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Página 1 de 34 EL PRESENTE DOCUMENTO SE DISTRIBUYE COMO COPIA NO CONTROLADA Y TIENE UNA VIGENCIA DE 2 AÑOS CONTANDO A PARTIR DE LA FECHA DE SU APROBACIÓN. LA UNIDAD DE GESTIÓN DE LA CALIDAD DEL CENTRO NACIONAL DE SALUD PÚBLICA PROCESA LAS PROPUESTAS DE MODIFICACIÓN Y ACTUALIZA LAS EDICIONES VIGENTES DEL MISMO. SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS ANTITUBERCULOSIS DE PRIMERA Y SEGUNDA LINEA POR EL METODO DE LAS PROPORCIONES AGAR EN PLACA. MET-CNSP-011 Elaborado por: Revisado por: Aprobado por: CNSP Blga. Neyda Quispe Torres. CNSP Blga. Elena Leo Hurtado CNSP Blga. Rosario Salazar Cruz CNSP Blgo. Luis Asencios Solís CNSP Blga. Gabriela Salinas Coronel CNSP Dr. Sergio Recuenco Cabrera RD N° 227-2015-DG-CNSP/INS Fecha: 16 /09 /2015
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Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:
CNSP Blga. Neyda Quispe Torres. CNSP Blga. Elena Leo Hurtado CNSP Blga. Rosario Salazar Cruz CNSP Blgo. Luis Asencios Solís CNSP Blga. Gabriela Salinas Coronel CNSP Dr. Sergio Recuenco Cabrera
RD N° 227-2015-DG-CNSP/INS Fecha: 16 /09 /2015
MÉTODO DE ENSAYO MET-CNSP-
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SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS ANTITUBERCULOSIS DE PRIMERA Y SEGUNDA LINEA POR EL METODO DE
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INDICE
Pág.
1. ÁMBITO DE APLICACIÓN 3
2. REFERENCIAS 3
3. DEFINICIONES OPERATIVAS 3
4. FUNDAMENTO DEL MÉTODO 6
5. DESARROLLO DEL MÉTODO DE ENSAYO 6
5.1. Condiciones previas: Infraestructura y Bioseguridad 6
5.2. Etapa pre- análisis 6
5.3. Equipos y Materiales 7
5.4 Etapa de Análisis 9
6. INFORME DE RESULTADOS 17
6.1 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 17
7 ASEGURAMIENTODE LA CALIDAD DE LA PRUEBA 17
7.1 Control de Calidad Interno 17
7.2 Control de Calidad Externo 18
8 FORMULARIOS 18
9 ANEXOS 19
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1. ÁMBITO DE APLICACIÓN
El método descrito se aplica a cepas de Mycobacterium tuberculosis
obtenidas a partir de muestras de pacientes y se ejecuta en el Laboratorio
de Referencia Nacional de Micobacterias del Centro Nacional de Salud Pública
del Instituto Nacional de Salud.
2. REFERENCIAS
Kent P, Kubica G. Public Health Mycobacteriology A Guide For the Level III Laboratory. U.S Department Of Health and Human Services. Centers for Disease Control. 1985, Atlanta -Giorgia. Serie de Normas Técnicas Nº 15 Manual de Procedimientos de Laboratorio para la Obtención y envío de muestras (I). Instituto Nacional de Salud – 2da Edición -1997. Serie de Normas Técnicas Nº 18 Manual Bioseguridad en Laboratorios de Ensayos, Biomédicos y Clínicos – Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud – 3ra Edición - 2005.
3. DEFINICIONES OPERATIVAS
Agar: Polisacárido complejo que en suspensión líquida funde a 100ºC y solidifica a 40ºC adoptando la forma de recipiente (Ej. Placa Petri). El agar no es degradado ni utilizado como nutriente por los microorganismos, es utilizado para obtención de medios sólidos (1,5 – 2%) y semisólidos. Baciloscopía: Técnica para la observación de Bacilo Alcohol-Acido Resistente (BAAR) en frotis de muestras de esputo, teñidos por la técnica de Ziehl-Neelsen. Buffer fosfato pH 6,8: El tampón fosfato es un sistema muy eficaz, para amortiguar ácidos. El buffer fosfato, son los sistemas encargados de mantener el pH de los medios biológicos dentro de los valores compatibles con la vida. Cepa sensible: Es una cepa de Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), que no crece en presencia de una concentración crítica de una droga antituberculosis. Cepa resistente: Es una cepa de M. tuberculosis, que crece en concentración crítica establecida para una determinada droga antituberculosis. Contaminación: Crecimiento de otros microorganismos en el medio de cultivo preparado para aislamiento de M. tuberculosis. Control de calidad: Medidas internas y externas adoptadas para garantizar la calidad de los resultados de la prueba.
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(*) Cultivo puro: Se denomina cultivo puro (axénico) al que contiene sólo un tipo de microorganismo los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuos del mismo tengan la misma composición genética. Los cultivos puros son esenciales para poder estudiar las características de los microorganismos e identificarlos con seguridad. Concentración crítica: Es la cantidad precisa de cada droga antituberculosis que contiene el medio. Droga: Sustancia mineral de uso en medicina. Especificidad de la prueba: Es la capacidad de la prueba para detectar a los verdaderos sensibles. Estándar McFarland: El patrón estándar McFarland se usa como una referencia para ajustar la turbidez de suspensiones bacterianas de manera que el número de bacterias estén dentro de un rango establecido en el estándar. Especificidad de la prueba de susceptibilidad proporciones Agar en Placa: Es la capacidad de la prueba para detectar a los verdaderos sensibles. Sensibilidad de la prueba de susceptibilidad proporciones Agar en Placa: Es la capacidad de la prueba para detectar a los verdaderos resistentes. La prueba de susceptibilidad: Es la capacidad de la prueba para detectar la verdadera sensibilidad o resistencia de la bacteria a los medicamentos antituberculosis. Medio Lowenstein-Jensen: medio de cultivo sólido a base de huevo usado para el crecimiento de micobacterias Medicamentos antituberculosis: Sustancias químicas con propiedades bactericidas o bacteriostáticas para complejo M. tuberculosis. Medicamentos antituberculosis de primera línea: Medicamentos anti-tuberculosis usados en el tratamiento de Tuberculosis sensible. Medicamentos antituberculosis de segunda línea: Medicamentos anti-tuberculosis usados en el tratamiento de Tuberculosis multidrogo -resistente Medio de cultivo: solución liquida o solidificada estéril que contiene nutrientes necesarios para el crecimiento de la bacteria. Método de proporciones convencional: Prueba de susceptibilidad a drogas antituberculosis, para determinar la proporción de mutantes resistentes en una población de bacterias.
