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Úlceras neuropáticas e isquémicas infectadas

en pie diabético.

Tesis doctoralCarolina Padrós Sánchez

PORTADAÚlceras neuropáticas e isquémicas infectadas

en pie diabético.



en pie diabético.


Memoria presentada por Carolina Padrós Sánchez para optar al grado

de doctor por la Universitat de Barcelona

Úlceras neuropáticas e isquémicas infectadas en pie diabético.

Úlceras neuropáticas e isquémicas infectadas en pie diabético.

Miguel Viñas Ciordia, Catedrático de Universidad y Teresa Vinuesa Aumedes Profesora Titular de Universidad, ambos del Departamento de Patología y Terapéutica Experimental de la Facultat de Medicina de la Universitat de Barcelona,

C E R T I F I C A N,

Que la tesis doctoral presentada por CAROLINA PADROS SANCHEZ, se ha desarrollado en el laboratorio de Microbiología Molecular y Antimicrobianos de este departamento bajo nuestra supervisión.

Que el trabajo cumple a nuestro juicio los requerimientos formales y conceptuales necesarios para ser defendida ante el tribunal correspondiente.

Y para que conste firman el presente en l’Hospitalet de Llobregat el día 12 de Enero de 2017.

Prof. Dr. Miguel ViñasCiordia Dra. Teresa Vinuesa Aumedes

A la meva mare. La dona, més valenta que conec i que sempre ha estat al meu costat

Agradecimientos

Cuando llega el momento dar las gracias, uno se da cuenta de la cantidad de personas que, de un modo u otro, le han ayudado. Son tantos que me resultaría imposible mencionarlos a todos, pero creo que debo citar a algunos de ellos. En primer lugar a todos los familiares y amigos que me han soportado y animado durante el tiempo que he dedicado a desarrollar este trabajo; si, Érica, estoy hablando especialmente de ti, que tanto tiempo has dedicado a ayudarme en el trabajo experimental y también de ti, Nico, que no has parado de darme ánimos para que siguiera adelante con el trabajo y por tu ayuda en la estadística. Tampoco puedo olvidarme de Enric un buen amigo que en los momentos de desesperación me ha dado confianza tratando de convencerme de que era capaz de esto y de mucho más.

A todo el equipo del Laboratorio de Microbiología de la Universidad de Barcelona, por su paciencia, y en especial al Dr. Miguel Viñas. Estoy segura que si no hubiera sido por él, este trabajo no hubiera llegado a su fin, quizás ni tan siquiera se hubiera iniciado. Él con su interés, paciencia y dedicación, muchas veces a horas intempestivas, me ha apoyado y animado para que siguiera trabajando. A la Dra. Teresa Vinuesa quien me ha enseñado toda la microbiología médica que sé.

A todos mis compañeros del Departamento de Podología, que no han dejado en ningún momento de darme ánimos

Al programa INNPACTO concretamente al proyecto FIBRODRESS, estimulado por Praxis Phamaceuticals y financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad de España.

Al Prof. Dr. Fernando Albericio y a la Dra. Miriam Royo y su equipo por la síntesis del péptido LL-37.

A todos ellos y a muchos más que como ya escribí no puedo citar aquí, gracias de nuevo.

Agradecimientos

Presentación

PresentaciónLa práctica clínica de la podología, a la que dedico mi actividad en el Hospital Podológico de la Universitat de Barcelona, y la propia evolución profesional, me han dirigido, con el transcurrir de los años, a especializarme en el tratamiento del pie diabético. Esta “especialización” está en el origen de muchas de las preguntas a las que esta tesis intenta dar alguna respuesta, o sobre las que, por lo menos, arrojar alguna luz.Hace más de 10 años, a modo de una primera aproximación intentamos, con el Prof. Miguel Viñas, conocer algo acerca de las bacterias presentes en las úlceras plantares. Este trabajo se presentó para la obtención del Diploma de Estudios Avanzados y se plasmó en algunas contribuciones a congresos. Cinco años después iniciamos el seguimiento sistemático de una población diabética con úlceras en los pies. De este seguimiento, de los trabajos experimentales en el laboratorio de Microbiología y del procesado posterior de los datos surge el trabajo que ahora se presenta en formato de tesis doctoral. Es, por lo tanto, una tesis doctoral atípica, no al inicio de una carrera personal, asistencial y científica sino en la etapa de madurez de la misma.

L’Hospitalet de Llobregat, 2016

Índice

1. Introducción ..................................................................................................................... 27 1.1 Diabetes Mellitus ..................................................................................................................... 27 1.2 Importancia de la enfermedad ......................................................................................................... 28 1.3 Clasificación ..................................................................................................................... 31 1.4 Complicaciones más frecuentemente asociadas a la Diabetes Mellitus ..................................... 33 1.5 Pie Diabético .................................................................................................................... 35 1.5.1 El Pie Diabético ..................................................................................................................... 35 1.5.2 Epidemiología del Pie Diabético ........................................................................................... 35 1.5.3 Fisiopatología del Pie Diabético ............................................................................................ 36 1.5.4 “La Glicemia” Factor básico o inicial .................................................................................... 36 1.5.5 “Neuropatía, Microangiopatía, y Macroangiopatía”Factores Primarios .......................... 36 1.5.5.1 Tipos Neuropatía que afectan al pie diabético: ....................................... 37 1.5.5.2 Micro- y Macro-angiopatías ...................................................................... 38 1.5.6 Factores secundarios (Hematológicos, Inmunológicos, Articulares, y Dermatológicos) ............................................................................................................ 39 1.5.7 Factores extrínsecos e intrínsecos. (Factores Desencadenantes) ............. 40 1.6 Infección del Pie Diabético .............................................................................................................. 40 1.6.1 Manifestaciones clínicas de la infección ............................................................................... 43 1.7 El Pie diabético como diana de la infección .................................................................................. 46 1.7.1 Bacterias más frecuentemente implicadas ........................................................................... 46 1.7.1.1 - S. aureus ..................................................................................................... 47 1.7.1.2 - Streptococcus. (ß-hemolíticos) ................................................................ 48 1.7.1.3 - S. pyogenes ................................................................................................. 49 1.7.1.4 - S. agalactiae ............................................................................................... 49 1.7.1.5 - Enterococcus .............................................................................................. 50 1.7.1.6 - Pseudomonas aeruginosa ......................................................................... 50 1.7.1.7 - Enterobacteriaceae .................................................................................... 51 1.7.1.7.1 - Escherichia coli (Bacilo de Escherich) ................................. 51 1.7.1.7.2 - Klebsiella (Bacilo de Friedlander) ........................................ 51 1.7.1.7.3 - Enterobacter ............................................................................ 52 1.7.1.7.4 - Proteus ..................................................................................... 52 1.7.1.8 Bacilos Gram negativos anaeróbios estrictos (Bacteroides) .................. 52 1.7.2 Levaduras más frecuentemente implicadas ......................................................................... 53 1.7.2.1 - Candida albicans ...................................................................................... 53 1.7.2.2 - Candida parapsilosis ................................................................................. 54 1.8 Patrones clínicos de la Infección ..................................................................................................... 54 1.9 Péptidos antimicrobianos ................................................................................................................. 56 1.10 Polifenoles ..................................................................................................................... 57

2. Hipótesis y Objetivos ...........................................................................................................61

3. Material y Métodos ...........................................................................................................65 3.1 Diseño ...........................................................................................................65 3.2 Población de estudio ...........................................................................................................66 3.2.1 Criterios de inclusión .................................................................................................66 3.2.2 Criterios de exclusión ................................................................................................66 3.2.3 Número de sujetos previstos .....................................................................................67 3.2.4 Criterios de retirada ...................................................................................................67 3.3 Aspectos éticos y legales .....................................................................................................68 3.3.1 Informe de la Comisión de bioética de la Universidad de Barcelona .................68 3.3.2 Consentimiento Informado ......................................................................................68 3.4 Toma de muestras ...........................................................................................................68 3.5 Medios de cultivo ...........................................................................................................71 3.6 Procedimientos de laboratorio ...........................................................................................76 3.6.1 Cultivos ...........................................................................................................76 3.6.2 Incubación ...........................................................................................................76 3.6.3 Identicación ...........................................................................................................77 3.6.3.1 Examen macroscópico .....................................................................77 3.6.3.2 Examen microscópico .....................................................................77 3.6.3.3 Pruebas bioquímicas ........................................................................77 3.7.3.4 Conservación y almacenaje de las cepas .......................................79 3.7.4 Susceptibilidad a los antibióticos .............................................................................79 3.7.4.1 Antibióticos ensayados ....................................................................80 3.7.4.2 Determinación de la actividad de la Oleuropeína .......................84 3.7.4.3 Determinación de la actividad del péptido antimicrobiano LL-37 ...........................................................................................................85

3.7.4.4 Experimentos de determinación de la actividad antimicrobiana de asociaciones de antimicrobianos ...........................................................86

3.7.4.5 Estudio de la Sinergia entre la Oleuropeína y el Péptido LL-37 ...........................................................................................................86 3.7.4.6 Efecto de la Oleuropeína sobre la formación de biofilm ............88

4. Resultados y Discusión ...........................................................................................................91 4.1. Datos epidemiología ...........................................................................................................91 4.1.1 Edad ...........................................................................................................91 4.1.2 Sexo ...........................................................................................................92 4.1.3 Edad/Sexo ...........................................................................................................93 4.1.4 Antigüedad de la Patología .......................................................................................94

4.1.5 Tipo de Diabetes ..................................................................................................................... 95 4.1.6 Sexo/Tipo de Diabetes ............................................................................................................. 95 4.1.7 Tiempo/ Tipo ..................................................................................................................... 96 4.1.8 Grados de ulceración ............................................................................................................... 97 4.1.9 Relevancia del cuidador .......................................................................................................... 97 4.1.10 Localización de las úlceras ................................................................................................... 100 4.1.11Vasculopatía/Neuropatía ....................................................................................................... 100 4.1.12 Tipo/Localización de la lesión ............................................................................................. 101 4.1.13 Número de complicaciones ................................................................................................. 102 4.2 Aislamiento de bacterias de las úlceras plantares .................................................................. 104 4.2.1 Aislamientos .................................................................................................................... 104 4.2.2 Microorganismos aislados ..................................................................................................... 105 4.2.3 Susceptibilidad a los antimicrobianos de los aislados de Pseudomonas ........................... 109 4.2.4 Susceptibilidad a los antimicrobianos de los aislados de S. aureus .................................. 110 4.2.5 Actividad antimicrobiana de la Oleuropeína frente Staphylococus aureus ...................... 111 4.2.6 Efecto de la Oleuropeína sobre la formación del biofilm................................................... 113 4.2.7 Actividad antimicrobiana del Péptido LL-37 frente a cepas de Staphylococcus aureus . 115 4.2.8 Interacciones entre LL-37 y la Oleuropeína......................................................................... 116 4.2.9 Limitaciones del estudio ......................................................................................................... 119

5. Conclusiones .................................................................................................................... 125

6. Abreviaciones .................................................................................................................... 129

7. Anexos .................................................................................................................... 133

8. Bibliografía .................................................................................................................... 143

Introducción

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1. Introducción

1.1 Diabetes MellitusBajo la denominación Diabetes Mellitus (DM) se agrupan una serie de trastornos metabólicos de carácter crónico caracterizados por la hiperglucemia, una condición común en los afectados y que, como veremos, contribuye al desarrollo de complicaciones macrovasculares, microvasculares y neuropáticas.

Esta enfermedad es una de las principales causas de mortalidad tanto en las sociedades desarrolladas como las que se encuentran en vías de desarrollo. En general se definen dos tipos principales de DM denominadas tipo 1 (DM1) y tipo 2 (DM2).

La DM1 se caracteriza por una destrucción completa de las células β, esta destrucción es debida, en general, a procesos autoinmunes que hacen que el propio sistema inmunológico “por error” proceda a la destrucción de las células productoras de insulina, en consecuencia en este tipo de DM1 se produce una falta total de insulina. Por su parte la DM2, no insulinodependiente, aparece como consecuencia de un déficit progresivo de secreción de insulina.

La enfermedad afecta a un número cada vez mayor de individuos, dándose un incremento moderado de DM1 y un incremento espectacular de DM2. La Organización Mundial de la Salud (OMS) relaciona estos incrementos con, (I) el crecimiento y envejecimiento de la población, (II) el incremento de obesidad, (III) los hábitos alimentarios poco saludables y finalmente, (IV ) el incremento de los modos de vida sedentarios. En pediatría se han descrito razones similares para explicar la DM2 emergente casi siempre asociada a la obesidad.

Por todo ello la DM en sus múltiples formas se va constituyendo en un problema de salud individual y pública de primer orden.

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La OMS define DM como una “….enfermedad crónica que aparece cuando el páncreas no produce insulina suficiente o cuando el organismo no utiliza eficazmente la insulina que produce. La insulina es una hormona que regula el azúcar en la sangre. El efecto de la diabetes no controlada es la hiperglucemia (aumento del azúcar en la sangre), que con el tiempo daña gravemente muchos órganos y sistemas, especialmente los nervios y los vasos sanguíneos.” (OMS, 2012)

1.2 Importancia de la enfermedad; consideraciones epidemiológicas. Las estimaciones en 2013 de la Federación Internacional de Diabetes (IDF) indican que la prevalencia estimada a nivel mundial se situaba en torno de 8,3% de adultos, por otro lado la organización mundial de la Salud (OMS) estima que del total de diabéticos un 10% corresponden a DM1 y el 90% restante a DM2. (OMS, 2012; IDF, 2013).

Se ha escrito que sufren DM aproximadamente 382 millones de individuos de los cuales aproximadamente el 80% reside en países con poblaciones con ingresos medios o bajos.

Las proyecciones estadísticas de la IDF permiten aventurar que, de seguir esta tendencia, en el año 2035 aproximadamente 592 millones de personas, o, lo que es lo mismo, un adulto de cada 10, sufrirá DM.

En otras palabras, podemos decir que la DM, aumentará en 10 millones de casos por año, con un incremento más acusado en los países en vías de desarrollo. (IDF, 2013). La IDF estima que cerca de la mitad de individuos que padecen DM no son conscientes de ello (de los cuales la gran mayoría son DM2).

Las consecuencias y costes asociados a la DM están bien estudiados, bien descritos y sus impactos sobre los sistemas sanitarios son conocidos. La DM es motivo de uso frecuente de los servicios de salud, pérdida de productividad y, finalmente, de discapacidad. Ello puede generar una carga considerable no sólo para los enfermos sino también para las personas relacionadas, las familias y, por ende, para la sociedad en general.

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Por otra parte los casos de DM no diagnosticada, que por tanto no se benefician de las ventajas del diagnóstico y del tratamiento precoz ni de la necesaria atención sanitaria, son causa de situaciones que conllevan pérdida de oportunidades, al tiempo que privan de obtener los beneficios potenciales de una detección y terapia temprana tanto en lo que respecta al estado de salud de los pacientes como al como a supervivencia (IDF, 2013). Algunos estudios sugieren que el gasto aproximado de la DM no diagnosticada es del orden de 18.000 millones de dólares al año sólo en los Estados Unidos. (Asociación Americana de diabetes (ADA), 2013).

A lo largo del año 2016 morirán a causa de la DM aproximadamente 5,1 millones de individuos de entre 20 y 79 años, lo que representa el 8,4 % del total de mortalidad por todas las causas a nivel global en este intervalo de edades. Parece oportuno resaltar aquí que un número similar de muertes son causadas por una serie de enfermedades infecciosas que se consideran prioritarias por los sistemas de salud de diferentes países.

Finalmente conviene resaltar que un 48% de los pacientes que mueren a causa de la diabetes tienen menos de 65 años.La DM y sus complicaciones principales se sitúan, en muchos países, entre las primeras causas de muerte prematura. La enorme dificultad del cálculo de muertes debidas a la diabetes hace que más de un tercio de los países no dispongan de datos fiables de mortalidad relacionados con la DM.

Por otra parte se ha descrito también que las medidas estadísticas rutinarias del estado de salud de las poblaciones subestiman el número de muertes por DM (IDF, 2013).

La dificultad básicamente estriba en que la causa directa de muerte está directamente relacionada con la DM pero el desconocimiento en muchos casos de la condición de diabético y en otros la insuficiencia de los detalles en las historias clínicas hace que la relación entre muertes y DM esté infravalorada.

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El ministerio de sanidad de España (MSSSI) considera que por cada paciente diabético conocido existe otro no diagnosticado, y que esta proporción aumenta significativamente con factores como la edad, el exceso de peso, la vida sedentaria, y otros: por lo que es esperable un incremento significativo de la población diabética en los próximos decenios. (MSSSI, 2012; Artola, 2012)

En Cataluña, la población estimada de individuos con DM es de unas 500.000 personas (un 8% del total) de acuerdo a los datos de la encuesta de salud de Cataluña (ESCA 2012). Además, es de destacar que anualmente se registran entre 250 y 270 casos nuevos de DM1 en individuos jóvenes (de menos de 30 años).

En el año 2012, el 7,8% de la población catalana mayor de 15 años declaraba que tenía DM, si separamos por sexo encontramos un 7,9% del total en hombres y un 7,7% en mujeres, es decir no se aprecian diferencias en lo que al sexo se refiere. El porcentaje aumenta con la edad y su aumento es claramente superior en edades que superan los 55 años. El conjunto de estos datos aumentan de modo constante: así en el periodo de 2010 a 2012 el porcentaje de los individuos que declaran ser diabéticos ha pasado del 5,7% al mencionado 7,8%, es decir un incremento de un 1 % anual.

Los datos de Cataluña muestran la importancia de ciertas variables sociales. Así es de destacar que las personas con estudios primarios o secundarios tienen más del doble de posibilidad de padecer DM que los ciudadanos con estudios universitarios (y esto tanto en la población masculina como la femenina). (Generalitat de Catalunya, enquesta de salut. 2013).

Aún con limitaciones para realizar los cálculos, los estudios que abordan la cuantificación de los costes asociados a la diabetes los sitúan en 2.531€ por paciente el primer año, y alcanzan 14.787€ para los casos que requieren amputación. (Ray et al., 2005).

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1.3 Clasificación. ▷ Diabetes mellitus tipo 1 (DM1).

▶ Diabetes autoinmune: La causa más frecuente, es una destrucción de las células ß-pancreáticas a causa de fenómenos autoinmunes. En principio puede debutar a cualquier edad, si bien lo más frecuente es que aparezca en edades tempanas. El inicio suele ser brusco, con la presencia de cetoacidosis, y, como se ha dicho principalmente en niños y adolescentes. Se inicia con una hiperglucemia moderada que puede evolucionar en algunos casos rápidamente a hiperglucemia severa y/o a cetoacidosis en presencia de infección o estrés.

▶ Diabetes idiopática: Es decir de etiología desconocida. Sólo algunos de los pacientes con DM1 pertenecen a este grupo; la mayoría son de origen africano o asiático. Existe un fuerte factor hereditario y al parecer no debe relacionarse con fenómenos autoinmunes. Los individuos con esta forma de diabetes pueden tener episodios de cetoacidosis, y presentar diversos grados de deficiencia insulínica entre los episodios. La necesidad absoluta de insulina puede ser intermitente de modo que aparece y desaparece por causas de difícil identificación. (Figuerola, 2003)

▷ Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2).

Puede aparecer en cualquier edad, aunque es habitual su inicio en la vida adulta, después de los 40 años. Se caracteriza por la resistencia a la insulina concomitante con un déficit relativo de insulina. La resistencia a la insulina es una condición en la que las células responden mal a su acción hormonal. De forma que aun cuando se produzca con normalidad, las células son incapaces de utilizarla. Se asocia esta resistencia con la producción deficitaria de la hormona. La acción sinérgica de ambas condiciones produce incrementos de glicemia. La obesidad es una condición que se da en el 80% de los pacientes de este grupo. El riesgo de desarrollar esta forma de DM aumenta con la edad, el peso y la falta de actividad física. Es

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más frecuente en mujeres con antecedentes de diabetes gestacional y en individuos con hipertensión o dislipemias. Suele tener un comienzo insidioso. La cetoacidosis es infrecuente, aunque pueden presentarla algunos individuos del grupo en situaciones de estrés o de infección. En la mayoría de los casos no se precisa insulina para el tratamiento, aunque puede requerirse para conseguir un buen control glucémico. En muchos casos se asociada a una fuerte predisposición genética, sin embargo este factor genético es complejo y no está claramente definido.

▷ Otros tipos específicos de Diabetes Mellitus (DM):

▶ Defectos genéticos de la función de las células beta: Estas formas de diabetes se caracterizan por un inicio de valores de hiperglucemia moderada a edades precoces de la vida. Son hereditarias, con herencia autosómica dominante.

▶ Defectos genéticos en la acción de la insulina: Bajo esta denominación se agrupan la resistencia insulínica tipo A, la diabetes lipoatrófica y algunas otras de menor incidencia.

