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El presente trabajo se realizó bajo la dirección de la Dra. Irma Romero Álvarez y el Biólogo Israel Castillo Juárez en el laboratorio 2 del Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la UNAM.

III

Agradecimientos especiales

Quiero expresar mí más sincero agradecimiento a todas las personas e instituciones

que de alguna manera colaboraron a la creación de este trabajo que me permito cumplir otra

etapa en mi formación académica.

A mis directores de tesis, la Dra. Irma Romero Álvarez y el Biólogo Israel Castillo

Juárez que ordenó mis ideas cuando estaban en un mar de confusión, que fue mi guía en la

construcción de esta tesis que ya llegó a su fin.

Al Dr. Heliodoro Celis Sandoval del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM,

por el apoyo y facilidades otorgadas.

Reconocimiento especial a la M. en C. María Edelmira Linares Mazari y al Dr.

Robert Bye Boettler por su asesoría botánica.

A la M. en C. Silvia Escobedo Martínez y a la Q. Laurel Élide Fabila Ibarra por su

colaboración técnica.

A la Universidad Autónoma Metropolitana por el apoyo que me dio para la

realización de mis estudios de licenciatura y a la Universidad Nacional Autónoma de

México por el apoyo en la realización de este proyecto de investigación.

IV

Agradecimientos

A mis padres, Teresa Aguilar García y Ervi Jaime Pacheco por el apoyo que me

brindaron, por la formación, por fomentar en mí el deseo de saber, de conocer lo novedoso

y abrirme las puertas al mundo ante mí curiosidad insaciable.

A mis hermanos, Claudia Alejandrina, Carlos Erwin y Luis Horacio Jaime Aguilar

que siempre están, estuvieron y seguirán estando, brindándome cariño y soporte.

A mis profesores, de esta organización autoorganizada de la que emerge

conocimiento y afecto en forma equivalente, a quienes conozco desde mi formación y en

especial a M. en C. Marco Antonio Gerardo Ramírez Romero, M. en B. Rosa María Galicia

Cabrera, M. en C. Octavio Francisco González Castillo, M. en C. Arturo Leopoldo

Preciado López, Dra. Elisa Vega Avila, M. en C. Rafaela Tapia Aguilar y Dr. Velasco

Lezama Rodolfo.

A mis compañeros de facultad con quienes construimos conocimiento, compartimos

mañanas, tardes y noches de estudio, momentos de nerviosismo en parciales y finales; en

especial a González Robledo Violeta Azeneth.

Y sobre todo, a Kirenia Velázquez Monroy, por la chispa que enciende el fuego y la

leña que ayuda a mantenerlo, por la llave que abre puertas, por la mano que acompaña y

tranquiliza, mi gran amor, por haber podido contar siempre con ella y ser en gran parte

responsable de esta tesis.

Finalmente gracias a todas las personas que indirectamente ayudaron a lograr esta

investigación.

V

INDICE Resumen …………………………………………………………………………………….1

1. Introducción ………………………………………………………………………2

1.1. Helicobacter pylori ……………………………………...………………..2

1.2. Taxonomia ………………………………………………..……………...3

1.3. Morfología ………………………………………………………..……...3

1.4. Modos de transmisión ……………………………………………...……..4

1.5. Epidemología ………………………………………………………..…...5

1.6. Mecanismos patógeno de H. pylori …………………………………….….6

1.7. Relaciones ecológicas aun no comprendidas entre H. pylori y el hombre ……8

1.8. Gastritis aguda …………………………………………………………..10

1.9. Gastritis crónica y crónica activa ………………………………………...10

1.10. Úlcera péptica ………………………………………………………….11

1.11. Helicobacter pylori y el cáncer gástrico …………………………………12

1.12. Estudios en México sobre de la infección de H. pylori …………………...13

1.13.Tratamiento …………………………………………………………….15

1.14.Métodos para el diagnóstico de la infección por Helicobacter pylori ……..17

1.14.1.Métodos no invasivos ………………………………………….18

1.14.2.Métodos invasivos …………………………………………….19

1.15.Generalidades de los usos de plantas medicinales ………………………...19

1.16.Plantas que se utilizan en la medicina tradicional mexicana ………………21

1.17. Técnicas para la aplicación de las distintas plantas medicinales …………..22

2. Planteamiento del problema …………………………………………………….25

3. Objetivos ………………………………………………………………………..27

3.1 Objetivo general …………………………………………………………27

3.2 Objetivos particulares …………………………………………………….27

4. Materiales y Métodos …………………………………………………………...28

4.1 Selección de plantas medicinales …………………………………………28

4.2. Cultivo de la bacteria Helicobacter pylori ……………………………...…28

4.3. Obtención de extractos …………………………………………………..29

VI

4.3.1. Extracto acuoso ……………………………………………….29

4.3.2. Extracto metabólico …………………………………………...29

4.4. Cálculo de la actividad mínima inhibitoria (MIC) de extractos acuosos de

plantas contra H. pylori por el método de dilución en agar …………………………….29

4.4.1. Preparación de cajas agar Mueller-Hinton-sangre-extractos ……30

4.4.2 Prueba de extractos acuosos de plantas contra H. pylori por el

método de dilución en agar …………………………………………………..30

4.5. Cálculo de la actividad mínima inhibitoria (MIC) de los extractos metanólicos

de plantas contra H. pylori por el método de cultivo liquido …………………………...30

4.5.1. Precultivo de la bacteria ……………………………………….31

4.5.2. Ensayo de extractos metanólicos de plantas contra H. pylori por el

método de cultivo liquido …………………………………………………….31

4.5.3 Determinación del porcentaje de inhibición y la CMI …………….34

4.6. Pruebas para la identificación de H. pylori ………………………………..34

5. Resultados y Discusión …………………………………………………………35

5.1. Recopilación bibliográfica y obtención del material vegetal ……………….35

5.2. Actividad anti- H. pylori de las plantas Seleccionadas …………………….38

5.2.1. Obtención de los extractos ……………………………………..38

5.3. Determinación de la actividad mínima inhibitoria (CMI) de los extractos

acuosos ……………………………………………………………………………..42

5.4. Determinación de la actividad mínima inhibitoria (MIC) de los extractos

metanólicos …………………………………………………………………………43

6. Conclusiones ……………………………………………………………………59

7. Bibliografía ……………………………………………………………………...61

1

RESUMEN

La bacteria Helicobacter pylori es considerada como el principal agente etiológico de la gastritis crónica activa y de la úlcera péptica. Este descubrimiento les hizo acreedores al premio Nobel de Medicina y Fisiología 2005 a los investigadores Barry Marshall y Robin Warren, quienes aislaron a la bacteria y la asociaron con dichas enfermedades en los años ochenta.

En los últimos años se han tratado estas patologías no solo con agentes antiácidos y gastroprotectores, sino que además se han incorporado antibióticos para erradicar a la bacteria. Sin embargo, en algunos casos, estas terapias no son exitosas debido a que H. pylori desarrolla resistencia a los antibióticos existentes, situación que ha llevado a la búsqueda de nuevos compuestos que garanticen su control, además de que reduzcan los efectos secundarios. Por otra parte, la idea de erradicar indiscriminadamente a la bacteria ha sido tema de controversia en los últimos años, principalmente porque se ha relacionado la eliminación no selectiva de H. pylori con el aumento de enfermedades gástricas superiores como es el reflujo gastroesofágico, el síndrome de Barret y el cáncer de esófago.

A nivel mundial se ha estudiado el efecto anti-H. pylori de alrededor de 327 plantas, tanto de uso medicinal como comestible y de las cuales al 60.8% se les ha encontrado un efecto directo sobre bacteria. No obstante, en México no se han realizado estudios al respecto, a pesar de la basta cultura herbolaria y al gran número de plantas con propiedades medicinales. En este trabajo se investigó el efecto anti-H. pylori de 20 plantas utilizadas en la medicina tradicional mexicana para el tratamiento de enfermedades relacionadas a trastornos digestivos (dolor de estómago, úlcera y gastritis).

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En 1994 la Conferencia Consenso de los Institutos Nacionales de Salud, declaró a H. pylori como la principal causa de la úlcera péptica (IARC, 1994) y en ese mismo año, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer, de la Organización Mundial de la Salud (OMS) la clasificó como un definitivo carcinógeno clase I (International Agency for Research on Cáncer, 1994).

1.2. Taxonomia

Desde su cultivo en 1982 ha recibido diferentes denominaciones hasta adquirir el nombre definitivo:

- CLO (Campylobacter like organism). - GCLO (Gastric Campylobacter like organism). - Campylobacter pyloridis. - Campylobacter pyloric. - Campylobacter pylori. - Helicobacter pylori: (1989) especie tipo de un nuevo género, Helicobacter.

Actualmente el género Helicobacter cuenta con 18 especies validadas y otras dos candidatas, las cuales fueron designadas por el Comité Internacional de Sistemática Bacteriológica (Murray y Stackebrandt, 1995).

1.3. Morfología

H. pylori es una bacteria Gram negativa de forma espiral, de alrededor de 3 micrómetros de largo con un diámetro aproximado de unos 0.5 micrómetros, posee múltiples flagelos (4–6 flagelos) en uno de sus extremos lo que hace altamente móvil (Fig. 2) (Blaser, 1991).

Fig. 2. Helicobacter pylori. Tomado de: http://blog.medicalpicture.de/B566148520/C1862531395/E20051003230536/index.html

4

Es un microorganismo de crecimiento lento y necesita de 3 a 5 días para poder apreciar las colonias en medios sólidos. Para su crecimiento en el laboratorio, se requiere de condiciones de microaerófilia y medios artificiales ricos en nutrimentos como peptona, triptona, extracto de levadura, glucosa y sales como cloruro de sodio y bisulfito de sodio (Harris y Guiraldes, 1996), suplementados con sangre de caballo, ciclodextrina o suero fetal bovino (SFB).

Su característica bioquímica mas sobresaliente es la abundante producción de la enzima ureasa, que cataliza la hidrólisis de la urea en amonio y bióxido de carbono; la producción de amonio es un mecanismo importante para la sobrevivencia de la bacteria en un ambiente con pH tan ácido debido al jugo gástrico (Dunn et al, 1990). Utiliza hidrógeno y metanogénesis como fuente de energía. Además es oxidasa y catalasa positiva (Goodwin et al, 1989)

1.4. Modos de transmisión.

Se ha postulado que la infección con H. pylori se adquiere desde temprana edad y el patrón de infección se asocia con mecanismos de transmisión directos o indirectos, relacionados con la higiene ambiental. Se han propuesto tres vías para la transmisión de esta bacteria: oral-oral, gástrica-oral y fecal-oral.

Transmisión oral-oral. Está apoyada en el hallazgo de H. pylori en la placa dental y en la saliva (Cellini et al., 1995; Krajden et al., 1989). También se ha identificado en la cavidad oral secuencias específicas del ADN de H. pylori. Por otra parte, se han encontrado reacciones positivas a la prueba de ureasa en muestras de saliva; sin embargo, otras bacterias de la flora oral pueden dar positivo para este ensayo, por lo que tal prueba no ha sido muy aceptada (Desai et al., 1991).

Transmisión gástrica-oral. La presencia de la bacteria en el jugo gástrico de los pacientes infectados ha llevado a la idea de que el reflujo gástrico sea un vehículo de transmisión. Esta posibilidad se apoya en la ocurrencia de algunos brotes asociados con el manejo y desinfección inadecuada de gastroscopios. Este modo de transmisión sería particularmente importante en los niños, a través de su vómito o regurgitaciones de material gástrico contaminado, lo que en cierta medida podría explicar las altas tasas de infección en niños. (Axon, 1995; Valori et al., 1991).

5

Transmisión fecal-oral. Aunque existen evidencias de que H. pylori pueda pasar a través de intestino, realmente no esta adaptada para eso y es poco probable que sobreviva. Ha habido informes esporádicos sobre el aislamiento de la bacteria a partir de heces, e incluso se ha descrito el método para tal aislamiento, pero estos hallazgos no son sistemáticos, lo que representa poco certera la verificación de esta hipótesis (Notarnicola et al., 1996).

Por otra parte, los métodos de detección de ADN por PCR han permitido su identificación en heces; no obstante, estas técnicas han enfrentado limitaciones debido a metabolitos como polisacáridos ácidos que han llevado a resultados erráticos, además, la presencia de la bacteria en las heces no implica su viabilidad (Mapstone et al., 1993). También la presencia de la bacteria en las heces de los pacientes infectados lleva a la posibilidad de que las moscas puedan actuar como vectores mecánicos de la infección. En tal sentido se ha documentado la sobrevivencia de la bacteria en moscas domésticas infestadas experimentalmente, alimentándolas con cultivos de H. pylori (Axon, 1995).

Sin embargo, otros autores ponen en duda tal posibilidad, pues no se ha logrado infectar a las moscas a partir de heces contaminadas con H. pylori. Por otra parte, el hallazgo de H. pylori en gatos domésticos plantea otra posible vía de diseminación, que podría afectar principalmente a niños que juegan con las mascotas (Handt et al., 1994; Johannes et al., 2006).

1.5. Epidemiología.

Los datos recopilados hasta la fecha indican que H. pylori tiene una amplia distribución a nivel mundial (Fig. 3) (Feldman et al., 1998). En los países desarrollados, la prevalecía oscila entre el 20 y 40%, mientras que en países vías de desarrollo, la prevalencia es del 70 y 90%. Estas diferencias se relacionan con los niveles de saneamiento ambiental, hacinamiento y nivel socio-económico, que son los principales determinantes del riesgo de contraer la infección (Rollán, 1997; Marshall, 1994).

Se considera que la infección por H. pylori es adquirida durante la infancia y los niveles de prevalencia de la infección van aumentando conforme a la edad, alrededor del 10% de los individuos menores de 30 años están infectados y esta cifra asciende a 60% entre los mayores de 60 años (Go y Crowe, 2000).

6

Fig. 3. Prevalencia de la infección por H. pylori a nivel mundial. Modificado de Rollán 1997.

Los estudios epidemiológicos han demostrado además, una fuerte correlación entre incidencia de cáncer gástrico y la prevalencia de la infección por la bacteria, e indican que las personas infectadas tienen entre 3 y 6 veces mayor probabilidad de desarrollar cáncer gástrico que quienes no lo están (Feldman et al., 1998; McManus, 2000).

1.6. Mecanismo patógeno de H. pylori.

H. pylori ingresa por la boca y se ubica dentro de la capa de moco que recubre la mucosa gástrica, preferentemente en la región del fundus y el antro pilórico, a donde se une por medio de adhesinas (Go y Crowe 2000). La bacteria no posee capacidad invasora pues no se observa en el interior de las células, sin embargo, es capaz de provocar daño epitelial debido a su batería enzimática. Tal es el caso de la ureasa que es imprescindible en el proceso de colonización de la mucosa gástrica ya que hidroliza la urea en amonio y CO2, lo que proporciona un pH casi neutro a su alrededor (Fig. 4) (Tsuda, 1994).

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Por otra parte, las fosfolipasas hidrolizan las membranas celulares que liberan lisolecitina, la cual constituye un factor ulcerogénico (Ibraghimov y Pappo, 2000). Por su parte, los tetrapéptidos bacterianos ejercen un importante efecto quimiotáctico sobre eosinófilos y neutrófilos, lo cual facilita su reclutamiento y proliferación (Hansen et al., 1999). Estas células al activarse provocan la liberación de citocinas, que promueven una respuesta inflamatoria, la cual lesiona aún más la mucosa mediante la liberación de mediadores inflamatorios como los metabolitos del ácido araquidónico, los radicales libres del oxígeno y los factores activadores de plaquetas, que junto con el microorganismo inducen la expresión de otros receptores para la liberación de interleucina I, algunos factores de crecimiento celular y los radicales libres oxidantes (Cover y Blaser, 1996).