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Microcolonias: Colonias muy pequeñas que son visualizadas a través de un estereoscopio. Proporción crítica o criterio de resistencia: Es la proporción de mutantes resistentes de una población de bacterias por encima de la cual la cepa es considerada resistente. Sensibilidad de la prueba: Es la capacidad de la prueba para detectar a los verdaderos resistentes.
Tuberculosis (TB): La tuberculosis es una enfermedad causada por la bacteria llamada M. tuberculosis, afecta principalmente a los pulmones, aunque puede comprometer a cualquier otro órgano. La infección se trasmite por vía aérea al inhalar gotitas provenientes de la tos o estornudo de la persona enferma. Tuberculosis sensible: Es una forma de TB, cuyo patrón de susceptibilidad no muestra resistencia a los medicamentos antituberculosis. Tuberculosis multidrogo-resistente (TB MDR): Es la forma grave de la TB, cuando la bacteria se hace resistente a isoniacida y rifampicina simultáneamente, dos de los medicamentos que son el núcleo del tratamiento de tuberculosis sensible. Tuberculosis extremadamente resistente (TB XDR): Es una de las formas más graves de la TB, la bactería es resistente a isoniacida, rifampicina más fluoroquinolonas (ciprofloxacin, levofloxacin, ofloxacin, etc), más aminoglucósidos de segunda generación ( Kanamicin, capreomicin, amikacin).
Velocidad de crecimiento: Tiempo de crecimiento de las colonias. SIGLAS
ATCC: American Type Culture Collection.
BAAR: Bacilo Ácido Alcohol Resistente.
CSB: Cabina de Seguridad Biológica.
CAP: Capreomycina Sulfato
CC: Control de calidad.
CCI: Control de Calidad Interno.
LEV: Levofloxacin.
CS: D- Cicloserina.
EMB: Ethambutol Dihidrochloride.
ESN-PCTB: Estrategia Sanitaria Nacional de Prevención y Control de Tuberculosis.
ETH: Etionamida.
INH: Isoniacida.
KM: Kanamicina Sulfato.
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LJ: Löwenstein-Jensen
PS: Prueba de susceptibilidad
TCH: Tiophene-acido Carboxílico Hidrazida.
PAS: Ácido Para Amino Salicilico sal sódica
RIF: Rifampicina.
SM: Dihidroestreptomicina sesquisulfato.
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4. FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE ENSAYO
El método de proporciones Agar en Placa, permite determinar la proporción de mutantes resistentes en una población de M. tuberculosis a un determinado medicamento antituberculosis. El método consiste en la siembra de un inóculo estandarizado en medios de cultivo preparados y observar el crecimiento en el medio control comparado con el crecimiento en medio que contiene concentraciones críticas de las drogas, para determinar la susceptibilidad o resistencia de una cepa. Cuando la proporción de mutantes es mayor al 1%, la cepa es considerada como “resistentes”.
5. DESARROLLO DEL MÉTODO DE ENSAYO 5.1 Condiciones previas.-
Infraestructura y bioseguridad El Laboratorio de Micobacterias, corresponde al Nivel de Bioseguridad III, se aplican medidas estrictas de bioseguridad, con equipos de contención primaria, elementos de protección personal como uso de mameluco, gorro, bata, botas, doble guantes ( guantes nitrilo y guantes de látex), respirador N95 y la ejecución de los procedimientos técnicos en forma correcta. Para las medidas de bioseguridad se sigue las instrucciones del MAN-CNSP-002: medidas de bioseguridad para la contención biológica en las instalaciones con nivel de bioseguridad 3 del laboratorio de microbiología y biomedicina del centro nacional de salud pública/INS. Etapa de pre – análisis
La fase pre–analítica la recepción de la muestra en el área de Recepción y Obtención de Muestra (ROM) hasta la recepción de la misma en el laboratorio de Micobacterias se lleva a cabo conforme lo establece el PRT-CNSP-001 “Manejo de muestras en la etapa de pre-análisis” y el ITT-CNSP-088 “Operación del Sistema de Información de Laboratorios NetLab”.
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Tipo de Muestra
Cultivo puro de M. tuberculosis en medio de cultivo sólido en fase de crecimiento logarítmico de tres a cuatro semanas de crecimiento, contadas a partir de la siembra en medio de cultivo sólido y que tenga más de 10 colonias.
Conservación de muestras en el laboratorio antes y después del análisis: Las cepas están ordenadas cronológicamente de acuerdo a su llegada y se conservan dentro del laboratorio a la temperatura de medio ambiente.
5.3 Equipos y Materiales:
Equipos Área de preparación de medios - Refrigeradora con rango de temperatura entre 4 a 10°C. - Congeladora -20°C.
- Balanza analítica con precisión 0,01g - Agitador de tubos. - Agitador magnético. - Baño maría con rango de temperatura entre 45°C a 50°C. - Autoclave. - Bomba de vacío. - Jeringa dispensadora graduada de 10 mL.
- Horno graduado a 100°C1°C. - Potenciómetro - Contómetro
Equipos Área de procesamiento de muestras - Cabina de Seguridad Biológica clase II, tipo A2 - Estufa incubadora 36 - 37 °C - Sellador de bolsas - Refrigeradora - Estereoscopio - Computadora con scanner - Congelador -86 °C
Materiales
- Desecadores - Pipeta serológica de 1mL, graduada al décimo - Pipeta de 10 mL, graduada al décimo. - Pipeta de 5 mL, graduada al décimo. - Pipeta de transferencia de polipropileno empaque individual de 3,5 mL. - Matraz Erlenmeyer de 2 L. - Beaker de 1 L. - Probeta graduada de 100 mL y 250 mL. - Probeta graduada 500 mL. - Barra magnética. - Micro-espátula metal de acero quirúrgico. - Criovial estéril de 2,0 mL
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- Placas estériles descartables de 4 cuadrantes (15 x 100 mm). - Parafilm - Tubos Pirex de 20x150 mm tapa rosca estéril. - Tubos Pirex de 16x125 mm tapa rosca estéril. - Tubos de centrífuga estéril de polipropileno x 15 mL. - Propipeta de jebe. - Jeringas 10 mL estériles descartables. - Filtros de jeringa estéril 0,22 µm. - Bolsas transparentes de polipropileno de 15x20 cm, permeables a CO2. - Bolsa de plástico opacas de 30 cm x 45 cm. - Cinta Masking Tape 4,4 cm. - Papel de aluminio de 18,5 m2, 60,9x30,4 cm. - Gradillas. - Plumón indeleble. - Papel absorbente plastificado - Silicagel absorbente de humedad
Reactivos e Insumos.- - Medio Base Agar Middlebrook 7H10 (Becton Dickinson). - Caldo Base Middlebrook 7H9 (Becton Dickinson). - Enriquecedor OADC (ácido oleico–albúmina–dextrosa-catalasa) (Becton
Dickinson). - Enriquecedor ADC (albúmina–dextrosa-catalasa) (Becton Dickinson). - Glicerol 99.5%. - Tween 80. - Dimetil sulfóxido (DMSO). - Agua destilada. - Solución de NaOH al 1%. - Cloruro de Sodio (ClNa). - Estándar McFarland 0,5.
