTICO Normal-Regenerativa/Reactiva- Neoplasia

CLASIFICACIN Asignar linaje. Estadio de diferenciacin. Asociacin con aberraciones cromosmicas.

EVALUACIN PRONSTICA

MONITOREO DEL TRATAMIENTO Deteccin de enfermedad mnima residual (EMR)

Caracterizacin de la clula neoplsica

Semejanza con la clula normal: asignar linaje y estadio de maduracin.

Diferencia con la clula normal: asincronismo madurativo, aberraciones fenotpicas.

Diagnstico de Neoplasias hematolgicasClnica:Signos y SntomasHallazgos de laboratorioINMUNOFENOTIPOBiologa Molecular /FISHMorfologa+ CitoqumicaCitogentica

Nueva tecnologa

Nuevos citmetros, ms lasers, ms colores

Incremento la sensibilidad, presicin, ms informacin +

Nuevos reactivos, Nuevos fluorocromos

Cal es la mejor combinacin ?

La Reprodubicilidad es el desafo

LA ESTANDARIZACIN UNA NECESIDAD URGENTE

propuesta Euroflow

It is an independent scientific consortium that aims at innovation and standardization of flow cytometric immunophenotyping to further improve and progress diagnostic patient care.

JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907

JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907

CF multicolores ( 8 colors) con tcnica completa estandarizada.Seteo del instrumentoProtocolo de inmunofenotipificacin Precisa definicin de paneles de diagnstico

Desarrollo de software: Infinicyt Combinar multiples tubos: calculo and APS Comparacin de muestras de leucemia al diagnostico y seguimiento contra templados de muestras normales /control.

Desarrollo de protocolos de 8 colores para protocolos para diagnstico, clasificacin y monitoreo de enfermedades oncohematolgicas Paneles diseados para responder las preguntas clinicas especficas (algoritmo). JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907Logros del Consorcio Euroflow

JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907

CF multicolores ( 8 colors) con tcnica completa estandarizada.Seteo del instrumentoProtocolo de inmunofenotipificacin Precisa definicin de paneles de diagnstico

Desarrollo de software: Infinicyt Combinar multiples tubos: calculo and APS Comparacin de muestras de leucemia al diagnostico y seguimiento contra templados de muestras normales /control.

Desarrollo de protocolos de 8 colores para protocolos para diagnstico, clasificacin y monitoreo de enfermedades oncohematolgicas Paneles diseados para responder las preguntas clinicas especficas (algoritmo). JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907Logros del Consorcio Euroflow

JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907

SLP-B: Algortmo diagnstico

Desrdenes linfoproliferativosLST(Tubo de Screening Linfoide)Linfocitos BLinfocitos madurosLinfocitos TPlasmocitosClulas NKScreening diagnstico de SLP de clulas B, T y NK. Identifica el linaje celular involucrado (en la linfocitosis), para detectar el fenotipo aberrante ms comn (CD5), y determinar la clonalidad B.*Identificar linaje B: CD20, CD19 y CD38. Aberraciones B ms comunes: CD5, y estudiar clonalidad: Lambda y Kappa.*Identificar clulas T y los sub-sets de clulas T: CD3, CD4 y CD8. TCRgd. Aberraciones T ms frecuente: CD5.*Marcadores para identificar las clulas NK: CD56. Y subtipos: CD8.Linfocitos B

Linfocitos B clonalesTubo LST Gr.Neutrofilos Monocitos Eosinfilos Celulas NK Linfocitos B LINFOCITOS B CLONALES Linfocitos T CD4+CD8- Linfocitos T CD4-CD8+ Linfocitos T CD4-CD8- Linfocitos T CD4+CD8+

Panel para SLP-B

Backbone MarketsIdentificar a todas las clulas B.

Se teste la expresin de /CD37/k/CD19/CD22/CD20 en 69 casos de LNH-B.