También se ha encontrado una isla de la patogenicidad cagPAI que es uno de los factores de virulencia más relevante para la patogénesis de la bacteria. Se han identificado dos factores de virulencia la citotoxina vacuolizante VacA, que es codificada por el gen vacA y la proteína CagA, codificada por el gen cagA. Todas las cepas de H. pylori tienen el gen vacA, no obstante sólo el 60% de las cepas aisladas producen la citotoxina activa. La citotoxina induce la formación de grandes vacuolas citoplasmáticas en células epiteliales in vitro y es capaz de inducir apoptosis. Estudios realizados in vitro han demostrado que VacA se une a la célula por interacción con receptores específicos (Rudi et al., 1998). El gen vacA es polimórfico, principalmente en la región del péptido señal, donde puede tener los subtipos s1a, s1b, s1c y s2 y en la región media, los genotipos m1 o m2. La actividad vacuolizante es mayor en los alelos s1m1 que en los s1m2 y no se encuentra en los genotipos s2m2 (Cover y Blanke, 2005). Por otro lado la proteína CagA se a considerado altamente inmunogénica aun cuando su función se desconoce, la proteína se encuentra en aproximadamente el 60% de los aislamientos de H. pylori. Sin embargo, la detección de anticuerpos contra CagA de H. pylori está bien documentada (Hacker et al., 1997; Covacci et al., 1993). Las cepas de H. pylori cagA+ inducen la secreción interleucina-8 (IL-8) un mediador inflamatorio, que contribuye al reclutamiento local de neutrófilos y a la activación de macrófagos (Harris, 1999). En pacientes con úlcera duodenal en un 87.5%, con úlcera gástrica en un 76% y con dispepsia no ulcerosa en un 56.4% (Dundon et al.,

Fig. 4 Algunos mecanismos de virulencia de H. pylori. Gracias a los flagelos puede movilizarse a través de la capa de moco y la ureasa mantiene un pH neutro, e incluso alcalino, en torno a la bacteria. Tomado de: http://www.iladiba.com/upr/1997/No41997/htm/Helic.asp

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2001). A los pacientes infectados con cepas que portan el gen cagA y expresan la proteína CagA se les ha asociado con el desarrollo de gastritis activa crónica, gastritis atrófica, úlcera péptica y un aumento en el riesgo a desarrollar adenocarcinoma o linfoma gástrico (Higashi et al., 2002; Maeda et al., 1998).

Las cepas de H. pylori se pueden dividir en dos tipos. Las tipo I que son cagA+/vacA+ y las de tipo II que son cagA-/vacA-. Las cepas de tipo I son más virulentas que las de tipo II que no tienen la isla de patogenicidad y tienen el genotipo vacA s2 y no son citotoxicas. Las cepas tipo II, se encuentran asociadas con patologías gástricas (Xiang et al., 1995). Las cepas cagPAI se encuentran con mayor frecuencia en pacientes con úlcera péptica y cáncer gástrico (Censini et al., 1996).

1.7. Relaciones ecológicas aun no comprendidas entre H. pylori y el hombre

Podemos decir que desde que surgió el primer reporte sobre la posible asociación de H. pylori con padecimientos de la parte superior del tubo digestivo, se ha establecido una intensa controversia alrededor de este microorganismo. Primero para aceptar su papel como agente etiológico de enfermedades como la úlcera duodenal y gástrica. Después ha sido el centro de discusión sobre su papel como principal factor de riesgo en el desarrollo del carcinoma gástrico y al mismo tiempo cuando alcanza un consenso casi mundial sobre su papel como patógeno, se publican una serie de estudios que sugieren que la erradicación de H. pylori en personas no sintomáticas representa un riesgo para el desarrollo de otros padecimientos como reflujo esofágico y cáncer de esófago (Pérez-Pérez, 2000).

Tradicionalmente la relación de un huésped con un microorganismo puede dividirse en tres categorías: parasitismo, comensalismo y simbiosis (Mackowiak, 1982). El parasitismo es una relación en la cual una especie se beneficia a expensas de la otra. El comensalismo se define como una relación en la cual una especie recibe beneficio y la otra no se afecta. Mientras que la simbiosis es la asociación biológica en la que las dos especies involucradas obtienen beneficio mutuo, esta asociación ha sido poco estudiada en humanos (Savage, 1997). H. pylori puede considerarse capaz de establecer una asociación con el ser humano en por lo menos dos de las tres categorías que son parasitismo y comensalismo (Blaser, 1999). Pero no está claro todavía cual de estas asociaciones define mejor la relación de H. pylori con el hombre (Blaser, 1996).

El papel de H. pylori como comensal se da cuanto es considerada como el primero de una nueva clase de patógeno, al cual Blaser ha denominado patógeno lento (Blaser, 1996). Esto se debe a que posee las siguientes características: 1) la infección persiste por décadas (probablemente de por vida) en la mayoría de las personas colonizadas en la ausencia de tratamiento, 2) a diferencia de otras infecciones persistentes en las que hay un estado de latencia, en H. pylori invariablemente hay una infección activa y 3) la exquisita adaptación al huésped, ya que solo los humanos y los primates son las únicas especies que se infectan naturalmente por esta bacteria (Taylor y Blaser, 1991).

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Además la adaptación de H. pylori al estómago humano le ha permitido desarrollar mecanismos para neutralizar o para incrementar la acidez gastrica (ureasa y la producción de N-methyl-histamina) (McGowan et al., 1994; Courillin-Mallet et al., 1995). Esto sugiere que H. pylori tiene la capacidad de regular el pH del ambiente que le rodea de acuerdo a sus propias necesidades (Blaser, 1997). Sobre la base de estas observaciones, la colonización de la cavidad gástrica con H. pylori en humanos puede ser una asociación benéfica tanto desde el punto de vista fisiológico en la regulación de la acidez gástrica, como desde el punto de vista preventivo gracias a que la acidez producida por la presencia de H. pylori disminuiría la posibilidad de infección de etnteropatógenos como Vibrio cholerae y Salmonella typhi (Medina et al., 2005).

Aunuqe algunos autores difieren de esto y consideran a H. pylori como patógeno, esto se debe que a pesar del número de personasque se encuentran colonizadas por está, la proporción de individuosque desarrollan alguna sintomatología es sólo del 10% y se puede dar de diferente manera, una de estas sería por la respuesta inmune natural y adquirida ya que mantiene la infección bajo control con un limitado número de microorganismos en la cavidad gástrica. (Pérez-Pérez, 2000). Otra explicación sería que los microorganismos presentes tienen una actividad metabólica mínima. Estas explicaciones, sin embargo, son contrarias al modelo de persistencia propuesto por Blaser y Kischner (Kirschner y Blaser, 1995), los cuales proponen un mecanismo de autorregulación por parte de H. pylori y no un control por parte del huésped. Además, numerosos estudios han demostrado que la respuesta inmune que se establece como resultado de la presencia de H. pylori es vigorosa. En pacientes colonizados con H. pylori es fácil demostrar la presencia de anticuerpos específicos para H. pylori tanto en suero como en jugo gástrico (Pérez-Pérez et al., 1998).

Una respuesta inmune celular también ha sido claramente demostrada con la participación de linfocitos T y producción de diferentes citocinas (Peek et al., 1995; Sharma et al., 1994). Otra forma de explicar la prevalencia sintomatología en las personas colonizadas por H. pylori sería por las características propias de esta bacteria. Es claro que las cepas de H. pylori son diferentes en el ámbito genético, lo cual se confirma por la presencia de elementos genéticos móviles, rearreglos cromosomales a gran escala y otras diferencias a nivel del genotipo (Atherton et al., 1995). Las diferencias a nivel del fenotipo entre cepas de H. pylori se han comenzado a reportar sólo recientemente. Una de las diferencias más importantes es la presencia o ausencia de la isla de patogenicidad denominada cagPAI(Censini et al., 1996).

Todos estos estudios nos conducen a que posiblemente los términos parásito, comensal o simbionte no sean aplicables a microorganismos como H. pylori los cuales han coevolucionado con un solo huésped, ya que este tiene mecanismos que le permiten regular el tipo e intensidad del daño a la mucosa gástrica. Antes de decidir si se debe o no promover una campaña indiscriminada contra H. pylori, debemos aceptar que falta mucho por investigar acerca de la historia natural de la colonización, de sus probables beneficios y de los riesgos que pueden surgir al eliminar una bacteria que por millones de años ha aprendido a vivir con nosotros (Torres, 2000).

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1.8. Gastritis aguda

La gastritis se puede clasificar de acuerdo a varios criterios y por la combinación de los mismos según el Sistema Sydney (Price, 1991), pero para el caso de la patología desarrollada por H. pylori, solo consideraremos las gastritis agudas y crónicas que es donde la bacteria esta involucrada. La gastritis aguda incluye procesos inflamatorios en la mucosa y submucosa, que pueden desaparecer en días si se encuentra en una fase aguda y es retirado el factor causal. Existen una serie de factores ligados etiopatogénicamente a las gastritis como el alcohol, los fármacos, el estrés y H. pylori (Valle et al., 1996; NIH, 1994).

Cuando la bacteria empieza colonizar, el huésped se presenta en general dos mecanismos de defensa, uno inflamatorio en la fase aguda y uno inmune (folicular) en la crónica. En la fase aguda, el organismo penetra a la capa mucosa del estómago, principalmente en las faveolas y muy cerca de la superficie del epitelio. El epitelio responde a la infección con depleción de mucinas, exfoliación celular y con cambios regenerativos compensatorios, además, comienzan a presentarse células del sistema inmune como polimorfonucleares dentro de las faveolas y lámina propia. Esta fase es acompañada por hipoclorhidria, así como de una disminución del ácido ascórbico en el jugo gástrico. Se ha visto que esta fase esta mediada por la liberación de lipopolisacáridos bacterianos que penetran por el epitelio dañado, induciendo la migración de los polimorfos. Esto va acompañado de otros productos bacterianos que liberan otros mediadores inflamatorios que incrementan la permeabilidad vascular. La bacteria estimula al epitelio provocando la liberación de la interleucina 8 (IL8) (Dixon, 2001). Esta fase es de vida corta y en una pequeña parte de la población, particularmente en los niños, la bacteria puede ser controlada espontáneamente y la morfología del estómago retornar a su normalidad. Sin embargo, en la mayor parte de las personas, la respuesta inmune del hospedero es incapaz de eliminar la infección y en tres o cuatro semanas se manifiesta la acumulación de células inflamatorias, para dar origen a una gastritis crónica activa (Dixon, 2001).

1.9. Gastritis crónica y crónica activa

La gastritis crónica activa se caracteriza por el arribo de linfocitos y células plasmáticas a la mucosa en respuesta a la gran producción de citocinas. La proliferación de células B y su subsiguiente diferenciación en células plasmáticas, producen la síntesis de IgM y anticuerpos que amplifican la reacción inflamatoria. La consistente presencia de H. pylori, hace que aparezca una segunda línea de defensa de las células B, las cuales se presentan en forma de folículos linfoides con la producción de células plasmáticas y la síntesis de IgA. Cuando llega a este nivel la respuesta inmune es insuficiente para erradicar a la bacteria en la mayoría de los casos y si la aparición de los folículos linfoides continua, ya se habla de una gastritis crónica activa. La adquisición de tejido linfoide organizado en la mucosa gástrica constituye lo que se denomina MALT (del inglés mucosa-associated lymphoid tissue) (Dixon, 2001).

11

Si continúa la infección, el tejido gástrico sufre otro nivel más de daño, que es la atrofia y que consiste en la alteración de la estructura y pérdida de tejido glandular. La pérdida de glándulas provoca que se deje de secretar moco y substancias elementales para mantener la funcionalidad de la mucosa, por lo que se empiezan a formar úlceras. Las úlceras consisten en una rotura de la mucosa que sobrepasa la muscularis mucosae y pueden presentarse tanto en el estómago como en el duodeno (Castillo, 2005)

1.10. Úlcera péptica

Una úlcera péptica ó gastroduodenal es una enfermedad caracterizada por la presencia de una o varias lesiones (llaga) en el revestimiento interior del estómago o del duodeno, que es una capa mucosa que recubre estos órganos por dentro para evitar que lesionen por efecto de los jugos digestivos con los que están en permanente contacto. Se trata de una enfermedad muy frecuente que produce un dolor característico y cambios de la calidad de vida en las personas afectadas.

La infección por H. pylori está presente en el 85-100% de los casos de úlcera duodenal y en el 65-80% de los casos de úlcera gástrica (Pan et al., 1991). La bacteria induce cambios significativos en la fisiología del estómago, especialmente en la secreción de ácido. Aunque la mayor parte de los sujetos infectados presenta una secreción ácida normal, los pacientes con úlcera duodenal son frecuentemente hipersecretores, lo que se asocia a una inflamación predominante en el antro gástrico, a un aumento en los niveles post-prandiales de gastrina y a una disminución en la actividad inhibitoria de la somatostatina (Hirschowitz et al., 1994). Esto provoca una mayor carga ácida duodenal y favorece la aparición de metaplasia gástrica en la mucosa duodenal, que puede ser colonizada por H. pylori, lo que probablemente determina la aparición de la úlcera a ese nivel. En cambio, los sujetos con úlcera gástrica o cáncer gástrico tienden a ser hiposecretores, lo que se asocia a una inflamación gástrica más extensa y a la aparición de áreas de atrofia mucosa (Walker et al., 1993). Estas variaciones en la distribución de la infección y en la secreción ácida dependen probablemente de la interacción entre factores del huésped y de la bacteria, como la edad al momento de la infección, el tipo de respuesta inmune mucosa y los factores de virulencia bacterianos mencionados (Hirschowitz et al., 1994).

La erradicación de la infección por H. pylori constituye la terapia de elección en todo paciente con úlcera péptica, ya sea gástrica o duodenal, activa o inactiva, complicada o no complicada, con o sin AINEs. La eliminación de H. pylori es tan efectiva como la terapia con antisecretores para lograr la cicatrización, pero muchísimo más efectiva para evitar la recurrencia. Diversos estudios demuestran que, luego de la sola erradicación, sin terapia, la recurrencia de la úlcera duodenal es de 5% al año y la frecuencia de complicaciones ulcerosas es prácticamente nula (Lanas et al., 1995).

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1.11. Helicobacter pylori y el cáncer gástrico

La Agencia Internacional para la investigación del cáncer y la Organización Mundial de la Salud designó a H. pylori como carcinógeno tipo I (Parsonnet, 1993a). En la actualidad, diversos trabajos tratan de relacionar y asociar la infección por H. pylori con el cáncer de estómago; a partir de evidencias epidemiológicas, anatomopatológicas y fisiopatológicas, lo que ha permitido crear varias hipótesis para explicar los mecanismos mediante los cuales la infección crónica del epitelio gástrico por está evoluciona hacia el cáncer gástrico (Katz et al., 1993; Correa, 1994).