Drogas químicamente puras.- - Isoniacida (INH) (Sigma). - Rifampicina (RIF) (Sigma). - Dihidroestreptomicina sesquisulfato (SM) (Sigma). - Ethambutol Dihidrochloride (EMB) (Sigma). - Ethionamide (ETH) (Sigma). - Kanamicina Sulfato (KM) (Sigma). - Acido Para Amino Salicilico sal sódica (PAS) (Sigma). - Capreomycina Sulfato (CAP) (Sigma). - Levofloxacin (LEV) . - D-Cycloserina (CS) (Sigma). - Hidrazida Acido 2-Thiophenecarboxylico (TCH) (Sigma).
Medios y soluciones:
- Medio Agar Middlebrook 7H10 estéril en placas. - Medio sólido Lowenstein –Jensen en tubos
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- Caldo Middlebrook 7H9, estéril en tubos - Solución Salina Tween, estéril en tubos
5.4 Etapa de análisis
Todos los materiales que se usan en el proceso de la prueba antes de ingresar a la CSB, son limpiados y desinfectados utilizando una gasa o paño embebido en alcohol al 70%, limpiar la CSB con el desinfectante, delimitar el área contaminada colocando el papel absorbente sobre la mesa de trabajo.
5.4.1 Siembra en caldo Middlebrook 7H9
- Colocar dentro de la CSB una cubeta de metal con fenol al 5% o hipoclorito de sodio al 3%. para descartar material contaminado que se usa durante el proceso.
- Sacar del refrigerador tubos con caldo Middlebrook 7H9 y dejar a temperatura ambiente aproximadamente 30 minutos antes de realizar la siembra.
- Rotular los tubos con el código de la cepa. - Utilizando una micro-espátula extraer las colonias del cultivo en medio
sólido y transferir al caldo Middlebrook 7H9. - Con la micro-espátula, macerar cuidadosamente las colonias en la pared
interna del tubo y homogenizar el contenido. Luego cerrar la tapa del tubo herméticamente.
- Colocar los tubos con la siembra en una gradilla. - Rotular la gradilla con la fecha de siembra e iniciales del analista. - Colocar en una incubadora a T° 36-37°C, de 5 a 7 días.
5.4.2 Siembra en placas Middlebrook 7H10
- Sacar de la refrigeradora las placas con el medio Middlebrook 7H10 y
tubos con medio L-J y colocar dentro de la CSB, para atemperar los medios.
- Sacar de la refrigeradora los tubos con Solución Salina Tween y dejar a medio ambiente por lo menos 30 minutos.
- Sacar de la incubadora los tubos de cultivo en medio líquido y colocar dentro de la CSB.
- En un agitador de tubos, agitar por 30 segundos, para homogenizar el contenido.
- Dejar en reposo de 10 a 15 minutos, para sedimentar las partículas gruesas.
- Utilizando una pipeta serológica de 1 mL o una pipeta de transferencia estéril de 3 mL, trasvasar el sobrenadante a un tubo con Solución Salina Tween y estandarizar la suspensión bacteriana comparando con la escala patrón Mc Farland 0,5.
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- Colocar en una gradilla 4 tubos con solución salina Tween de 4.5 mL, para realizar las diluciones 10–1, 10–2, 10–3 y 10–4 y 2 tubos con medio L-J rotulados con el código de la cepa.
- Utilizando una pipeta serológica de 1 mL, absorber 0,5 mL de la suspensión estandarizada y transvasar al primer tubo de solución salina tween (dilución 10–1 ).
- Con otra pipeta serológica estéril, mezclar bien con movimientos circulares y proseguir con las diluciones trasvasando 0,5 mL del primer tubo al segundo y así sucesivamente hasta el cuarto tubo (dilución 10–4 ).
- Sembrar la suspensión sin diluir en dos tubos con medio L-J a razón de 0,2 mL por tubo, bañar la superficie del medio y colocar en una bandeja con la tapa ligeramente floja incubar a 36°-37 °C de 3 a 4 semanas.
- Utilizando una pipeta de transferencia estéril de 3 mL, realizar la siembra en la “placa control” empezando con la dilución más alta, es decir, con la dilución 10 – 4.
- Sembrar 3 gotas equidistantes de la dilución 10–4 en el cuadrante “control -4” de la “placa control”, con la misma pipeta de transferencia continuar la siembra con la dilución 10–2 en los cuadrantes “control -2” y RIF, proseguir la siembra en los cuadrantes INH0.2, INH1, EMB y SM de la placa 1 y los cuadrantes ETH, KM y PAS de placa 2 y los cuadrantes LEV, CAP, CS y TCH de la placa 3 respectivamente.
- Terminar la siembra con la suspensión sin diluir en el cuadrante “control 0” de la “placa control”.
- Las placas sembradas, dejar secar dentro de la CSB en funcionamiento y con la luz apagada de 2 a 3 h.
- Colocar cuidadosamente cada placa dentro de una bolsa de polipropileno transparente y sellar.
- Colocar las placas en forma ordenada en cilindros de metal, previamente limpiados y desinfectados con alcohol al 70%.
- Rotular cada cilindro anotando:
Fecha de siembra en placa
Fecha para voltear las placas
Fecha de lectura.
Iniciales del analista.
- Colocar los cilindros a estufa incubadora a 36-37 °C.
- Luego de transcurrido de 5-7 días, retirar los cilindros de la incubadora, colocar en la mesa de trabajo, sacar las placas y revisar si existe contaminación y luego voltear las placas para eliminar líquido de condensación.