▶ Enfermedades del páncreas exocrino: Pancreatitis, Hemocromatosis, Traumatismo/Pancrectomía, Neoplasias.

▶ Endocrinopatías: Ligadas a patologías tales como la acromegalia, la enfermedad de Cushing, el hipertiroidismo etc.

▶ Inducida por tóxicos: En algunas ocasiones hay que buscar el origen en el contacto con sustancias tóxicas tales como Vacor, Pentamidina, Acido nicotínico, Corticoides, etc. (Aznar Rodríguez et al.,2012)

▶ Infecciones: Algunas infecciones víricas se han descrito también como causas posibles, tal es el caso de la Rubéola transmitida de la madre al feto, y también la infección por citomegalovirus.

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▶ Otros síndromes genéticos asociados ocasionalmente con la diabetes son el síndrome de Down, la ataxia de Friedreich, la corea de Huntington. (Figuerola, 2003; Aznar Rodríguez et al., 2012)

▶ Diabetes Mellitus Gestacional: Es la DM que se inicia o se diagnostica por primera vez durante el embarazo. La prevalencia según estudios (Ben-Haroush et al., 2004), va del 1 al 14%. Las mujeres con DM gestacional tienen a corto, medio o largo plazo mayor riesgo de desarrollar DM sobre todo de tipo 2. (Deruelle et al.,2009)

1.4 Complicaciones más frecuentemente asociadas a la Diabetes Mellitus

▷ Retinopatía Diabética: Las complicaciones de la DM a nivel ocular son numerosas y complejas, pueden afectar a cualquier parte del ojo.

La retina es la estructura que se afecta con mayor frecuencia e importancia, aunque tanto el segmento anterior del ojo (córnea, cristalino, iris), como el nervio óptico y los nervios oculomotores pueden verse afectados; también aparece afectación arterial, lo que provoca la retinopatía diabética (Moreno et al., 2013). La población con DM tiene un riesgo de ceguera 25 veces superior a la población no diabética.

▷ Nefropatía Diabética: La nefropatía diabética constituye la causa más frecuente de enfermedad renal terminal en el mundo occidental. Aproximadamente el 35% de los pacientes con DM1 y el 10% de los pacientes con DM2 desarrollan nefropatía diabética. La microalbuminuria es el marcador de riesgo más potente de mortalidad, especialmente de origen renal en la DM2. El deterioro de la función renal del diabético es un proceso progresivo en el tiempo y que se manifiesta clínicamente en varios estadios. (Galcerán 2011)

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▷ Enfermedad Cardiovascular: La enfermedad cardiovascular (ECV) es la principal causa de mortalidad entre las personas diabéticas. El riesgo anual de muerte por ECV es 2 a 3 veces superior en personas diabéticas que en las que no lo son. Los diabéticos tienen 2 a 3 veces más riesgo de presentar enfermedad cerebrovascular o de arteriopatía coronaria y 5 veces más riesgo de presentar enfermedad vascular periférica que los individuos no diabéticos (Figuerola, 2003). Aproximadamente el 75-80% de los diabéticos adultos mueren a consecuencia directa de las complicaciones cardiovasculares (Sidney et al., 2012). La ECV no solo se da con mayor frecuencia en la población diabética, sino que su presentación es más precoz, de evolución más rápida y de mayor severidad que en los no diabéticos. (Luscher-Beckman et al., 2013; Ruiz 2012).

▷ Neuropatía Diabética: La extensión y severidad de la neuropatía diabética se relaciona directamente con el grado y duración de la hiperglucemia (MSSSI, 2012). El diagnóstico se basa en la anamnesis y la exploración física. Presenta diferentes formas clínicas de aparición. (Gómez Hoyos et al., 2012)

▶ Mononeuritis diabética.▶ Polineuritis diabética. ▶ Neuropatía diabética autónoma.

▶ Pie Diabético: Los problemas derivados de la patología del pie del paciente diabético constituyen uno de los objetivos prioritarios de la Declaración de St. Vincent y del Programa Nacional de Diabetes, siendo la principal causa de amputación no traumática como ya se ha mencionado. Los factores responsables de la lesión del pie pueden reducirse mediante una correcta educación del paciente (Nemcová y Hlinková, 2014). Asimismo, un diagnóstico precoz y el tratamiento adecuado de las lesiones, pueden asegurar la integridad del pie en la mayor parte de los pacientes, evitando así la necesidad de gran número de amputaciones. Este es el tema central de este trabajo de doctorado.

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1.5 Pie Diabético 1.5.1 El Pie Diabético.Hablamos de pie diabético para referirnos a un escenario clínico frecuente que se da en diabéticos. La Sociedad Española de Angiología y Cirugía Vascular define el pie diabético “como una alteración clínica de base etiopatogénica neuropática e inducida por una hiperglucemia mantenida, en la que con o sin coexistencia de isquemia, y previo desencadenante traumático, se produce lesión y/o ulceración del pie”. (Aragón y Sánchez, 2002).

Por su parte en el documento de Consenso Internacional del pie diabético IWGDF se define el pie diabético como, “La infección, ulceración y/o destrucción de los tejidos profundos relacionados con alteraciones neurológicas y diferentes grados de enfermedad vascular periférica en las extremidades inferiores” (IWGDF, 2011).Es por lo tanto una entidad bien determinada que podría definirse de cara a nuestro trabajo como la condición creada por la enfermedad de base (DM) en lo que afecta al pie. Caracterizada por ulceraciones, que frecuentemente se infectan y se ven agravadas por las angiopatías y las neuropatías características de estos enfermos a las que nos hemos referido con anterioridad.

1.5.2 Epidemiología del Pie Diabético De acuerdo a lo dicho hasta aquí el pie diabético es una de las complicaciones frecuentes y graves de la DM. Según el documento de consenso del año 2012 del International Working Group of the Diabetic Foot (IWGDF), la prevalencia de úlceras en enfermos diabéticos se sitúa entre el 4% y el 10% según los países y el nivel socio-económico y cultural de las poblaciones analizadas.

En realidad puede afirmarse que la incidencia de desarrollo de una úlcera a lo largo de la vida de un enfermo de diabetes puede alcanzar un 25% de la población enferma. En lo que respecta a las consecuencias de mayor entidad se ha publicado que entre un 40% y un 70% del total de las amputaciones llevadas a cabo en las extremidades inferiores están

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relacionadas con la DM. Las diferencias en porcentaje se atribuyen principalmente al nivel socioeconómico, al nivel de atención sanitaria y a las recomendaciones de los distintos sistemas nacionales de salud. Puede, en definitiva, afirmarse que el 85% de todas las amputaciones relacionadas con la DM están precedidas de una úlcera en el pie. (IWGDF, 2011). El impacto económico del pie diabético supone un 20% del coste sanitario total de la DM. En el estudio EURODIAL realizado en 14 centros de 10 países europeos, se ha analizado el consumo de recursos sanitarios por esta causa. Se estimó un coste promedio del tratamiento de la úlcera (gastos directos e indirectos) de 10.000€/enfermo afectado. La mayoría de estos gastos se deben a los periodos de hospitalización. (Shaper, 2012)

1.5.3 Fisiopatología del Pie DiabéticoCuatro son los factores principales que condicionan la aparición del pie diabético, y que actúan de forma secuencial.

1.5.4 “La Glicemia” Factor básico o inicial. En general se considera que unos valores de glicemia superiores a 126 mg/dL, cuando es mantenida de forma persistente durante largos periodos de tiempo (unos 10 años para los DM1 y 15 años para DM2), constituyen la base fisiopatológica esencial que condiciona la aparición tanto de la neuropatía, como de la micrangiopatía y la macroangiopatía. Sería por lo tanto el factor desencadenante de todo el proceso. (Shaper, 2012)

1.5.5 “Neuropatía, Microangiopatía, y Macroangiopatía”Factores Primarios

I)-Neuropatía: La OMS considera a la neuropatía como la complicación más frecuente de la DM. Se ha estimado que alrededor del 40% de los enfermos diabéticos presentan algún tipo de alteración neuropática en el momento del diagnóstico de la diabetes. Por otra parte se ha observado que la neuropatía está en relación directa con el grado de control de los niveles de glucemia, y tiene también relación con la edad de los pacientes y con los años de evolución de la enfermedad.

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1.5.5.1 Tipos Neuropatía que afectan al pie diabético:

▷ Polineuropatía sensitivo-motora.▶ a) Sensitiva: Se manifiesta con una pérdida de sensibilidad que comporta una disminución de la percepción de los cambios de temperatura, vibraciones o sentido del tacto, ello comporta una mayor vulnerabilidad frente a traumatismos continuados o cualquier otro tipo de agresión en la superficie. ▶ b) Motora: Se manifiesta como una atrofia de los músculos intrínsecos del pie. Ello provoca deformaciones y luxaciones en las articulaciones metatarso-falángicas e interfalángicas de los dedos. Según la forma que adopte en podología, se denominan dedos en martillo cuando la deformación afecta a la falange proximal lo que le confiere una forma de “martillo” o, en el caso de afectación de la falange distal hablamos de dedos “en garra” ( figura 1)

▷ Neuropatía autónoma.La neuropatía autónoma se define como aquella que afecta exclusivamente al sistema nervioso autónomo. Provoca anhidrosis, lo que conlleva sequedad de piel y, por consiguiente, favorece la aparición de fisuras y pequeñas lesiones. También ejerce una acción

Figura 1.- Dedos en Garra. - Unitat funcional del peu diabètic del Hospital de

Bellvitge (UFPD)

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directa sobre la microcirculación, en tanto que genera apertura de fístulas arteriovenosas, con aumento del flujo en reposo. Ello hace que la circulación capilar que básicamente se encarga de la nutrición celular, se vea afectada. Finalmente se da un aumento de los depósitos de calcio en las arterias. (Flynn y Tooke, 1995; Purewal et al., 1995; Jitka, 2013).

▷ Neuroartropatia de Charcot.Es una de las más graves complicaciones de la diabetes relacionadas con el pie. La osteoclastia está aumentada, hay hiperemia como consecuencia de la denervación simpática de la microcirculación. La pérdida de sensibilidad hace que en muchas ocasiones los microtraumatismos repetidos sobre la misma zona no sean percibidos por el paciente, ello conduce a distensiones ligamentosas y microfracturas. Por otra parte el peso corporal en bipedestación (tanto en estática como en dinámica) y fuerzas de otras direcciones y sentidos que pudieran aplicarse sobre el pie, pueden ocasionar destrucción articular. (Roger et al., 2011; Baumhauer et al., 2006)

1.5.5.2 Micro- y Macro-angiopatíasLas macroangiopatías se producen a consecuencia de la formación de placas de ateroma en los grandes vasos. (Botet et al., 2012). La lesión ateromatosa que aparece en los pacientes diabéticos se desarrolla de forma más precoz rápida y extensa que la que presenta la población sana.

No obstante, desde el punto de vista anatomo-patológico el proceso ateromatoso no muestra diferencias significativas en la estructura y composición del ateroma en uno y otro caso.

El proceso aterogénico se inicia con la retención de lipoproteínas en el espacio subendotelial que posteriormente se modifica por procesos fundamentalmente oxidativos.

El acúmulo de los depósitos lipídicos da lugar a la formación de estrías grasas, esto puede considerarse como la fase inicial de la placa de ateroma. (Kurbanov y Sergeyev, 2011; Tamba et al., 2014)

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Las razones de mayor riesgo de arteriosclerosis en la diabetes mellitus no se han explicado completamente, aunque se conoce su influencia en las diferentes etapas del proceso ateromatoso, en parte debida directamente a la hiperglicemia.

▷ II a) Microangiopatia: Cursa como un engrosamiento hipertrófico de la membrana basal y proliferación de la capa íntima de las arteriolas y vénulas. Se distinguen dos tipos:

▶ a) Microangiopatía funcional, que provoca una alteración del flujo y por lo tanto hipoxia tisular. El grado de severidad viene determinado por el grado de alteración neuropática que controla la funcionalidad del vaso y su movilidad.

▶ b) Microangiopatía orgánica que estimula la apertura de shunts arteriovenosos, y, por tanto derivación de flujo sanguíneo de los capilares, todo ello conlleva dificultades en el intercambio de nutrientes y por lo tanto afectación de los procesos metabólicos celulares. (Gibbons y Shaw, 2012)

▷ II b)-Macroangiopatía: Consiste en la alteración de las células que forman el endotelio de las arterias y arteriolas provocando el inicio de un proceso aterogénico con un incremento en la formación de la placa de ateroma, un aumento de la progresión de la misma y de sus complicaciones (estenosis, obliteración vascular), esto conlleva una reducción del flujo sanguíneo, de la presión de perfusión, y por lo tanto a un incremento de la isquemia. (Jude et al., 2010)

1.5.6 Factores secundarios (Hematológicos, Inmunológicos, Articulares, y Dermatológicos) Se trata de factores que aunque contribuyen a la definición global del síndrome, pueden presentarse en mayor o menor medida. Estos factores secundarios incluyen (I) factores hematológicos tales como hiperfibrinogenia, agregación plaquetaria aumentada, aumento de la producción de tromboxano o niveles elevados de ß-tromboglobulina.

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La contribución de estos factores tiene lugar principalmente porque su expresión comporta una disminución de la actividad fibrinolítica, una reducción de la capacidad de deformación eritrocitaria y leucocitaria, y un aumento de la viscosidad hemática. (Cicco et al., 2011) (II) factores inmunitarios; algunas alteraciones que afectan a las células del sistema inmune pueden contribuir a la evolución de las lesiones, así ocurre con el aumento de la diapédesis, las modificaciones en la quimiotaxis, la disminución de la fagocitosis, y los cambios en la función granulocítica y en la adherencia leucocitaria. (McIntyre, 1987)

Otro grupo de factores puede definirse como (III) factores articulares que esencialmente se explican porque el aumento de la glucosa plasmática provoca una afectación del tejido conectivo periarticular, consecuencia directa de la glucosilación no enzimática. La insuficiente eficacia del retorno venoso, por su parte conduce a un incremento de la presión hidrostática que conlleva limitación de la movilidad. Se da también un aumento de la actividad osteoclástica. (Birke et al., 1995)

Unidos a todos estos factores encontramos alteraciones dérmicas provocadas por una glucosilación no enzimática del colágeno, que provoca rigidez fibrilar y aumento de la queratina plantar. (Peterson 1982)

1.5.7 Factores extrínsecos e intrínsecos. (Factores Desencadenantes)Son factores cuya contribución se requiere para que aparezca la lesión. Los clasificamos normalmente en factores intrínsecos (deformidades óseas, limitaciones de movilidad etc.) y factores extrínsecos (principalmente traumatismos externos ya sean mecánicos, térmicos, físicos, químicos o incluso en ocasiones de origen biológico).

1.6 Infección del Pie DiabéticoLa emergencia y el desarrollo de las infecciones en el pie diabético están influidos por diversos factores de naturaleza variable. Como hemos comentado anteriormente los pacientes diabéticos son propensos a desarrollar úlceras de origen neuropático/angiopático. Por otra parte los efectos de la diabetes sobre las características de la piel tienen su

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reflejo en las poblaciones bacterianas residentes, tanto en su estructura como en las proporciones de las especies, de modo que las microbiotas dérmicas de estos pacientes presentan algunas características propias y diferenciadas de lo que podríamos llamar poblaciones dérmicas convencionales (de individuos sanos). Ello se debe al menos en parte a que la neuropatía condiciona una pérdida de las funciones vasomotoras y del reflejo de sudoración del pie.

Como consecuencia directa, provoca sequedad de la piel y por tanto formación de discontinuidades (grietas). Estas grietas asociadas a la disminución del flujo sanguíneo por los capilares nutritivos secundarios a la apertura de los schunts arterio-venosos, hacen que el pie en la DM sea más susceptible de sufrir infecciones.

Diferentes estudios descriptivos de la microbiota dérmica muestran de modo inequívoco que la flora microbiana de la piel varía según el área anatómica de que se trate al tiempo que la complejidad de la estructura poblacional es variable. En este sentido, como es bien sabido, es el entorno el que predispone a los distintos tipos de colonización bacteriana “le terrain c’est tout, le microbe c’est rien” (Louis Pasteur).

En las áreas secas, la microbiota es limitada con unos valores aproximados de 1000 bacterias/cm2 de piel. Estos niveles se mantienen gracias a las propiedades físico-químicas de la superficie dérmica. En zonas húmedas se promueve tanto el crecimiento fúngico como el bacteriano, y tanto en densidad como en variedad, particularmente si hay nutrientes.

Sin embargo en muchos casos, la población bacteriana se mantiene controlada aún en estas zonas por medio de mecanismos distintos, que en ocasiones implican a los mismos microorganismos cuyo desarrollo crea condiciones inhabitables para otros microbios.

Tal es el caso de la región del canal vaginal donde la flora acidófila y acidogénica mantiene un pH en el que solo pueden sobrevivir las bacterias habitantes naturales.

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La microbiota del pie tiene algunas características propias diferenciadas de otras zonas del organismo. En general las especies aisladas con más frecuencia son, en el pie sano, Staphylococcus y bacterias del grupo corineforme.

Recientemente Redel et al., han publicado un artículo en el que se demuestran algunas diferencias significativas. Las más destacables son que en el pie diabético las poblaciones de Staphylococcus están disminuidas si se comparan con los de la población sana. Sin embargo puede afirmarse de modo concluyente que las poblaciones de S. aureus están claramente incrementadas, así como también que la diversidad bacteriana en el pie diabético es mucho mayor. Ello, obviamente puede tener una gran influencia en el riesgo de infección. (Redel et al., 2013)Por lo que respecta a la etiología microbiana de las úlceras plantares sin embargo, el acuerdo entre autores no es total. (Lipsky et al., 2013), señalan que al cultivar en condiciones óptimas 20 úlceras plantares infectadas aislaron hasta 116 bacterias con una media de 5,8 especies por especimen (3,2 aerobios y 2,6 anaerobios). Los aislados con mayor frecuencia fueron Bacteroides ssp. (17), Peptococcus (16), Proteu ssp. (11), Enterococcus (9), Staphylococcus aureus (7), Clostridium (7) y Escherichia coli (6). Como se comentará en el capítulo correspondiente, estos datos se alejan notablemente de los encontrados en esta tesis. Sorprende que en el trabajo de Lipsky no se aislara ninguna bacteria del grupo Corineforme ni Pseudomonas aeruginosa que son especies que en nuestra experiencia se encuentran en una buena proporción de casos.

Independientemente de la estructura poblacional de la microbiota dérmica, y de las características propias de la microbiota de los diabéticos, la disminución de los mecanismos de defensa favorece que los enfermos diabéticos desarrollen infecciones en las úlceras. Estas infecciones, frecuentemente polimicrobianas en condiciones en las que no funcionan de forma correcta los mecanismos de defensa ni de alerta frente a las mismas generan cuadros complicados y de difícil tratamiento. Es por ello que lesiones que inicialmente parecen poco relevantes e incluso banales, con frecuencia evolucionan en

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estos pacientes a situaciones extremas. Otras condiciones agravan los cuadros de forma significativa, entre ellas figura de forma destacada la alteración de la respuesta inflamatoria. La respuesta inflamatoria es un actor esencial tanto en el proceso de la cicatrización como en la defensa ante la infección.

Podemos describir el proceso inflamatorio y de cicatrización en tres fases: (I) fase de aumento del aporte sanguíneo en la zona lesionada; (II) fase de acumulación de exudado hiperprotéico, en el que los leucocitos intervienen de forma significativa en la eliminación de los agentes infecciosos y (III) fase de formación de tejido colágeno fibroso. De hecho las tres fases están alteradas en los enfermos de DM, y por lo tanto el proceso secuencial cursa mal, con menos eficiencia, dado que se da una disminución del aporte sanguíneo, que en ausencia de complicaciones puede ser suficiente para mantener la viabilidad de la piel intacta pero que no lo es para conseguir la cicatrización, incluso de pequeñas heridas, con lo que el riesgo de infección se agrava de forma notable. (Bakker et al., 2011; Bulton 2013)

Hay que tener además en cuenta que el desarrollo de microorganismos anaerobios está favorecido a consecuencia de la isquemia y también que la mayoría de estas infecciones son de tipo mixto, con lo que las bacterias aerobias y sobre todo las facultativas favorecen la generación de ambientes anaerobios por consumo del oxígeno en el metabolismo respiratorio.

1.6.1 Manifestaciones clínicas de la infecciónCuando las lesiones del pie diabético se complican como consecuencia de una infección, suelen experimentar una evolución rápida, con presencia de exudado, supuración y edema.