La más aceptada es la planteada por Correa, quien sugiere que la bacteria, al infectar la mucosa gástrica, provoca una gastritis crónica atrófica multifocal, lo cual facilita el crecimiento bacteriano y el aumento de nitrosaminas y nitrosamidas, que tienen alta capacidad mutagénica, por lo cual son las responsables de las lesiones premalignas (Correa et al., 1990); así mismo, la respuesta inmunológica local y sistémica durante la infección y el proceso inflamatorio, pueden inducir a la aparición de errores de replicación celular y facilitar el desarrollo del cáncer (Parsonnet, 1993b).

Otro hecho importante en la génesis del cáncer gástrico es la disminución de vitamina C en el jugo gástrico provocada por la bacteria. Esta vitamina tiene propiedades antioxidantes, en consecuencia, su disminución en el jugo gástrico favorece el desarrollo de tumores (Gil et al., 1990; Besasso, 1996). Existe también una fuerte asociación entre H. pylori y la metaplasia intestinal I, acompañado de aumento del pepsinógeno II y de hipergastrinemia en pacientes infectados con la bacteria, por lo que la determinación de niveles altos de pepsinógeno II y de gastrina sérica en pacientes sería un indicativo de riesgo de neoplasia gástrica. (Parsonnet et al., 1993; Kato et al., 1994).

Por otra parte, existen diferentes tipos de cepas de H. pylori con variado potencial cancerígeno, especialmente aquellas que presentan la citotoxina asociada al gen A (Cag A), las cuales favorecen el desarrollo de gastritis atrófica multifocal y metaplasia tipo I (Blaser et al., 1995; Kutz, 1996)

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El tratamiento utilizado en México, generalmente consiste en una triple terapia en la cual se prescriben inhibidores de la bomba de protones para eliminar la acidez del estómago y una combinación de antibióticos como la amoxicilina y la claritromicina. Su efectividad alcanza entre un 70 y un 80% (Ladrón de Guevara et al., 2004; Hernández et al., 2005).

Por otra parte, también se han hecho estudios acerca de la resistencia a los antibióticos utilizados, la mayor resistencia es al metronidazol, la cual, en 1995, era del 5%; en el 96, de más del 20%; en el 97, superior al 30% y en los últimos tres años, del 80% (Gold et al., 2000, Kim et al., 2003, Torres et al., 2001).

En el año 2003, el Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática (INEGI) registró a los Tumores malignos de estómago, entre las 20 principales causas de muerte en México; en mujeres ocupa el lugar 14, con una tasa de mortalidad del 4.6 por cada 100,000 mujeres, mientras que en hombres ocupa el lugar 19, con una tasa de mortalidad del 4.5 por cada 100,000 hombres (Dirección General de Información en Salud. Secretaría de Salud, 2005). Aunque hay que tomar en cuenta que estos resultados no mencionan cual es el indicie de muerte por H. pylori.

En un estudio que realizó Torres y colaboradores, se hizo un análisis nacional de la distribución de sero-prevalencia de H. pylori (1987-1988) y de la tasa de mortalidad de cáncer gástrico en México. (Torres et al., 1998). Con los resultados obtenidos se dividió al país en cuatro grupos tal como se indica en la Fig. 6. Se encontró, que en 4 estados de la República (Quintana Roo, Tabasco, Aguascalientes y Tlaxcala) se presenta el índice de mortalidad por cáncer gástrico mas bajo (<4.0%), pero se encuentra el índice más alto por infección de H. pylori (70%). Por otro lado, 8 estados (Baja California Sur, Sonora, Coahuila, Tamaulipas, Zacatecas, San Luis Potosí, Guerrero, Chiapas y Yucatán) tienen el índice de mortalidad mas alta por cáncer gástrico (6.0%) con una sero-prevalencia del 66%.

Estos datos podemos decir que no son considerados relevantes entre la proporción de mortalidad entre el cáncer gástrico y H. pylori, solo se podría decir que los Estados del norte tienen un índice mas alto de mortalidad por cáncer gástrico que aquellos del sur, que tienen el desarrollo económico mas bajo (Torres et al., 2005).

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Manifestándose expresamente no erradicarla en aquellas personas asintomáticas aunque estén infectadas por la bacteria, en las enfermedades extradigestivas que se han tratado de relacionar con esta infección y en la dispepsia funcional no ulcerosa, ya que los datos existentes hasta el momento en la literatura no indican ningún beneficio de la erradicación en estos grupos de pacientes (Sáinz et al.,1999).

Actualmente el tratamiento de erradicación considera el uso de dos antibióticos (claritromicina, amoxicilina o metronidazol) e inhibidores de la secreción ácido en el estómago (antagonistas de receptores de histamina e inhibidores de la bomba de protones) (Tabla I). Con esta terapia se tienen buenos resultados en la mayoría de los casos (Boixeda y Argila, 2000), sin embargo, esta combinación no siempre es exitosa, principalmente porque la bacteria ha desarrollado resistencia a los antibióticos ya existentes, además que, frecuentemente, estas terapias producen efectos secundarios para el organismo, tales como diarreas, nauseas, dolor abdominal, dispepsia, etc.

Tabla I. Fármacos eficaces en la erradicación de H. pylori

Inhibidores de la bomba de protones (IBP). I. Omeprazol.

II. Lansoprazol. III. Pantoprazol.

Compuestos de Bismuto. I. Subsalicilato de bismuto.

II. Ranitidina-citrato de bismuto. Antibioticos.

I. Amoxicilina. (Fig. 7 c) II. Macrólidos: claritromicina. (Fig. 7 b)

III. Nitroimidazoles: metronidazol (Fig. 7 a) y tinidazol (Fig. 7 e). IV. Tetraciclina(Fig. 7 d)

En cuanto a la resistencia a los antibióticos, la más frecuente es al metronidazol y es excepcional encontrar las resistencias a la amoxicilina y a la tetraciclina (Boixeda y Argila, 2000). En relación a la duración del tratamiento, la mayoría de los estudios europeos concluyen que son suficientes 7 días de tratamiento; no obstante en Estados Unidos se ha propuesto prolongar la duración hasta 10-14 días (Lindt et al., 1996; Laine et al., 1996a).

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Fig.7. Estructura química de los principales antibióticos utilizados contra H. pylori. a. metronidazol. b. claritromicina. c.amoxicilina. d. tetraciclina y e. tinidazol.

1.14. Métodos para el diagnóstico de la infección por Helicobacter pylori

Tradicionalmente los métodos utilizados para el diagnóstico de la infección por H. pylori se han dividido en no invasivos e invasivos, en función de que no precisen o necesiten de la realización de una endoscopía para la toma de biopsias de la mucosa gástrica (Tabla II).

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Tabla II. Métodos de diagnóstico de la infección por H. pylori

MÉTODOS DIRECTOS O NO INVASIVOS

a) Prueba del aliento con urea marcada (C13 o C14) b) Serología en sangre. c) Detección de antígenos en heces.

MÉTODOS INDIRECTOS O INVASIVOS

d) Histología. e) Cultivo. f) Prueba de la ureasa rápida. g) Tinción de gram.

1.14.1. Métodos no invasivos

La prueba del aliento con urea marcada con C13 o C14 es la técnica más empleada y confiable para el diagnóstico inicial de la infección de aquellos pacientes que no precisen de la realización de una endoscopia. La prueba del aliento se basa en la actividad de la ureasa de H. pylori, la cual es posible determinar a través de la medida del dióxido de carbono espirado, marcado con C14 o C13, tras la administración oral de urea marcada con dicho isótopo. La dosis de radiactividad es baja, la técnica es barata y la sensibilidad y especificidad superior al 90 %. Posterior a la erradicación, la prueba del aliento se negativa con rapidez, por lo que esta técnica es la de elección para el seguimiento de los pacientes tratados. (Gisbert et al., 1996; Laine et al., 1996b).

También puede emplearse en el diagnóstico inicial la serología en sangre mediante técnica de ELISA, ésta técnica tiene el inconveniente de que debe validarse previamente y no es útil para el control de la erradicación, pues se precisa un mínimo de 6 meses para que se produzca un descenso en el título de anticuerpos en sangre. El fundamento de las pruebas serológicas está dado por la respuesta inmune, tanto local como sistémica que produce la infección por el H. pylori, fundamentalmente, de anticuerpos IgG e IgA. Los anticuerpos tipo IgG constituyen la respuesta inmune humoral frente a la infección a nivel sistémico, mientras que las inmunoglobulinas de la clase IgA constituyen los anticuerpos en la respuesta a nivel local (mucosa gástrica) (Hirschl y Rotter, 1996; Crabtree et al., 1991).

Algo similar ocurre con las pruebas serológicas en heces, que si bien son útiles para el diagnóstico inicial (especialmente en niños), tienen una alta incidencia de falsos positivos en los controles post-tratamiento (Trevisani et al., 1999).

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1.14.2. Métodos invasivos

El método histológico permite la observación de H. pylori en las muestras de biopsias de la mucosa gástrica. Es una prueba que tiene la ventaja de informar sobre los cambios morfológicos de la mucosa. Su sensibilidad es alta, pero su especificidad es algo baja (70%), probablemente debido a la distribución irregular del H. pylori o al escaso número de microorganismos. Aunque cuando se realiza una endoscopía la prueba de referencia es el examen histológico, el diagnóstico suele realizarse mediante la prueba rápida de la ureasa dado su menor costo, junto a su buena sensibilidad y especificidad (Matsukura et al., 1995).

La prueba de la ureasa rápida se basa, al igual que la prueba del aliento, en la actividad de esta enzima que posee H. pylori. Este método consiste en introducir una biopsia endoscópica en un caldo de urea, produciéndose un cambio cromático del amarillo a rosa o rojo, si la actividad de la ureasa es elevada. Es un examen sencillo, económico y rápido, con una sensibilidad y especificidad superior al 90% (Adelman, 1996; Matsukura et al., 1995; Mokuolu et al., 1997).

La tinción con Gram y el cultivo pueden proporcionar resultados rápidos. El primero es un examen sencillo y económico, sin embargo, su baja sensibilidad (alrededor del 60 %), hace que no sea muy utilizado. El segundo, lógicamente, sería el método de elección, pero su uso se reserva para aquellos enfermos en los que ha fallado el tratamiento, permitiendo conocer la aparición de microorganismos resistentes. El cultivo no suele emplearse de modo rutinario, restringiéndose su uso para la determinación de las resistencias antibióticas en los pacientes que persiste la infección tras sucesivos tratamientos y en investigación clínica (Matsukura et al., 1995; Mokuolu et al., 1997).

En los pacientes tratados, la concentración de bacterias puede estar muy disminuida dando lugar a falsos resultados negativos en las pruebas diagnósticas, por lo que en estos casos se recomienda aplazar la realización de la prueba diagnóstica un mínimo de 8 días en el caso de pacientes tratados con anti-secretores gástricos y preferiblemente un mes cuando se hayan empleado los otros medicamentos (Laine et al, 1998).

1.15. Generalidades de los usos de plantas medicinales.

Desde sus orígenes, la humanidad, en su necesidad de encontrar los medios para aliviar sus dolencias y curar sus enfermedades, ha buscado en las plantas una alternativa para lograrlo. Las propiedades terapéuticas de las plantas han sentado las bases de la medicina empírica, la que se ha mantenido vigente durante siglos sin que los conocimientos científicos modernos hayan podido prescindir de ellas (Linares et al., 1999).

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Entre los indígenas mesoamericanos, la herbolaria fue una práctica místico-religiosa muy común y era primordial en los ritos adivinatorios; pese a ello, hoy en día ya no preservamos la esencia de esta práctica, como lo hacían nuestros antepasados. En México, muchas personas utilizan sólo plantas medicinales como remedio casero al no tener recursos ni posibilidad alguna de acceder a la medicina institucional debido a que viven en zonas marginadas o muy alejadas de los grandes núcleos poblacionales (Roig, 1945; Losoya y Losoya, 1982).

Hay países que todavía están muy influidos por la curandería; tan es así que el Parlamento sudafricano, por ejemplo, está considerando la posibilidad de conceder licencias a los curanderos para incorporarlos a su sistema nacional de salud pública; el número de ellos es realmente sorprendente, ya que se estima que hay más de 200 mil curanderos en ese país y que más de 70% de su población acude a sus servicios, aun cuando tal permiso impide que traten a pacientes con enfermedades terminales. Con tales permisos se pretende eliminar prácticas que emplean remedios medicinales naturales mezclados con creencias que implican ciertos tipos de sacrificio (Fuentes et al., 1989).

La medicina tradicional es un elemento cultural con profundas raíces en todas las civilizaciones. Según la Organización Mundial de la Salud, entre 66 y el 85% de la población del planeta recurre a la herbolaria para curar diversos padecimientos y enfermedades (OMS. 2004).

Las plantas medicinales tienen propiedades curativas que ya eran conocidas en la antigüedad, aunque también se han añadido al arsenal terapéutico otras plantas cuya utilidad ha sido descubierta recientemente. Hasta el desarrollo de la química, y particularmente, de la síntesis de compuestos orgánicos a lo largo de los siglos XIX y XX, las plantas medicinales eran prácticamente la única fuente de principios activos capaces de mejorar el estado de salud de las personas. Las plantas medicinales continúan teniendo una gran importancia para personas que no tienen acceso a las medicinas modernas y además, muchos medicamentos modernos dependen en gran medida en los mismos principios activos. Éstos difieren de unas plantas a otras debido a su biodiversidad, ya que el código genético de cada especie vegetal contiene información para producir compuestos químicos diferentes (Gupta, 1995).

En la Edad Moderna el uso de las plantas medicinales disminuyó, en parte, a causa de los adelantos efectuados en el campo de la Química. Pero hoy día, incluso en la farmacopea oficial, los vegetales ostentan un lugar de honor. El estudio meticuloso de las plantas desde el punto de vista científico y las diversas experiencias llevadas a cabo, han dado a conocer con gran precisión las virtudes curativas y preventivas de casi todas las plantas y asimismo, los efectos nocivos de algunas.

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En realidad, las plantas tienen una gran superioridad sobre las drogas usadas como remedios. Y esta superioridad se debe al enorme número de principios activos que poseen todos los representantes del reino vegetal (Estrada, 1985). La Naturaleza, en efecto, ha agrupado varias sustancias capaces junto a la principal de moderar, estimular y corregir la acción primordial de la planta. Por esto, un mismo vegetal ejerce funciones diversas y sirve como cura de varias enfermedades, actuando sobre distintos órganos y vísceras corporales con la misma intensidad, el mismo poder, igual ritmo.

Hoy en día la medicina oficial está incorporando el uso de las plantas curativas, por lo cual ya se puede contar con el inestimable asesoramiento de médicos y farmacéuticos para tratamientos medicinales con hierbas y no arriesgarse a una total automedicación, de dudosas consecuencias (Guerra, 1990; Martínez et al., 1994).

1.16. Plantas que se utilizan en la medicina tradicional mexicana.

México se distingue por su larga tradición herbolaria. Se tiene estimado que existen cerca 30,000 especies de plantas de las cuales, en 1997, el Instituto Nacional Indigenista documentó 3,000 con usos medicinales, esto es el 10% del total de la riqueza florística del país (INI, 1994). La efectividad de muchas de ellas se ha probado de manera empírica, en cambio, pocas se han estudiado exhaustivamente, por lo que existe un vasto campo de trabajo para la investigación.

Numerosas plantas medicinales se usan actualmente en el tratamiento de enfermedades modernas, conocidas como enfermedades de la civilización. Como ejemplo de ellas están las causadas por las condiciones de tensión en que viven los habitantes de las grandes ciudades y las que resultan de los efectos secundarios provocados por el empleo indiscriminado de productos farmacéuticos, que pueden llegar a producir tensiones, úlceras, dolor de cabeza, alergias en la piel, etc. (Aguilar et al., 1994a).