- Devolver las placas a los cilindros
- Devolver a la incubadora a 36-37°C hasta completar los 21 días.
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ETAPAS DE LA PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD PROPORCIONES AGAR EN PLACA
Foto 01.- Cultivo en caldo 7H9
Foto 02.- Solución Salina Tween, 4 tubos
Foto 03.- Placas de Agar Middlebrook 7H10
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Foto 04.- Siembra en Placas con medio 7H10
Foto 05.- Embolsar y sellar las Placas
Foto 06.- Equipo Sellador de Bolsa
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Foto 07.- Placas sembradas, embolsadas y selladas
Foto 08.- Colocar placas en cilindro
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Foto 09.- Colocar los cilindros a la estufa
5.4.3 Lectura de las placas
- Sacar los cilindros de la incubadora y colocar sobre la mesa de trabajo. - Sacar las placas del cilindro sobre la mesa de trabajo. - Hacer las lecturas con la ayuda de un estereoscopio. - Observar el crecimiento de las colonias en los cuadrantes de cada placa. - Anotar en la hoja de trabajo los resultados de las lecturas de cada cuadrante
de las placas. - Durante la lectura tener en cuenta los siguientes criterios:
La placa control en la dilución 10–2 debe tener crecimiento entre 100 a 200 colonias contables. Si se observa menos de 100 colonias, se repite la prueba, porque puede dar resultado de falso sensible.
Si en la placa control con dilución 10–2, se observa crecimiento mayor 200 colonias (o confluente), la prueba es aceptada solamente cuando la cepa es sensible para todas los medicamentos antituberculosis. Si se observa resistencia a uno o más medicamentos, la prueba se repite.
En la placa control con dilución 10–4, debe tener crecimiento menor o igual a 50 colonias, para que la prueba sea válida.
Si en la placa control dilución 10–4, se observa mayor de 50 colonias, repetir la prueba.
- Utilizando un estereoscopio verificar las características de las micro-colonias, si corresponde al complejo MTB. La prueba no se repite, por desarrollo de micro-colonias.
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Foto 10.- Lectura de Placas
Foto 11.- Registro de Lecturas
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Foto 12.- Observación macroscópica de la placa
5.4.4 CÁLCULOS:
Para la determinación de sensibilidad o resistencia de la cepa, se determina la proporción para cada droga.
aResistenci %100 x 10Dilución Control Placa laen Colonias N
oMedicamentcon Cuadranteun en Colonias N2-
Ejemplo:
Control (cuadrante II) 126 colonias KM 6 colonias 6 colonias x 100 = 4,7%, resistente 126 colonias
Ejemplo:
Control (cuadrante II) 126 colonias ETH 1 colonia 1 colonia x 100 = 0,8%, sensible
126 colonias
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6. INFORME DE RESULTADOS
Los resultados se registran en el sistema informático NETLAB, se realiza la verificación del mismo. Los usuarios autorizados a través de la página Web del INS, pueden acceder al sistema NETLAB, para visualizar los resultados e imprimir y entregar a su respectivo establecimiento. (Anexo 09)
6.1 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
- Si la proporción de crecimiento de colonias en medio conteniendo droga es mayor de 1%. El resultado, se informa como resistente.
- Si la proporción de crecimiento de colonias en medio conteniendo droga es
menor de 1%. El resultado, se informa como sensible. 7. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LA PRUEBA
7.1 Control de calidad interno
7.1.1 Control de esterilidad de los medios y soluciones preparados:
Caldo Middlebrook 7H9
- Medio líquido (caldo 7H9) en tubos.
- Verificar que el caldo sea transparente, ligeramente amarillo.
- Seleccionar al azar 5 tubos de cada lote de medio recién preparado e incubar de 36° a 37°C, entre 48h a 72 horas.
- Verificar que los caldos incubados se mantengan transparentes.
- Si presentan turbidez, indica contaminación, por lo que se descartara todo el lote.
Solución Salina Tween
- Verificar que la solución sea transparente e incolora.
- Seleccionar al azar 5 tubos de cada lote de medio recién preparado e incubar a 36 a 37°C , entre 48 a 72 horas
- Verificar que la solución salina luego de incubación se mantenga transparente, si se observa turbia indica contaminación, y se procede a descartar todo el lote.
Medio sólido en placas.-
- Seleccionar al azar cinco placas con medio control y RIF, cinco placas de la serie INH, EMB, SM, 5 placas de la serie ETH, KM y PAS y 5 placas de la serie TCH, LEV, CAP y CS de un lote de reciente preparación e incubar de 36 a 37°C, entre 48 a 72 horas
- Verificar que en las placas incubadas no haya evidencia de crecimiento de colonias contaminantes. Si existe contaminación de más de una placa, descartar todo el lote.
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7.1.2 Manejo de cepas de referencia.-
- Cada vez que se prepare un lote nuevo de medios para la prueba de susceptibilidad, se realiza el control de calidad – CCI para el método de ensayo de “Susceptibilidad a drogas antituberculosis de primera y segunda linea por el método de las proporciones agar en placa”, se detalla en el ITT-CNSP-270: Control de calidad Interno para susceptibilidad a drogas antituberculosis de primera y segunda línea por el método de las proporciones agar en placa. Donde se utilizan:
- Cepas de referencia H37Rv pan sensible, resistente a Isoniacida y mono resistente a Rifampicina.
- Esta operación se realiza para cada lote de placas preparado y se realizan junto con la siembra de las cepas de rutina como un control de calidad interno de la siembra.
- Retirar de la congeladora -70°C, un criovial de cada cepa de referencia, dejar a temperatura ambiente para descongelar.
- Homogenizar la suspensión, en un agitador de tubos, dejar en reposo de 5 a 10 minutos.
- Sembrar en medio líquido 7H9 Middlebrook, al mismo día que se realiza la siembra de cepas en estudio.
- Incubar en estufa de 36-37°C de 5 a 7 días
- Realizar la prueba de susceptibilidad siguiendo los procedimientos técnicos descritos.
7.2 Control de calidad externo
El laboratorio de Micobacterias participa en el programa de evaluación externa de la calidad.
Nombre del método Nombre de la entidad
evaluador externo Frecuencia
Prueba de Susceptibilidad a drogas de 1ra y 2da línea Agar en Placa
Laboratorio de Referencia Supranacional Massachusetts State Laboratory Institute (MSLI)
1 vez por año
8. FORMULARIOS.
FOR-CNSP-050:Registro de Insumos para la preparación del medio MIDDLEBROOK 7H10. FOR-CNSP-051: Preparación y control de esterilidad del medio MIDDLEBROOK 7H10. FOR-CNSP-052: Insumos para la preparación de caldo medio MIDDLEBROOK 7H9.