El proceso suele iniciarse con celulitis o infección del tejido celular subcutáneo que origina un enrojecimiento de la zona periulcerosa. La infección puede agravar tanto las lesiones neuroisquémicas como las neuropáticas. Si no se detecta precozmente suele evolucionar con rapidez y causar una pérdida tisular extensa. Es por lo tanto relevante

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la detección de la infección (cuando la hay) en el examen inicial del pie.Una vez iniciado el proceso, progresa por los conductos linfáticos en forma de linfangitis, caracterizada por la formación de líneas eritematosas que ascienden por el dorso del pie y de la pierna en disposición de malla —linfangitis reticular—, y por la cara lateral interna del muslo en forma de cordones linfáticos —linfangitis cordonal—.

En casos severos, el enfermo presenta fiebre elevada y en agujas, y la compensación metabólica (control de la glucemia) es muy problemática mientras persiste esta situación.La supuración, la celulitis, la linfangitis y la inflamación de los ganglios linfáticos de drenaje son signos de infección. Por otra parte a diferencia de lo que ocurre con el rubor isquémico, el eritema originado por la celulitis no desaparece con la elevación del pie. (Beltran 2001; Noviello et al., 2012)

En base a lo dicho hasta aquí podemos, siquiera brevemente, definir los distintos tipos de úlceras características del pie diabético:

A) Lesiones Neuropáticas.

a.1 Úlceras Neuropáticas. Podríamos afirmar que constituyen la complicación más frecuente de la neuropatía diabética. Aparecen sobre puntos de presión, que pueden ser debidos a deformaciones del pie. Si bien su descripción clásica es plantar, a nivel de la epífisis distal de los metatarsianos y de ahí el nombre de “mal perforante plantar”, de forma genérica puede afirmarse que en realidad pueden localizarse en cualquier punto del pie en el que se dé una presión extrínseca mantenida y una disminución de la sensibilidad. Suele rodearse de tejido calloso y ser indolora. La perfusión arterial del pie es normal o está aumentada. La circulación venosa del dorso puede conferir un aspecto turgente mientras que la piel presenta una temperatura normal. Los pulsos tíbiales son palpables, aunque pueden estar disminuidos en amplitud a causa del edema. (Viade, 2006; Zalacain et al., 2008)

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B) Lesiones neuroisquémicas.

b.1) Úlcera y gangrena neuroisquémica: Suele presentarse como una zona necrosada rodeada de un halo eritematoso, habitualmente sin tejido calloso. Puede complicarse por sobreinfección por bacterias tanto aerobias como anaerobias, este último grupo puede (y de hecho frecuentemente lo hace) provocar gangrena. Sus localizaciones más frecuentes son el primer dedo, en la superficie medial de la epífisis distal del primer metatarsiano, en la superficie lateral de la epífisis del quinto y en el talón. En elevación del miembro afectado se observa reducción del flujo sanguíneo, con ausencia de pulsos, frialdad y palidez de la extremidad.

b.2) Necrosis o gangrena digital: Lesión que aparece en las zonas más distales de los dedos. El enfermo presenta síntomas y signos de isquemia al igual que los descritos anteriormente y, aunque resulta difícil establecer un diagnóstico diferencial en base a su aspecto clínico, hay que distinguirla de la gangrena digital infecciosa y del “síndrome del dedo azul” por ateroembolia. Estas dos últimas cursan con pulsos tíbiales palpables.

C) Formas Infecciosas

c.1) Celulitis superficial: suele estar provocada por una única especie patógena, habitualmente se trata de una bacteria Gram-positiva, las más frecuentes son Streptococcus del grupo A de Lancefield y S. aureus, y, a veces, otras especies de Staphylococcus.

c.2) Infección necrotizante de tejidos blandos: este tipo de infección es polimicrobiana —entre tres y seis microorganismos —, siendo los más frecuentes:- Cocos gram-positivos: Streptococcus spp. S. aureus, Staphylococcus coagulasa negativos (S. epidermidis), Enterococcus spp.- Bacilos gram-negativos: enterobacterias (Escherichia coli, Proteus spp., Klebsiella, Enterobacter spp.) y Pseudomonas aeruginosa.- Anaerobios: Bacteroides spp., Peptostreptococcus spp.

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c.3) Necrosis gangrena digital: es secundaria a la trombosis de las artérias digitales causada principalmente por toxinas necrotizantes liberadas por los microorganismos y, en especial, por S. aureus. Streptococcus Grupo Ac.4) Osteomielitis: causada por S. aureus; su localización más frecuente es en el primero, segundo y quinto dedos, pudiendo cursar clínicamente sin signos inflamatorios. El principal problema diagnóstico estriba en objetivar su presencia y diferenciarla de la osteoartropatía diabética. La presencia de fondo o base perióstica en una úlcera es indicativa de osteomielitis, con un valor predictivo del 89%. (Blanes et al., 2012; Lipsky et al., 2004)

1.7 – El Pie diabético como diana de la infecciónComo hemos mencionado el pie diabético es lugar de frecuente aparición de úlceras, difíciles de tratar y con facilidad para infectarse. Estas infecciones son con frecuencia causadas por microorganismos multi-resistentes. La OMS alerta que las infecciones causadas por bacterias multi-resistentes han aumentado en los últimos años de forma alarmante, hasta el punto que considera la infección por bacterias multi-resistentes como una “enfermedad” emergente. En este marco adquiere mucha relevancia el conocimiento científico de la situación, que pasa por identificar cada una de las bacterias responsables y determinar su sensibilidad a los agentes antimicrobianos. Ello asegura el establecimiento de un tratamiento antimicrobiano correcto.

1.7.1 - Bacterias más frecuentemente implicadas.

a)StaphylococcusLos miembros del género Staphylococcus. (estafilococos) son cocos Gram positivos que tienden a agruparse en estructuras a modo de racimos de uvas. La estructura de su pared celular es típicamente Grampositiva con un peptidoglicano muy abundante, carecen de flagelos, no tienen por tanto movilidad y no forman esporas. Producen catalasa y son anaerobios facultativos a pesar de que crecen mejor en condiciones aerobias. S. aureus es la principal especie causante de infecciones purulentas agudas, pero también otras especies de Staphylococcus de

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la microbiota de la piel pueden originar infección, aunque en menor grado, particularmente cuando el paciente tiene afectado el sistema inmune. (de la Rosa y Prieto, 2003; Martínez et al.,2009)

1.7.1.1- S. aureus:Esta especie se denomina coloquialmente estafilococo dorado por el color amarillo de sus colonias en los medios de cultivo sólidos. Podemos diferenciar S. aureus de las otras especies de cocos gram positivos, en general menos virulentos, determinando su capacidad de producir un enzima denominado coagulasa. La coagulasa permite diferenciar S. aureus (que es coagulasa positivo) del resto de especies de Staphylococcus (coagulasa negativos).

El enzima puede estar libre en el medio circundante y también ligada a la superficie de la bacteria. La procoagulasa reacciona con un factor activador presente en el plasma sanguíneo similar a la protrombina, dando lugar a un complejo análogo a la trombina que es la coagulasa y que tiene la capacidad de reaccionar con el fibrinógeno lo que genera un coágulo de fibrina, por el contrario la coagulasa ligada actúa directamente sobre el fibrinógeno y lo convierte en fibrina. El resultado de ambas es la coagulación del plasma.

S. aureus está presente normalmente formando parte de la microbiota de la piel y de las mucosas. Se estima que una gran proporción de la población sana es portadora de S. aureus. Este valor se incrementa en ciertos grupos de población como el personal sanitario que trabaja con enfermos hospitalizados, internos de residencias de la tercera edad, y también drogadictos parenterales y enfermos diabéticos. Estos portadores pueden actuar como reservorio y ser origen de toxiinfecciones alimentarias e infecciones nosocomiales por transmisión del microorganismo por el contacto directo con alimentos o con los enfermos. (Peres y Madrenas, 2013)

Las infecciones ocasionadas por S.aureus son frecuentemente agudas y piogénicas. Es importante que sean tratadas ya que pueden diseminarse a los tejidos adyacentes o incluso invadir la sangre ocasionando

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bacteriemia y otras infecciones graves, (neumonía y endocarditis). Estos cuadros se producen tras lesiones cutáneas, traumáticas o quirúrgicas que abren vías para la penetración del microorganismo desde la piel hasta los tejidos más profundos. (Iwamoto et al., 2013; Cosgrove y Karchmer, 2005)

La mayoría de las cepas de S.aureus son productoras de ß-lactamasas, enzimas que inactivan los antibióticos ß-lactámicos como la Penicilina G y todos los derivados y las cefalosporinas. Es por ello que en el tratamiento de las infecciones estafilocócicas es común el empleo de antibióticos resistentes a la acción de las ß-lactamasas o el uso de moléculas que compitan con las ß-lactamasas como es el caso del ácido clavulánico. Actualmente algunas cepas de S. aureus se han hecho resistentes no solamente a las penicilinas sino también al resto de antibióticos ß-lactámicos.

Estos microorganismos son denominados S. aureus meticilina resistentes (MRSA, Methicillin-Resistant S.aureus). Estas cepas normalmente presentan además resistencia a antibióticos de grupos no relacionados como eritromicina, gentamicina, etc. Las cepas MRSA son frecuentes en ambientes hospitalarios y emergieron al adquirir la bacteria el gen mecA que confiere resistencia a los antibióticos ß-lactámicos. Las cepas MRSA se aislaron por vez primera en 1960 en Inglaterra (Jevons 1961) y se expandieron rápidamente siendo en realidad una pandemia a partir de los años 70. Dos de los tres tipos están todavía ampliamente distribuidos y se conocen como multi-drug-resistant health care-associated MRSA (HA-MRSA). (Hiramatsu et al., 2013)

1.7.1.2 - Streptococcus. (ß-hemolíticos)Las bacterias del género Streptococcus son cocos Gram positivos anaerobios tolerantes al oxígeno, catalasa negativos, que se disponen formando cadenas de longitud variable. De acuerdo con los trabajos iniciados por Rebeca Lancefield, este género está dividido en distintos grupos denominados de Lancefield en base a los distintos antígenos polisacarídicos presentes en la pared celular que permiten la clasificación en grupos serológicos (A, B, C, D, etc.)

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En este género, como en Staphylococcus, hay especies con patogenicidad intrínseca tales como S. pyogenes, S. agalactiae y S. pneumoniae entre otros. Sin embargo, la mayoría de las especies de este género son poco o nada virulentas y forman parte de la microbiota normal de la piel. (Blanes et al., 2012)

1.7.1.3 - S. pyogenesTambién se denomina estreptococo betahemolitico del grupo A. Las colonias en agar sangre producen una hemólisis completa, denominada hemólisis beta, y el aspecto del halo de hemólisis es transparente.S. pyogenes puede ocasionar infecciones en la piel. La penetración del microorganismo puede tener lugar por una herida traumática, por lesiones dérmicas consecuencia de micosis interdigitales o de úlceras varicosas.

En este caso se origina una infección aguda con compromiso linfático, que se presenta abruptamente con fiebre elevada y frecuentemente recibe el nombre de Erisipela. (Torok y Conlon, 2005)Aparte también puede originar otros tipos de cuadros infecciosos incluso en individuos inmuno-competentes. Es el caso de cuadros graves de necrosis tisular en que cepas muy virulentas segregan toxinas que provocan necrosis de los tejidos.

Las infecciones por S. pyogenes pueden originar complicaciones graves como las fiebres reumáticas y la glomerulonefritis aguda, que pueden aparecer mucho después de la infección, probablemente por mecanismos que implican también fenómenos autoinmunes. (Rantala, 2013)

1.7.1.2.2 - S. agalactiaeS. agalactiae es un estreptococo ß-hemolítico integrante del grupo B de Lancefield. Pertenece a la microbiota normal del tracto digestivo y se comporta como un patógeno oportunista típico, pudiendo producir una gran diversidad de infecciones: principalmente en puérperas y recien nacidos (sepsis y meningitis neonatal). (de la Rosa y Prieto, 2003; Otaguiri et al., 2013)

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1.7.1.5 - EnterococcusEl término enterococo se debe a su presencia en el tubo intestinal y a las muchas características bioquímicas y de cultivo que reflejan este hábitat, como la capacidad de crecer en presencia de concentraciones elevadas de sales biliares y cloruro de sodio. Los enterococos producen infecciones sistémicas casi exclusivamente en pacientes inmunodeprimidos y en las infecciones de heridas y tejidos blandos suelen encontrarse mezclados con otros microorganismos. (Vanschoonevels et al., 2009)

Enterococcus es un microorganismo muy relevante en las infecciones orales, siendo responsable de más del 90 % de las infecciones endodónticas post-intervención. (Arnabat et al., 2010).

c) PseudomonasEs un bacilo gramnegativo aeróbico de metabolismo oxidativo por lo que se integra dentro del grupo de bacilos gramnegativos no fermentadores. Es móvil y oxidasa positivo. A menudo sus colonias originan una pigmentación verde fluorescente característica y un aroma afrutado particular. (de la Rosa y Prieto, 2003)

1.7.1.6 - Pseudomonas aeruginosaP. aeruginosa es comúnmente encontrada en la naturaleza (suelos y aguas) y puede resistir ambientes con características adversas. Es posible encontrarlas en diversos tipos de fluidos, incluyendo algunas soluciones antisépticas utilizadas en el lavado de manos y líquidos de desinfección de material clínico, esponjas de baño y objetos hospitalarios. La colonización de individuos sin enfermedad aparente es frecuente. En este caso puede alcanzar regiones del organismo normalmente libres de microorganismos ya través de una lesión o de actos médicos (catéteres utilizados para la administración de sueros intravenosos, catéteres urinarios, etc.), en estos casos P. aeruginosa tiende a comportarse como un patógeno oportunista de gran virulencia. En los sujetos inmuno-competentes no es común que produzcan enfermedad pese a elevadas cargas del microrganismo, no obstante, en el huésped inmuno-deficiente, en enfermos de avanzada edad, en intervenidos

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quirúrgicamente, quemados etc. puede ocasionar una infección activa. A menudo, se aíslan cepas hospitalarias de P.aeruginosa multiresistente a antibióticos y pueden producir brotes de infección nosocomial. (Breidenstein et al., 2011; Doring, 1997))

1.7.1.7 - EnterobacteriaceaeLa familia de las Enterobacteriaceae está formada por bacterias aisladas en gran cantidad del intestino humano. Son bacilos gramnegativos anaerobios facultativos móviles, que crecen bien en la mayoría de los medios de cultivo. Las morfologías suelen ser distintas dependiendo de las propiedades metabólicas y de los componentes del medio. Todas fermentan la glucosa, reducen los nitratos a nitritos, resisten los ácidos biliares y carecen de oxidasa. (Blanes et al., 2012). Algunos géneros están ampliamente distribuidos:

1.7.1.7.1 - Escherichia coli (Bacilo de Escherich)Es el principal microorganismo facultativo de la microbiota normal del tracto gastrointestinal del hombre y numerosos vertebrados. En el ambiente humano es uno de los microorganismos más abundantes, alcanzando concentraciones bacterianas en las heces del orden de 106 bacterias por gramo.E.coli posee abundantes factores de virulencia que no están presentes en todas las cepas. Por lo tanto, la mayor parte de las cepas son incapaces de producir infecciones en inmunocompetentes, mientras que otras presentan factores específicos de virulencia que les capacitan para originar infecciones desde relativamente leves hasta muy graves, como es el síndrome hemolítico-urémico. Suele producir infecciones urinarias, intestinales, intrabdominales, sepsis, meningitis neonatales y bacteriemias, pero también puede infectar las heridas al igual que otras enterobacterias o microorganismos (Page y Liles, 2013).

1.7.1.7.2 - Klebsiella (Bacilo de Friedlander)Las características más distintivas de este género son la falta de movilidad y la presencia de una abundante cápsula de polisacáridos que ofrece a las colonias de Klebsiella un aspecto mucoide radiante y que protege a las bacterias infectantes frente al sistema inmune. Puede

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ser además utilizada para serotipar estas bacterias.Entre todas las enterobacterias posiblemente las especies de Klebsiella se encuentran en la actualidad entre aquellas más resistentes a los antimicrobianos.

1.7.1.7.3 - EnterobacterLas especies pertenecientes al género Enterobacter son fermentadores rápidos de la lactosa y producen colonias morfológicamente semejantes a las de Klebsiella, aunque no tan mucoides.Suelen encontrarse en infecciones mixtas y su importancia debe determinarse con bases clínicas y epidemiológicas ya que tienen una virulencia moderada. Sin embargo ha sido implicada en diversos brotes hospitalarios como consecuencia de contaminación.

1.7.1.7.4 - ProteusEs un patógeno oportunista que se encuentra con frecuencia variable en la flora intestinal normal. Algunas especies comparten la capacidad de diseminarse sobre las superficies del medio de cultivo en vez de formar colonias localizadas. Esta característica denominada swarming hace que estos microorganismos sean fáciles de identificar al observar su desplazamiento.

1.7.1.8 Bacilos Gram negativos anaeróbios estrictos (Bacteroides)Son parte de la microbiota normal del ser humano y se encuentra en la boca, en el tracto respiratorio superior y sobre todo en el tracto urogenital e intestinal, donde llegan a alcanzar concentraciones del orden de 1011 microorganismos por gramo.Entre todos los bacilos gramnegativos anaerobios, Bacteroides fragilis es el más frecuentemente aislado de muestra clínicas. Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas son otros géneros de bacilos Gram negativos anaerobios estrictos que pueden causar infecciones por sí solos o en asociación con otras bacterias y también son constituyentes de la microbiota oral y del tubo digestivo.B. fragilis es un bacilo Gram negativo anaerobio estricto y el microorganismo predominante en la microbiota normal del colon. Se comporta como patógeno oportunista mayoritariamente en presencia

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de otras bacterias, produciendo infección (infecciones mixtas) cuando se dan una serie de factores que favorecen su desarrollo en los tejidos. Entre estos factores predisponentes se encuentran los traumatismos quirúrgicos y otros procesos que interrumpen la continuidad de las mucosas, la existencia de tejidos desvitalizados o su introducción en una localización normalmente libre de microorganismos.La infección se caracteriza por la formación de abscesos y el tratamiento, se requiere de drenaje quirúrgico y el empleo de antibióticos activos. B. fragilis suele ser sensible a metronidazol, amoxicilina + ácido clavulánico, etc. (Ng et al., 2008; Lipsky 2012).

1.7.2 Levaduras más frecuentemente implicadasEn contraste con las bacterias, las levaduras son células eucariotas, ovaladas que se reproducen por gemación. Obviamente las grandes diferencias estructurales hacen que los antibióticos activos frente a las bacterias sean absolutamente ineficaces para el tratamiento, de las infecciones debidas a levaduras utilizándose otros tipos de agentes antimicrobianos que conocemos con el nombre genérico de antifúngicos.

Ciertas especies de levaduras forman parte de la flora normal de la piel o viven como saprofitos en el ambiente. Cuando hay un descenso de la inmunocompetencia del huésped, pueden producir infecciones, que pueden afectar desde zonas superficiales de la piel o mucosas hasta invasiones profundas que, eventualmente pueden conducir a un compromiso sistémico multiorgánico. (Spampinato y Leonardi, 2013)

1.7.2.1 - Candida albicansLa levadura patógena más frecuente es Candida albicans que se encuentra en pequeñas cantidades en todas las personas formando parte de la flora de la boca, intestino, vagina y piel, pero que en huéspedes susceptibles puede crecer de forma incontrolada ocasionando infecciones recurrentes. Es muy frecuente en diabéticos, y en todo tipo de pacientes después de tratamiento antibiótico así como en inmunodeprimidos. (Mayer et al., 2013; François et al., 2013)

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1.7.2.2 - Candida parapsilosisEsta levadura se ha convertido en causa frecuente de sepsis e infecciones de heridas en pacientes inmunodeprimidos. En las infecciones ocasionadas por C. parapsilosis el sistema inmunológico del paciente juega un papel muy destacado. Esta especie es comensal de la especie humana y a la vez uno de los hongos más frecuentemente aislados a partir de la mano y espacio subungueal de trabajadores sanitarios e incluso de población en general y solo se comporta como patógeno en situaciones de inmunodepresión o inmunosupresión. Su aparición está relacionada con la capacidad de colonizar la piel, tiene la capacidad de proliferar en soluciones que contienen glucosa, y también presenta buena capacidad de adherencia al plástico.