Algunas plantas medicinales son parte tradicional de la dieta diaria de los mexicanos. Este hecho ha dado la pauta para entender y conocer cuáles son los alimentos medicinales que, además de ser curativos, forman parte de la dieta y actúan como preventivos. Así se contribuye una práctica de medicina preventiva, muchas veces no advertida y de gran importancia. (Linares et al., 1999).

Además de que existen personas que cuentan con un conocimiento muy amplio de las plantas medicinales y han aprendido a usarlas con mucha autoridad. Otros no cuentan con los conocimientos debidos, las venden pero no las usan y la gente que la compra las conoce y sabe como utilizarlas. Por lo tanto, cuando se quiera emplear cualquier planta medicinal y no esté seguro de su uso, dosificación e identificación, se tiene que recurrir al especialista, ya que entre las mismas familias botánicas existen plantas que pueden ser venenosas y que morfológicamente son tan similares que llegan a confundirse con las inofensivas (Linares et al., 1999).

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1.17. Técnicas para la aplicación de las distintas plantas medicinales.

Las plantas medicinales, según cómo han de utilizarse y el fin a que se destinan, han de prepararse de modos diversos, bien como infusiones, cataplasmas, tinturas, etc. A continuación detallamos cuáles son las distintas formas de aplicación de las hierbas medicinales y cómo prepararlas (Muñoz, 1987).

Aplicaciones externas

Algunas hierbas se aplican sobre la piel o las heridas a fin de que sus aceites volátiles penetren en los tejidos, estimulándolos. Estas partes de las hierbas se lavan y se colocan sobre la piel en una sola capa. Se dejan unos 15 ó 20 minutos, se retiran y se repite la operación con más plantas frescas. Entre estas podemos entrar aquellas que se pueden aplicar en baños, comprensas, ungüentos y vahos.

Baños

Los baños curativos pueden ser de tronco, de asiento, de pies o de chorro de agua. Para conseguir el buen resultado de los baños, es necesario que el cuerpo, después del baño, entre en calor. Para lograr esta reacción el cuerpo ha de poseer calor suficiente antes del baño, que no se aplicará mientras esté frío.

Compresas

Las compresas vegetales ejercen el mismo efecto que 105 ungüentos, aunque poseen la ventaja de la acción curativa del calor. Para preparar una compresa se ponen unos dos puñados de la hierba a aplicar en una taza de agua hervida. Se empapa una tela con el líquido filtrado y después de exprimir el sobrante del líquido se coloca la tela sobre la parte afectada del cuerpo, bien caliente, cubriendo con otro pedazo de tela (lana, a ser posible).Se retira la compresa al enfriarse y esta operación puede repetirse dos o tres veces más. A ser posible, el tejido que interviene en el proceso debe estar debidamente esterilizado.

Ungüentos

Los principios activos de las plantas actúan sobre la piel, aplicados en forma de ungüentos, durante periodos de tiempo más bien prolongados, acelerando, por ejemplo, una cicatrización o inhibiendo los derrames. Se ponen a hervir hierbas en vaselina neutra por las cantidades que se determinen. La mezcla se filtra y, ya fría, se guarda el ungüento en frascos de cierre hermético.

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Vahos

Los vahos son útiles para curar un resfriado o un catarro respiratorio. También lo son en casos de sinusitis. Para su uso se pone una cantidad de hierba en una cacerola esmaltada (nunca metálica), con un poco de agua, y tras dos minutos de ebullición se retira del fuego. Se aplica el rostro sobre el vapor que se desprende de la cacerola a fin de absorberlo por las fosas nasales y por todos los poros, hasta que arranque el sudor, copioso, casi insoportable.Este tratamiento debe prolongarse por espacio de diez minutos, con la cabeza completamente tapada con una toalla de baño o una frazada, a fin de reducir la pérdida de vapor. Después se puede lavar la cabeza con agua fría, siendo recomendable acostarse acto seguido, al menos durante media hora.

Aplicaciones internas En estas se toman cierta parte de planta, la cual se pueden preparara de diferentes maneras como puede ser por decocciones, infusiones, jarabes, mezclas, tinturas, tisanas, tónicos y zumos. A continuación mencionaremos como es que se preparan algunas de estas.

Decocciones

Suelen hacerse con hierbas o plantas cuyos principios medicinales no se desprenden con facilidad. En un cazo esmaltado se echa un puñado de hierba seca (o frescas según el caso) con, aproximadamente, un tazón de agua, y se hierve durante tres minutos, a fuego moderado. Seguidamente se cuela y puede endulzarse con miel.

Infusiones

Es la manera más corriente y sencilla de preparar una hierba medicinal; normalmente, también la más empleada. Para ello se pone un puñado o “puñadito” de la hierba seca (en ocasiones fresca) en una taza previamente calentada, y acto seguido se llena de agua hirviendo. Se tapa la taza y se deja en reposo de cinco a diez minutos, para que el agua absorba los principios medicamentosos. Puede endulzarse con miel, en la justa proporción, siempre preferible al azúcar.

Jarabes

Se vierten 100 gr. de hierbas frescas o secas, según el caso, en un litro de agua. Se hierve un minuto y sé deja que la mezcla repose 2 ó 3 días. Después se exprime y se filtra, añadiendo azúcar de caña, a razón de medio kilo por litro de agua. Los jarabes están indicados contra las dolencias de carácter bronquial o catarral.

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Mezclas

Para preparar la mezcla o combinación de hierbas, existen unas reglas fijas. Naturalmente, para conseguir una mezcla de hierbas destinada a curar o aliviar las dolencias de órganos diversos a la vez, o al menos a lograr que la curación de una enfermedad no incida desfavorablemente sobre otra cualquier parte del organismo, es preferible recurrir a los herbolarios. Cada fórmula de dichas mezclas incluye la hierba básica y específica para la curación de la enfermedad de que se trate, más el o los coadyuvantes reforzantes, y a veces un correctivo del sabor de alguna de las hierbas componentes de la mezcla.

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2. PLANTAMIENTO DEL PROBLEMA

Se calcula que el 50% de la población mundial esta colonizada por H. pylori pero en países en vías de desarrollo como el nuestro, la prevalencia puede llegar a sobrepasar al 80%. La terapia utilizada para la erradicación es eficiente, aunque se ha visto que la resistencia a los antibióticos utilizados va en aumento y en muchos casos se presentan efectos secundarios perjudiciales para la salud. Por otra parte, actualmente esta en discusión la eliminación indiscriminada de la bacteria y se recomienda que se erradique únicamente en aquellos pacientes que presenten úlcera péptica y/o linfomas gástricos MALT y en algunos casos de gastritis crónica activa.

Antes de reconocer a H. pylori como el principal agente etiológico de la gastritis crónica activa y de la úlcera peptica, la búsqueda de agentes derivados de plantas -extractos crudos, fracciones y compuestos- para tratar estas enfermedades ya había sido abordado. En estos trabajos se encontraron mecanismos de acción que involucraban efectos gastroprotectores o inhibidores de la secreción de ácido, pero actualmente se ha visto que muchas plantas reportadas etnobotánicamente para este tipo de padecimientos actúan también sobre el principal agente causal, la bacteria H. pylori (Castillo y Romero, 2007). La búsqueda de propiedades anti-H. pylori en plantas es reciente; el primer reporte que se tiene es de Cassel-Beraud y colaboradores en 1991 y es a partir de los últimos cinco años que este tipo de estudios ha aumentado considerablemente (Castillo y Romero, 2007).

Las plantas han sido una fuente muy importante para la obtención de muchos fármacos que actualmente se utilizan para diversos propósitos. En México, se reporta que alrededor de 3,000 especies de su flora poseen atributos medicinales, sin embargo, un porcentaje muy bajo se les ha realizado una valoración farmacológica y biomédica.

A nivel mundial se ha estudiado el efecto anti-H. pylori de alrededor de 327 plantas tanto de uso medicinal como comestible y de las cuales al 60.8% se les ha encontrado un efecto directo sobre bacteria. Pero en México no obstante a su basta cultura herbolaria y al gran numero de plantas con propiedades medicinales, no se han realizado estudios al respecto (Castillo y Romero, 2007). Todos estos estudios los han realizado investigadores extranjeros y de acuerdo a Castillo (2005), no hay trabajos al respecto hechos por grupos mexicanos. Por otra parte, algunas de las plantas que se han investigado y que también se distribuyen en México, no son nativas ni endémicas de nuestro país (Castillo, 2005). Bajo este contexto la información generada en éste trabajo es relevante por que:

Es un estudio preliminar que valora científicamente el uso tradicional de plantas con propiedades anti-gastritis y anti-ulcerosas, mediante un mecanismo alterno a los previamente reportados (gastroprotectores e inhibidores de la secreción de ácido) y que consiste en un efecto directo sobre el principal agente causal de estas patologías, la bacteria H. pylori.

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Permite la identificación de plantas con actividad anti-H. pylori, las cuales son una fuente importante para obtener compuestos químicos alternos a los antibióticos comerciales (los cuales, en algunos casos, han ido disminuyendo su eficiencia debido a la creciente resistencia por parte de la bacteria).

Fomenta el aprovechamiento de los recursos naturales propios, evitando las patentes extranjeras hechas con nuestros recursos.

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3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Estudiar el efecto de extractos de plantas medicinales utilizadas para el tratamiento de trastornos digestivos (dolor de estómago, úlcera y gastritis), sobre el crecimiento de Helicobacter pylori.

3.2 Objetivos particulares

Recopilación bibliográfica de la información etnobotánica referente a las plantas medicinales utilizadas en México para el tratamiento de trastornos digestivos.

Ubicar su distribución, uso y si existen investigaciones farmacológicas que validen su empleo.

Elección de las especies de plantas a usar en el trabajo experimental, con base en su distribución geográfica y potencialidades de tener un efecto antibacteriano.

Obtención del material biológico e identificación del mismo.

Obtención de Extractos y Realización de las Pruebas de inhibición bacteriana. (Obtención de concentraciones mínimas inhibitorias).

Análisis de los resultados.

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4. MATERIALES Y METODOS

4.1 Selección de plantas medicinales

El criterio de selección para las plantas medicinales utilizadas, fue la búsqueda de antecedentes de su uso popular en México para malestares estomacales. Estos antecedentes se obtuvieron de los libros “Flora Medicinal Indígena de México.” Tomos I, II y III, desarrollado por el Instituto Nacional Indigenista (INI) en 1994, así como de una búsqueda bibliográfica de plantas utilizadas para de trastornos digestivos como dolores de estómago, gastritis y úlcera.

Una vez hecho esto se elaboró una lista, de la cual se escogieron 20 plantas que pudieran conseguirse con facilidad en el “Mercado de Sonora”, localizado en Av. Fray Servando Teresa de Mier # 419 Col. Merced Balbuena. Las plantas se compraron en el local denominado “Plantas Medicinales Isabel” (Pasillo 8) en diciembre del 2006, a excepción de 5 plantas que fueron obtenidas por la M. C. Edelmira Linares Mazari (Haplopappus spinulosus (Pursh) DC. (A) y Machaeranthera cf. Parviflora A. Gray (B), Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng, Limpia graveolens f. berlandieri y Tithonia diversifolia) con fecha de colecta en agosto del 2006 y dos por la Dra. Rebeca Romero Álvarez (Poliomintha longiflora y Hesperozygis marifolia (S. Schauer) Epling), colectadas en diciembre del 2006.

Los ejemplares fueron identificados por la M. en C. Edelmira Linares Mazarí del Jardín Botánico del Instituto de Biología de la UNAM y los ejemplares de referencia se encuentran depositados en el Herbario Nacional de México (MEXU).

4.2. Cultivo de la bacteria Helicobacter pylori

Se utilizó la cepa ATCC 43504 de H. pylori, la cual se encuentra almacenada en viales de 200 μl a -80°C. Las bacterias se cultivaron en cajas de agar- sangre (3.8% Agar Muller-Hilton, 5% de sangre desfibrinada de carnero y 4 antibióticos: anfotericina 2 μg/ml, polimixina B 2.5 μg/ml, trimetropina 5 μg/ml y vancomicina 10 μg/ml) en una atmósfera microaerófilica (5% O2 y 10% CO2) durante 48 hrs a 37°C. Las bacterias se observan como un tapete uniforme translúcido, el cual se colecta en 0.5 ml del medio de cosecha (Caldo Brucella (DIFCO), 10% de suero bovino fetal y 10% de glicerol) y se guardan hasta su utilización a -80°C.

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4.3. Obtención de extractos

4.3.1. Extracto acuoso

Se pesaron 50 g de cada una de las plantas y se hirvieron en 400 ml de agua corriente durante 5 min, posteriormente se centrifuga a 3,000 rpm por 10 min y el sobrenadante se filtra (papel filtro Whatman No. 1) para quitar los residuos sólidos que aun se tengan. Finalmente se liofiliza los extractos y se determina el rendimiento.

4.3.2. Extracto metanólico

Cincuenta gramos de cada una de las plantas se maceraron en 150 ml de metanol por dos días en obscuridad. Se decanta el metanol y se filtra (papel filtro Whatman No. 1) para después concentrar en un evaporador marca Laborota 4000 efficient Heidolph. Una vez recuperado el extracto se determina el rendimiento.

4.4. Cálculo de la actividad mínima inhibitoria (MIC) de extractos acuosos de plantas contra H. pylori por el método de dilución en agar.

La dilución en agar es el método propuesto por el Comité Nacional para los Estándares Clínicos de Laboratorio (NCCLS, siglas en inglés), para determinar la susceptibilidad de compuestos contra H. pylori (NLCCS, 2005). Estas recomendaciones, se indican en la Tabla III y son la base para la prueba del extracto acuoso en este estudio.

Tabla III. Parámetros considerados en el Método de Dilución en Agar para determinar la susceptibilidad de compuestos contra H. pylori.

Parámetro USA - NCCLS Medio Muller- Hinton agar plus, sangre de carnero (5%) Inóculo 1 x 107–1x 108 UFC/ml (Densidad de 2.0 McFarland )

Crecidas en cajas de Agar-sangre. Incubación 35-37°C, en atmósfera microareofílica, 3 días. Cepa Control H. pylori ATCC 43504 Antibióticos de referencia

Amoxicilina, Ciprofloxacina, Claritromicina, Metronidazol, Tetraciclina.

*UFC: Unidades formadoras de colonias

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4.4.1. Preparación de cajas agar Mueller-Hinton-sangre-extractos.

Las concentraciones finales de los extractos acuosos en el agar, que se utilizaron para los ensayos son 125, 250, 500 y 1000 μg/ml. Para preparar las cajas se usa el siguiente procedimiento:

1. Se disuelve en un tubo Falcon 10, 20, 40 y 80 μg de extracto liofilizado en 10 ml de agua estéril (para preparar las solución de 125, 250, 500 y 1000 μg/ml, respectivamente).

2. Por otra parte se preparan las cajas de agar de la siguiente manera: 3.04 gr. de agar Mueller-Hinton (para un volumen final de 80 ml) se disuelven en 66 ml de agua bidestilada caliente y se esterilizan. Al agar esterilizado, a una temperatura de 40°C, se le agrega en constante agitación y en condiciones estériles, los 10 ml de agua donde se disolvió el extracto acuoso liofilizado y 4 ml de sangre desfibrinada de carnero.