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FOR-CNSP-053: Preparación y control de esterilidad caldo MIDDLEBROOK 7H9. FOR-CNSP-054: Registro de Insumos para la preparación de solución salina TWEEN. FOR-CNSP-055: Preparación y control de esterilidad de la solución salina TWEEN. (*) FOR-CNSP-100: Centro Nacional de Salud Pública - Prueba de susceptibilidad - hoja de trabajo.
9. ANEXOS
Anexo 01: Preparación de medios y reactivos para la prueba de susceptibilidad a drogas antituberculosis de primera y segunda línea – método de las proporciones agar en placa. Anexo 02: Preparación de soluciones stock de drogas de primera línea. Anexo 03: Concentraciones críticas de los medicamentos antituberculosis de segunda línea. Anexo 04: Preparación de soluciones de drogas de segunda línea. Anexo 05: Condiciones de conservación de las sustancias químicamente puras. Anexo 06: Preparación de caldo MIDDLEBROOK 7H9. Anexo 07: Preparación de solución salina TWEEN. Anexo 08: Preparación de la escala 0.5 Mc FARLAND.
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ANEXO 01
PREPARACIÓN DE MEDIOS Y REACTIVOS PARA LA PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS ANTITUBERCULOSIS DE PRIMERA Y SEGUNDA LÍNEA – MÉTODO
DE LAS PROPORCIONES AGAR EN PLACA
- Previamente sacar el OADC de la refrigeradora y dejar a temperatura ambiente. - Sacar las soluciones de stock de drogas de la congeladora -20° C, dejar a
temperatura de ambiente. - Desembolsar las placas estériles y rotular los cuadrantes de las placas con las
abreviaturas de cada una de las drogas. MEDIO AGAR 7H10
- Pesar 7.6 g. de Agar Middlebrook 7H10 y colocar en el matraz Erlenmeyer de 2 L. - Agregar 360 mL de agua destilada. - Adicionar 2 mL de glicerol - Disolver por movimientos circulares por uno a dos minutos. - Tapar la boca del matraz con papel aluminio y papel kraft. - Esterilizar el medio Agar Middlebrook 7H10, en una Autoclave a 121° C x 10 minutos. - Retirar el medio del Autoclave y colocar en la mesa de trabajo y dejar reposar a
temperatura ambiente x 10 minutos. - Colocar el matraz en Baño María a temperatura de 56°C±1 (aprox. 1 a 2 h). - Retirar el medio del Baño María y colocar dentro de la cabina de esterilidad. - Repartir el medio en matraz de 2 L a razón de 720 mL por cada matraz. - Colocar nuevamente el matraz en Baño Maria. - Sacar el matraz uno por uno, colocar la barra magnética estéril, agregar el OADC y
las concentraciones críticas de cada droga, según corresponde. - Colocar el matraz sobre la placa caliente (Hot Plate) a 56 °C x 2 minutos, para
homogenizar el medio. - Retirar el matraz del hot plate y colocar dentro de la cabina, destapar el matraz e
introducir asépticamente la manguera de la jeringa dispensadora, eliminar el aire existente, para evitar la formación de burbujas.
- Dispensar 4.5 mL de medio por cada cuadrante de acuerdo a la rotulación y apilar ordenadamente en grupos de 10 placas.
- Dejar las placas en la cabina en funcionamiento y con la luz apagada x 2 horas, para solidificar el medio.
Conservación de medios Agar en placa:
- Después de las 2 horas, colocar las placas en posición invertida en bolsas de
plástico sellar y rotular indicando: N° de lote, Fecha de preparación Fecha de expiración.
- Guardar las placas en refrigeración a la temperatura de 2 a 8°C. - Las placas pueden almacenarse hasta por 3 semanas.
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Nota: - Es muy importante que el matraz este expuesto a 56 °C de 1 a 2 h , para
estabilizar la temperatura y no afectar la actividad de las drogas ni al enriquecedor OADC.
- Las placas de 7H10 cuando están expuestas a los rayos solares producen derivados de formaldehído que es tóxico a organismos biológicos.
PREPARACIÓN DE CONCENTRACIÓN.- Patrón universal de la potencia de cada droga, cuando no indica en el inserto.
Droga
µg de sustancia activa por mg
Isoniacida (INH) 1000
Dihidroestreptomicina Sesquisulfato (SM) 800
Rifampicina (RIF) 1000
Ethambutol Dihidrochloride (EMB) 890
Acido Para Aminosalicilico sal sódica (PAS)
877
Kanamicina Sulfato (KN) 700
Capreomicina Sulfato (CAP) 885
Levofloxacin (LEV) 1000
Concentraciones críticas de las drogas de Primera Línea
Medicamento
Concentración Crítica
Isoniacida (INH) 0.2 ug/ mL
Isoniacida (INH) 1.0 ug/ mL
Rifampicina (RF) 1.0 ug/ mL
Ethambutol Dihidrochloride (EMB) 5.0 ug/ mL
Dihidroestreptomicina Sesquisulfato (SM)
2.0 ug/ mL
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ANEXO 02
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES STOCK DE DROGAS DE PRIMERA LÍNEA
Droga Peso (mg)
Solvente Volumen Solvente
(ml)
Concentración Final
( µg/mL)
Isoniacida 100 Agua
destilada 10 10 000
Dihidroestreptomicina sesquisulfato
100 Agua
destilada 10 10 000
Rifampicina 100 Dimethyl Sulfoxide
10 10 000
Ethambutol Dihidrochloride
100 Agua
destilada 10 10 000
a) Isoniacida (INH).
Preparación de Solución stock.-
- Pesar 100 mg de droga químicamente pura en una balanza analítica. - Colocar en un tubo de polipropileno con tapa rosca estéril de 15 mL - Disolver la droga agregando 10 mL de agua destilada estéril - Mezclar en vórtex hasta su disolución. - Esterilizar por filtración usando filtro Millipore 0.22 micras.