Lo que la convierte en un microorganismo con gran capacidad de penetración por vías endovenosas. Su virulencia aparece asociada a su gran capacidad de producir biofilm y de producir fosfolipasas y aspartil-proteasas. Históricamente, el antifúngico más utilizado contra las infecciones severas causadas por hongos ha sido la anfotericina B, el fluconazol se considera actualmente una alternativa mucho mejor y más utilizada en la clínica. (Van Asbeck et al., 2009; Eveline et al.,2009)

1.8 Patrones clínicos de la InfecciónSe han propuesto muchas clasificaciones para ordenar las infecciones características del pie diabético realizadas y consensuadas por diferentes organismos internacionales. En esta memoria utilizaremos la clasificación de PEDIS (International Consensus on the Diabetic Foot)

(Anexo 1.) Teniendo en cuenta algunas consideraciones: (Blanes et al., 2012; Burullo et al., 2007)

▶ a) Infección localizada: Úlceras superficiales que no superan los 2 cm de extensión y con escasa profundidad, solo está afectado el tejido dérmico y epidérmico. No hay afectación de músculo ni tejidos más profundos. No suponen riesgo para el paciente y pueden

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ser tratadas a nivel ambulatorio. (PEDIS 2)▶ b) Infección moderada o grave: Úlceras con afectación de músculo tendones y cápsula articular, que se acompañan de celulitis extensa. En algunos casos requieren ingreso hospitalario (PEDIS 3)

▶ c) Infecciones muy graves: Úlceras que llegan a afectar el tejido óseo y que cursan con abscesos profundos, necrosis etc. Suele acompañarse con afectación del estado general del paciente y requieren tratamiento hospitalario intensivo. (PEDIS 4) (Verdú et al., 2009) .- ( Anexo 1)

Figura 2 .- Infección moderada o grave( Pedis 3)

Unitat funcional del peu diabètic del Hospital de Bellvitge (UFPD)

Figura 3 .- Infección moderada o grave (Pedis 3)


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1.9 Péptidos antimicrobianosLos péptidos antimicrobianos de origen natural son oligopéptidos o polipéptidos generados por la mayoría de los seres vivos (Zasloff, 2012) que actúan como mecanismo de defensa frente a microorganismos del entorno, protegiendo a las células de sus hospedadores sin inducir resistencia microbiana.

Algunos de ellos presentan un amplio espectro antibacteriano por lo que se han postulado como opciones terapéuticas idóneas para el tratamiento de distintas infecciones cutáneas. (Zasloff, 2012; Ulvatne 2013). Entre ellos y en referencia a la terapéutica anti infecciosa frente a las infecciones del pie diabético se han realizado diversos estudios in vitro sobre la actividad de Pexiganan, un análogo sintético del péptido natural MagaininaII, frente a aislamientos bacterianos de úlceras de pie diabético infectadas, obteniendo unos resultados prometedores.(Grek et al., 1999; Lipsky et al., 2008)

Actualmente se está realizando en EEUU un ensayo clínico Fase 3 sobre el uso de una crema tópica (Pexiganan 0,8% o MSI- 78 dos aplicaciones diarias durante 14 días) para el tratamiento de infecciones leves de ulceras de pie diabético (Dipexium Pharmaceuticals. 2000). También se están realizando ensayos clínicos multicentricos con otros péptidos. (Rodgers et al., 2015; Grek et al., 2015)

Por otra parte recientemente se ha descrito que los pacientes con ulceras de pie diabético presentan unos niveles de péptidos antimicrobianos inferiores en el área de lesión lo que contribuiría a una peor cicatrización. En un estudio experimental en el que se han tratado cultivos primarios de piel de pacientes con ulcera de pie diabético, con vitamina D u L-isoleucina se ha conseguido aumentar la producción de los péptidos humanos beta defensina-2 (HBD-2) y catelicidina (LL-37) con actividad antimicrobiana frente a E.coli y que actúan induciendo la migración de los queratinocitos. (Gonzalez-Curiel,2014)

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1.10 PolifenolesLos polifenoles se caracterizan por presentar uno o varios anillos fenólicos en su estructura. Son los componentes que más abundan en los alimentos que constituyen la dieta humana y se originan principalmente en las plantas como producto de su metabolismo secundario. (Quiñones M. et al.,2012.Perez-Vizcaino F. et al., 2009)

En los últimos años se ha demostrado que una dieta rica en polifenoles vegetales puede mejorar la salud y disminuir la incidencia de enfermedades cardiovasculares (Quiñones M. et al., 2012) Son capaces de modular la actividad enzimática de distintos procesos celulares como consecuencia de su participación en deferentes reacciones metabólicas de óxido-reducción. Como consecuencia a su acción antioxidante los polifenoles poseen efecto vasodilatador, antitrombótico, antiinflamatorio y antiapoptóticos. (Schroeter H. et al.,2006; Dell’Agli M. et al., 2004; Ruf JC. et al., 1999)

La oleuropeina y su derivado el hidroxitirosol es el principal compuesto fenólico presente en el extracto de oliva. En los últimos años se ha estado estudiando las diferentes propiedades farmacológicas de estos compuestos como la actividad antioxidante, antiinflamatoria, anti-arteriogénica y anticarcinogénica.

También se ha demostrado recientemente su actividad antimicrobiana frente a diferentes tipos de bacterias, hongos microscópicos como también Mycoplasma. (Bisignano G. et al., 1999; Furneri PM. et al., 2002; Syed Haris O. 2010)

Estos datos indican que además de su potencial empleo de los compuestos fenólicos como aditivos alimentarios, también podemos considerar esos principios activos como fuente potencial de agentes antimicrobianos para el tratamiento de las infecciones.

Hipótesis y Objetivos

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2. Hipótesis y Objetivos

HipótesisEsta tesis se planteó inicialmente a partir de preguntas surgidas en la actividad asistencial de nuestro grupo que atiende un colectivo numeroso de pacientes diabéticos con infecciones en las úlceras plantares, usuarios del Hospital de Santa Creu i Sant Pau y del Hospital Podológico de la Universitat de Barcelona.

Debido a la variedad del colectivo de pacientes, resulta de interés averiguar qué factores específicos podrían favorecer la aparición de úlceras plantares, así como el debut de la infección y por consiguiente qué factores influyen en el pronóstico. Finalmente, esta tesis plantea la exploración de una nueva estrategia de tratamiento, dado que los antibióticos por vía sistémica no dan buenos resultados derivado de la escasa disponibilidad consecuencia de los problemas vasculares en el pie diabético. Los polifenoles tienen actividad antimicrobiana al tiempo que han sido descritos como agentes estimuladores de la cicatrización. Esta tesis doctoral forma parte de un proyecto centrado en la búsqueda de terapias basadas en principios activos diferentes de los antibióticos de forma que puedan, en algunos casos substituirlos evitando la promoción de la emergencia de formas resistentes.

La hipótesis general podría formularse como: “los polifenoles derivados del aceite de oliva (oleuropeina) son útiles en el tratamiento y la prevención de las infecciones de las úlceras plantares en pacientes diabéticos”.

..

ObjetivosEsta tesis intenta contestar siquiera parcialmente preguntas surgidas en la actividad asistencial de nuestro grupo, que atiende un colectivo numeroso de pacientes diabéticos con infecciones en las úlceras plantares. El grupo de pacientes incluye, usuarios del Hospital de Santa Creu i Sant Pau y del Hospital Podológico de la Universitat de Barcelona. El objetivo general de esta tesis es, por tanto, contribuir al conocimiento de las infecciones del pie diabético y de los pacientes afectados a través de los siguientes objetivos parciales:

▶ 1. Aislamiento e identificación de las bacterias presentes en las úlceras de pie diabético infectadas.

▶ 2. Determinación de la susceptibilidad a los antimicrobianos de uso común en el tratamiento de este tipo de infecciones, de los aislamientos realizados.

▶ 3. Evaluación de la posible utilización de polifenoles como agentes para el tratamiento de las úlceras así como de sus efectos sobre las poblaciones bacterianas presentes en las lesiones.

▶ 4. Evaluación del uso de péptidos sintéticos de origen humano (LL-37 y otros) como antimicrobianos.

▶ 5. Aportar datos epidemiológicos de los pacientes diabéticos que presentan úlceras infectadas, referentes a la enfermedad, las características demográficas y el entorno familiar.

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Material y Métodos

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3. Material y Métodos

3.1 DiseñoUn objetivo parcial del presente trabajo de tesis doctoral es el de obtener un registro de la incidencia de microorganismos bacterianos en las úlceras de pie diabético, así como determinar el grado de susceptibilidad de esos microorganismos a los agentes antimicrobianos de uso clínico común. Asimismo, constituye también un objetivo el explorar la eventual actividad de los polifenoles y péptidos de origen humano (oleuropeína, péptido antimicrobiano LL‐37 y otros péptidos) en el tratamiento de las úlceras diabéticas infectadas y su cicatrización. Este objetivo concreto surge, al menos en parte, del proyecto FIBRODRESS en el que se ha desarrollado la presente tesis doctoral. En función de estos objetivos, mejor definidos en el capítulo correspondiente, se han elegido unos métodos factibles y proporcionados que permitieran estudiar un número de casos significativo. Es un trabajo experimental de carácter observacional. Es, por lo tanto un estudio prospectivo. La información obtenida habría de tener un impacto claro en futuros análisis así como en la delimitación de los métodos y estrategias aplicadas al tratamiento de las úlceras del pie diabético. Este es un estudio basado en una metodología descriptiva y, dadas sus características, no se ha incluido ningún grupo de control. Las muestras se obtuvieron dedos centros hospitalarios: el Hospital de la Santa Creu i de Sant Pau y el Hospital Podológico de la Universitat de Barcelona. El estudio consta de 4 fases: En una primera fase se procedió a la recolección de las muestras La segunda fase se ha centrado en el procesado en el laboratorio de las muestras obtenidas. Esta parte del trabajo y las siguientes se han desarrollado en el laboratorio de Microbiología Molecular y Agentes antimicrobianos de la Facultad de Medicina de la Universidad de Barcelona y, esencialmente ha consistido en el aislamiento y la identificación de los microorganismos presentes así como en la determinación de la resistencia/susceptibilidad de las bacterias aisladas a los agentes antimicrobianos de uso más común en clínica.

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En la tercera fase, y una vez identificadas las muestras y conocida su susceptibilidad a los antibióticos, se determinó el potencial efecto antimicrobiano de la oleuropeína, y de algunos péptidos antimicrobianos tanto por separado como conjuntamente para explorar la eventual sinergia propuesta en el proyecto inicial. Estos trabajos se combinaron con la determinación del efecto anti-biofilm de dichos productos. En realidad la acción sobre el biofilm reviste una gran importancia en esta patología.

Finalmente en la cuarta y última fase de este proyecto se han procesado estadísticamente los resultados obtenidos desarrollando un análisis estadístico descriptivo mediante el uso del paquete estadístico SPSS v.17 a fin de establecer las conclusiones del trabajo.

3.2 Población de estudioLos sujetos que se incluyen en este estudio son los miembros de la población de diabéticos tipo 1 y tipo 2 atendidos en los Hospitales mencionados. Sólo se han considerado aquellos pacientes con DM1 y DM2 inequívocamente confirmada por diagnóstico clínico, que han acudido a alguno de los hospitales para tratarse de una úlcera en el pie. Se han incluido en la población del estudio los pacientes de ambos sexos y de diferentes edades. Estas variables se han incluido en el estudio estadístico como variables demográficas.

3.2.1 Criterios de inclusiónPacientes de ambos sexos afectos de DM 1 y DM 2, sin importar la edad ni el sexo, con úlcera en uno o ambos pies. Es requisito indispensable para la inclusión en el estudio el conocimiento explícito de las características del mismo así como la aceptación firmada para participar en el estudio.

3.2.2 Criterios de exclusiónSe excluyen de este estudio todos los pacientes con DM con herida sin signos de infección, así como aquellos pacientes informados que no quieran voluntariamente participar en el mismo.

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3.2.3 Número de sujetos previstos Se ha desarrollado el trabajo en una población total de 1500 pacientes con DM de los cuales aproximadamente un 10 % ha acudido a consulta para tratarse una úlcera. Las características del estudio se sitúan a un nivel de confianza del 95% (Z=1,96) y una precisión deseada del 5%. Ante la imposibilidad de calcular valores aproximados de respuesta se ha indicado una proporción esperada del 50% para maximizar el tamaño de la muestra. El cálculo del tamaño de la muestra se ha realizado mediante la fórmula siguiente:

n = (N x Z2 x p x q) / d2 x (N-1) x Z2 x p x q

N = El tamaño de la poblaciónZ = Valor correspondiente al nivel de confianza p = Probabilidad de éxito o proporción esperadaq = Probabilidad de fracaso d = Precisión (Error máximo admisible en términos de proporción)

La muestra resultante fue de 176 sujetos. Dado el carácter polimicrobiano de estas infecciones se han eliminado de la población del trabajo aquellos casos en los que el número de microorganismos fue superior a 3. Con ello el total de individuos incluidos es de 176.

3.2.4 Criterios de retirada Como hemos comentado se procede a la retirada de las muestras cuando el procedimiento microbiológico ha conducido al aislamiento de más de 3 microorganismos distintos que presuntivamente pudieren tener algún papel en la infección de acuerdo a los conocimientos establecidos. La presencia de tres organismos en una muestra dificulta establecer la identidad del agente causal de la infección, y en muchos casos podría significar que nos encontramos ante una infección mixta pero también podría tratarse de una muestra contaminada accidentalmente.

En general se asume que el aislamiento de gran variedad de microorganismos en un mismo espécimen es indicativo de

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contaminación accidental. Como criterio se entiende que recuentos bacterianos de 105 UFC/g de muestra serian indicativos de que la bacteria tiene un papel activo en el proceso infeccioso.

3.3 Aspectos éticos y legales

3.3.1 Informe de la Comisión de Bioética de la Universidad de Barcelona Este proyecto ha sido evaluado favorablemente por la Comisión de Bioética de la Universitat de Barcelona (documento anexado a esta memoria doctoral).(Anexo2)

3.3.2 Consentimiento InformadoSe adjunta como anexo el documento de consentimiento informado que se ha entregado a todos los pacientes al informarles antes de incluir al paciente en el estudio. (Anexo3)Así mismo se adjunta en el Anexo 4, la hoja de Laboratorio en la que se recogen todos los datos relacionados con el paciente, su enfermedad y las diferentes características de la úlcera.

3.4 Toma de muestrasLas muestras se han obtenido en los actos médicos de atención a los enfermos diabéticos atendidos en los hospitales mencionados anteriormente. Se obtuvieron dos muestras/paciente, mediante dos procedimientos distintos;

▶ a) Toma de la muestra de la úlcera mediante hisopo estéril. ▶ b) Biopsia de la parte interna de la lesión. Las biopsias se obtuvieron mediante el uso de un punch.En ambos casos los especímenes contenidos en tubos esteriles de 10 ml y en tubos Eppendorf respectivamente, se transportaron inmediatamente al laboratorio.

La toma de muestra de exudados impone una limpieza exhaustiva y meticulosa de la zona de la lesión con suero fisiológico estéril a fin de reducir al máximo la toma de bacterias habitantes normales de la piel y

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sin relación alguna con la infección. Se tomó la muestra con el hisopo extremando los cuidados para que los procedimientos fueran asépticos introduciendo el extremo estéril del Hisopo en la lesión y moviendo Hisopo con movimientos rotatorios en sentido horario y antihorario sucesivamente buscando siempre la zona más profunda de la lesión y evitando entrar en contacto con los bordes de la misma.

Una vez introducida la muestra en el tubo de transporte se ha transportado al laboratorio en el menor tiempo posible. Se tomaron dos muestras con dos hisopos distintos de la misma herida y con la misma metodología. De forma que en el laboratorio se ha empleado la primera para sembrar los medios de cultivo y la segunda para preparar las extensiones para la observación microscópica. (Guerrero y Sánchez 2003; Sugandhi y Arvind Prasanth 2014)

Frotis de la lesión mediante Hisopo Indicaciones: Lesiones de la piel, Úlceras superficiales con poco exudado,Material necesario: Suero FisiológicoGasas estériles Escobillón + medio de transporte (Hisopo)

Figura 4. Hisopo

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Figura 5.- Toma de muestra mediante Hisopo


Figura 7 .-Toma de muestra mediante Punch


FIg 6.- Punch 3,0mm (Stiefel laboratorios SRL)Punch

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Las biopsias se obtuvieron mediante la utilización de un punch de 3 mm de diámetro.

Tras limpiar de forma meticulosa la piel circundante a la lesión se introduce el punch en la zona más profunda de la úlcera y se realizan movimientos rotatorios para recoger muestras del tejido del suelo de la úlcera. Una vez recogida la muestra, se introduce la muestra en un tubo de Eppendorf con 1ml de Suero fisiológico, se precinta para que la muestra no entre en contacto con el exterior y se lleva al Laboratorio. (Anexo5)

3.5 Medios de cultivo En este trabajo se han utilizado los medios de cultivo bacteriológicos descritos a continuación:

Agar sangreSe trata de un medio de cultivo de gran riqueza que permite prácticamente el desarrollo de cualquier microorganismo patógeno humano. Su composición es la siguiente:

Material necesario: Suero FisiológicoGasas estériles Punch: Biopsy Punch 3,0mm (Stiefel laboratorios SRL)

Columbia base agar30 ................................................. g/LSangre desfibrinada de Carnero ...............................10 %Agar Agar ................................................................. 15 g /lSe ajusta el pH a 7,2 y se dispensa en placas de Petri.

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Agar chocolateEs una variante del anterior en el que la sangre se añade cuando el medio está a temperatura elevada (próxima a los 100ºC) con lo que se produce una hemolisis. La composición del medio utilizado sin embargo, difiere del agar sangre. Su composición es la siguiente:

Agar CNA (Colistin-Nalidixic Agar)Se trata de un medio selectivo para cocos Gram positivos (tanto estafilococos como estreptococos) cuya composición es:

El carácter selectivo de este medio viene determinado por la presencia de los dos antibióticos (colistina y ácido nalidíxico) que impiden el crecimiento de bacterias Gramnegativas y de algunas Grampositivas.

Digerido pancreático de caseína ..................................................... 10,0/LPeptona de soja ................................................................................. 3,0 g/LTejido animal .................................................................................. 10,0 g/LDextrosa ............................................................................................. 1,0 g/LExtracto de levadura ........................................................................ 2,0 g/LCloruro sódico .................................................................................. 5,0 g/LBisulfito sódico ................................................................................. 0,1 g/LAgar .................................................................................................. 15,0 g/LCofactor .........................................................................................10,0 ml/LSangre de oveja .............................................................................45,5 ml/LpH 7,0 ± 0,2 a25 °C

Peptona especial .......................23, 0 g/LAlmidón ......................................1, 0 g/LCloruro sódico ............................5, 0 g/LAgar ...........................................10, 0 g/LÁcido nalidíxico .................... 15, 0 mg/LColistina ................................ 10, 0 mg/LpH 7,3 ± 0,2

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Agar Sabouraud con CloranfenicolEl Sabouraud-Dextrosa-Agar es el medio universalmente utilizado para el cultivo de hongos tanto patógenos como comensales y también de levaduras.

La alta concentración de dextrosa y el pH ácido de la fórmula permite una cierta selectividad para los hongos. Este medio es beneficioso en estudios de esporulación y producción de pigmento.

El Sabouraud con Cloranfenicol es una modificación del Sabouraud Dextrose Agar con la adición de Cloranfenicol para inhibir el crecimiento bacteriano. Su composición se indica en el cuadro siguiente:

Se suspendieron 65,5 g de polvo en 1L de agua bi-destilada y se llevó a ebullición. Se esterilizó en autoclave durante 15 minutos a 121°C.

Agar Mc ConkeyEl Agar McConkey es un medio de cultivo selectivo y diferencial diseñado para el cultivo de bacterias Gram negativas que resisten las sales biliares y que al mismo tiempo permite diferenciar las fermentadoras de lactosa de las que no lo son.

Contiene sales biliares (que inhiben a la mayoría de las bacterias Gram positivas), colorante cristal de violeta (que también inhibe ciertas bacterias Gram positivas), y un indicador (rojo neutro) que vira al acidificarse el medio por efecto de los productos de la fermentación de la lactosa.

Peptona de Caseina............................................................5,0 g/LPeptona de carne................................................................5,0 g/LD(+)-Glucosa.......................................................................40 g/LCloranfenicol………………………………………………0,5 g/LAgar......................................................................................15 g/LpH 5,6 ± 0,2 a25 °C

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Se suspendieron 51,5 g en 1L de agua destilada. Se calentó hasta la completa disolución. Se esterilizó en autoclave a 121°C durante 15 minutos y se dispensó en placas de Petri.