Después de que se disuelva perfectamente se vacía en cajas de Petri y se marcan con las concentraciones correspondientes. Se recomienda que se dejen secar durante toda la noche a temperatura ambiente antes de realizar las pruebas para quitar el exceso de humedad o ver si existen contaminaciones.

4.4.2 Prueba de extractos acuosos de plantas contra H. pylori por el método de dilución en agar

Se siembra una caja de Agar-sangre con H. pylori, como se indicó previamente. Se cosechan las bacterias, se resuspenden en medio de cosecha y se ajustan la D.O660= 0.1. Se siembran por tapete 100 μl por caja (que corresponden a 1 x 106 UFC/ml) y se incuban en ambiente microaerofilico en una campana Nuaire TS autoflow mod. 3500 a 37°C por 3 a 7. Transcurrido el tiempo de incubación se determina la concentración mínima inhibitoria (CIM), la cual se define como la concentración mínima a la cual se inhibe el crecimiento de las bacterias en un 100%. Todos los ensayos se realizan por triplicado (Fig. 8).

4.5. Cálculo de la actividad mínima inhibitoria (MIC) de los extractos metanólicos de plantas contra H. pylori por el método de cultivo liquido.

Las concentraciones utilizadas para probar el efecto de los extractos metanólicos fueron: 7.81, 15.62, 31.25, 62.5, 125, 250 y 500 µg/ml. Para la preparación de estas concentraciones se pesan inicialmente 50 mg de extracto y se diluyen en 500 µl de dimetil sulfóxido (DMSO) para obtener una solución madre de 100 mg/ml con las que se hacen diluciones seriales 1:2.

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4.5.1. Precultivo de la bacteria

Se resuspenden 2 o 3 viales de H. pylori ATCC 43504 almacenada a -80°C, en 100 ml de Caldo Muller-Hinton, ciclodextrina 2% y vancomicina 10 μg/ml en un matraz nefelométrico de 125 ml, hasta obtener una absorbencia de 40 UK (A600≈0.2). Posteriormente se coloca en la incubadora Nuaire TS autoflow mod. 3500 a 37°C, en condiciones microaerofílicas y con agitación (150 rpm). Se deja crecer aproximadamente 15 h o hasta que alcance 50 UK (que corresponde al inicio de la fase logarítmica y a una UFC=1 x 107–1x 108 UFC/ml).

4.5.2. Ensayo de extractos metanólicos de plantas contra H. pylori por el método de cultivo liquido.

Se preparan tubos de cultivo estériles de 18 ml con tapa metálica, con 3 ml del cultivo anterior a 50 UK. A cada uno se le añade la 15 μl de los extractos metanólicos (disueltos en DMSO) para obtener las concentraciones finales deseadas, se agita suavemente y se mide la D.O600 de 1 ml directo de todos los cultivos (D.Oinicial). Para cada experimento se preparan 3 tubos controles a los que solo se les agrega 15 μl del solvente (DMSO). Se incuban en condiciones microaerofílicas a 37ºC, con una agitación de 150 rpm por 18 a 20 hrs y se mide la D.O600 de 1ml de cultivo directo (D.Ofinal). Todas las concentraciones de extracto metanólico se realizan por duplicado (Fig. 9).

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Fig. 8. Proceso para el cálculo de la actividad mínima inhibitoria (MIC) por el método de dilución en agar.

Extracto liofilizado + 10 ml de H2O 125-1000 μg/ml

Se preparan cajas de petri

3.04 gr. de agar M-H + 66 ml de H2O

Se siembra H. pylori a 1 x 107–1x 108 UFC/ml

Se determina la concentración mínima

inhibitoria

Esterilizan en autoclave

Se seca a temperatura ambiente por 24 hrs.

Quitar exceso de humedad

Se incuban en ambiente

microaerofilico por 5 dias.

15 min a 121°C Se colocan 4 ml de sangre a uma temperatura de 40 °C

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Fig. 9. Proceso para el cálculo de la actividad mínima inhibitoria por el método de cultivo líquido.

Del extracto metanólico se peso 50 mg.

500 μl de DMSO

Solución madre de 100mg/ml se hacen disolución 1:2 Concentraciones finales probadas son 7.81, 15.62 31.25, 62.5125, 250 y 500 μl/ml.

Se resuspenden 2 ó 3 viales de H. pylori en 100 ml de M-H + Ciclodextrina+ Vancomicina

D.O600 = 0.2

37°C en condiciones microaerofílicas con

agitación

Se deja crecer aprox. 15 h o hasta que alcance D.O600 = 0.27

Se preparan tubos con 3 ml de cultivo de H. pylori

D.O600 = 0.27

Se toma 1 ml de cada tubo y se mide la Ainicial

37°C en condiciones microaerofílicas con

agitación

12 hrs

Se toma 1 ml de cada tubo y se mide la

D.O600 =final

34

4.5.3 Determinación del porcentaje de inhibición y la CMI

Para determinar el porcentaje de inhibición primero se calcula la diferencia en la absorción (ΔD.O600) de cada uno de los cultivos (tanto de los que contienen los extractos metanólicos, así como del control) para esto se utiliza la siguiente formula:

ΔA600 = Afinal – Ainicial

Como cada condición se realizó por duplicado, ó triplicado en el caso del control, se obtiene la media de Absorbencia (ΔĀ600). Una vez hecho esto se calcula el porcentaje de crecimiento de la bacteria respecto al control, por medio de la siguiente formula:

(ΔĀ600 x 100) % crecimiento = ΔĀ600 control

% de inhibición = % crecimiento de la bacteria - 100

La concentración mínima inhibitoria (CMI) para cada uno de los extractos metanólicos equivale a la concentración mínima a la cual se obtiene el 100% de inhibición en el crecimiento del cultivo.

4.6. Pruebas para la identificación de H. pylori

Para verificar la pureza de H. pylori en todos los cultivos realizados, se realizan las siguientes pruebas:

Tinción de Gram

Se coloca una gota de solución salina en un portaobjetos en el cual se disuelve una pequeña parte de la colonia seleccionada y se extiende la gota sobre el portaobjetos.

Se fija el frotis por calor. Se cubre la preparación con una solución de cristal violeta al 2% durante 1

min, y se lava la laminilla con agua destilada. Se aplica lugol (yodo 0.33 %, yoduro de potasio 0.66 %) durante1 min, se

escurre y se lava con agua. Se decolora con la mezcla alcohol-acetona 50%/50% (5 a 15 segundos) hasta

que ya no escurra líquido azul, se escurre y se lava con agua. Se cubre con una solución de safranina 2.5% durante 1 min, se escurre y se

lava con agua. Se deja secar al aire y se observa al microscopio.

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Prueba de Ureasa.

Se colocan 100 μl de una solución urea 6 M, rojo de fenol 0.05% en alcohol, pH 7.2-7.4 en un pozo de una placa Elisa y se añaden 15 μl de la muestra de H. pylori, cuando la reacción es positiva vira de un color rosado.

Prueba de Catalasa.

En un portaobjeto se coloca una gota de H2O2 al 3% y se añaden 5μl de la muestra. Cuando la reacción es positiva se observan la producción de espuma.

Prueba de Oxidasa.

Se pone una gotita del cultivo en una placa de Dry Slide oxidase DIFCO. En unos cuantos segundos ocurre la reacción, obteniéndose una coloración azul si la bacteria es oxidasa positiva.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. Recopilación bibliográfica y obtención del material vegetal

La información etnobotánica de las plantas medicinales fue obtenida de los libros Flora Medicinal Indígena de México, tomos del I al III. Estos libros brindan información acerca del nombre común de la planta, el nombre científico, localización geográfica regional, uso medicinal, causas y síntomas de la enfermedad para la que se utiliza la planta, entre otros datos. Así mismo, hace una breve reseña de los pueblos indígenas y de algunos estudios sobre las plantas medicinales reportadas.

Con la información recopilada se elaboró una primera lista que contiene 105 plantas medicinales usadas para dolores estomacales, gastritis y úlcera que a continuación se muestra (Tabla IV).

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Tabla IV. Algunas especies utilizadas en la medicina popular mexicana para el tratamiento de dolores de estómago, gastritis y úlcera.

Familia Nombre científico Nombre común Enfermedad AGAVACEAE Nectandra heydeana Mez. Laurel blanco Dolor de estómago ANNONACEAE Annona cherimola Chirimoya Úlcera APIACEAE Eryngium Heterophyllum Hierba del Sapo Dolor de estómago APOCYNACEAE Thevetia ahovai Bola de Venado Úlcera ARISTOLOCHIACEAE Aristolochia elegans Guaco Úlcera Aristolochia quercetorum Hierva del indio Dolor de estómago ASTERACEAE Aster gymnocephalus Árnica Rosa Úlcera Calendula officinalis Mercadela Úlcera Caléndula officinalis Maravilla Gastritis Eupatorium petiolare Hierba del Ángel Gastritis Gnaphalium oxyphyllum Canelilla Úlcera Gnaphalium viscosum Canelilla Úlcera Haplopappus spinulosus (Pursh) DC. Árnica para lavar Gastritis y úlcera Heterotheca inuloides Árnica del país Gastritis y úlcera Heterotheca subaxillaris Arnica amarilla Dolor de estómago ó

úlcera Tagetes filifolia Anis, Anisillo Dolor de estómago Tagetes lucida Pericón, Periquillo, Santa

Maria Gastritis y dolor de estómago

Tagetes micrantha Anisillo Dolor de estómago Tanacetum parthenium Santa María Dolor de estómago Thymophylla pentacaeta Manzanilla del monte Dolor de estómago Tithonia diversifolia Árnica Dolor de estómago Verbesina crocata Capitaneja Dolor de estómago Zinnia peruviana San Miguel Dolor de estómago BETULACEAE Alnus jorullensis Aliso Gastritis BIGNONIACEAE Tecoma stans Tronadora Gastritis BOMBACACEAE. Ceiba acuminata Carpas, Pochote Úlcera gástrica Ceiba parvifolia Pochote Gastritis Ceiba pentandra Pochote Dolor de estómago BRASSICACEAE Eruca sativa Chacuacumba Gastritis BROMELIACEAE Tillandsia usneoides Heno Gastritis COMPOSITAE Artemisia ludoviciana Estafiate, Ajenjo Dolor de estómago Gnaphalium attenuatum Gordolobo Dolor de estómago y

ulcera Gnaphalium bourgovii Manzanilla del río Dolor de estómago Gnaphalim aff. Conoideum Gordolobo Dolor de estómago Gnaphalium strameneum Manzanilla Dolor de estómago Gnaphalim oxyphylium Gordolobo Dolor de estómago Heterotheca inuloides Árnica del pais Gastritis y ulcera

gástrica Pinaropappus roseus Clavel del Monte Gastritis Taraxacum officinale Diente de león Dolor de estómago CHENOPODIACEAE Chenopodium graveolens Epazote de zorrillo, Hierba

del zorrillo Dolor de estómago

Teloxys ambrosioides Epazote morado Dolor de estómago Teloxys ambrosioides Epazote verde Dolor de estómago Teloxys graveolens Epazote de zorrillo, Hierba

de zorrillo Dolor de estómago

Teloxys graveolens Hierba de zorrillo Dolor de estómago CLUSIACEAE Hypericum silenoides Corazoncillo Gastritis CYATHEACEAE Trichipteris scabriuscula Helecho Gastritis

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DILLENIACEAE Curatella americana Rasca Viejos Dolor de estómago y gastritis

EQUISETACEAE Acalypha phleoides Hierba del pastor o del cáncer

Gastritis

Equisetum sp. Cola de caballo Úlcera gástrica ERICACEAE Arctostaphylos pungens Manzanilla del campo,

Manzanita Dolor de estómago

EUPHORBIACEAE Croton reflexifolius Cascarillo Gastritis Pedilanthus tithymaloides Mayorca Gastritis FAGACEAE Acacia schaffneri Huisache, Huisache Chino Ulceras Acacia angustissima Timbre Gastritis Equisetum hyemale Cola de Caballo Gastritis y úlcera Hymenaea courbaril Guapinol Úlcera Inga jinicuil Chalahuite Dolor de estómago y

gastritis Leucaena leucocephala Huazin huichin Ulceras Quercus sp. Encino Úlcera gástrica Quercus oleoides Encino Úlcera gástrica GESNERIACEAE Kohleria sp. Ahuehuete o Sabino Gastritis y ulcera Kohleria deppeana Tlalchichinole, tochimitillo,

tlachichinoa, tochomitl. Gastritis y úlceras.

HELIANTACEAE Verbesina sp. Capitaneja Úlcera HIPPOCRATEACEAE Hippocratea excelsa Cancerina Úlcera JULIANIACEAE Amphipteryngium adstringens Cuachalalate Úlcera gástrica Mentha sp. Hierbabuena china Dolor de estómago Ocimum micranthum Albahacar Dolor de estómago LAMIACEAE Hesperozygis marifolia Oregano Dolor de estómago Marrubium vulgare L. Manrrubio, Manrubio

blanco, Mastrantoy Mata ceniza

Úlcera gástrica y gastritis

Mentha arvensis Menta Gastritis y úlcera Mentha pulegium Menta Gastritis y úlcera Plectranthus sp. Oreganón u Orégano de

tierra caliente Dolor de estómago

Poliomintha longiflora Orégano Dolor de estómago LAURACEAE Persea americana Aguacate Dolor de estómago LEGUMINOSAE Cardiospermum coriandrum Tomatillo o Tronador Dolor de estómago LYTHRACEAE Cuphea sp. Cofea Úlcera MALVACEAE Hibiscus Sabdariffa Rosa de jamaica Dolor de estómago NYCTAGINACEAE Mirabilis jalapa Maravilla Dolor de estómago PASSIFLORACEAE Passiflora coriacea Ala de murciélago Gastritis PAPAVERACEAE Bocconia frutescens Gordolobo Dolor de estómago y

ulcera POACEAE Cymbopagon citratos Te de limón Dolor de estómago POLYPODIACEAE Phlebodium aureum Lengua de ciervo Úlcera PORTULACACEAE Portulaca oleracea Verdolaga Gastritis y úlcera

gástrica PHYTOLACCACEAE Phytolacca icosandra Congora, Hierba del coyote Dolor de estómago Petiveria alliacea Hierba del Zorrillo Dolor de estómago y

gastritis PLANTAGINACEAE Plantago australis Llantén Úlcera RUBIACEAE Hamelia patens Balletilla Dolor de estómago,

gastritis y úlcera Hintonia latiflora Colpalquin Ulcera gástrica RUTACEAE Citrus aurantium Naranjillo, Naranjilla Dolor de estómago Ruta chalepensis Ruda Dolor de estómago RHAMNACEAE Colubrina macrocarpa Árnica roja Úlceras SOLANACEAE Solanum sp. Berenjena Úlceras gástricas

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SCROPHULARIACEAE Hamelia erecta Coralillo Úlceras URTICACEAE Capraria biflora Claudiosa o sabonilla Dolor de estómago y

gastritis UMBELLIFERAE Eryngium beecheyanum Hierba del sapo Dolor de estómago VERBENACEAE Lippia alba Mastran Dolor de estómago Lippia graveolens Orégano Dolor de estómago Lippia graveolens f. berlandieri Orégano Gastritis y úlceras Lippia palmeri Orégano Dolor de estómago Lippia sp. Siete negritos, Buena suerte Dolor de estómago Limpia stoechadifolia Epazotillo, Hierba del negro Dolor de estómago Verbena Carolina Verbena, San Antón Dolor de estómago Urtica chamaedryoides Chichicastle, ortiga, mala

mujer Úlcera

ZYGOPHYLLACEAE Lantana camara Cinco negritos Dolor de estómago y gastritis

Larrea tridentata Gobernadora, Falsa alcaparra, hediondilla, huamis.