Marcadores de CaracterizacinLinfopoyesis B normal

CD10, CD20, CD22CD24, CD27, CD38CD39, CD43, CD63CD81, CD95, CD138Bcl-2, HLA-DR, IgMHoming de clulas B

CD11a, CD11cCD31, CD49dCD62L, CXCR5CCR6, LAIR1Para diferenciar

CD5, CD23CD25, FMC7CD79b, CD103CD200, sIg

SLPC-B

CD10Linfomas del CG

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP+++-/--

CD200*LLC Vs LCM*LF Vs LBDCG CD10+

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP++++/--

CD43

*LF Vs LBDCG CD10+

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP+d+d-/-+

SLPC-B

CD31*LF y LB (y LB like) son negativos. *TL y LLP son ++

*LF Vs LBDCG CD10+

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP-+-/++

LAIR 1*LF y LB son negativos. *TL ++

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP++++/++-

CD11c*LLC atpicas +*TL+++*Algunos LZM+

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP

IgM*LLC Vs LCM*LB Vs LF

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP

CD81

*LLC +d*LB ++

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP+++-/+++

SLPC-B

CD103

*nicamente TL++

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP----

CD95

*LB Vs LBDCG

*LB, LLC Y LCM neg

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP---/+d+

CXCR5

*Se expresa en todos los SLP-B

*Muy fuerte: LB y LLC

*LLC con CXCR5 +d no existe.

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP--++-

CD49d

*LLP y TL++* LLC pronstico

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP+++-/--

CD49d: Factor pronstico para LLC

Leukemia (2006) 20, 523-525. doi: 10.1038/sj.leu.2404087*Estudio de la expresin de CD38 y CD49d en LB clonales (SP) 115 pacientes con LLC-B.*Correlacin entre ambos.*El anlisis combinado da una mayor poder predictivo como factor pronstico.

SLPC-B

CD62L

*LB neg*Para todo el resto de SLP-B es positivo.*Puede ayudar LLP Vs. LZM.

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP---/+-

CD39

*Linfomas de CG es neg. LF siempre neg.

*LZM heterogeneo.

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP--+-

CD27

*LLC y LCM +.*LBDCG, LF y TL neg.*LLP +d*LZM heterogeneo. (CD27- / CD62L-/ CD39 +)

Prec LBCD34+Prec LBCD34-MaduroN/MCP---/+++

LLC-B Gr.Neutrofilos Monocitos BasfilosLinfocitos B Linfocitos T Celulas NK LINFOCITOS B CLONALESMuestra: Mdula sea

LLC-B CLULAS PATOLGICAS 49,9 % Clulas de pequeo tamao, CD45++, CD19++, CD20+d, CD22-/+d, CD38(-), CD10(-), CD49d(-), CD5++, CD23-/+v(20%), CD43+, CD200++, CD25(-), CD11c(-), sIgM(-), CD79b(-) y restriccin en la expresin de inmunoglobulinas de superficie, cadena liviana Kappa+d.CONCLUSIONESCompromiso por proceso linfoproliferativo de clulas B maduras cuyas caractersticas fenotpicas podran asociarse a un linfoma de pequeos linfocitos/LLC- B Gr.Neutrofilos Monocitos BasfilosLinfocitos B Linfocitos T Celulas NK LINFOCITOS B CLONALESMuestra: Mdula sea

L.Manto Gr.Neutrofilos Monocitos BasfilosLinfocitos B Linfocitos T Celulas NK LINFOCITOS B CLONALESMuestra: Mdula sea

L.FolicularMuestra:GANGLIO CLULAS PATOLGICAS 42 % Clulas de tamao pequeo a mediano CD45+, CD19++v, CD20++, CD22+ CD38(-), CD10+, CD5(-), CD23(-), CD43(-), CD200(-), CD25(-), CD11c-/+, CD79b++, sIgM (-), BCL2+/++ y sin expresin de inmunoglobulinas de superficie, fenotipo vinculable a linfocitos B clonales.CONCLUSIONESCompromiso por proceso linfoproliferativo de clulas B maduras. Si bien la expresin de CD10 se asocia a origen centrofolicular no implica necesariamente patrn histolgico; sin embargo las caractersticas fenotpicas globales favorecen el diagnstico de linfoma folicular.Linf. B policlonales Linf. B CLONALES Otros linfocitos