Concentración de la solución stock: 10 000 µg/mL
Preparación de Diluciones.-
Dilución A. - Diluir 1 mL de la solución stock en 9 mL de agua destilada estéril Concentración: 1 000 µg/mL Dilución B. - Diluir 1 mL de la dilución A (1 000 µg/mL) en 9 mL de agua destilada estéril - Concentración: 1 00 µg/mL - Añadir 4 mL de la concentración 1 00 µg/mL a 400 mL de medio 7H10 - Concentración final: 1.0 µg/mL - Dilución C. - Diluir 2 mL de la dilución B (1 00 µg/mL) en 8 mL de agua destilada estéril
Concentración: 20 µg/mL. - Añadir 4 mL de la concentración 20 µg/mL a 4 00 mL de medio Concentración
final: 0.2 µg/mL
Nota: La droga Isoniacida es bastante inestable por tanto debe prepararse el mismo día en que se va a adicionar al medio y desechar el sobrante.
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Esterilización de la solución stock por filtración.
- Usar una jeringa descartable estéril de 10 mL, sacar la jeringa de su envoltura, retirar la aguja y el embolo de la jeringa, poner el filtro Millipore en la jeringa, colocar en la boca del tubo de polipropileno de 15 mL estéril y fijar el filtro usando cinta adhesiva.
- Verter los 10 mL de droga dentro de la jeringa y dejar filtrar por gravedad. b) Ethambutol Dihidrochloride (EMB)
Preparación de Solución stock
- Pesar 100 mg de la droga químicamente pura en una balanza analítica. - Colocar en tubo de polipropileno estéril de 15 mL - Disolver la droga agregando 10 mL de agua destilada estéril , - Esterilizar por filtración usando filtros 0.22 micras - Mezclar en el vórtex hasta su disolución.
Concentración de la solución stock: 10 000 µg/mL
- Alicuotar la solución stock en tubos de polipropileno estéril de 15 mL a razón de
1 mL por tubo. - Sellar la tapa de los tubos con parafilm. - Rotular el tubo con el nombre de la droga y la fecha de preparación. - Conservar a – 68°C a –70°C - Utilizar dentro de los 6 meses.
Preparación de Diluciones.-
- Retirar la alícuota de la droga de la congeladora -70°C y dejar a temperatura
ambiente para descongelar. - Diluir 1 mL de la alícuota agregando 9 mL de agua destilada estéril (1:10) - Mezclar en el vórtex
Concentración: 1000 µg/mL
- Añadir 2 mL de la concentración 1000 µg/mL a 4 00 mL de medio
Concentración final: 5 µg/mL
c) Rifampicina (RIF):
Preparación de Solución stock.-
- Pesar 100 mg de droga químicamente pura en una balanza analítica. - Colocar en tubo de polipropileno estéril de 15 mL - Disolver con 10 mL de DIMETHYL SULFÓXIDO
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Concentración stock: 10 000 µg/mL
- No requiere esterilizar por filtración - Alícuotar la solución stock en tubos de polipropileno estériles de 15 mL a razón
de 1 mL por tubo. - Sellar la tapa de los tubos con parafilm. - Rotular el tubo con el nombre de la droga y la fecha de preparación. - Guardar las alícuotas en una congeladora a –70°C - Utilizar dentro de los 6 meses.
Preparación de Diluciones.- Dilución A. - Retirar de la congeladora -70°C una alícuota y dejar a temperatura ambiente para
descongelar.
- Diluir 1 mL de solución stock agregando 9 mL de agua destilada estéril (1:10) y homogenizar manualmente por rotación, para evitar la formación de burbujas. Concentración : 1000 µg/mL.
Dilución B. - Diluir 1 mL de dilución A, agregando 9 mL de agua destilada estéril (1:10) y
homogenizar manualmente por rotación, para evitar la formación de burbujas. Concentración : 100 µg/mL.
- Añadir 4 mL de la concentración 100 µg/mL a 4 00 mL de medio Concentración final : 1.0 µg/mL
d) Dihidroestreptomicina Sesquisulfato (SM):
Preparación de Solución stock.- - Pesar 100 mg de droga químicamente pura en una balanza analítica. - Colocar en tubo de polipropileno estéril de 15 mL - Disolver la droga agregando 10 mL de agua destilada estéril - Mezclar en un vórtex hasta su disolución
Esterilizar por filtración usando filtro millipore 0.22 micrones
Concentración :10,000 µg/mL. - Alicuotar la solución stock en tubos de polipropileno estéril de 15 mL a razón de 1
mL por tubo. - Sellar la tapa de los tubos con parafilm. - Rotular el tubo con el nombre de la droga y la fecha de preparación. - Guardar las alícuotas en una congeladora a –70°C - Utilizar dentro de los 6 meses.
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Preparación de Diluciones.- Dilución A. - Retirar la alícuota de -70°C y dejar a temperatura ambiente para descongelar. - Diluir 1 mL de solución stock, agregando 9 mL de agua destilada estéril (1:10) - Mezclar en el vórtex - Concentración : 1000 µg/mL.
Dilución B. - Diluir 1 mL de dilución A, agregando 9 mL de agua destilada estéril (1:10) - Mezclar en un vórtex
Concentración : 100 µg/mL .
- Añadir 8 mL de la concentración 100 µg/mL a 4 00 mL de medio Concentración final : 2.0 µg/mL
e) Ethionamida (ETH) :
Preparación de Solución stock.-
- Pesar 100 mg de droga químicamente pura en una balanza analítica - Colocar en tubo de polipropileno con tapa rosca estéril de 15 mL - Disolver en 10 mL de DIMETHYL SULFOXIDE - Mezclar en el vórtex - Concentración solución stock : 10 000 µg/mL - Alicuotar la solución stock en tubos de polipropileno estéril de 15 mL a razón de
1 mL por tubo. - Sellar la tapa de los tubos con parafilm. - Rotular los tubos con el nombre de la droga y la fecha de preparación. - Guardar las alícuotas en una congeladora a –70°C - Utilizar dentro de los 6 meses. Nota. La Ethionamida es sensible a la luz, se recomienda cubrir con papel aluminio.
Preparación de la Dilución.-
- Retirar de la congeladora -70°C una alícuota y dejar a temperatura ambiente para descongelar.