Gastritis

De ésta primera lista, se seleccionaron 20 plantas que se podrían conseguir con facilidad en el Mercado de Sonora, con el objetivo de realizar nuestro estudio de actividad anti-H. pylori. (La lista de las plantas escogidas se presenta en la siguiente sección).

Se eligió el Mercado de Sonora por ser el más grande en su tipo en todo México y es conocido nacional e internacionalmente por la peculiaridad de su giro comercial. La industria herbolaria nacional comercializa alrededor de 1,200 toneladas mensuales, de las cuales el Mercado de Sonora participa con 160. Los “hierberos” del Sonora han obtenido, en su mayoría, el conocimiento a través de las enseñanzas de sus ancestros (Mendoza, 1997).

Las plantas obtenidas fueron presentadas, para su identificación taxonómica, a la M. C. Edelmira Linares Mazari, académico del Jardín Botánico del Instituto de Biología, de la UNAM y están depositadas en el Herbario nacional (MEXU).

5.2. Actividad anti- H. pylori de las plantas Seleccionadas

5.2.1. Obtención de los extractos.

De las plantas seleccionadas se prepararon los extractos acuosos y metanólicos, como se describió en la sección de Materiales y Métodos (Figs. 10 y 11).

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Fig. 10. Obtención de los extractos acuosos.

50 gr. de planta +

400 ml H2O

Liofilizar el filtrado

Determinar el rendimiento del polvo

liofilizado

Hervir 15 min

Centrifugar y

Filtrar

40

Fig. 11. Obtención de los extractos metanólicos.

50 gr. de planta +

150 ml Matanol

Decantar el

Sobrenadante

Concentrar el sobrenadante en el

evaporador

Determinar el rendimiento del

sedimento

Maceración 2 días

obscuridad

41

En la Tabla V se indica, la familia, nombre científico, nombre común, la parte utilizada y el rendimiento obtenido para cada extracto. En general se utilizaron las plantas frescas o tal como se comercializan. Una vez obtenidos los extractos se guardaron en refrigeración y protegidos de la luz.

Para el caso de Haplopappus spinulosus (Push) DC se utilizaron dos tipos: A y B; ambas fueron colectadas en el Valle de Zaragoza, Chihuahua, pero en dos poblaciones diferentes (no determinadas por el colector), por lo que se decidió utilizar a las dos en el estudio para determinar si existían diferencias en los resultados, debidas a la población de origen.

Tabla V. Descripción de las plantas seleccionadas para en el estudio inhibitorio de H. pylori y rendimiento de los extractos obtenidos.

Nombre común No. MEXU Parte utilizada

Rendimiento (gr) Ex. Ex. Acuoso etanólico

ASTERACEAE Haplopappus spinulosus (Push) DC A

Árnica para lavar 1204422 P. C. 2.29 1.57

Haplopappus spinulosus(Push) DC B

Árnica para lavar 1204424 P. C. 2.08 1.22

Tagetes lucida Cav. Pericón 1201173 P. C. 2.00 2.65 Tanacetum parthenium Santa María 1201179 P. C. 1.05 1.74 Tithonia diversifolia Árnica 1201170 P. C. 2.76 3.48 CHENOPODIACEAE Chenopodium graveolens Lag. Epazote de zorrillo 1201178 P. C. 1.26 1.47 Teloxys ambrosioides L. Weber Epazote morado 1201177 P. C. 0.33 0.85 Teloxys ambrosioides L. Weber Epazote verde 1201176 P. C. 0.83 0.80 GESNERIACEAE Kohleria deppeana (Schltdl. et Cham.) Fritsch

Tlalchichinole 1201171 P. C. 0.52 0.70

LAMIACEAE Hesperozygis marifolia (S. Schauer) Epling

Orégano 1501 H 3.71 4.38

Marrubium vulgare L. Manrrubio 1201172 P. C. 1.45 0.74 Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng

Orégano de tierra caliente

1204423 H y T 3.34 2.72

Poliomintha longiflora Orégano 1502 H 5.14 4.02 LAURACEAE Persea americana Mill Aguacate 1201175 H 1.05 1.10 MALVACEAE Hibiscus Sabdariffa L. Rosa de jamaica 1492 F 9.12 8.83 POACEAE Cymbopagon citratos (D.C.) Stapf

Té de limón 1201181 H 0.86 1.87

RUTACEAE Ruta chalepensis L. Ruda 1201180 P. C. 1.07 1.49 VERBENACEAE

42

Lippia graveolens f. berlandieri Orégano 1507 P. C. 0.92 0.41 Verbena Carolina L. Verbena,

San Antón 1201174 P. C. 0.98 2.19

ZYGOPHYLLACEAE Larrea tridentata Gobernadora 1493 P. C. 2.47 3.03

P.C.: Planta completa, H: hoja, C: Corteza, T: Tallo y F: Flores.

5.3. Determinación de la actividad mínima inhibitoria (CMI) de los extractos acuosos.

La actividad anti-H. pylori de los extractos acuosos a concentraciones de 125, 250, 500 y 1000 µg/ml se determinó por el método de dilución en agar, calculando la concentración mínima inhibitoria (MIC). Este método es el aprobado por el Comité Nacional para los Estándares Clínicos de Laboratorio (NCCLS, 2005), para determinar la susceptibilidad de compuestos contra H. pylori. La MIC se define como la concentración mínima a la cual se inhibe el crecimiento de las bacterias en un 100% (Fig. 12).

Fig. 12. Determinación de susceptibilidad de compuestos contra H. pylori.

En la Tabla VI se presentan los valores obtenidos para cada una de las plantas, en orden decreciente de la MIC obtenida, también se incluyen los valores obtenidos para los antibióticos de referencia amoxicilina y metronidazol.

Crecimiento Control (sin adición de extractos a probar)

100% de Inhibición del Crecimiento (en presencia del extracto a probar)

43

Como puede observarse, los valores de MIC encontrados están en el intervalo de 500 a más de 1000 µg/ml (a excepción de los antibióticos de referencia cuyos valores encontrados coinciden con los valores indicados por la NCCLS (2005). Cuatro plantas (20% del total) mostraron un MIC de 1000 µg/ml y 5 plantas (25%) tuvieron el MIC más bajo de este trabajo (500 µg/ml).

Tabla VI. Actividad anti-H. pylori de los extractos acuosos.

Nombre científico Nombre común Parte utilizada

MIC µg/ml

Haplopappus spinulosus (Pursh) DC. A Árnica para lavar P. C. >1000 Haplopappus spinulosus (Pursh) DC. B Árnica para lavar P. C. >1000 Kohleria deppeana (Schltdl. et Cham.) Fritsch

Tlalchichinole P. C. >1000

Cymbopagon citratos (D.C.) Stapf Te de limón H >1000 Marrubium vulgare L. Manrrubio P. C. >1000 Persea americana Mill Aguacate H >1000Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng. Orégano de tierra

caliente H y T >1000

Poliomintha longiflora Orégano H >1000 Hibiscus Sabdariffa L. Rosa de Jamaica F >1000 Tanacetum parthenium Santa María P. C. >1000 Teloxys ambrosioides L. Weber Epazote morado P. C. >1000 Teloxys ambrosioides L. Weber Epazote verde P. C. 1000 Hesperozygis marifolia (S. Schauer) Epling

Orégano H 1000

Ruta chalepensis L. Ruda P. C. 1000 Lippia graveolens f. berlandieri Orégano P. C. 1000 Tithonia diversifolia Árnica P. C. 500 Tagetes lucida Cav. Pericón P. C. 500 Verbena Carolina L. Verbena P. C. 500 Larrea tridentata Gobernadora P. C. 500 Chenopodium graveolens Lag. Epazote de Zorrillo P. C. 500

ANTIBIOTICOS Amoxicilina 0.05 Metronidazol 75

5.4. Determinación de la actividad mínima inhibitoria (MIC) de los extractos metanólicos.

A diferencia de los extractos acuosos, los extractos metanólicos se probaron utilizando el método de Cultivo líquido y a concentraciones de 7.81, 15.62, 31.65, 62.5, 125, 250 y 500 µg/ml.

44

Los valores de MIC obtenidos para cada extracto se muestran en la Tabla VII, además, se refieren los valores obtenidos para los antibióticos de referencia amoxicilina y metronidazol.

Tabla VII. Actividad anti-H. pylori de los extractos metanólicos.

Nombre científico Nombre Común Parte utilizada

MIC µg/ml

Hibiscus Sabdariffa L. Rosa de Jamaica F >500 Teloxys ambrosioides L. Weber Epazote morado P. C. 500 Tagetes lucida Cav. Pericón P. C. 500 Teloxys ambrosioides L. Weber Epazote verde P. C. 250 Poliomintha longiflora Orégano H 250 Haplopappus spinulosus (Pursh) DC. A Árnica para lavar P. C. 125 Chenopodium graveolens Lag. Epazote de Zorrillo P. C. 125 Verbena Carolina L. Verbena P. C. 125 Tanacetum parthenium Santa María P. C. 62.5 Hesperozygis marifolia (S. Schauer) Epling.

Orégano H 62.5

Ruta chalepensis L. Ruda P. C. 62.5 Tithonia diversifolia Árnica P. C. 62.5 Larrea tridentata Gobernadora P. C. 62.5 Cymbopagon citratos (D.C.) Stapf Te de limón H 31.2 Marrubium vulgare L. Manrrubio P. C. 31.2 Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng. Orégano de tierra

caliente H y T 31.2

Lippia graveolens f. berlandieri Orégano H 31.2 Haplopappus spinulosus (Pursh) DC. B Árnica para lavar P. C. 31.2 Kohleria deppeana (Schltdl. et Cham.) Fritsch

Tlalchichinole P. C. 15.6

Persea americana Mill Aguacate H <7.5 ANTIBIOTICOS

Amoxicilina 0.1 Metronidazol 300

Como puede observarse, en este caso los datos obtenidos se distribuyeron en todo el intervalo de concentraciones probado. Para los antibióticos de referencia, no tenemos patrón de comparación, debido a que no hay valores reportados, con éste método, por la NCCLS. Sin embargo, en el caso de la amoxicilina, el valor obtenido de MIC (0.1 µg/ml) es ligeramente menor que el reportado por la NCCLS para el método de dilución por agar (0.015-0.12 µg/ml) y para el caso del metronidazol, el valor resultó ligeramente mayor (para NCCLS el intervalo es de 64 a 256 µg/ml). Para el caso de Haplopappus spinulosus, se encontraron diferencias entre en el MIC de A (125 µg/ml) respecto a la denominada B (31.2 µg/ml), por lo que estos resultados sugieren que podría haber diferencias relacionadas al tipo de región donde se crecen las plantas. Estas discrepancias solo se presenaron en el extracto metanólico pero no en el

45

acuoso. Estos datos indican que el lugar geográfico donde se desarrolla la planta puede ser un factor importante para el estudio de las actividades anti-H. pylori.

Para analizar nuestros resultados en un contexto más global, se realizó una comparación de todos los estudios mundiales que evaluan el potencial anti-H. pylori de conjuntos de plantas. Los resultados se resumen en la Tabla VIII y al final de la misma, se incluyen los parámetros experimentales utilizados en esta Tesis.

Analizando los datos de la Tabla VIII, podemos observar que los trabajos presentan una gran variación entre los diferentes parámetros considerados, como son: los métodos utilizados para la extracción de compuestos de las plantas, el tipo y número de cepas, el número de bacterias, el medio de cultivo, antibióticos utilizados, tiempo de incubación, etc. También podemos apreciar que algunos trabajos han empezado ha considerar algunas de las recomendaciones hechas por la NCCLS.

Dado que no es posible realizar comparaciones con trabajos previos de la literatura, decidimos definir nuestros intervalos de actividad, considerando como control interno de nuestro ensayo los valores de MIC obtenidos para los antibióticos de referencia. Estamos conscientes que estos valores son relativos, ya que los valores obtenidos para los antibióticos de referencia son para compuestos puros, lo cuál no es el caso en nuestros experimentos con extractos crudos de plantas, que están formados de diversos metabolitos de la planta.

En el caso de los extractos acuosos, los antibióticos de referencia tuvieron MIC dentro del intervalo propuesto por la NCCLS para amoxicilina (0.015-0.12 µg/ml) y para metronidazol (64 a 256 µg/ml). De las plantas ensayadas solo cinco tuvieron un MIC de 500 µg/ml (que sería el valor más cercano al MIC para metronidazol): Tithonia diversifolia, Tagetes lucida Cav., Verbena Carolina L., Larrea tridentata y Chenopodium graveolens Lag. Por esta razón, consideramos a los extractos acuosos de estas plantas como los más activos de nuestro grupo y serían las primeras candidatas para estudiar su potencial anti-H. pylori. No obstante, no podemos descartar a las plantas con MIC de 1000 µg/ml que, aunque a más concentración, también eliminaron a la bacteria en su totalidad.

Para los extractos metanólicos se obtuvieron valores de MIC más bajos y muchos de ellos, dentro del intervalo de los antibióticos de referencia, así, definimos nuestros límites de actividad de la siguiente manera:

0 - 15.6 µg/ml Buena actividad anti-H. pylori 31 - 62.5 µg/ml Moderada actividad anti-H. pylori 125 - 250 µg/ml Baja actividad anti-H. pylori 500 - >500 µg/ml Nula actividad anti-H. pylori

46

Tabla. VIII. Estudios mundiales que evalúan el potencial anti-H. pylori de conjuntos de plantas.

Referencia (Nacionalidad de

autores), medicina

tradicional

No. de plantas y

cepas utilizadas

Usos tradicionales y lugar de colecta

Tipo de extracto MIC del Antibiótico

de referencia μg/ml

Método para la determinación

del MIC

Tiempo de

incubación

No. de bactérias UFC/ml

Actividad significativa

MIC

Intervalo de actividad μg/ml

Fabry et al 1996. (Alemanes y africanos) Africana.

6 plantas contra 11 aisladas

clínicas y 43504

----------------

campo

Soxhlet metanol

-----------------

Dilución en agar (ciclodextrina)

5 días

3 X105

3 de 6 plantas con un MIC 50

125-250

2 - 4000

Bae et al 1998. (Koreanos)

51 plantas contra 5 aisladas clínicas y 43504

----------------

Almacén comercial

Agua hirviendo por 6 hrs. y luego se evapora

Ampicilina 0.5-2

Dilución en agar (sangre)

3 días

5 X 105

5 < 1000 7 = 1000-200 1 = 2000-5000 de 51

Muy fuerte = < 1000 Fuerte =

1000-2000 Débil =

2000-5000 Nula = >

5000 Yesilada et al 1999 (Turkos) Turka

7 plantas contra 8 aisladas clínicas y NCTC 11637

Dolor de estómago incluyendo úlceras.

campo

Agua y metanol macerado 24 hrs filtrado y concentración. Y después fraccionados.