Fastidious anaerobe agar (FAA)Es el medio de elección para aislamiento de anaerobios clínicamente significativos. Este medio soporta el crecimiento de la mayoría de los anaerobios de cultivo complicado (fastidious bacteria). La formación de colonias clásicas, el olor y la fluorescencia a la luz ultravioleta son caracteres que pueden ayudar a la identificación presuntiva. La presencia de peptonas y factores de crecimiento permiten el rápido crecimiento de la mayoría de los microorganismos. Este medio se puede hacer selectivo para varios grupos de anaerobios por adición de agentes selectivos apropiados. Su composición es la siguiente:

Peptona ..............................................20 g/LLactosa ...............................................10 g/LSales biliares nº 3 ..............................1,5 g/LCloruro Sódico .................................5,0 g/LRojo neutro .....................................0,03 g/LCristal de Violeta ..........................0,001 g/LAgar ....................................................15 g/LpH 7,1 ± 0,2 a25°C

Mezcla de peptonas ........................ 23,0 g/LCloruro sódico ................................. 5,0 g/LAlmidón ........................................... 1,0 g/LGlucosa ............................................ 1,0 g/LPiruvato sódico ................................ 1,0 g/LArginina ........................................... 1,0 g/LSuccinato sódico .............................. 0,5 g/LBicarbonato sódico .......................... 0,4 g/LL-cisteina HCl .................................. 0,4 g/LPirofosfato férrico ........................... 0,3 g/LHemina ........................................ 0,005 g/LVitamina K ................................... 0,004 g/LAgar bacteriológico ....................... 12,0 g/LpH 7.3 +/- 0.2

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Se suspendieron 45,6 g de polvo en 1L de agua destilada. Se esterilizó en el autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Posteriormente se enfrió a 48 °C y se añadió un 5-7% de sangre estéril desfibrinada de caballo u oveja. Se mezcló bien mediante agitación y se vertió en placas de Petri de 90 mm.

Agar Manitol hipersalinoEl medio de manitol hipersalino es un medio selectivo indicado para el aislamiento de estafilococos patógenos. Dado que la concentración de sales es extremadamente elevada (7,5%), sólo permite el crecimiento de microorganismos tolerantes a esta concentración. La degradación del manitol con la formación de ácido está muy relacionada con la patogenicidad del microorganismo y sirve como indicativo del S. aureus. Su composición es la siguiente:

Se suspendieron 111g del polvo en 1L de agua destilada y se llevó a ebullición. Se esterilizó en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Estos medios de cultivo se seleccionaron atendiendo a la información que suministran cuando los microorganismos se desarrollan en su superficie, así como para cubrir todas las especies que por trabajos preliminares conocíamos que pueden encontrarse implicadas en procesos infecciosos ligados a las úlceras de pie diabético. (Padrós y Viñas no publicado).

Extracto de carne ....................................... 1,0 g/LPeptona de caseína ...................................... 5,0g/LPeptona de carne ......................................... 5,0g/LCloruro de sodio ....................................... 75,0g/LD-Manitol ................................................. 10,0g/LRojo de fenol ........................................... 0,025g/LAgar ........................................................... 15,0g/LpH 7,4 ± 0,2 a25°C

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3.6 Procedimientos de laboratorio

3.6.1 Cultivos El cultivo primario se obtiene directamente por siembra del material recogido con el hisopo que se ha usado para el muestreo. Por el contrario, en el caso de las muestras obtenidas con punch de las que se ha transferido el contenido a un tubo de ensayo, la inoculación de los medios de cultivo se lleva a cabo: a partir del material homogenizado con un instrumento de mano con pieza esterilizable que se extrae con una pipeta Pasteur. Los inóculos se extienden con la ayuda del asa de Kole para distribuir el material biológico sobre la superficie del agar. A partir de las colonias pueden obtenerse cultivos puros (poblaciones clónicas de microorganismos) para su posterior estudio. (Burullo et al., 2007)

Como se ha señalado anteriormente en el caso de las biopsias, éstas se trasfirieron a tubos con Ringer ¼. El Ringer ¼ es una solución salina isotónica que permite una buena supervivencia bacteriana en periodos de tiempo cortos para los anaerobios y considerablemente largos para las bacterias aeróbicas y facultativas.

Tras agitación durante un minuto y centrifugación a baja velocidad (2000 rpm 5 min) para la sedimentar las partículas de gran tamaño mediante una pipeta Pasteur se recolectó el líquido sobrenadante y se inocularon 10 µl del sobrenadante en cada placa de medio de cultivo.

3.6.2 Incubación Para la detección de bacterias mesófilas heterotróficas el Agar Sangre y el Agar Chocolate se incubaron a 37ºC en una atmósfera microaerófila (4 % CO2) durante 48 horas igual que las placas de Agar CNA, Agar McConkey y Manitol hipersalino. El Sabouraud con cloranfenicol, que como hemos comentado se inocula para determinar la presencia de hongos se incubó a 30ºC durante 4 días, toda vez que los hongos suelen tener temperaturas óptimas de crecimiento inferiores a las bacterias y que su crecimiento es considerablemente más lento. Por último el FAA se incubó en cámara de anaerobiosis durante 7 días. Las placas se observaron cada 24 horas.

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3.6.3 IdentificaciónLa descripción de las colonias desarrolladas se basa en la observación de su aspecto: tamaño, color, bordes etc. A partir de las colonias y por observación de las tinciones de Gram se puede asociar cada tipo colonial a una morfología celular y el correspondiente carácter Gram (Winn et al.,2008) Asimismo se obtienen cultivos puros que son utilizados para la inoculación de las pruebas bioquímicas de identificación microbiana.

3.6.3.1 Examen macroscópicoMacroscópicamente la microbiología se restringe al análisis de la morfología colonial. Las colonias se caracterizan por su forma, color, bordes y perfil. Si bien la morfología colonial no es un componente esencial de la identificación, si nos permite conocer el número de microorganismos distintos presentes en la muestra así como proceder a su separación en cultivos puros. Por otra parte en algunos medios de cultivo pueden observarse ya en los cultivos primarios algunas propiedades biológicas tales como la hemólisis en el agar sangre.

3.6.3.2 Examen microscópicoLa observación microscópica de las bacterias aisladas tras ser teñidas por Gram permite describir la forma, la manera de agruparse, y el tamaño, así como el carácter Gram, primer paso para la identificación microbiana. La información derivada del análisis de las colonias bacterianas y la tinción Gram de los frotis bacterianos, nos informa de las técnicas específicas convenientes para abordar la identificación del microorganismo implicado (pruebas bioquímicas).Para visualizar al microscopio óptico se ha utilizado un objetivo de 100 aumentos en inmersión con aceite de cedro.

3.6.3.3 Pruebas bioquímicasLas pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de identificación. Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan la presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos

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hasta unas pocas horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h; a este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de identificación que contienen el sustrato a metabolizar.

▶ Pruebas que hemos utilizado en la identificación preliminar, con lectura inmediata han sido las siguientes:

Catalasa. La catalasa es un enzima presente en la mayoría de los microorganismos que poseen citocromos. Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan el peróxido de hidrógeno en agua y oxigeno gaseoso que se libera en forma de burbujas. El principal objetivo de esta prueba en el contexto de este trabajo es el de separar Micrococacceae (positiva) de Streptococcus.spp. y Enterococcus spp. (negativa).

Oxidasa. Esta prueba sirve para determinar la presencia del enzima citocromo c-oxidasa, que es un pigmento de la cadena respiratoria del que carecen muchas bacterias. La reacción se pone de manifiesto por adición de un indicador de óxido/reducción que en presencia de citocromo c-oxidasa adquiere color púrpura oscuro (el tetrametil-para-fenilen-di-amida).

Oxidación-Fermentación (O/F). Mediante esta prueba se determina si la utilización de los hidratos de carbono se realiza por vía oxidativa (proceso aeróbico, presencia de oxígeno) o por vía fermentativa (proceso anaeróbico, ausencia de oxígeno).

Agar hierro de Kligler. Mediante esta prueba se puede determinar: a) La capacidad de un microorganismo de metabolizar hidratos de carbono (en este caso glucosa, lactosa o ambas) incorporados en un medio de crecimiento básico.b) Producción de gases: CO2 e H2 como productos finales del metabolismo de los hidratos de carbono.c) Producción de ácido sulfhídrico (SH2).

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El medio de Kligler contiene como hidratos de carbono glucosa y lactosa. Existe otro medio, el triple sugar-iron (TSI) que contiene un tercer hidrato de carbono, la sacarosa.

Hidrólisis de la esculina. Algunos microorganismos tienen la capacidad de hidrolizar la esculina a esculetina y glucosa. La esculetina reacciona con citrato férrico para formar un compuesto castaño oscuro o negro.

Coagulasa. Permite determinar la capacidad de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa. Se utiliza para diferenciar S. aureus (coagulasa positivo) de otras especies de Staphylococcus. La prueba de la coagulasa en tubo se puede leer tras incubación de 4h, pero si a las 4 h es negativa debe incubarse hasta 24h repitiendo la lectura tras la incubación.

3.7.3.4 Conservación y almacenaje de las cepasLos tres propósitos de un buen sistema de almacenamiento son mantener la pureza del cultivo, que sobrevivan al menos el 70-80% de las células, y que permanezcan genéticamente estables. En general se utiliza la congelación.

Se han congelado las células en suspensión en medio con un agente crioprotector y se han conservado a -80ºC. Los medios utilizados para la conservación han sido Skim Milk – leche descremada en polvo reconstituida- o TSB + glicerol al 10 %.

3.7.4 Susceptibilidad a los antibióticos La susceptibilidad a los antibióticos de los aislados se determinó en primera instancia por la técnica de Kirby-Bauer (antibiograma en placa). Se trata de la técnica más usual en microbiología clínica para las determinaciones rutinarias. La técnica se basa en la difusión del antibiótico a partir de discos de papel de Watman impregnados de antimicrobiano. El antibiótico difunde por el agar de modo que, en realidad, se crea un gradiente de concentraciones de antimicrobiano concéntrico al disco. (Figura 2.6.4)

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La placa inoculada de modo uniforme para generar un crecimiento semiconfluente , un crecimiento en el que las colonias están muy próximas unas a otras pero se distinguen entre ellas, presentará, en el caso de que la bacteria sea sensible, una zona de inhibición del crecimiento circular alrededor del disco denominada halo de inhibición.

Por lo tanto el diámetro del halo de inhibición viene determinado por la difusibilidad del antibiótico en el agar y, principalmente por la susceptibilidad de la bacteria al antimicrobiano. Es de señalar que este es un método cualitativo o semicuantitativo.

3.7.4.1 Antibióticos ensayados

BETALACTÁMICOS: penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos y monobactamicos.Los antibióticos betalactámicos tienen habitualmente una actividad bactericida, y actúan sobre las proteínas de membrana citoplasmática bacteriana conocidas como “proteínas fijadoras de penicilinas” (PBP: penicillin binding proteins). La fijación del antibiótico betalactámico a las PBP ocasiona una alteración en la síntesis del peptidoglicano (integrante de la membrana bacteriana), y con ello la lisis de la bacteria. (Suarezy Gudiol 2009; Cruz y Diaz 2010)

CloxacilinaEs un antibiótico betalactámico semisintético resistente a las betalactamas, especialmente estafilocócicas. Está indicado para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias grampositivas, en particular para estafilococos (Staphylococcus aureus y S. coagulasa-

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negativos). La resistencia a cloxacilina entre cepas de estafilococos ha ido en aumento en los últimos años; ésta es mayoritariamente debida a la presencia de una PBP de baja afinidad (PBP2a) para este antibiótico y que además suele condicionar resistencia a otros antimicrobianos. La forma de administración de la cloxacilina es habitualmente la vía endovenosa mientras que la absorción oral (biodisponibilidad) es baja. (Olaechea et al.,2007)

CeftazidimaEs una cefalosporina de tercera generación. Su espectro de actividad abarca las bacterias bacilares gramnegativas, con la característica particular de tener actividad antipseudomónica, y poco activa o incluso completamente inactiva frente a cocos Gram-positivos y a anaerobios. Su administración es parenteral, y suele ser limitado al medio hospitalario.

Imipenem y MeropenemSon antibióticos carbapenémicos. El espectro antimicrobiano de actividad es amplio y similar para ambos antibióticos, incluyendo bacterias grampositivas, gram negativas aerobias (P. aeruginosa inclusive) y anaerobios. El imipenem presenta un elevado metabolismo renal producido por la enzima humana deshidropeptidasa-1I (DHP-1) que ocasiona la formación de productos neurotóxicos. Por este motivo, la administración de imipenem se realiza asociada a cilastatina, un inhibidor de la DHP. Meropenem es estable ante la enzima renal DHP-1 y por ello no precisa la coadministración de cilastatina. Los carbapenémicos, en especial meropenem, penetran bien en diferentes tejidos y líquidos corporales, incluyendo líquido cefalorraquídeo, bilis, pulmón, líquido peritoneal.(Pasteran et al.,2011)

AztreonamEl aztreonam es un antibiótico betalactámico monocíclico (monobactámico) sintético. Tiene una actividad bactericida selectiva frente a bacterias aerobias Gram-negativas, incluyendo también a Pseudomonas aeruginosa. Su administración es exclusivamente por víaparenteral.

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AMINOGLUCÓSIDOSLos antibióticos aminoglucósidos tienen un mecanismo de acción que implica su fijación a la subunidad ribosómica bacteriana 30S. Su efecto final condiciona una inhibición de la síntesis proteica y la muerte bacteriana. El espectro de actividad es especialmente manifiesto frente a bacilos gramnegativos aerobios (P. aeruginosa inclusive) mientras que no tienen actividad frente a anaerobios. Las bacterias grampositivas varían en su sensibilidad a los aminoglucósidos, manteniéndose su uso, especialmente en combinación con otros antibióticos, frente a infecciones estafilocócicas y estreptocócicas. Los aminoglucósidos más utilizados son Gentamicina, Tobramicina y Amikazina. Su administración es exclusivamente por vía parenteral. Un aspecto destacable de estos antibióticos es su toxicidad (en especial renal y sobre el sistema vestibular y acústico), por lo que su uso prolongado debe ser estrictamente supervisado.

GLUCOPÉPTIDOSLa Vancomicina es el antibiótico más representativo de esta familia de antimicrobianos que actúan inhibiendo la síntesis de la pared celular bacteriana y produciendo generalmente una actividad bactericida. Su uso suele limitarse a bacterias grampositivas, en especial frente a S. aureus resistente a meticilina. La Vancomicina no se absorbe por vía oral por lo que debe ser administrada por vía endovenosa en el tratamiento de una infección sistémica, mientras que se reserva la administración oral para el tratamiento local de infección por Clostridium difficile.

FLUOROQUINOLONASLa Ciprofloxacina es el antibiótico más utilizado de este grupo. Su modo de acción consiste en el arresto de la replicación del DNA al unirse con enzimas implicados en el desenrrollamiento y disposición espacial (DNA girasas y Topoisomerasas). Es un antibiótico bactericida con una mayor actividad frente a bacterias gramnegativas (P. aeruginosa inclusive) que frente a grampositivas, donde no es recomendable su uso en solitario en la práctica clínica por la facilidad de desarrollar resistencias especialmente en S. aureus. Sin embargo las resistencias

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a quinolonas no son patrimonio de los grampositivos y han emergido también en muchas especies Gramnegativas. La Ciprofloxacina puede administrarse por vía oral y presenta una buena absorción y pocos o nulos efectos secundarios a largo plazo. Sin embargo una tendencia creciente de los microbiólogos propone estudiar más a fondo un a posible relación entre el aumento del consumo de quinolonas y los incrementos de ciertas neoplasias.

MISCELÁNEACotrimoxazolEs la asociación de Trimetoprim y Sulfametoxazol, dos antimicrobianos que por su actividad complementaria suelen utilizarse asociados, recibiendo la asociación el nombre de Cotrimoxazol. Ambos actúan sobre la ruta de síntesis del tetrahidrofolato. Su espectro de actividad incluye bacterias aerobias grampositivas y gramnegativas.

ClindamicinaEs una Lincosamida de origen semisintético, derivada de la Lincomicina

TigeciclinaTigeciclina es el primero de una nueva familia de antibacterianos de amplio espectro, las glicilciclinas. Estructuralmente es similar a las tetraciclinas, presenta un esqueleto central de cuatro anillos carbocíclicos, derivando directamente de la minociclina. Tigeciclina tiene una sustitución en la posición D-9 que le confiere un amplio espectro de actividad. Inhibe la síntesis proteica por unión a la subunidad del ribosoma bacteriano 30S y es bacteriostático.Es activo contra bacterias gramnegativas, grampositivas, incluyendo anaerobios incluyendo actividad contra S. aureus resistente a meticilina, pero no tienen actividad frente a Pseudomonas spp o Proteus spp.

Ac FusídicoEl ácido fusídico es un agente bacteriostático de estructura esteroidea de efecto limitado, efectivo sólo contra las bacterias grampositivas incluyendo especies de Staphyloccoccus y Corynebacterium. Actúa inhibiendo la síntesis proteica aunque no se une al ribosoma, sino que

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impide la translocación de los aminoácidos, paso final de la síntesis de cadenas peptídicas. Presenta buena biodisponibilidad incluso si se administra por vía oral, lo que hace recomendable su administración por esta vía.

MupirocinaLa mupirocina es activa frente a cocos grampositivos como Staphylococcus y S. pyogenes. La vía usual de administración en la práctica clínica es la vía tópica bajo forma de ungüentos o cremas. Su mecanismo de acción es inhibir la síntesis de proteínas bacterianas mediante la unión con la enzima isoleucil-tRNA sintetasa, de manera que impide la incorporación de la isoleucina a las proteínas.

ColistinaLa colistina (polimixina E) es un antibiótico producido por ciertas cepas de la bacteria Paenibacillus polymyxa var. Colistinus. La colistina es una mezcla de polipéptidos cíclicos que interactúan con la membrana citoplasmática bacteriana lo que tiene un efecto bactericida frente a bacilos gramnegativos. Actualmente es una de las escasas opciones terapéuticas contra bacterias gramnegativas multirresistentes como P. aeruginosa, Acinetobacter, etc.

3.7.4.2 Determinación de la actividad de la Oleuropeína

Para la determinación de la actividad antimicrobiana de la oleuropeína se utilizó el método de microdilución como herramienta para determinar la concentración mínima inhibitoria frente a cepas clínicas (45/1; 58/1; 64/2) y ATCC de Staphycococcus aureus.En el método de microdilución, cada uno de los pocillos de la placa de microtiter de fondo en “U” representa uno de los tubos del método de macrodilución. Las placas de microtiter contienen 96 pocillos (12X8) y el volumen final de cada pocillo es habitualmente de 100µl, por lo que antes de la inoculación de la placa, cada pocillo debe contener 100µl de caldo antimicrobiano y el volumen de inóculo menor a 10µl, de esta manera se impide que haya dilución del volumen final. La concentración final de microorganismo por pocillo ha de ser de 5x105 UFC/ml.

85

Se partió de una solución patrón de Oleuropeína en agua MiliQ de 32000µg/ml adicionando un volumen tal en el primer pocillo que su concentración final ha sido de 4000µg/ml.

3.7.4.3 Determinación de la actividad del péptido antimicrobiano LL_37Para la realización de la determinación de la actividad antimicrobiana del péptido LL-37, se utilizó el método descrito por (Noore J et al., 2013), modificado ligeramente, que se describe a continuación.

Se hacen crecer las cepas clínicas (37/3; 44/2; 45/1; 58/1) y ATCC 28213 de Staphyloccoccus aureus en medio TSB a 37ºC durante toda una noche. Al día siguiente, del cultivo en fase estacionaria se pasa a otro recipiente que contiene medio de cultivo fresco un 10% del nuevo volumen y se incuba durante 2,5 horas a 37ºC en agitación a 80rpm.Una vez en fase exponencial esta suspensión se diluye con medio de cultivo TSB estéril hasta una densidad óptica de 0,195 a 650nm. Una suspensión con estas características según Hinds A.E & Peterson G.X, 1963 equivale a una concentración de 8.107UFC/ml de Staphylococcus aureus.

De esta suspensión se preparan las debidas diluciones para que en el experimento pueda iniciarse con una suspensión de 105 UFC/ml.Utilizando tubos Eppendorf de 2 ml se añade el volumen correspondiente, partiendo de una solución patrón del péptido LL-37 en agua Milli-Q a una concentración de 1400µg/ml, hasta que las concentraciones en los tubos sean de 0,05µM, 0,25µM, 0,5µM, 1,0µM, 2,0µM y 3,0µM.

A continuación se disponen los tubos de manera horizontal en un Shaker orbital incubando durante 30minutos a 37ºCy a 80rpm. Cuando finaliza el período de incubación se preparan las diluciones seriadas en PBS y se inoculan de cada dilución, placas de TSA por duplicado, se incuban las placas a 37ºC durante 24 horas cuando se procede al recuento de colonias. En un segundo grupo de experimentos el periodo de incubación del péptido con el inóculo se incrementó hasta 2,5h.

86

Se ensayaron también diferentes medios de mantenimiento, así como el péptido ll-37 diluido en ácido acético al 5 % en agua a distintas concentraciones distintas.

3.7.4.4 Experimentos de determinación de la actividad antimicrobiana de asociaciones de antimicrobianos. El método utilizado para estudiar la interacción entre estos dos componentes también ha sido el método de microdilución en placas de microtitulación, método descrito anteriormente en el punto 3.8.4.3, con la diferencia de que en cada pocillo se combinaron diferentes concentraciones de la oleuropeína y del péptido LL-37. Esta parte experimental se centró en el objetivo de determinar y, eventualmente comparar los comportamientos de la actividad antimicrobiana de las dos sustancias cuando son utilizadas in vitro conjuntamente y compararlas con sus efectos cuando se aplica cada componente por separado frente a Staphylococcus aureus.