L.Manto Gr.Neutrofilos Monocitos BasfilosLinfocitos B Linfocitos T Celulas NK LINFOCITOS B CLONALESMuestra: Mdula sea CLULAS PATOLGICAS 1,4 % Clulas de tamao pequeo, CD45++, CD19++, CD20++, CD38++, CD5++, CD10(-), CD23(-), CD43+, CD200(-), CD25+, CD22+, sIgM++, CD49d(-), CD79b++ y restriccin en la expresin de inmunoglobulinas de superficie, cadena liviana Lambda+, fenotipo vinculable a linfocitos B clonales. CONCLUSIONESPresencia de una pequea poblacin (1,4 %) de linfocitos B clonales cuyas caractersticas fenotpicas se asocian a linfoma del Manto.

L.Folicular Gr.Neutrofilos Monocitos BasfilosLinfocitos B Linfocitos T Celulas NK LINFOCITOS B CLONALESMuestra:GANGLIO

Backbone MarketsIdentificar a todas las clulas B.

Se teste la expresin de /CD37/k/CD19/CD22/CD20 en 69 casos de LNH-B.

FUSIN y CLCULO

Base de datos de referencia para LLC-B

Base de datos de referencia:Normal vs LLC-B

Panel SLPC-B: utilidad

Panel SLPC-B: utilidad

Panel SLPC-B: utilidad

Panel SLPC-B: utilidad

Panel de clasificacin SLPC-B

Anlisis comparativo de un caso vs varios grupos de referencia

Para recordar.

Es necesario conocer la sospecha clnica.La CFM es una tcnica rpida, sensible para el diagnstico.La CFM es una tcnica complementaria y para llegar a un diagnstico definitivo se debe correlacionar con la manifestacin clnica y estudios complementarios.CFM es una tcnica con altas sensibilidad para el monitoreo de EMR.Importancia de la estandarizacin para obtener resultados objetivos y reproducibles, que nos permite utilizar base de datos de referencia.

***Desde el punto de vista prctico,los SLPC B presentan una incidencia claramente superior a la de los SLPC-T, siendoraros los casos de SLPC-NK. As, segn diferentes autores, los SLPC-B representanms de 90-95% de todas las enfermedades linfoproliferativas crnicas de naturalezaneoplsica [2]. As mismo, merece destacar que los SLPC-B son un amplio grupo deentidades diferentes, clnica y biolgicamente bien definidas, mientras que el numerode SLPC-T y NK es significativamente ms reducido [1][3].***Revisaremos en primer lugar la maduracin linfoide normalcomo punto de partida para identificar la presencia de clulas linfoides alteradas endistintos tipos de muestras biolgicas y establecer las similitudes y diferencias quepresentan respecto a su contrapartida normal.Tanto los linfocitos T y B como las clulas NK tienen su origen en un precursorhematopoytico CD34+De forma general, se establece que la maduracin de las clulas B tiene lugaren dos estadios diferentes, y en dos localizaciones distintas: i) la diferenciacin deprecursores de clulas B desde la clula stem hasta los linfocitos B maduros nave,que ocurre en la MO [18] y ii) la maduracin a clulas de memoria/efectoras, que tienelugar en los rganos linfoides secundarios ganglios linfticos (GL), bazo, MO y tejidolinfoide asociado a mucosas (MALT)-