- Diluir 1 mL de solución stock agregando 9 mL de agua destilada estéril (1:10) - Mezclar en el vórtex - Concentración : 1000 µg/mL (dilución 1/10 ) - Añadir 2 mL de la concentración 1000 ug/mL a 400 mL de medio de cultivo. - Concentración final: 5 µg/mL
f) Kanamicina Sulfato (KM). La potencia varía entre lotes de fabricación
Preparación de la solución stock:
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Ejemplo: Kanamicina lote # xxx. Potencia = 794
Utilizar la fórmula:
10000 x 10 = xxx mg. Kanamicina Sulfato Potencia
10000 X 10 = 125,94 mg. 794 (=j=)
- Pesar 125,94 mg de droga químicamente pura en una balanza analítica - Colocar en un tubo de polipropileno estéril de 15 mL - Disolver en 10 mL de agua destilada estéril. - Mezclar bien en un vórtex . - Esterilizar por filtración usando filtro Millipore 0.22 micrones
Concentración solución stock: 10 000 µg/mL
- Alicuotar la solución stock en tubos de polipropileno estéril x 15 mL de
capacidad a razón de 1 mL/tubo. - Sellar la tapa de los tubos con parafilm. - Rotular los tubos con el nombre de la droga y la fecha de preparación. - Guardar las alícuotas en una congeladora a –70°C - Utilizar dentro de los 6 meses. Preparación de Diluciones.-
- Retirar de la congeladora -70°C una alícuota y dejar descongelar a temperatura
ambiente. - Diluir 1 mL de la alícuota agregando 9 mL de agua destilada estéril - Mezclar bien usando un vórtex. - Concentración: 1000 µg/mL. - Añadir 2 mL de esta dilución a 400 mL de medio de cultivo 7H10
Concentración final: 5 µg/mL
g) Acido Para amino Salicilico (PAS) (Potencia = 1000 mg/g.)
Preparación de la solución stock:
- Pesar 100 mg de droga químicamente pura PAS en una balanza analítica y colocar en un tubo de polipropileno estéril de 15 mL
- Adicionar 10 mL de 1% Hidróxido de Sodio estéril para su disolución - Mezclar bien en un vórtex hasta su disolución. - Esterilizar por filtración usando filtro millipore 0.22 micras
Concentración de solución stock: 10 000 µg/mL
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- Alicuotar la solución stock en tubos de polipropileno estéril x 15 mL de
capacidad a razón de 1 mL/tubo. - Sellar la tapa de los tubos con parafilm. - Rotular los tubos con el nombre de la droga y la fecha de preparación. - Guardar las alícuotas en una congeladora a –70°C - Utilizar dentro de los 6 meses.
Preparación de Diluciones.-
- Retirar de la congeladora de -70° C y dejar descongelar a temperatura
ambiente. - Diluir 1 mL de la alícuota agregando 9 mL de agua destilada estéril - Concentración:1000 µg/mL. - Añadir 3.2 mL de PAS a 400 mL de medio de cultivo 7H10.
Concentración Final: 8 µg/mL
Nota: Preparación de Hidróxido de Sodio al 1%
- Pesar en una balanza analítica 1 g de Hidróxido de Sodio (NaOH) - Disolver en 100 mL de agua destilada - Esterilizar en autoclave a 121°C x 15 minutos
Esta solución se prepara cada vez que se requiera h) Levofloxacine (LEV)
Preparación de la solución stock:
- Pesar 100 mg de droga químicamente pura LEV en una balanza analítica y colocar en un tubo de polipropileno estéril de 15 mL
- Adicionar 10 mL de agua destilada estéril para su disolución. - Mezclar bien en un vórtex hasta su disolución. - Esterilizar por filtración usando filtro Millipore 0.22 micras - Concentración solución stock : 10 000 µg/mL - Alicuotar la solución stock en tubos de polipropileno estéril de 15 mL a razón de
1 mL por tubo. - Sellar la tapa de los tubos con parafilm. - Rotular los tubos con el nombre de la droga y la fecha de preparación. - Guardar las alícuotas en una congeladora a –70°C - Utilizar dentro de los 6 meses.
Preparación de Diluciones.- Dilución A : - Retirar de la congeladora -70°C una alícuota y dejar descongelar a temperatura
ambiente. - Diluir 1 mL de la alícuota agregando 9 mL de agua destilada estéril - Mezclar bien usando un vórtex. - Concentración: 1000 µg/mL.
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Dilución B: - Diluir 1 mL de dilución A, agregando 9 mL de agua destilada estéril (1:10) y
homogenizar utilizando vórtex. Concentración : 100 µg/mL.
- Añadir 4 mL de la concentración 100 µg/mL a 4 00 mL de medio
Concentración final : 1.0 µg/mL
i) Capreomicina Sulfato (CAP). Preparación de la solución stock: Ejemplo: Capreomicina lote # xxx. Potencia = 855 Utilizar la fórmula : 10000 x 10 = xxx mg.
Potencia
10000 X 10 = 116.95 mg. 855
- Pesar 116.95 mg de droga químicamente pura en una balanza analítica - Colocar un tubo de polipropileno estéril de 15 mL - Disolver 116,95 mg de Capreomicina en 10 mL de agua destilada estéril - Disolver en 10 mL de agua destilada estéril - Mezclar en un vortex. - Esterilizar por filtración usando un filtro de membrana de 0.22 micras Concentración de la solución stock :10 000 µg/mL. - Alicuotar la solución stock 1 mL en tubos de polipropileno estéril x 15 mL. - Sellar la tapa de los tubos con parafilm. - Rotular los tubos con el nombre y la fecha de preparación. - Guardar em la congeladora a -70° C - Utilizar dentro de los 6 meses.
Preparación de la Dilución:
- Retirar de la congeladora -70° C una alícuota de la solución stock y dejar
descongelar a temperatura ambiente. - Disolver 1 mL de la alícuota en 9 mL de agua destilada estéril, - Mezclar bien un vórtex.
Concentración : 1000 µg/mL. - Añadir 4 mL capreomicina de 1000µg/mL a los 400 mL de medio
Concentración final: 10 µg/mL
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j) Cicloserina (CS) (Potencia = 1,000 mg/g).
Preparación de la solución stock:
- Pesar 30 mg de droga químicamente pura en una balanza analítica - Colocar en tubo de polipropileno estéril de 15 mL - Disolver en 10 mL de agua destilada estéril - Mezclar en el vórtex - Esterilizar por filtración usando un filtro de membrana de 0.22 micras
Concentración solución stock : 3 000 µg/mL
- Adicionar 4 mL Cicloserina de 3000 µg/mL a 400 mL de medio
Concentración final: 30 µg/mL
k) Thiophene - Acido Carboxilico hidracida (TCH),
Potencia = 1,000 mg/g).