Las concentraciones de la oleuropeína y del péptido utilizado estuvieron comprendidas entre 4000 µg/ml y 31,25 µg/ml y entre 30 µM y 0,23 µM respectivamente.

3.7.4.5 Estudio de la Sinergia entre la Oleuropeína y el Péptido LL-37

Para el estudio de las interacciones entre Oleuropeína y el péptido LL-37 se partió de una solución patrón de Oleuropeína en agua y una solución patrón de ll-37 en DMSO.Se utilizaron placas de microtitulación para mezclar las diferentes concentraciones de oleuropeína y del péptido con el objetivo de poner de manifiesto cualquier tipo de interacción que pudiera darse.Como inóculo se utilizó la cepa ATCC 28213 de Staphyloccoccus aureus a una concentración bacteriana de 105 UFC/ml.En la tabla 3.8.4.5 se muestran las concentraciones y sus combinaciones ensayadas en cada placa de microtitulación de 96 pocillos.

1 2 3 4 5 6 7 81 ControlOleuropeína

4000 µg/ml

2000 µg/ml

1000 µg/ml

500 µg/ml

250 µg/ml

125 µg/ml

62,5 µg/ml

31,25 µg/ml

2 Control LL-37 30 µM 15 µM 7,5 µM 3,75 µM 1,87 µM 0,93 µM

1,46 µM

0,23 µM

3 30 µM + 4000 µg/

ml

15 µM +4000 µg/ml

7,5 µM +4000 µg/ml

3,75 µM +4000 µg/ml

1,87 µM +4000 µg/ml

0,93 µM

+4000 µg/ml

1,46 µM

+4000 µg/ml

0,23 µM

+4000 µg/ml

4 30 µM+ 2000 µg/

ml

15 µM +2000 µg/ml

7,5 µM +2000 µg/ml

3,75 µM +2000 µg/ml

1,87 µM +2000 µg/ml

0,93 µM

+2000 µg/ml

1,46 µM

+2000 µg/ml

0,23 µM

+2000 µg/ml

5 30 µM + 1000 µg/

ml

15 µM +1000 µg/ml

7,5 µM +1000 µg/ml

3,75 µM +1000 µg/ml

1,87 µM +1000 µg/ml

0,93 µM

+1000 µg/ml

1,46 µM

+1000 µg/ml

0,23 µM

+1000 µg/ml

6 30 µM + 500 µg/

ml

15 µM +500 µg/ml

7,5 µM +500 µg/ml

3,75 µM +500 µg/ml

1,87 µM +500 µg/ml

0,93 µM

+500 µg/ml

1,46 µM

+500 µg/ml

0,23 µM

+500 µg/ml

7 30 µM + 250 µg/

ml

15 µM +250 µg/ml

7,5 µM +250 µg/ml

3,75 µM +250 µg/ml

1,87 µM +250 µg/ml

0,93 µM

+250 µg/ml

1,46 µM

+250 µg/ml

0,23 µM

+250 µg/ml

8 30 µM +125 µg/

ml

15 µM +125 µg/ml

7,5 µM +125 µg/ml

3,75 µM +125 µg/ml

1,87 µM +125 µg/ml

0,93 µM

+125 µg/ml

1,46 µM

+125 µg/ml

0,23 µM

+125 µg/ml

9 30 µM + 62,5 µg/

ml

15 µM +62,5 µg/ml

7,5 µM +62,5 µg/ml

3,75 µM +62,5 µg/ml

1,87 µM +62,5 µg/ml

0,93 µM

+62,5 µg/ml

1,46 µM

+62,5 µg/ml

0,23 µM

+62,5 µg/ml

10 30 µM +31,25 µg/ml

15 µM +31,25 µg/ml

7,5 µM +31,25 µg/ml

3,75 µM +31,25 µg/ml

1,87 µM +31,25 µg/ml

0,93 µM

+31,25 µg/ml

1,46 µM

+31,25 µg/ml

0,23 µM

+31,25 µg/ml

1112

Control Medio Cultivo + S. aureusControl Medio de Cultivo

Tabla 3.8.4.5

88

La primera fila se utilizó como control de la OleuropeÍna, con una concentración que varió de 4000µg/ml a 31,25µg/ml. En la segunda fila se describe el control del péptido LL-37 con una concentración que varió entre 30µM a 0,23µM.

A partir de la tercera fila se preparó una serie de combinaciones de concentraciones entre las dos moléculas con excepción de la fila 11 en la que se preparó el control del medio de cultivo inoculado con S.aureus (control positivo de crecimiento bacteriano) y en la 12 control de medio de cultivo sin inocular (control negativo). Las placas se incubaron a 37oC durante 18 horas procediendo a la lectura transcurrido este periodo.

3.7.4.6 Efecto de la Oleuropeína sobre la formación de biofilmSe diseñó una modificación del protocolo de determinación de la concentración mínima erradicadora de biofilm (MBEC Minimal biofilm eradication concentration) con el fin de determinar la concentración que evita la formación de biofilm (BPC Biofilm Prevention Concentration). Para ello se utilizaron PEGS (Fernández-Olmos et al., 2012) que se sumergieron en placas de microtiter de 96 pocillos que contenían 100 µl de una dilución 1/200 de un cultivo de una noche de S.aureus (diversas cepas de las utilizadas en este estudio) y 100 µl de oleuropeína a concentraciones de 5 y 50 mg/mL en TSB adicionado con glucosa al 0.25 %. Tras 24 horas de incubación a 37°C los PEGS se lavaron con suero fisiológico estéril (NaCl 0.9 %). Tras el lavado se sumergen en 200 µl de metanol al 99% para fijar el biofilm formado y se incubaron durante 15 minutos. Tras el tiempo establecido, se eliminó el metanol y los PEGS se secaron en el aire. A continuación, se sumergen en 200 µl de Cristal violeta (CV) al 0,1 % con el fin de teñir la biomasa que forma el biofilm durante 15 minutos. Se solubiliza el CV unido al biofilm con 200 µl de ácido acético al 33% y se procede a la lectura de la absorbancia a 550nm de longitud de onda (Christensen GD et al.,1985). Este experimento se realizó con un total de 23 cepas clínicas de S.aureus procedentes de pacientes diabéticos con infecciones en el pie.

Resultados y Discusión

91

4. Resultados y Discusión

Este trabajo comprende dos partes claramente diferenciadas. La primera que esencialmente contempla los aspectos epidemiológicos de la población tratada, y la segunda que es de orientación microbiológica. Por ello me ha parecido oportuno presentan los resultados junto con la discusión en un mismo capítulo.

4.1 Datos epidemiológicos.

4.1.1 Edad Las edades de los pacientes incluidos en el estudio se muestra en la figura 4.1.1.

Podemos observar un cierta centralidad en la edad de los pacientes incluidos que se sitúa entre los 40 y los 70 años. Con una media de 64,6 años, una mediana de 67,5 y una desviación típica de 12,9 la distribución de edades nos indica que cerca del 50% de los pacientes tienen edades comprendidas entre los 50 y los 70 años principalmente. Para facilitar la comprensión de los datos se han realizado agrupaciones en grupos

Fig. 4.1.1. Histograma de edad de los pacientes incluidos en el estudio.

0

92

de 5 años. Nuestra muestra de pacientes no dispone de individuos de menos de 31 años y únicamente un 0,6% tiene más de 90 años. El resto de la muestra analizada se distribuye a grandes rasgos como sigue: cerca del 40% entre 31 y 50 años, aproximadamente un 50% entre 51 y 70 años y un 10% entre 71 y 80 años. 4.1.2 Sexo.Por lo que respecta a la distribución por sexos 130 pacientes (73,9 %) fueron hombres mientras que el resto (46) mujeres (26,1%). Es de señalar pues que en este trabajo la distribución por sexos es claramente desigual. Prácticamente 1 mujer por cada 3 hombres. Esta característica no es, obviamente buscada sino que responde a la tipología de los pacientes atendidos en el periodo de desarrollo de esta tesis. Ello es particularmente sorprendente pues algunos autores han señalado que no hay diferencias por sexo en cuanto a otras complicaciones, por ejemplo las cardiovasculares, durante el seguimiento. (Vidal-Perez et al., 2010)

La distribución entre géneros es bastante sorprendente dado que muchos autores han publicado la falta de diferencias entre sexos en lo que hace a otras complicaciones diabéticas (Vidal Pérez et al., 2010; Wat et al., 2016). En lo que respecta a las razones más frecuentes para el ingreso de pacientes lo más frecuente es que tuvieran que ser hospitalizados debido a complicaciones crónicas de la diabetes (42.1 %), seguido por episodios de (26.4 %) e infecciones (15.7 %). Se vio también que la cetoacidosis diabética es más común en mujeres que en hombres, por el contrario la nefropatía diabética y los neoplasmas son más frecuentes en hombres que en mujeres, así como las infecciones respiratorias (Lin et al., 2016) . Otros autores han mostrado que el sexo femenino en combinación con otras características tales como edad por encima de 60, bajo nivel educativo, tiempo de enfermedad diabética y niveles altos de hemoglobina glicosilada están fuertemente relacionados con elevados riesgos de sufrir retinopatías (Valizadeh et al. 2016). También Kawamoto et al. (2016) describen incidencia más elevada de síndromes coronarios en las mujeres. Está generalmente aceptado que mientras entre los individuos no diabéticos el riesgo de enfermedad cardiovascular es más elevado entre los hombres que en las mujeres,

93

la diabetes revierte completamente este escenario, es decir, entre las mujeres diabéticas se da una mayor incidencia de complicaciones cardiovasculares que entre los hombres con igual patología (Seghieri et al., 2016). Por el contrario Herrera-Rangel et al (2014) muestran que el sexo tiene una influencia clara en la estabilidad postural en pacientes con DM2 de modo que mientras en los hombres sin historia previa de desórdenes de equilibrio son más vulnerables que las mujeres. Dado que los desórdenes posturales pueden estar en el origen de las úlceras esta es una línea que merece ser explorada en el futuro.

4.1.3 Edad/Sexo La combinación de los datos de los dos apartados anteriores se muestra en la gráfica 4.1.3

Como puede observarse la distribución por sexo/edad muestra diferencias muy aparentes en todos los grupos de edad, pero muy especialmente en los grupos de 51/60 y 61/70. En el grupo de 51/60 el porcentaje de varones afectados por ulcera plantar fue del 91 % y en el grupo de 61/70 del 78 %.

Fig. 4.1.3 Histograma que muestra el sexo y la edad del conjunto total de pacientes incluidos en el estudio.

94

4.1.4 Antigüedad de la patología. Un parámetro de importancia máxima a la hora de evaluar las lesiones es, en la diabetes, el tiempo transcurrido desde el debut de la enfermedad. Por ello en la recopilación de datos epidemiológicos, y en la medida de lo posible, es relevante recoger la información máxima acerca de este período.

Hemos agrupado los enfermos en grupos de 5 años para facilitar la visualización y el manejo de los datos. Los resultados nos muestran que existe una variada distribución que va desde un año hasta a prácticamente 70, aunque con una marcada concentración entre los 11 y los 25 años que concentran el 63,6% de nuestra muestra. Analizando los datos observamos una importante discontinuidad entre número de pacientes con menos de 10 años de enfermedad y con más de 10 años de enfermedad.

Se trata de una discontinuidad enormemente significativa que se deberá analizar con mayor profundidad. Los datos desagrupados nos indican una media de 19,84 mediana de 18 con una desviación típica de 10,51. Además nos explican la discontinuidad por una proporción de pacientes con 13 años superior al resto de situaciones, con un 13,1%.

Esta concentración de respuestas en los 13 años puede indicarnos que se trata de una cifra de respuesta estándar para los pacientes que no recuerdan los años exactos de enfermedad o no quieren hacer el cálculo, si fuera este el caso la curva de respuestas se diluiría entre los valores cercanos a trece. Otra explicación podría ser que durante el proceso de la enfermedad, una glicemia descontrolada puede dar lugar a un creciente problema vascular que alrededor de los 13 años podría generar una mayor probabilidad de originar úlceras.

95

4.1.5 Tipo de diabetes. La población estudiada mayoritariamente se compone de DM2 de tipo (81% del total), con aproximadamente un 19 % de pacientes afectos de DM1.

4.1.6 Sexo/Tipo de diabetes. También con el objetivo de observar la interacción de la variable sexo con otros parámetros se realizó la comparación entre sexo y tipo de diabetes con una relación estadística cercana al 95% de confianza (sig= 0,054). Vemos en el gráfico que representa el número de casos que entre los hombres con úlcera predomina el tipo 2 de diabetes en mucha mayor medida que en las mujeres, si bien las diferencias del tamaño muestral no permiten obtener ninguna conclusión.

Fig. 4.1.4 Histograma que muestra el tiempo transcurrido desde el debut de la enfermedad y la aparición de la lesión.

Fig. 4.1.6 Histograma que muestra la relación tipo de Diabetes y sexo.

96

4.1.7 Tiempo/Tipo. Otra de las relaciones estadísticamente significativas que se han encontrado es la relación de las úlceras encontradas entre tipo de diabetes y años de enfermedad (sig=0,00). La DM2 predomina en los grupos de la muestra con menos años de enfermedad y disminuye significativamente cuando avanzan los años de enfermedad. Por otro lado la DM1 sigue una distribución normal concentrada entre los 21 y los 35 años de enfermedad.

Esta comparación, obviamente viene afectada por el hecho de que DM1 debuta al inicio de la vida, mientras que como hemos puesto de manifiesto anteriormente la el debut de DM2 se produce en cualquier momento de la vida con el máximo en la aparición en aproximadamente 50 años, con lo que el tiempo transcurrido no tiene el mismo significado en ambos tipos de diabetes. El gráfico podría modificarse atendiendo a estos valores. Fig. 4.1.7.2

Fig. 4.1.7.1 Histograma que muestra la relación que existe entre la presencia de úlcera el tipo de Diabetes y los años de enfermedad.

97

Es decir de hecho la aparición de úlcera es en teoría más precoz en la DM2 que en la DM1 lo cual puede deberse a que los DM1 son diagnosticados más precozmente, o que la edad juega un papel relevante a parte de la propia diabetes.

4.1.8 Grado de ulceración. En la figura 4.1.9. Se muestra la distribución de grados de ulceración. Podemos observar como los grados de ulceración que predominan son los del grupo 2 con un 71,6% de los casos estudiados, con menor gado de representación encontramos los grados 3 con un 27,3% y por último un único caso de grado 4.

4.1.9 Relevancia del cuidador. En la valoración clínica y anamnésica de los pacientes llama la atención que aquellos individuos que viven solos, particularmente los de sexo masculino manifiestan una gravedad mayor de las ulceraciones.

Fig 4.1.7.2 Comparación del tipo de diabetes y años de evolución hasta la aparición de úlcera

Fig 4.1.8 Grados de ulceración.

98

Esto es posiblemente susceptible de relacionarse con el grado de cuidado en la higiene personal y en la aceptación de la enfermedad y del tratamiento. (Ver tabla 4.1.9)

Podemos analizar la tabla anterior desde tres puntos de vista diferentes:

▶ a. Si decidimos que la variable base es la convivencia hemos de analizar la tabla de arriba abajo observando para cada grupo de úlcera la segunda casilla. Se puede observar que en el grupo “total” la segunda casilla es un 100% cosa que indica que lo estamos haciendo bien. Si la base de análisis que utilizamos es la convivencia, la pregunta que estamos realizando es qué porcentaje de personas que viven sola tiene grado de úlcera 2, y 3, y 4, Obviamente el total de personas que viven solas será el 100% y si sumamos las segunda casilla de cada úlcera nos dará 100%. En este caso el porcentaje de

Tabla 4.1.9

V. Solo V. Pareja TotalGrado de úlcera 2 % dentro de Grado de úlcera 25,4% 74,6% 100,0%

% dentro de convivencia 59,3% 77,0% 71,6%% del total 18,2% 53,4% 71,6%

3 % dentro de Grado de úlcera 43,8% 56,3% 100,0%% dentro de convivencia 38,9% 22,1% 27,3%% del total 11,9% 15,3% 27,3%

4 % dentro de Grado de úlcera 50,0% 50,0% 100,0%% dentro de convivencia 1,9% ,8% 1,1%% del total ,6% ,6% 1,1%

Total % dentro de Grado de úlcera 30,7% 69,3% 100,0%% dentro de convivencia 100,0% 100,0% 100,0%% del total 30,7% 69,3% 100,0%

Tabla de contingencia Grado de úlcera * convivencia

99

personas que viven solas (base de análisis) con grado 2 es 59,3%. El porcentaje de personas que viven solas (base de análisis) con grado 3 es de 38,9%. Y por último el porcentaje de personas que viven solas (base de análisis) con grado 4 es de 1,9%. Obviamente si sumamos los tres grados de úlcera nos dará 100% que quiere decir que todos los individuos que viven solos (base de análisis) tienen o grado 2, o 3 o 4.

▶ b. Si decidimos que la variable base es el grado de úlcera hemos de analizar la tabla de izquierda a derecha. Cada grado de úlcera tendrá un 100% de casos ya que es nuestra base de análisis. En este caso analizamos la primera casilla de cada grupo y veremos que al final siempre aparece un 100%. Si analizamos en detalle el grado de úlcera 3 como base de análisis vemos que dentro de este grado de úlcera un 43,8% son individuos que viven solos y un 56,3% vive en pareja. Obviamente, dentro de la base de análisis grado de úlcera 2 el total de personas que vive sola sumadas con el total de personas que vive en pareja suma el total de personas que tiene grado de úlcera 2, un 100%. La pregunta que nos hacemos aquí es: dentro de las personas con grado de úlcera 2 cuantas viven solas. Y cuantas en pareja.

▶ c. Por último podemos mirar la tabla de manera cruzada, es decir que tenga en cuenta las dos variables a la vez. En este caso analizamos la tercera casilla de cada grupo y la pregunta que nos hacemos es: del total de población (todas las úlceras y que viven solas o en pareja) qué porcentaje vive solo y tiene grado de úlcera 2. Y qué porcentaje vive en pareja y tiene grado de úlcera 3. Vemos que aquí no hay una variable base de análisis, no hay ninguna variable fija ya que movemos las dos variables a la vez. Por ejemplo, las personas con grado de úlcera 2, que viven solas son un 18,20%. Las personas que viven en pareja con grado de úlcera 3 son un 15,3%.

Por último hemos de tener en cuenta que en una tabla de contingencia, la fila o columna total es una más del análisis. Por ejemplo si tomamos

100

como variable base de análisis la vida sola o en pareja, en verdad tenemos 3 variables: vive solo, vive en pareja y total (suma de los que viven solos y en pareja). Lo mismo con los grados de úlcera, tenemos 4 filas que nos dan información en la misma línea: grado 2, grado 3, grado 4 y total (suma de grado 2, 3 y 4).

Es de destacar que se ha encontrado una relación estadística entre estar casado (o vivir en pareja) y el grado de úlcera (sig=0,053). Es decir que proporcionalmente la población de personas que viven con pareja tiende a mostrar úlceras de grado menor que las que viven solas tal como se muestra el gráfico anterior. Puede traducirse en una preocupación mayor por el estado de sus pies, ya sea por parte de la persona implicada o por parte de la persona con quien convive el enfermo.

4.1.10 Localización de las úlceras. El gráfico 4.1.10. muestra como un 49,4% de las úlceras se localizan en el antepié mientras que un 33,90% en los dedos. El talón aparece mucho menos representado con únicamente un 16,7% de los casos estudiados.

4.1.11 Vasculopatias/Neuropatías. En el gráfico 4.1.12 podemos observar que las vasculopatías aparecen en una proporción mucho menor que las neuropatías o las mixtas, únicamente en un 3% de los casos estudiados se ha encontrado únicamente vasculopatía.

Fig 4.1.10

101

Por otro lado la Neuropatía es bastante frecuente entre la muestra con un 49% de representación. La opción mixta, vasculopatía y neuropatía al mismo tiempo aparece en un 48% de los casos.

4.1.12 Tipo/Localización de la lesión. En la figura 4.1.13 se muestra un histograma que relaciona el tipo de lesión y su localización.

Es interesante analizar la relación entre neuropatía y/o vasculopatía y la localización de la úlcera. Los datos indican que una gran proporción de úlceras solamente neuropáticas se localizan en el antepié mientras que la mayoría de las vasculopáticas las encontramos en los dedos.

Los casos en los que encontramos tanto neuropatía como vasculopatía se encuentran casi por igual entre dedos y antepié y con menor frecuencia en el talón.