Amoxicilina

> 0.2 Ofloxacina 0.49-0.98

Dilución en agar (Suero fetal

bovino)

5 días

1 X105

1 de 7 acuoso

62.5-125 metanol 125 Si fraccionan con solventes

6 de 7 1.95- 62.5

Acuoso = 0.49 - 250

Metanólico = 0.49 - 250

Stamatis et al 2003 (Griegos) Griegos

70 plantas contra 15 aisladas clínicas y 43504

Dolor de estómago incluyendo úlceras. Almacén comercial

Extracto acuoso metanolico 70%

Claritromicina

1 - 2

Dilución en agar (sangre)

multiplacas

3-5 días

5X 105

Cuenta viable

13 de 70

625 - 5000

625-5000

Nariman et al 2004 (iranies) Iran

6 plantas contra 70 aisladas clínicas de H. pylori

----------------

campo

Agua hierven por 1 hora, se filtra y se evapora en

baño de agua hirviendo. El acuoso es activo en método de difusión

Mezcla de solventes y por separado (metanol, dietil eter, benceno de petroleo) maceración por 24 hrs y

filtradas .

-----------------

Líquido

Dilución en agar (SBF)

2-5 días

5 X 105

McFarland

2 de 6 plantas y se hizo por Mezcla y

metanolico= 31.2-250

3.75-2000

47

Wang et al 2005 (Taiwaneses) Taiwan

50 plantas contra 10

cepas

----------------

Mercados

Etanol al 95% por Maceración

-----------------

Dilución en agar (sangrede oveja)

3 días

0.5-1 X 105

Por el método de difusión: 5 con inhibición y 19 moderada de 50 plantas

640-5120 Solo las 5

mas activas

Li et al 2005 (Chinos) China

30 plantas contra 5 aisladas clínicas y 43504

Plantas recetadas para desordenes

relacionados con la gastritis.

Colectadas y compradas

Etanol 95% y agua por reflujo 4hrs liofilizan

Ampicilina 2

Dilución en agar

(sangre)

3 días

5 X 106

15 en etanol (40-100) 9 acuoso (60-100) de 30 plantas

5 – 100

Mahady et al 2005 (EUA) Varios lugares del mudo.

23 plantas contra 14 aisladas clínicas y 43504

Plantas para el tratamiento de

desordenes gastrointestinales

Almacén comercial

Metanol 95%

Amoxicilina

0.002 - 0.06

Metronidazol

64-128

Dilución en agar

(sangre)

NCCLS

3 días

1 X 106

McFarland

1 de 25 2 de 25 5 de 50

12 de 100 3 de >100 20 de 23 plantas

0.78-100

Nostro et al 2005 (italianos) Italia

17 plantas contra 11 aisladas clínicas y 43629

---------------

Almacén comercial

Agua maceración y decocción 30 min

Etanol 95% maceración

Claritromicina

0.06-4

Dilución en agar

(sangre)

NCCLS

5-7 días

5 X 105

McFarland

7 de 17 plantas en acuoso y

13 de 17 plantas en metanolico

Calculado por disco.

Pero los 15 mas activos MIC:

Acuosos 300-10 000 Etanolicos 75- 10 000

75-10 000

Este trabajo (Mexicanos) México

20 plantas contra la 43504

Plantas utilizadas para gastritis,

ulceras y dolor de estómago.

Colectadas y de mercados

Agua decocción Metanol por maceracion

Amoxicilina

0.05 - 0.1

Metronidazol

75 - 300

Dilución en agar (sangre) NCCLS

Líquido

5 días

Disolucion en agar 1X105

Líquido 1X107 -1X108

Cuenta viable

9 de 20 plantas en acusoso y

17 de 20 plantas en metanolico

125-1000

y

2.5-500

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Los resultados obtenidos son: 2 extractos con buena actividad (Kohleria deppeana (Schltdl. et Cham.) Fritsch y Persea americana Mill.), 10 extractos con moderada actividad (Cymbopagon citratos (D.C.) Staff, Marrubium vulgare L., Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng., Lippia graveolens f. berlandieri y Haplopappus spinulosus (Push) DC B, Tanacetum parthenium, Hesperozygis marifolia (S. Schauer) Epling, Ruta chalepensis L., Tithonia diversifolia y Larrea tridentata.) y 5 extractos con baja actividad (Haplopappus spinulosus (Push) DC A, Chenopodium graveolens Lag. y Verbena Carolina L., Teloxys ambrosioides L. Weber y Poliomintha longiflora). En resumen, 85% de los extractos metanólicos de las plantas ensayadas están dentro de nuestros límites de actividad y por lo tanto son buenos candidatos para profundizar en su estudio.

Hay que hacer notar que las plantas que mostraron la mayor actividad en los extractos metanólicos, no son las mismas que muestran la mejor actividad en los acuosos, esto podría deberse a varios factores como que los compuestos que se extraen con uno y otro método son diferentes o que la concentración de los compuestos activos es diferente con los dos métodos, entre otras cosas.

Sin embargo, es interesante el hecho de que, de las 5 plantas que tuvieron la mejor actividad en el extracto acuoso, 4 de ellas también tuvieron actividad (entre moderada y buena) con su correspondiente extracto metanólico, lo que las perfila como mejores candidatas para posteriores estudios.

Aunque estamos encontrando plantas con mayor potencial anti-H. pylori que otras, no se puede descartar a las que no lo tuvieron o tuvieron muy baja actividad, ya que en este trabajo solo se realizaron dos tipos de extractos y es posible que cualquiera de esas plantas tengan compuestos activos que no pudieron extraerse bajo las condiciones utilizadas aquí.

A continuación se resumen algunas características de las plantas que se consideraron como activas (tanto para el extracto acuoso, como en el metanólico) y se describe, en su caso, si se han aislado compuestos de ellas.

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Nombre científico: Haplopappus spinulosus (Push) DC Nombre común: Árnica para lavar Familia: Asteraceae Uso: Gastritis y úlcera Modo de empleo: Se toma el cocimiento de la parte aérea. Distribución: Chihuahua Análisis Fitoquímico: No existen referencias de compuestos aislados de esta planta.

Nombre científico: Tagetes lucida Cav. Nombre común: Pericón, Periquillo Familia: Asteraceae Uso: Gastritis y dolor de estómago Otros Usos: Contra el susto, vómito, diarreas color cacahuate, gastrointestinales, dolor de cabeza, como astringente y tónico estomacal; es abortivo, uterotónico y antiinflamatorio. Modo de empleo: Se toma en cocimiento las hojas en forma de té. Distribución: Chihuahua, Durango, Guerrero, Jalisco, Michoacán y Oaxaca Análisis Fitoquímico: Las flores contienen cartamina, un colorante flavonoide, pero no presentan aceites esenciales (Bicchi et al., 1998). La planta se cultiva exhaustivamente por su aceite comestible que se extrae de las semillas. Contiene triglicéridos con ácido linoleico (70%) y con ácido linolénico (10%); este último, junto con el alto contenido de vitamina E, son los responsables de la buena reputación que tiene

el aceite de cártamo entre los especialistas en nutrición (Linares et al., 1999). Además de que contiene alcaloides y ácido tánico, tiofenos que son derivados sulfurados, letales para bacterias, levaduras, hongos y nemátodos (Márquez et al., 1999)

50

Nombre científico: Tanacetum parthenium Nombre común: Santa María Familia: Asteraceae Uso: Dolor de estómago. Otros Usos: Dolor de cabeza, trastornos de tipo nervioso, regula la menstruación, Fiebre puerperal y enfermedades de la matriz. No tomar durante el embarazo. Modo de empleo: El cocimiento de la planta se toma como té Distribución: Chihuahua, Durango, Guerrero y Michoacán Análisis Fitoquímico: Son pocos los estudios en cuanto sus propiedades fitoquimicas. Contiene aceite esencial, flavonoides (tanetina, heterósidos de apigenina, luteolina y crisoeriol), lactonas sesquiterpénicas y poliínos (Márquez et al., 1999)

Nombre científico: Tithonia diversifolia Nombre común: Árnica Familia: Asteraceae Uso: Gastritis y ulcera Otros Usos: Problemas con el hígado, en los animales se utiliza para disminuir los abortos y también en los animales se ocupa para depurar y arrojar la placenta, se suministra a las conejas 2 o 3 días antes del parto y 5 a 8 días después del parto. Modo de empleo: Las hojas en maceración con alcohol como si fuera árnica Distribución: Sur de México, en el especial en el estado de Guerrero Análisis Fitoquímico: Se ha reportado una cumarina, posiblemente la colinina, pero no se cuantificó su nivel (Ríos y Salazar, 1995). En un análisis de metabolitos secundarios en T. diversifolia, realizado por Rosales (1992), no se encontraron ni fenoles ni taninos, mientras que Vargas (1994) encontró un

bajo contenido de fenoles y ausencia de saponinas. Murgaruline et al (1993) encontraron el compuesto citotóxico Tagitinin. Dutta et al (1993) encontraron Hispidulin, además del compuesto Tagitinin, a los cuales le atribuyen el efecto repelente contra los insectos. En términos generales T. diversifolia se caracteriza por tener buena palatabilidad y altos contenidos de proteína.

51

Nombre científico: Chenopodium graveolens lag. Nombre común: Epazote de zorrillo, Hierba del zorrillo Familia: Chenopodiaceae Uso: Dolor de estómago Otros Usos: Diarrea, disentería, empacho, parásitos (ascaris, amibas y solitaria) indigestiones, flatulencias, falta de apetito y tos. Modo de empleo: Para la tos: Se hierve una ramita en 1 l de agua y se toma una taza. Para el dolor de estómago se hierve una ramita con chocolate en 1 l de agua y se endulza con panela. Distribución: Chihuahua, Durango, Guerrero, Jalisco, Michoacán y Oaxaca. Análisis Fitoquímico: La esencia del epazote de zorrillo está constituida por hidrocarburos terpénicos (cimeno, limoneno, terpineno, etc.) y ascaridol (es un compuesto orgánico natural, clasificado como un monoterpeno bicíclico que tiene un puente inusual peróxido en el grupo funcional.). Este último tiene las siguientes propiedades:

Tónico estomacal y carminativo (evita los gases intestinales) y Antihelmíntico y vermífugo (destruye los parásitos intestinales). (Rzedowski et al., 2001).

Nombre científico: Teloxys ambrosioides L. Weber. Nombre común: Epazote morado, epazote blanco, epazote cimarrón, epazote criollo, epazote de comer, ipazote, alskini (tepehua de Puebla), cuatzitish-atcingo (Purhe), gail (otomí de Puebla) Familia: Chenopodiaceae Uso: Dolor de estómago. Otros Usos: Amibas, disentería y lombrices. Modo de empleo: En caso de dolor de estómago y disentería se pone a hervir una ramas en 1/2 litro de agua y tomar en ayunas. Distribución: Puebla. Análisis Fitoquímico: Sus componentes principales son ascaridol, componente activo responsable del efecto antiparasitario, p-cimeno, (-) limoneno, (+) alcanfor, artasona, safrol, N-docosano, N-hentriacontano, N-heptacosano, N-heptacosano, β pineno, metadieno, salicilato de metilo, dimetil sulfóxido, d terpineol y otros componentes (Font, 1980).

El aceite de epazote está compuesto por ascaridol en hasta un 70 %. El ascaridol es tóxico y de sabor no muy agradable. Se presume que el contenido de ascaridol es menor en el epazote de México que en el epazote de Europa y Asia. (Avello et al., 2006). Por destilación se obtiene aceite esencial, en mayor porcentaje en los frutos: de 0,6 a 1,0% y menor en los tallos foliáceos: 0,30 a 0,35%. Este aceite esencial es un líquido incoloro o ligeramente amarillento, de olor penetrante, agradable, canforáceo y de sabor amargo y ardiente (Márquez et al., 1999).

52

Nombre científico: Teloxys ambrosioides L. Weber. Nombre común: Epazote verde. Familia: Chenopodiaceae Uso: Dolor de estómago y vómito Otros Usos: Parasitosis intestinal, diarrea, estreñimiento, indigestión, flatulencia, desorden menstrual, dolor de muelas, trastornos cardíacos, herpes, picaduras de insectos y úlceras cutáneas. No usar en epilépticos. Modo de empleo: Para el dolor de estómago y vómito se prepara un té con dos o tres ramitas de Epatozillo en dos tazas o medio litro de agua. Para el dolor de estómago se le agrega al te orégano de oreja y para el vomito una ramita de tepejilote. Distribución: Chihuahua, Durango, Guerrero, Jalisco y Michoacán. Análisis Fitoquímico: La planta entera es rica en aceite esencial, cuyo componente principal es el ascaridol, causante del efecto antiparasitario de esta planta. El mayor contenido de este aceite se encuentra en las

semillas. En el aceite esencial se reporta la presencia de p-cimeno, (-)-limoneno, (+) alcanfor, artisona, safrol, dimetilsulfoxido, d-terpinol. Además se le reportan en diferentes partes de la planta los siguientes compuestos: ambrósidos, betaína, chenoposdiosidos A y B, saponinas A, rhamnósidos y santoína (Vizoso et al., 2000).

El ascaridol (peróxido terpénico) constituye el 75-80 % del aceite, siendo este el componente con actividad antihelmíntica y antibacteriana demostrada farmacológicamente. (Vizoso et al, 2000)

Nombre científico: Kohleria deppeana (Schltdl. et Cham.) Fritsch. Nombre común: Tlalchichinole, tochimitillo, tlachichinoa, tochomitl. Familia: Gesneriaceae Uso: Gastrointestinales y úlceras. Otros Usos: Llagas, heridas, hemorroides y riñón. Modo de empleo: Se recomienda su uso en el tratamiento de dolor de riñones. Se usa para lavados vaginales en caso de leucorrea y otros flujos. Para lavar las llagas. Distribución: Oaxaca. Análisis Fitoquímico: No existen referencias de

compuestos aislados de esta planta.

53

Nombre científico: Hesperozygis marifolia (S. Schauer) Epling. Nombre común: Orégano Familia: Lamiaceae Uso: Como alimento y en poca medida medicinal. Modo de empleo: Las infusiones o también llamadas, tisanas, se preparan con una cucharadita por taza de hojas y flores secas trituradas. Infundir diez minutos. Tres tazas al día, antes o después de las comidas. Distribución: Nuevo León Análisis Fitoquímico: No existen referencias de

compuestos aislados de esta planta.

Nombre científico: Marrubium vulgare L. Nombre común: Manrrubio, Manrubio blanco, Mastrantoy Mata ceniza Familia: Lamiaceae Uso: Gastritis. Otros Usos: Se usa para curar bilis, empacho, gases, cólicos, diarrea, diabetes, catarro constipado, problemas renales, reumatismo, puerpuerio, recaídas de señoras, cólicos menstruales por frialdad, disentería, muina y como purgante. Modo de empleo: Para controlar el exceso de bilis y el dolor de estómago se toma un té de toda la planta combinada con canela e hinojo. Distribución: Chihuahua, Durango, Guerrero, Jalisco, Michoacán y Oaxaca Análisis Fitoquímico: En las sumidades floridas (los extremos de los tallos que contienen hojas) )encontramos pequeñas cantidades de esencia, algo de resinas, ceras, taninos, un glucósido y una saponina con

carácter ácido. El principio activo está constituido por la marrubiína. Además, abundan otros componentes como marrubiol, peregrinol, vulgarol, flavonoides, taninos, mucílagos, sales minerales como el hierro y el potasio, así como vitamina C. (El Bardai et al., 2003) Las saponinas con carácter ácido le confieren a la planta propiedades aperitivas, digestivas, balsámicas, expectorantes y tiene marcadas acciones sobre los bronquios. Su alto contenido en sales potásicas parece ejercer un efecto diurético moderado. Se la considera así mismo un buen antiarrítmico y depurativo (Herrera et al., 2004).