*Origen de los SLPC-B de acuerdo con sus similitudes respecto a su contrapartida normal.La mayoria de los SLPC-B derivan de clulas B que an no han pasado por el CG (LLC, LCM, LZM,), de clulas B del CG (LF, LBDCG, LB), o de clulas B ms diferenciadas que han transitado previamente por el CG (LLP, MM).Segn hayan sufrido o no el proceso de hipermutacin somtica en los genesde las Ig, se considera que el origen de los SLPC-B se situara en clulas B que no han pasado por el CG (carentes de mutaciones en los genes de las Ig) o de clulas Bdel CG o post-CG (clulas B que han pasado a travs del CG y que presentanmutaciones en los genes de las Ig). As mismo, de acuerdo consus patrones de expresin gnica, algunos SLPC-B como el LF, el LB y el LBDCG,muestran perfiles asociados con clulas B del CG [250-251], aunque existen casos deLBDCG cuyos perfiles de expresin gnica se asemejan ms a los de las clulas Bactivadas in vitro [251].*So we have now new technologies with more lasers and more colors. Consequently,we have increased sensitivity, accuracy, and we have more information now. In paralel we can label with a great offer of new reagents and fluorochromes and new problems

the listof clinically useful antibodies (Abs) has progressively increased,leading to the definition of complex immunophenotypic profiles. In parallel, the number of antigens that can be assessed in a single measurement has increased dramatically owing to the availability of new multicolor digital instruments and a greater number ofcompatible fluorochromes. This has facilitated more preciseidentification and phenotypic characterization of specificpopulations of tumor cells in samples over the background ofthe coexisting residual normal leukocyte subsets.

How to choose the best combination? It was the daily question in our labs

REPRODUCIBILITY is a CHALLENGE so we understood that STANDARDIZATION IS URGENTLY NEEDED

*E is a multicenter group of 16 universiies developping new protocols and solution for flow cytoemtry applicatiosn

E is the meeting of 16 universities, a multidisciplinary group with (in) open discussion( re castellano esta frase), dynamic interaction and heterogeneous contributions , they give us the way to do and without spending resources,

We detail its achievements. We will begin with the instrument setting our experiences

*

We detail its achievements. Their mayor We will begin with the instrument setting our experiences

*

We detail its achievements. Their mayor We will begin with the instrument setting our experiences

*Glicoprotena de membrana con funciones inmunosupresorasMolcula que se expresa en estados pre-CG.Los LB que reconocieron antgeno, son negativos (CP y clulas de memoria).Es una glucoproteina de membrana perteneciente a la superfamilia de Igs. Podria jugar un papel inmunosupresor.*No se conoce muy bien el papel biologico del CD43, pero lo pierden a medida que maduran, y luego las CP vuelven a expresarlo.*El CD31 es una molecula de ahdesion (familia PCAM-1)LF es claramente negativo y no suele expresarlo.LB es gral// negativo, LBlike tambin , LLC B es + y DLBCL es +.Tricoleucemia,LPL y MCL son ++.

*Permite discriminar LLC (IgM-) de LM (IgM++).Permite disriminar LB (IgM++) de LF (IgM+ de menor intensidad).Las tricoleucemias son IgM- porque suelen expresar IgG.

*Util para LLC que es + debil, LB++El resto es +*El CD103 es una integrina. LB normales son CD103 neg*R FAS. C{elulas que van a morir por apoptosis en el CG.*

Marcador relacionado con homing.Se expresa cuando la clula es madura.Es positivo en clulas que van hacia CG.Luego de la reaccin de CG, la expresin disminuye.Es un marcador de LB,

*Molcula que acta como estructura de adhesin para componentes de la matriz extracelular, relacionado con el transito linfocitario. Permite al LB salir a tejidos

*Estudiando el perfil de espresion genica en LLC con mal (CD38+) pronostico. Varios genes sobreexpresados, entre ellos el CD49d.*Es una L-selectina.Es muy negativo en el LB.Para el resto de los SLP B, es positivo, pero no muy fuerte.Nos ayuda para diferenciar LPL(+) vs MZL(-),

*Relacionado a un ambiente inmunosupresor.*