Fig 4.1.11 Histograma que muestra las distribuciones de neuro/vasculopatías y coexistencia de ambas.

102

4.1.13 Número de complicaciones diagnosticadas. Como se ha señalado en la introducción las complicaciones de la diabetes son numerosas y variadas y abarcan diversos sistemas (ojos, riñón, etc.). Como una variable epidemiológica más se ha considerado interesante registrar el númerode distintas complicaciones que presentaba cada paciente. La figura 4.1.13 muestra un histograma que resume estos datos.

Fig. 4.1.12 Histograma que muestra la relación entre localización y tipo de lesión.

Fig. 4.1.13 Histograma de frecuencias del número de complicaciones diagnosticadas en el grupo de pacientes estudiados.

103

En el Histograma 4.1.14. observamos que la retinopatía es por excelencia una de las complicaciones que más se observan en este grupo de pacientes muy por encima de las demás, también observamos que un 17% de estos pacientes presentan además de pie diabético, retinopatía y nefropatía.

Nefropatía Retinopatía Nefropatía y Retinopatía Cardiopatía Cardiopatía

y NefropatíaCardiopatía y Retinopatía

Si 46 78 30 52 20 26No 130 98 146 124 156 150

Total 176 176 176 176 176 176

Nefropatía Retinopatía Nefropatía y Retinopatía Cardiopatía Cardiopatía

y NefropatíaCardiopatía

y RetinopatíaSi 26,1% 44,3% 17,0% 29,5% 11,4% 14,8%

No 73,9% 55,7% 83,0% 70,5% 88,6% 85,2%Total 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%

Fig. 4.1.14 Histograma de frecuencias del número de complicaciones diagnosticadas que se asocian más frecuentemente en un mismo paciente del grupo de pacientes estudiados.

104

Como hemos comentado en la introducción, el pie diabético es una de las complicaciones más graves de la diabetes, y, en muchas ocasiones, conduce a situaciones en las que se hace necesaria la amputación. Por otra parte, ha quedado bien establecido que los cuidados de enfermería y podológicos son del todo imprescindibles para prevenir (o por lo menos para retrasar) la aparición del pie diabético (Sugandhi et al., 2014). Sin embargo no puede dejar de tenerse en cuenta que los clínicos se enfrentan a dificultades considerables a la hora de establecer diagnósticos y establecer terapias precoces y aplicar los cuidados necesarios o más convenientes.

Desde el punto de vista de la microbiología, el conocimiento del microorganismo implicado, de los factores de riesgo, y del resto de condiciones que pueden jugar un papel en el establecimiento de la infección es fundamental. Y, sin embargo, es poco frecuente que se disponga de estos datos en el momento de establecer los tratamientos. En nuestro estudio el pie diabético fue, en general, de mayor incidencia y gravedad en hombres que en mujeres al igual que ocurre en muchas otras publicaciones, que tratan sobre la cuestión. (Sugandhi et al., 2014; Umasankari et al., 2012; Bentkover et al., 1999). También ocurre lo mismo con los datos referidos a la edad, que en todos los casos presenta una mayor concentración a partir de los 50 años. De acuerdo a nuestros datos la aparición del pie diabético se establecería a partir de los 13 años del diagnóstico de la enfermedad en aquellos pacientes que fueron debidamente diagnosticados.

4.2 Aislamiento de bacterias de las úlceras plantares.

4.2.1 Aislamientos. El aislamiento de bacterias procedentes de heridas sépticas es, desde el punto de vista experimental un objetivo fácil. Ahora bien, en general se aíslan una gran variedad de microrganismos, lo que en la mayoría de los casos obstaculiza de modo significativo la determinación de cuál es el agente responsable de la infección y de sus consecuencias. En la figura 4.2.1 se muestran las frecuencias de aislamiento por lo que respecta al número de especies aisladas e identificadas en cada muestreo. Tradicionalmente se han utilizado

105

dos métodos de obtención de muestra (hisopos y punch). Como se observa en los datos las muestras tomadas con hisopo presentan un número significativamente mayor de especies bacterianas. Es obvio que la contaminación del instrumento con bacterias procedentes de la microbiota dérmica es mucho mayor al utilizar escobillones, ello, es en muchas ocasiones, un factor que complica enormemente la obtención de conclusiones con respecto a la identidad del microorganismo responsable, así como en el establecimiento de la terapia antimicrobiana.

Las líneas de tendencia muestran como la toma de muestras con punch tiene mayor pendiente que la definida por los aislamientos con hisopo que es prácticamente paralela al eje de abscisas.

4.2.2 Microorganismos aislados. Los trabajos de seguimiento de los pacientes diabéticos inmediatamente anteriores al comienzo de esta tesis, y la consulta bibliográfica, mostraron que había una discrepancia notable entre diversos trabajos por lo que hace a la caracterización de las especies implicadas en la infección de las úlceras plantares.

Fig 4.2.1. Histograma que representa los datos con respecto al número de especies aisladas y el método de obtención de la muestra. En las abscisas se indican el número de bacterias distintas aisladas (desde ninguna a 4) y en ordenadas el número de casos. En azul se representan los datos de muestras tomadas con hisopo y en rojo las tomadas con punch.

106

Es muy posible que, en parte, estas diferencias se deban a los métodos microbiológicos, los métodos de toma de muestras, pero también es muy posible que algunas diferencias pudieran deberse a factores geográficos, del tipo de calzado, de las costumbres higiénicas, y otros.Por lo tanto esta sección tiene exclusivamente un propósito descriptivo.

Dicho de otro modo esta sección es, en cierto modo, un relato, y una relación de las bacterias que nosotros en nuestro trabajo de clínica y de laboratorio podemos referir como las que infectan las úlceras plantares de los pacientes atendidos en las dos instituciones sanitarias en las que se ha desarrollado este trabajo. Ello no prejuzga que el agente etiológico del proceso infeccioso sea un determinado aislamiento excepto en los casos en que el cultivo resultó ser puro.

Como se ha comentado anteriormente se han empleado dos métodos alternativos de toma de muestras: hisopo y punch. Como era de esperar las muestras tomadas con hisopo rinden un mayor número de especies/muestra. En la tabla 4.2.2.1 se muestra la distribución de los aislamientos a partir de muestras tomadas con hisopo. En la tabla 4.2.2.2 se muestran los aislamientos obtenidos a partir de muestras tomadas con punch. En la figura 4.2.2.3 se comparan los resultados de uno y otro método.

Como puede apreciarse en la figura 4.2.2.3 los dos métodos de muestreo no modifican sensiblemente las proporciones de modo que el efecto del modo de obtención de la muestra sobre los resultados se refiere más bien al número total de aislamientos, que es mucho mayor en el caso de las muestras tomadas con hisopo.

Es por tanto muy posible que este tipo de muestreo “incremente” la presencia bacteriana por captación de bacterias de la piel que nada tengan que ver con el proceso infeccioso. Pero podría también tratarse de una limitación que afectaría por igual, en sentido contrario, a ambos métodos y que pondría en cuestión no sólo los resultados de otros autores sino los propios de esta tesis y cuantos pudieran obtenerse con estos métodos. Si la variabilidad bacteriana

107

Tabla 4.2.2.1 Número de aislamientos y porcentaje con respecto al total resultante de los cultivos de especímenes tomados con hisopo.

no se modifica se podría concluir que en los dos métodos se obtienen las mismas bacterias, cuando la muestra se ha tomado de lugares profundos (punch) la diversidad es menor, pero la distribución es la misma. En otras palabras contaminar la muestra con flora dérmica no afecta sensiblemente a los resultados “epidemiológicos” aunque si podría alterar de modo significativo el diagnóstico de laboratorio de cada caso en particular. Y queda claramente demostrado que las bacterias responsables de los procesos infecciosos en las úlceras de pie diabético son, en su mayoría, procedentes de la propia microbiota del enfermo.

Especie Número PorcentajeProteus spp. 32 7Escherichia coli 10 2.2Otras enterobacterias 75 13.4Pseudomonas spp. 86 18.9Corynebacterium spp. 22 4.8Acinetobacter calcoaceticus 5 1.1Staphylococcus coagulasa negativa 35 7.7Staphylococcus saprophyticus 2 0.4Staphylococcus aureus 95 20.8Micrococcus spp 8 1.8Streptococcus viridans 7 1.5Streptococcus pyogenes 7 1.5Streptoccoccus A 18 3.9Streptoccoccus D 5 1.1Enterococcus spp. 21 4.6Otros cocos Grampositivos 10 2.2Rhodotorula spp. 2 0.4Candida albicans 4 0.9Candida parapsilosis 11 2.4Cryptococcus spp. 1 0.2Total 456 100

Frecuencia de aislamientos a partir de muestras de hisopo

108

En definitiva, en base a nuestros resultados la toma de muestras con punch disminuye el número de aislamientos pero no su diversidad, con lo que la conclusión podría ser que la muestra obtenida con el punch es una muestra más limpia, con menor número de aislamientos .

Con ello, se facilitan las labores en el laboratorio pues el número de microorganismos a identificar y estudiar es menor. Por lo tanto concluiríamos que la toma con punch, es recomendable en todos los

Especie Número PorcentajeProteus spp. 18 9Escherichia coli 5 2.5Otras enterobacterias 33 16.4Pseudomonas spp. 42 20.9Corynebacterium spp. 5 2.5Acinetobacter calcoaceticus 2 1Staphylococcus coagulasa negativa 9 4.5Staphylococcus saprophyticus 1 0.5Staphylococcus aureus 42 20.9Micrococcus spp 4 2Streptococcus viridans 2 1Streptococcus pyogenes 2 1Streptoccoccus A 6 3Streptoccoccus D 3 1.5Enterococcus spp. 9 4.5Otros cocos Grampositivos 5 2.05Rhodotorula spp. 2 1Candida albicans 2 1Candida parapsilosis 8 4Cryptococcus spp. 1 0.5Total 201 100

Frecuencia de aislamientos a partir de muestras de punch.

Tabla 4.2.2.2 Número de aislamientos y porcentaje con respecto al total resultante de los cultivos de especímenes tomados con punch.

109

casos particularmente teniendo en cuenta que la neuropatía hace esta toma de muestra totalmente indolora.

4.2.3 Susceptibilidad a los antimicrobianos de los aislados de PseudomonasEn general las cepas aisladas de las ulceras plantares presentaron marcadores de resistencia, si bien en pocos casos se aislaron cepas multiresistentes. Presentaremos estos datos ordenados por especies.

En Pseudomonas aeruginosa fue frecuente el aislamiento de cepas resistentes a ciprofloxacina (mas de la cuarta parte) y una cierta resistenca a carbapenems (imipenem y meropenem) y a monobactamas.

Es de destacar que hasta el momento en que se desarrolló esta tesis de forma empírica se trataban en los dos centros las infecciones de ulceras diabéticas con ciprofloxacina, que sorprendentemente cubriria (en el

Figura 4.2.2.3 Histograma comparativo entre las frecuencias de aislamientos de las distintas especies en relación al modo de obtención de la muestra. En rojo los valores de las muestras obtenidas con hisopo, en azul las correspondientes a punch

110

caso de ulceras infectadas por Pseudomonas), sólo el 75 %. Esto pone de manifiesto la relevancia de los datos de laboratorio en la deterimación del agente antibacteriano a usar.

4.2.4 Susceptibilidad a los antimicrobianos de los aislados de Staphylococus aureus.En el caso del Grampositivo más frecuente los resultados se muestran en la gráfica 4.2.4

Aquí puede observarse como, nuevamente se da una resistencia a la ciprofloxacina en 17 % de los casos y que el 100 % de los aislados fueron resistentes a la penicilina y derivados.

Fig 4.2.3 Porcentajes de cepas susceptibles (azul) intermedias (rojo) y resistentes (verde) a los antibióticos más frecuentemente utilizados en clínica para combatir las infecciones por Pseudomonas aeruginosa

111

Destaca en estos resultados la elevada susceptibilidad a clindamicina, tobramicina, amikacina, ácido fusídico, mupirocina, gentamicina y tigeciclina. Se observa también resistencia total a penicilina y a amoxicilina, aunque esta última revierte al añadir ácido clavulánico en prácticamente la mitad de las cepas que se comportan como intermedias. Es de destacar que algunas de las resistentes a los betaláctamicos, podrían considerarse MRSA (Methicillin-Resistant-Staphylococcus aureus).

4.2.5 Actividad antimicrobiana de la Oleuropeína frente Staphylococus aureus.La actividad antimicrobiana de la oleuropeína se ensayó por el método de la microdilución sobre 4 de los aislamientos de Staphylococcus aureus. Las concentraciones ensayadas fueron; 62,5µg/ml, 125µg/ml, 250µg/ml, 500µg/ml y 1000µg/ml.

Fig 4.2.4 Frecuencias de cepas susceptibles (azul) intermedias (rojo) y resistentes (verde) a los antibióticos más frecuentemente utilizados en clínica para combatir las infecciones por Staphylococcus aureus

112

Los aislamientos 58/1, 64/2 y 45/1 presentaron una MIC de oleuropeína de 500 µg/ml, mientras que 44/2 arrojó un valor de 1000 µg/ml. Los aislados utilizados en estos experimentos presentaban una considerable multiresistencia como puede apreciarse en la tabla 4.2.5.

Antimicrobiano 58/1 64/2 45/1 44/2Penicilina R R R RCefoxitina S R R S

Eritromicina I S R IClindamicina S S S STobramicina S S R SAmikacina S S R S

ácido Fusídico S S R SOxacilina S R R R

Mupirocina I I I SGentamicina S S S SVancomicina S S S S

Co-trimoxazol S S S ICiprofloxacina R S R S

Tigeciclina S S S S

Tabla 4.2.5. Susceptibilidad de los aislados utilizados en la determinación de MIC de oleuropeína.

113

Como puede observarse en las cepas S1, S2, S5 y S7 se alcanzó una inhibición completa de la formación de biofilm. Por ello se abordó una determinación experimental en un número mayor de cepas. A concentraciones superiores (50 mg/ml) la inhibición es más marcada como se puede observar en los datos de la tabla 4.2.6.2 en la que se presentan datos en un total de 23 cepas.

Tabla 4.2.6.1. Valores de DO a 550 nm de longitud de onda del biofilm formado en presencia de 5 mg/mL de oleuropeína.

4.2.6 Efecto de la Oleuropeína sobre la formación del biofilm.La inhibición de la formación de biofilm por parte dela oleuropeína se puede apreciar en los valores de las tablas siguientes: (Tabla 4.2.6.1 ; 4.2.6.2)

S.aureus+5 mg/mL de oleuropeïna

S.aureus sin tratamiento

C-

S1 0,366 3,303 0,155S2 0,187 3,344 0,146S3 3,208 3,371 0,128S4 2,758 3,498 0,151S5 0,128 4,101 0,160S6 3,519 3,820 0,152S7 0,175 2,665 0,142S8 2,470 2,826 0,130

114

Tabla 4.2.6.2. Valores de DO a 550 nm de longitud de onda del biofilm formado en presencia de 50 mg/mL de oleuropeína.

A estas concentraciones relativamente elevadas de oleuropeina la inhibición de la formación del biofilm se dio en todas las cepas estudiadas.

S.aureus + 50 mg/mL de oleuropeïna

S.aureus sin tratamiento

C-

S1 0,419 2,079 0,153S2 0,302 3,046 0,124S3 0,227 3,336 0,126S4 0,340 1,969 0,124S5 0,253 2,082 0,127S6 0,275 2,977 0,117S7 0,262 3,212 0,117S8 0,286 2,042 0.118S9 0,208 1,816 0,200

S10 0,121 0,629 0,203S11 0,126 1,636 0,184S12 0,392 3,200 0,167S13 0,134 3,161 0,201S14 0,123 1,928 0,175S15 0,140 2,825 0,199S16 0,227 2,046 0,238S17 0,220 2,083 0,216S18 0,257 1,182 0,142S19 0,227 1,066 0,147S20 0,279 1,561 0,169S21 0,202 1,360 0,151S22 0,305 1,055 0,136S23 0,327 2,559 0,245

115

4.2.7 Actividad antimicrobiana del Péptido LL-37 frente a cepas de Staphylococcus aureus.Inicialmente la determinación del efecto antimicrobiano del péptido LL-37 propuesto como agente antimicrobiano a añadir a la formulación con oleuropeína se ensayó por el método de microdilución utilizando para ello péptido LL-37 adquirido en Sigma Chem Co.

Se utilizaron seis cepas clínicas de Staphylococcus aureus además de la cepa ATCC 28213. Se ensayaron concentraciones decrecientes a partir de 14 µg/ml (lo que equivale a 3,11 µM) y no se observó efecto antimicrobiano alguno. Tampoco se observó ningún efecto cuando las concentraciones se elevaron a un rango de entre 12,46 y 56 µg/ml. Ni tampoco a rangos superiores (del orden de 200 µg/ml). Dado que a dichos rangos de concentración, que exceden en mucho los que podrían ser imcorporados a un producto farmacéutico de aplicación tópica, no se había encontrado actividad antimicrobiana detectable mediante el método de determinación de la MIC, parecía oportuno averiguar si LL-37 era capaz de modificar los patrones de crecimiento a tiempos más cortos.

Para ello se utilizó el método de Noore et al., (2013), este método consiste (como se ha señalado en el capítulo de material y métodos) en poner en contacto durante 30 minutos bacteria y péptido, y transcurrido el periodo de contacto, determinar la supervivencia bacteriana. Tampoco en este caso se detectó actividad ninguna ni tampoco cuando se incrementó el tiempo de contacto hasta 2 horas 30 min. En esta etapa del proceso se habían realizado más de 30 experimentos para determinar la actividad antimicrobiana de LL-37 por tres protocolos distintos con los mismos resultados negativos. El péptido se había obtenido del suministrador comercial (Sigma).

Por lo que decidió antes de dar por finalizada esta parte de la experimentación, desarrollar una nueva serie de experimentos mediante el método de Noore pero utilizando péptido LL-37 sintético obtenido en el laboratorio del prof. F. Albericio (DEP Química Organica.UB).

116

Tras 0,5 h de contacto (bacteria-LL-37) y utilizando concentraciones: de 1,5µM hasta 30,0 µM se obtuvieron los resultados que se muestran en la tabla 4.2.7

Es decir, en este caso a 15 µM ll-37 es capaz de eliminar completamente los supervivientes. Dados los resultados abordamos la determinación de la MIC del péptido sintético determinando por microdilución cuyo valor resulto ser de 1,88 µM.

4.2.8 Interacciones entre LL-37 y la OleuropeínaLos experimentos desarrollados con el fin de averiguar si existía efecto sinérgico entre la oleuropeína y el péptido LL-37 se llevaron a cabo por estar planificados, aunque de hecho los resultados obtenidos con LL-37 solo, junto con el elevado costo de este péptido ya excluían su posible incorporación al desarrollo de un apósito con el fin de tratar y prevenir úlceras en pie diabético. En este mismo sentido los resultados no mostraron efecto sinérgico alguno de modo que las MIC no se modificaron por efecto de la utilización conjunta. Los cálculos de FICI se muestran a continuación.

MIC Oleuropeína = 1000 µg/mlMIC ll-37 = 15 µMMIC Oleuropeína en conbinación = 1000MIC ll-37 en combinación 30 µMFICI Oleuropeína = 1000/1000 = 1FICI LL-37 = 30/15 = 2

Tabla 4.2.7

Cepa ATCC - 28213 Recuento bacterias viablesControl positivo 1,55 106ufc/ml

[1,5µM] 1,1 105ufc/ml[3,0µM] 5,5 103ufc/ml[6,0µM] 5,5 103ufc/ml[15µM] 0[30µM] 0

Control negativo 0

117

Los valores situados entre 1 y 2 se consideran indicativos de indiferencia. Por lo tanto no puede considerarse que el péptido LL-37 sea sinérgico con la oleuropeína. Pareceria por lo tanto indicado buscar otro antiicrobiano de menor precio y mayor actividad en el diseño del tratamiento y prevención de las úlceras plantares.