Preparación de la solución stock:
- Pesar 100 mg de droga químicamente pura en una balanza analítica - Colocar en tubo de polipropileno con tapa rosca estéril de 15 mL - Disolver en 10 mL de agua destilada estéril - Mezclar en un vórtex por aproximadamente 20 minutos (el TCH es difícil de
disolver). - Esterilizar por filtración usando un filtro de membrana de 0.22 micras
Concentración solución stock : 10 000 µg/mL
- Alicuotar la solución stock en tubos de polipropileno estéril de 15 mL a razón de 1 mL/tubo.
- Sellar la tapa de los tubos con parafilm. - Rotular los tubos con el nombre y la fecha de preparación. - Guardar en una congeladora a -70° C - Utilizar dentro de los 6 meses.
Preparación de la Dilución: Dilución A. - Retirar de la congeladora -70°C una alícuota de la solución stock y descongelar a
temperatura ambiente. - Diluir 1 mL de la alícuota agregando 9 mL de agua destilada estéril - Mezclar en el vortex x 30 segundos
Concentración :1000 µg/mL.
Dilución B. - Diluir 1 mL de la dilución A en 9 mL de agua destilada estéril
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- Mezclar bien en un vortex. Concentración : 100 µg/mL.
- Añadir 4 mL de TCH (100 µg/mL) a 400 mL de medio . Concentración Final: 1 µg/mL de TCH.
ANEXO 03 CONCENTRACIONES CRÍTICAS DE LOS MEDICAMENTOS ANTITUBERCULOSIS DE
SEGUNDA LÍNEA
Drogas de Segunda Línea Concentración
Crítica
ETH
5 µg/ mL
KM
5 µg/ mL
PAS
8 µg/ mL
LEV
1 µg/ mL
CAP
10 µg/mL
CS
30 µg/mL
ANEXO 04 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE DROGAS DE SEGUNDA LÍNEA
Drogas Cant (mg)
Vol. Sol. (mL)
Sol. Stock µg/mL
Dilución Sol.
Trabajo µg/mL
Vol Medio 400 mL
Conc. Crítica µg/mL
CICLOSERINA 30 10 mL Agua
destilada 3000 - 3000 4 30
CAP SULFATO * 10 mL Agua
destilada 10000 1:10 1000 4 10
ETH 100 10 mL DMSO
10000 1:10 1000 2 5
KM SULFATO * 10 mL Agua destilada
10000 1:10 1000 2 5
LEV * 10 mL Agua destilada
10000 1:10 1000 4 1
P.A.S 100 10 mL 1% NaOH
10000 1:10 1000 3.2 8
TCH
100 10 mL Agua destilada
10000 - 100 4
1
* Potencia variable con cada lote. Calcular el peso necesario para preparar 10 mL (10 000 µg/mL)
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ANEXO 05
CONDICIONES DE CONSERVACIÓN DE LAS SUSTANCIAS QUÍMICAMENTE PURAS
Droga
Temperatura
Isoniacida Temperatura ambiente
Estreptomicina 2-8 °C
Etambutol Temperatura ambiente
Rifampicina 2-8 °C
Cicloserina 2-8 °C
Capreomicina Sulfato -20 °C
Ethionamida 2-8 °C
Kanamicina Sulfato Temperatura ambiente
Levofloxacin Temperatura ambiente
Acido Paraminosalisilico 2-8 °C
Tiophene Acido Carboxilico Hidracida 2-8 °C
Conservar en desecadores a la temperatura indicada.
ANEXO 06
PREPARACIÓN DE CALDO MIDDLEBROOK 7H9 Ingredientes:
- Caldo 7H9 …………………… 4,7 g - Glicerina (*) …………………… 2 mL - Agua destilada estéril…..… 900 mL - ADC (Enriquecimiento)…… 100 mL (*) La Glicerina se adiciona de acuerdo al inserto del producto
Procedimiento - Pesar 4.7 g de Middlebrook 7H9 , incorporar a un Matraz Erlenmeyer de 2 L, - Añadir 900 mL de agua destilada - Adicionar 2 mL de Glicerina - Mezclar hasta disolver completamente - Luego autoclavar a 121°C x10’ - Dejar enfriar a medio ambiente - Añadir asépticamente 100 mL de ADC, cuando el medio esté a 45°C - Ajustar el pH (6.6) del caldo - Dispensar asépticamente en tubos estériles de 16 x 125 mm tapa rosca a razón de 5
mL por tubo. Conservación
- Colocar los tubos en bolsas de plástico y rotular el nombre del medio, número de - lote.
fecha de preparación y fecha de expiración
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- Conservar en refrigeración de 2-8°C - Utilizar el caldo Middlebrook 7H9 dentro de los 90 días de su preparación
Control de esterilidad del caldo 7H9
- Seleccionar al azar 5 tubos con caldo 7H9 del lote de reciente preparación y colocar a la incubadora a 37 °C por 72 horas.
- Hacer la lectura y observar si existe evidencias de contaminación
ANEXO 07
PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN SALINA TWEEN Ingredientes:
- Cloruro de Sodio (NaCl) …………… 17.0 g - Tween 80 ……………………………. 2.0 mL - Agua destilada estéril….…………… 2000 mL
Procedimiento:
- Pesar 17.0 g de NaCl, disolver en 2000 mL de agua destilada. - Adicionar 2.0 mL de Tween 80 - Mezclar en un Hot Plate ( Solución se observará lechoso) - Autoclavar x 20’ a 121°C - Dispensar en tubos estériles de 16 x 125 con tapa rosca a razón de 4.5 mL por tubo
Conservación - Colocar los tubos en bolsas de plástico y rotular el nombre de la Solución Salina
Tween, el N° de lote, fecha de preparación y fecha de expiración. - Conservar en refrigeración de 2-8°C por 3 meses.
Control de esterilidad de la Solución salina Tween
- Seleccionar al azar 5 tubos de la solución salina Tween del lote de reciente preparación y colocar a la incubadora a 36-37 °C por 72 horas.
- Hacer la lectura y observar si existe evidencias de contaminación
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ANEXO 08
PREPARACIÓN DE LA ESCALA 0.5 Mc FARLAND
Reactivos: BaCl2.2H2O PM 244.28 H2SO4 97 % Q.P. Procedimiento
- Agregar 0.5 mL de BaCl2 0.048 M (1.175% P/V BaCl2.2H2O ) a 99.5 mL de H2SO4 0.18 M ( 1% v/v). Mientras agrega el BaCl2 mantenga la suspensión continúa.
- Verificar la densidad correcta del estándar usando un espectrofotómetro - El estándar 0.5 de escala Mc Farland , absorbancia de 0.08 – 0.13 a 625 nm
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