En general se ha afirmado que las infecciones del pie diabético eran polimicrobianas. (Lipsky et al., 2013). Esta aseveración siendo cierta no excluye que en nuestro trabajo hemos detectado un porcentaje significativo de infecciones monomicrobianas (42,4 % en las muestras tomadas con trocar y 32,9 % en las muestras tomadas con hisopo). El trabajo de Sughandi y Arwing (2014) obtiene un 66 % de muestras monoespecíficas aun cuando las muestras fueron tomadas únicamente con hisopo. Ello podría deberse a que el número y variedad de los medios de cultivo inoculados con los especímenes fue en ese trabajo mucho menor (únicamente agar sangre, BHIA y agar nutritivo) en realidad no es previsible que los resultados en estos medios mejoren la utilización únicamente de agar sangre, por lo tanto podríamos pensar que la inoculación de una mayor variedad de medios de cultivo aumentaría la capacidad de detección de infecciones polimicrobianas. Esta conclusión, que puede verse como algo obvio, pone de manifiesto la necesidad de establecer patrones o protocolos analíticos de utilización universal, pues como se ve en este caso la falta de un protocolo consensuado conduce a resultados que en apariencia son divergentes. Nuestros resultados en esta cuestión coinciden notablemente con los Sugandhi, Dhanasekan y Tiwari. (Sughandi et al., 2014; Dhanasekaran et al., 2003; Tiwari et al., 2012)

Como hemos señalado en el capítulo correspondiente, los microorganismos aislados con mayor frecuencia fueron Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Enterobacterias en general. Estos datos coinciden con algunos trabajos y claramente difieren de otros. En este caso hay que tener en cuenta los parámetros geográficos y culturales de forma muy central. Así nuestros resultados con respecto al hecho de que P. aeruginosa es el microorganismo predominante coinciden con Citrón y colaboradores (Citrón et al., 2007) quienes desarrollaron

118

su trabajo en los Estados Unidos de América y que incluía también casos entre severos y moderadamente graves. Sin embargo las proporciones en lo que respecta a Pseudomonas y corynebacterias están invertidas pues en este trabajo se detectaron el doble de cepas de bacterias corineformes que Pseudomonas. Otros autores describen en sus trabajos que el microorganismo predominante es Staphylococcus aureus. En cualquier caso, en nuestro trabajo se obtuvieron unos resultados inequívocos en lo que respecta a la distribución de especies, que nos lleva a concluir que en principio, y a fata de abordar un estudio en profundidad de anaerobios estrictos, las especies a tener más en cuenta son Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, las distintas especies de enterobacterias y que la presencia de corineformes es ocasional.

Hemos hecho referencia en el párrafo anterior a los anaerobios estrictos. En nuestro trabajo no se abordó su aislamiento e identificación, pues cuando este trabajo se inició el laboratorio disponía de medios muy precarios para abordar el aislamiento de un elevado número de muestras con las técnicas propias de cultivo e identificación de anaerobios estrictos. Durante el periodo experimental de esta memoria el laboratorio se equipo con una cámara de anaerobios (Anaerobe work Station) con la que en un futuro inmediato se pretende iniciar un nuevo trabajo teniendo en cuenta estos microorganismos. Sin embargo, es un hecho conocido que las infecciones por anaerobios estrictos responden excelentemente al desbridamiento, con lo que, en realidad, desde el punto de vista terapeutico, los cuidados podológicos muy posiblemente, cubren esta cuestión.

Por lo que respecta a la susceptibilidad antimicrobiana es fácil observar que en general se presentan niveles de resistencia altos. Esto es alarmante en el caso de Pseudomonas y la ciprofloxacina (ampliamente utilizada de modo empírico en el tratamiento de úlceras de pié diabético en nuestro medio). Una cuarta parte de los aislamientos fueron totalmente resistentes. Ello pone de manifiesto la importancia de proceder al aislamiento, identificación y determinación de la susceptibilidad antes de instaurar un tratamiento antimicrobiano.

119

Las concentraciones a las que la oleuropeína inhibe por completo la formación del biofilm podrían parecer muy elevadas. Sin embargo el hecho de que en la estrategia experimental de este proyecto los resultados hayan ido dirigiendo la investigación hacia el diseño de un apósito utilizable para tratar las infecciones de pie diabético y /o prevenir la aparición de infecciones, hacen que concentraciones de este orden no constituyan un hándicap. Por una parte la oleuropeína es de bajo costo (por lo menos en países productores de aceite de oliva) y por otra parte sus propiedades físico-químicas no plantean dificultades significativas para ser adicionadas a un apósito. Por lo tanto, si bien los resultados obtenidos con el péptido LL-37 parecen recomendar la búsqueda de otras alternativas, el uso de la oleuropeína parece justificado a la luz de los resultados microbiológicos. En estudio dermatológico del efecto de la oleuropeína, actualmente en curso habrá de complementar estos resultados.

4.2.9 Limitaciones del estudioLa investigación que hemos desarrollado a lo largo de los seis años de trabajo clínico y experimental para la confección de esta memoria doctoral, pretendía, en primer lugar, dibujar una perspectiva global del escenario en el que se desarrolla la tarea de las unidades de Pie diabético. En este sentido y centrados de modo particular en el tratamiento de las úlceras de pie diabético hemos atendido cientos de consultas, realizado cientos de tomas de muestra, análisis microbiológicos, caracterizaciones de las cepas bacterianas y seguimientos clínicos de los pacientes. Esta memoria recoge, con el mayor rigor del que hemos sido capaces, los datos acumulados y los resultados del tratamiento estadístico de los mismos e intenta hacer una interpretación de los mismos. Como ocurre con la práctica totalidad de los estudios realizados sobre enfermos diabéticos, el estudio adolece de una serie de limitaciones que es difícil, sino imposible evitar, pero que tampoco pueden soslayarse. La primera es la heterogeneidad del cuidado, del grado de consciencia del estado de enfermedad, de la metódica en el seguimiento de las normas de prevención, etc. Resulta inabordable tabular estas condiciones en un estudio como el presente. Pero es también una

120

enorme limitación la sobre-medicación que se puede observar en muchos de estos pacientes. Así no es baldío tener en cuenta que muchos de los datos microbiológicos que aquí hemos referido pueden estar condicionados por administraciones de antimicrobianos en el periodo inmediatamente anterior a las tomas de muestras. Ello viene determinado en primer lugar porque normalmente los pacientes llegan a los hospitales con unidades especializadas cuando el tratamiento instaurado por el médico de cabecera ha fracasado o no ha obtenido los resultados esperados.

Así, teniendo en cuenta los datos de los que hemos dispuesto, podemos afirmar que 79 pacientes refirieron que habían tomado antibióticos en el periodo más o menos inmediatamente anterior al de la primera consulta; la distribución por antibióticos se muestra en la tabla 5.1

Es importante señalar que en todos los casos la prescripción antibiótica había sido en base empírica, ya que en ningún caso figuraba aislamiento, identificación y determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de los presuntos agentes etiológicos en la historia clínica. A pesar de ello no se muestran diferencias significativas en las frecuencias

Levofloxacina 2 2,5%Rifampicina 1 1,3%

Amoxicilina+ÁcidoClavulanico 34 43,0%Ciprofloxacina 23 29,1%

Piperacilina+Tazobactam 12 15,2%Clindamicina 2 2,5%Metronidazol 4 5,1%Cloxacilina 1 1,3%

Total 79 100,0%

Tabla 5.1 Pacientes con toma de antibióticos en el periodo anterior a la entrada en el estudio.

121

de aislamientos bacterianos, ni en la distribución de especies, ni en las proporciones entre ellas. Todo ello conduce a pensar que estos tratamientos antibióticos desde la estricta visión del tratamiento de las úlceras del pie diabético tienen escaso valor terapéutico y que por el contrario pueden estar ejerciendo presión selectiva sobre las microbiotas normales de otras regiones del cuerpo y también la de la úlcera en el sentido de promover la emergencia de las resistencias a los antibióticos.

Ello plantea serias dudas acerca de su conveniencia, y recomendaría centrar una línea de investigación en biología y dinámica de poblaciones basada en datos moleculares de los genes de resistencia que ayudara a despejar este horizonte. Las causas por las que la acción antibiótica se ve debilitada pueden ir desde la interpretación de que se trata de consecuencias directas de las alteraciones vasculares, como al hecho de que las bacterias se acantonen en zonas necróticas de difícil acceso para los antimicrobianos, con lo que los parámetros infecciosos se restauran cuando la presión antibiótica decrece. En cualquier caso habría que tener datos de los enfermos que resolvieron la situación a partir del tratamiento empírico instaurado por el médico de cabecera, datos de los que carecemos por completo en este momento.

En este mismo apartado de limitaciones debemos señalar también que la exploración del posible rol que pudiera jugar el uso del péptido LL-37 en el tratamiento de ulceras infectadas no ha dado los resultados previstos. Se estudió este péptido por ser una de las dos moléculas propuestas en el proyecto de investigación FIBRODRESS /INNPACTO 2012.

Uno de los encargos recibidos por nuestro grupo, fue el de estudiar el efecto de LL-37 y la eventual sinergia de este con los polifenoles presentes en los residuos del aceite de oliva (este era uno de los objetivos principales del proyecto).

122

Los resultados, poco prometedores, nos pusieron sin embargo, en la línea de estudiar otros péptidos sintéticos, principalmente “derivados” de la colistina y diferentes polimixinas, lo que en algunos casos parece ofrecer una perspectiva relativamente prometedora. Asimismo los ensayos con LL-37 y oleuropeína hicieron obvio que debíamos probar combinaciones sinérgicas de otros antimicrobianos cuyos resultados comentaremos más adelante.

Conclusiones

125

5. Conclusiones

▶ 1. Aislamiento e identificación de las bacterias presentes en las úlceras de pie diabético infectadas.Las especies bacterianas más frecuentemente aisladas de las úlceras de pie diabético han sido por este orden Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, seguidas a gran distancia por Enterobacterias. La toma de especímenes con punch parece la más adecuada para el estudio microbiológico de las úlceras de pie diabético al no afectar a la representatividad y en cambio reducir el número de aislamientos de microorganismos contaminantes la mayoría posiblemente derivados de la microbiota dérmica

▶ 2. Determinación de la susceptibilidad de los aislamientos a los antimicrobianos de uso común en el tratamiento de este tipo de infecciones.Los microorganismos aislados son en general muy susceptibles a clindamicina, tobramicina, amikacina, ácido fusídico, mupirocina, gentamicina y tigeciclina. Se ha hallado una resistencia total tanto a penicilina como a amoxicilina, aunque esta última revierte al añadir ácido clavulánico en prácticamente la mitad de las cepas que se comportan como intermedias. La frecuencia de aislamientos resistentes a ciprofloxacina demuestra que la costumbre de prescribir de forma empírica este antibiótico para tratar ulceras plantares infectadas es un grave error y debe detenerse por lo menos en nuestro medio.

▶ 3. Evaluación de la posible utilización de polifenoles como agentes para el tratamiento de las úlceras así como de sus efectos sobre las poblaciones bacterianas presentes en las lesiones. La oleuropeina tiene un escaso poder antimicrobiano pero es un excelente inhibidor de la formación de biofilm.El diseño de un apósito para el tratamiento de úlceras plantares y eventualmente otras formas farmacéuticas que contengan oleuropeína aparece como una aplicación deseable y prometedora.

▶ 4. Evaluación del uso de péptidos sintéticos de origen humano (LL-37 y otros) como antimicrobianos.La utilización de LL37 en combinación con la oleuropeina no aumenta el poder antimicrobiano.

▶ 5. Obtener información sobre las características de los pacientes diabéticos que presentan ulceras infectadas. Sobre la enfermedad, características demográficas y de su entorno familiar.

5.1 - A diferencia de lo que ocurre en otras complicaciones de la diabetes, el “pie diabético” es más frecuente en los hombres (73,9 %) que en las mujeres (26,1%). Si bien ignoramos las razones, la proporción de individuos diabéticos no es manifiestamente distinta en ambos sexos, por lo que podría concluirse que los cuidados y modos de vida “femeninos” contribuyen a la prevención de esta complicación.

5.2.- El tiempo transcurrido desde el debut de la enfermedad y el correspondiente diagnostico hasta la aparición de las úlceras de pie diabético se sitúa en este estudio alrededor de los trece años.

5.3.- En la población estudiada el 40 % de los diabéticos de tipo I son mujeres, mientras que entre los diabéticos de tipo 2 las mujeres representan solo el 23 %.

5.4.- La aparición de úlcera es más precoz en la DM2 que en la DM1 lo cual puede deberse a que los DM1 son diagnosticados más precozmente, o a que la edad juega un papel relevante a parte de la propia diabetes.

5.5 Los cuidados de enfermería y por parte del entorno fa miliar mejoran sensiblemente el pronóstico de las úlceras plantares.

5.5.- Hay una buena relación estadística entre estar casado (o vivir en pareja) y el grado de úlcera (sig=0,053). Proporcionalmente la población de personas que viven en pareja tiende a mostrar úlceras de grado menor que las que viven solas.

5.6.- Las vasculopatías aparecen en una proporción de pacientes mucho menor que las neuropatías o las mixtas.

Abreviaciones

129

6. Abreviaciones

(DM) .-Diabetes mellitus.(DM1) .-Diabetes mellitus. Tipo 1 (DM2) .-Diabetes mellitus. Tipo 2 (OMS) .-La Organización Mundial de la Salud.(IDF) .-Federación Internacional de Diabetes.(ADA) .-Asociación Americana de diabetes.(MSSSI) .-El ministerio de sanidad de España.(ESCA) .-Encuesta de salud de Cataluña.(ECV) .-Enfermedad Cardiovascular.(IWGDF) .-Working Group of the Diabetic Foot(MRSA) .-Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(HA-MRSA) .-Healthcare-associated MRSA(PEDIS) .-Perfusion, extension, depth, infection and sensitivity(PBP) .-Penicillin binding proteins .(DHP) .-Deshidropeptidasa.(DNA) .-Ácido desoxirribonucleico(ATCC) .-American type culture collection(PBS) .-Buffer fosfato salino(TSA) .-Agar Tripticasa soya.(TSB) .-Tryptic Soy Broth(MBEC) .-Minimal biofilm eradication concentration(BPC) .-Biofilm Prevention Concentration(CV) .-Cristal Violeta(MIC) .-Concentración mínima inhibitoria

Anexos

133

7. Anexos

Anexo 1: Clasificación PEDIS

El sistema de clasificación PEDIS, nace como un sistema de clasificación de lesiones en el pie diabético capaz de cubrir las necesidades específicas de los grupos investigadores en este campo.

Este sistema fue concebido por IWDGT en 2003, siendo actualizado en el 2011, con un único fin. El de ayudar a interpretar correctamente los datos obtenidos en los proyectos de investigación. Este sistema evalúa cinco categorías diferentes que según la literatura científica y la opinión de los expertos son los parámetros más importantes para los proyectos de investigación en úlceras diabéticas. Estas categorías son: Irrigación, extensión, profundidad, infección y sensibilidad. Cada una de estas categorías es graduada de forma independiente. Cada una de sus letras hace referencia a cada una de las características de las lesiones antes mencionadas en Ingles Perfusion, Extens (size), Depth (tissue loss), Infection, Sensation (neuropathy).En esta muestra se ha utilizado la escala de clasificación según la severidad de la infección.

Grado 1: No infectada▶ Úlcera sin secreción Purulenta sin ningún tipo de inflamación.

Grado 2: Infección leve▶ Infección que afecta a la piel y tejido subcutáneo (sin afectar tejidos más profundos i sin signos sistémicos). Pero que aparecen dos de los siguientes parámetros.- Edema local o induración.- Eritema local >0,5 a 2 cm alrededor de la úlcera.- Dolor local o zonas maceradas.- Calor local.- Secreción purulenta espesa, opaca o sanguinolenta.

134

Grado 3: Moderada▶ Eritema de más de 2 cm con más de un ítem de los descritos a continuación (Edema, calor, rubor, secreción purulenta) o infección que afecta estructuras profundas, musculo, tendón, articulación o hueso.

Grado 4: Grave▶ Cualquier infección en el pie con 2 o más signos de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS).- Temperatura >38º o <36º Celsius.- Frecuencia cardiaca >90 latidos/minuto.- Frecuencia respiratoria >20 respiraciones /minuto.- Recuento células blancas >12.000 o <4000/cu mm10% formas inmaduras.

135

Anexo 2: Informe de la Comisión de Bioética de la Universidad de Barcelona

3.5.1. Informe de la Comisión de Bioética de la Universidad de Barcelona Este proyecto ha sido evaluado favorablemente por la Comisión de Bioética de la Universitat de Barcelona (documento anexado a esta memoria doctoral página 136) →

136136

137

Anexo 3: Consentimiento informado.

Consentimiento informado de exploración/tratamiento e intervención.

Sr/Sra________________________________________________, mayor de edad, con

D.N.I núm._____________ manifiesto voluntariamente mi conformidad para que se prac-

tique el proceso asistencial a _____________________, después de haber sido informado

debidamente por ________________________ del equipo de U.P.R. de la Clínica Podoló-

gica Universitaria, Así como a la toma de muestras de la úlcera plantar, para proceder al

cultivo de los agentes infecciosos presentes en la muestra y determinar su susceptibilidad

a los antibióticos, y comprobar sobre los agentes infecciosos resultantes la efectividad de la

Oleuropeína y el Péptido LL-37

Una vez informado de esta circunstancia que me han explicado de manera comprensible y después de valorada la conveniencia, y conociendo que estos resultados formaran parte de una ficha de datos para su evaluación epidemiológica, y para la investigación científica

Autorizo de forma consciente que el nombrado equipo lleve a cabo el acto clínico propuesto.

L¨Hospitalet de Llobregat, de 200

Firma del paciente Firma Podólogo. N Col.

*El orden de relación para la autorización es la siguiente: paciente, padres hijos, hermanos, parientes más próximos y tutores.

138

Anexo 4: Hoja toma de datos Laboratorio

Fecha _________________________

Datos pacientesNombre y apellidos: _________________________________________________Año de nacimiento: _______________________ Edad: ______________Sexo: Hombre Mujer Población: __________________Estado civil: Casado/Pareja Separado/Divorciado Soltero ViudoActividad laboral: ___________________________________________________

Tipo de diabetes: Tipo 1 Tipo 2 Año Diagnostico: _____Tratamiento: ADO InsulinaComplicaciones asociadas: Neuropatía Vasculopatía Nefropatía Cardiopatía Retinopatía Otras ________________Tabaquismo: No Sí Que edad tenía cuando empezó a fumar_______

ÚlceraLocalización úlcera: Antepié: ____________________________________ Talón: ______________________________________ Dedos: ______________________________________

Toma Antibióticos: Tipo _______________Dosis ____________ Fecha de inicio _______Clasificación úlcera.- (Pedís)

Grado 1

Úlcera superficial. Destrucción espesor total de la piel. No Infectada

Grado 2

Úlcera profunda. Penetra piel, grasa y ligamentos. Infección Leve

Grado 3

Úlcera profunda+ abcesso (OM) Sepsis articular. Infección Moderada

Grado 4

Gangrena limitada. Necrosis de una parte del pie. Infección Grave

139

Anexo 5: Protocolo Toma de muestras

Protocolo toma de muestras

A) Frotis de la lesión mediante Hisopo

Material necesario: Suero Fisiológico Gasas estériles Escobillón + medio de transporte (Hisopo)

Descripción de la técnica para el cultivo de exudado.▶ Limpiar de forma meticulosa la lesión suero fisiológico.▶ Desprecintar el Hisopo. ▶ Sujetar el Hisopo por la zona del precinto sin tocar en ningún momento el soporte que se introducirá en el tubo de transporte (con el fin de no contaminar la muestra).▶ Introducir el extremo estéril del Hisopo en la lesión y girar el Hisopo con movimientos circulares de izquierda a derecha y de derecha a izquierda buscando siempre la zona más profunda de la lesión y evitando tocar los bordes de la misma.▶ Colocar inmediatamente, el Hisopo dentro del tubo.▶ Es importante realizar la toma de muestras mediante dos Hisopos de la misma herida y con la misma metodología ya que el Laboratorio utilizara una para inocular los medios de cultivó y la otra para realizar la extensión para tinción de Gram.

B) Biopsia tisular mediante Punch

Material necesario: Suero Fisiológico Gasas estériles Punch 3,00mm Recipiente estéril (Epèndorf)

140

Descripción de la técnica para la realización de la biopsia

▶ Limpiar de forma meticulosa la piel circundante a la lesión con suero Fisiológico.▶ Limpiar las paredes y el fondo de la úlcera de forma meticulosa mediante gasa estéril impregnada de S. Fisiológico. Una vez limpia la úlcera finalizaremos la limpieza mediante la introducción en la misma de S. Fisiológico a presión utilizando la técnica de barrido. ▶ Introducir el Punch en la zona más profunda de la úlcera y realizar movimientos rotatorios en sentido horario y antihorario, para recoger una muestra del tejido que se encuentre en el suelo de la úlcera.▶ Una vez recogida la muestra, introducir los fragmentos en un recipiente tipos Ependorf o recipiente de cristal estéril y llevarla al Laboratorio. (En el caso de que la duración desde la extracción de la muestra y la llegada de la misma al laboratorio sea indeterminada se cubrirá la muestra con S. Fisiológico)

Las muestras se identificaran juntamente con la hoja de los datos del paciente se llevaran a Laboratorio.

Observaciones Las muestras no pueden permanecer en temperatura ambiente más de 6h, hay que mantenerlas en la nevera un tiempo máximo de 24h antes de proceder a su cultivo.

Bibliografía

143

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Úlceras neuropáticas e isquémicas infectadas

en pie diabético.



en pie diabético.


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