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Nombre científico: Plectranthus amboinicus (Lour) Spreng. Nombre común: Orégano Familia: Lamiaceae Uso: Dolor de estómago. Otros Usos: Riñones, dolor de oídos, aire, tos, gripe, dolor de vientre, cólico, vasca y bronquitis. Modo de empleo: Se cuece una taza de leche, se le echan las 3 hojitas y se la toma uno. Distribución: En las zonas mediterráneas y en el este y centro de Asia; China, África y América del Sur. Análisis Fitoquímico: No existen referencias de compuestos aislados de esta planta.

Nombre científico: Poliomintha longiflora Nombre común: Orégano Familia: Lamiaceae. Uso: Dolor de estómago. Otros Usos: Es un potente fungostático, además de un excelente agente antibacterial que ataca a la mayoría de bacterias patogénicas como estreptococos, estafilococos. Afecciones respiratoria que cursan con tos seca o irritativa, como la laringitis (irritación de garganta) o la tos ferina. El orégano tiene también acción expectorante, béquica y antitusígena, tanto en uso interno como externo. Dolores musculares, tortícolis y lumbago, aplicado externamente tanto en cataplasmas como en fricciones sobre la piel. Modo de empleo: Las infusiones o también llamadas, tisanas, se preparan con una cucharadita por taza de hojas y flores secas trituradas. Infundir diez minutos.

Tres tazas al día, antes o después de las comidas. Distribución: Nuevo León. (Real de catorce y de Marea de Juárez) Análisis Fitoquímico: Toda la planta es rica en un aceite esencial que contiene timol y carvacrol, de acción sedante, antiespasmódica y carminativa. Contiene asimismo flavonoides y ácido ursólico, a los que se atribuyen sus propiedades antirreumáticas (Linares et al., 1999).

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Nombre científico: Persea americana Mill. Nombre común: Aguacate Familia: Lauraceae Uso: Dolor de estómago. Otros Usos: Se recomienda para el tratamiento de la diarrea y lombrices Modo de empleo: Se prepara como Té. Distribución: Se cultiva en diversas regiones tropicales y subtropicales del país. Dentro del Estado de México, San Luis Potosí, Veracruz, Puebla, Tabasco, Campeche, Quintana Roo, Guerrero, Michoacán, Colima, Jalisco y Chiapas. Análisis Fitoquímico: El estudio químico del aguacate ha estado dirigido fundamentalmente hacia el fruto, en vista de su valor alimenticio. La pulpa es rica en ácidos grasos tales como: oléico, linoléico, palmitito, esteárico, linolénico, palmitoleícoy mirístico, que forman el 80% del contenido graso del fruto. Otros compuestos presentes en el fruto son el escualeno y un grupo numeroso de

hidrocarburos alifáticos saturados, un poliol no saturado, así como otros alcoholes alifáticos y terpénicos. Respecto a los aminoácidos existentes en la pulpa, se tienen: el ácido aspártico y el glutámico, acompañados de leucina, valina y lisina, además de cantidades considerables de GABA. Dentro de las vitaminas que se encuentran en los extractos están: vitamina A, D, niacina, tiamina, riboflavina y ácido ascórbico. Se ha demostrado en el fruto la existencia en cantidades importantes del ácido γ-aminobutírico y de glucósidos. El aceite extraído de la pulpa contiene un 10% de compuestos insatuponificables como esteroles: β-sitosterol, estigmasterol, camprestrol, α-5-avenasterol y ácidos volátiles. Por ultimo, contenido de sales minerales: fósforo y hierro.Las semillas contienen una amplia variedad de componentes, incluidos ácidos grasos, alcoholes y un número de compuestos insaturados con un sabor muy amargo. La protocianidina, la camitina y un alto contenido de carotenoides en la semilla. El aceite de la semilla es abundante en tocoferol.Las hojas de este árbol contiene primordialmente un aceite escencial amarillo-verdoso compuesto de estragol, pireno, cíñelo, acetol, transanetol, alcanfor y trazas de ácido enántico, gammametilionona, β-pineno y limoneno. Los extractos acuosos basándose en hojas de aguacate, ademas de su alto contenido en aceite esencial, poseen dopamina y serotonina, flavonoides derivados del quercetol, perseita, persiteol y un principio amargo llamado abacatina (Márquez et al., 1999; Hall et al., 2002).

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Nombre científico: Hibiscus sabdariffa L. Nombre común: Rosa de Jamaica, flor de Jamaica Familia: Malvaceae Uso: Alivia el dolor de estomago Otros usos: Cura la mala circulación, ayuda a expulsar los aires cuando se ha comido demasiado. Baja las fiebres por catarro Modo de empleo: Se hierve durante 4 minutos una cucharada de cálices en una tasa de agua. Tapar, dejar entibiar y colar. Distribución: Originaria de África, Guerrero, Oaxaca, Colima y Campeche Análisis Fitoquímico: El análisis fitoquímico de la jamaica ha revelado la presencia en ella de ciertas sustancias naturales que se encuentran en las plantas y en la mayoría de aceites vegetales llamadas fitosteroles, además de flavonoides, saponinas y otros glucósidos, además de carbohidratos, ácido ascórbico y una mezcla de ácido cítrico y málico.

La jamaica contiene dos pigmentos coloridos: la hibiscina y la gosipitina, que se usan como base natural de jarabes y licores coloridos. Se han identificado los pigmentos extraídos de las flores, como la hibiscina, gosipetrina, quercetina, mirecetina, hibiscetina, hibiscetrina y sabedaretina. Los principales pigmentos de esta planta son las antocianinas: la cianidina-3-glucósido y la delfinidina- 3-glucósido, que tienen propiedades antioxidantes y que no presentan actividad tóxica ni mutagénica. Se ha demostrado que los compuestos fenólicos como el ácido procatecuíco, aislado de las flores de esta planta tienen fuertes propiedades antioxidantes, mientras que el ácido hibiscus manifiesta una elevada actividad inhibitoria sobre ciertas enzimas pancreáticas (Márquez et al., 1999).

Nombre científico: Cymbopogon citratus (DC.) Staff. Nombre común: Te de limón o hierba de limón. Familia: Poaceae Uso: Para el dolor de estómago Modo de empleo: Para aliviar el dolor de estómago se hierve unas hojas de té limón en agua y el hervido se azucara y bebe. También puede masajear el estómago y ponerse plantias con las hojas calientitas del hervido junto con el aceite y las hojas de epazote. Distribución: El Centro de origen de esta especie es el Sureste Asiático y al igual que el resto de las especies del género Cymbopogon, está distribuida en las regiones tropicales y subtropicales. India y otras regiones de Asia suroriental. Análisis Fitoquímico: El componente principal de esta planta es el citral. Las investigaciones sobre la caracterización química de esta especie han permitido aislar, a partir de las partes aéreas de la planta, sustancias no volátiles entre las cuales se pueden mencionar

flavonoides, ácido caféico, fructosa y sacarosa. Entre los constituyentes volátiles del aceite esencial de dicha planta se encuentran terpenos como geraniol y citronenol (Roig, 2002).

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Nombre científico: Ruta chalepensis L. Nombre común: Ruda Familia: Rutaceae Uso: Dolor de estómago. Otros Usos: Para tratar enfermedades de la piel, fertilidad, dolor de cabeza, oidos, y músculos; diarreas, mal de ojo, espanto, flautulencias, daño, brujería, regular la regla, dolor de menstruación y baños para parturientas. Modo de empleo: Se pone una ramita de ruda mezclada con 5 hojas de aguacate en 1 litro de agua, se ponen a hervir, después se deja entibiar y ya se puede tomar una taza las veces que sea necesario durante el día. Distribución: Chihuahua, Guerrero, Michoacán y Oaxaca Análisis Fitoquímico: El principal componente que se extrae de esta planta es un glucósido llamado rutina que se encuentra sobre todo en las hojas. También se extrae una esencia incolora o ligeramente amarilla, de olor intenso y sumamente desagradable. Las virtudes de esta planta derivan principalmente de la acción de la rutina, que es

capaz de aumentar la resistencia de los capilares sanguíneos, evitando su rotura y las consiguientes hemorragias que podrían aparecer. También es una planta muy rica en vitamina C, pero más que para combatir el escorbuto se utiliza para prevenir aquellos casos en los que hace falta reforzar los vasos capilares. La esencia tiene una acción emenagoga, es decir, aceleradora de la menstruación, pudiendo llegar a ser abortiva, ya que se ejerce una potente acción sobre el útero. Es una esencia muy tóxica que hay que manejar con sumo cuidado, pues en caso de intoxicación pueden aparecer hemorragias, confusión mental, problemas digestivos e incluso puede sobrevenir la muerte si la dosis es excesiva. (Márquez et al, 1999).

Nombre científico: Lippia graveolens f. berlandieri. Nombre común: Orégano Familia: Verbenaceae Uso: Gastritis y úlcera. Otros Usos: Como condimento, en la fabricación de cosméticos, fármacos, licores, etc. Modo de empleo: La preparación va a depender del efecto que se desea. Por lo general se hacen infusiones, cocciones u otras aplicaciones. Distribución: Chihuahua Análisis Fitoquímico: A pesar que los aceites esenciales de L. graveolens han sido analizados en múltiples ocasiones, sólo existen estudios de los compuestos más polares de la planta

y dichos estudios no son integrales,

por tal motivo la composición química de la especie sigue siendo incierta. Se ha descrito la presencia de iridoides y de algunos flavonoides en la planta. Los flavonoides identificados son: pinocembrina, galangina, 3-O-metilgalangina, sakuranetina y dihidrogalangina ó

pinobankasina. Los dos primeros poseen actividad antibacteriana,

mientras que la 3-O-metilgalangina actúa como inhibidor de la lipasa pancreática (Domínguez et al., 1989).

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Nombre científico: Verbena carolina L. Nombre común: Verbena, San Antón Familia: Verbenaceae Uso: Para el estómago. Otros Usos: Para dolor de cabeza y fiebre. Modo de empleo: Para el dolor de estómago se usa el cocimiento de esta planta y se toma como remedio. A los niños con el estómago inflamado se les ponen sobre el estómago las hojas refregadas en agua, para que suba lo caliente. Distribución: Chihuahua: Batopilas. Durango: Canelas Guerrero: Buenavista de Cuellar, Iguala de la independencia, Pilcaya. Oaxaca: Mpio. San Pablo Macuiltianguis. Dto. Mixe, Mpio. Totontepec. Análisis Fitoquímico: Contiene glucosidos, verbenolina y verbenita, taninos, aceite esencial, mucílago, saponina y sales minerales (Sussaeta, 1988).

Nombre científico: Larrea tridentata Nombre común: Gobernadora, Falsa alcaparra, hediondilla, huamis. Familia: Zygophyllaceae Uso: Disturbios gástricos. Otros Usos: Para curar reumas, contra la disuria erosiones y heridas de la piel. También se dice que el cocimiento disuelve los cálculos renales y vesiculares. Se le atribuyen propiedades contra los disturbios gástricos y las enfermedades venéreas Modo de empleo: En infusión. Distribución: Chihuahua y Durango. Análisis Fitoquímico: Las hojas contienen flavonoides, triterpenos y lignanos, especialmente el ácido nordihidroguayarético (NDGA), que puede llegar al 40-50% de la resina que recubre la hoja. El principal lignano de la gobernadora, conocido como

ácido nordihidroguaiarético (ANDG) es un potente antioxidante y se pensó que podía ser un tratamiento contra el cáncer. En estudios en ratas, se observó que el ANDG y un extracto de las hojas de una subespecie sudamericana de gobernadora tenían un efecto antitumoral, pero este efecto no se observó en los estudios en humanos. La posible utilidad de la gobernadora como tratamiento para el cáncer no se ha demostrado en humanos. También se han descrito propiedades anti inflamatorias y efectos antimicrobianos en estudios in vitro de la gobernadora (Lira et al., 2003).

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6. CONCLUSIONES

En este trabajo se decidió analizar la actividad anti-H. pylori de extractos polares (acuoso y metanólico) debido a que el modo de preparación tradicional reportado para las plantas utilizadas, es a base de agua. Se examinó el efecto de dichos extractos sobre el crecimiento de H. pylori bajo dos sistemas experimentales: dilución en agar y cultivo líquido. Respecto a este último punto, hay que estar conscientes de que los resultados obtenidos en cada método pueden variar, ya que la actividad encontrada va a depender de varios factores como son las sustancias que se extraen con cada sistema de extracción, las características químicas de los compuestos activos y de su concentración, de la presencia de efectos sinérgicos así como de las condiciones experimentales que pueden favorecer determinado modo de acción.

Por otra parte y con el objetivo de utilizar un método comparativo para el cálculo de la actividad mínima inhibitoria (MIC) se tomaron en cuenta las recomendaciones hechas por la NCCLS para el método de dilución en agar. Estas consideraciones han empezado a ser aplicadas en estudios a nivel de extractos en los últimos años, sin embargo, aún no se puede hacer comparaciones adecuadas. También, cabe señalar, que la NCCLS solo hace mención del cálculo para compuestos puros y en ningún momento hace referencia de su uso para extractos de plantas. Por la experiencia en el laboratorio se decidió analizar bajo este método únicamente los extractos acuosos, ya que nos hemos percatado que solo es útil para el análisis de actividad de compuestos polares y no para algunos extractos metanólicos.

Para el caso del extracto metanólico, no todos los compuestos que se extraen son solubles en agua, esto se comprueba por la presencia de precipitados en las cajas de agar, así como por el análisis de los compuestos por cromatografía en capa fina (datos no publicados del laboratorio). Por otro lado, resultados previos del laboratorio, han mostrado que el uso de cultivos líquidos permite analizar la actividad de compuestos poco polares, razón por la cual se decidió probar los extractos metanólicos en este sistema.

Hasta la fecha aún no podemos definir cual o cuales son los métodos y condiciones por lo cuales se logre determinar confiablemente la efectividad de extractos de plantas anti-H. pylori in vitro. Sin embargo, creemos que si nos basamos en el criterio de selección etnobotánico, la metodología antes planteada es la más adecuada. Con el uso de estos dos métodos y bajo sus condiciones experimentales, creemos se pueden obtener mejores y más confiables resultados sobre la posible actividad anti-H. pylori de estas plantas.

Como conclusiones de este trabajo podemos mencionar:

1. Solo 9 plantas de 20 (45% del total) muestran un resultado positivo en ambos

métodos, indicando que este trabajo es significativo para diferenciar actividad anti-H. pylori.

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2. El método del extracto acuoso es “menos efectivo” tanto en cantidad de plantas como en actividad y esto es muy similar a los demás artículos reportados en la tabla IX. En este método se presentaron 9 plantas activas de 20 (45%), solamente 4 (20%) mostraron un MIC de 1000 µg/ml y solo 5 plantas (25%) tuvieron un MIC mas bajo de 500 µg/ml.

3. En el método del extracto metanolico es “mas efectivo” ya que se observó un mayor número de plantas con actividad inhibitoria. En el extracto metanólico se presentaron 17 plantas activas de 20 (85%) de las cuales 2 (10%) tienen una actividad buena, 10 (50%) tiene una actividad moderada y 5 (25%) muestran una actividad baja.

4. En caso de caso de Haplopappus spinulosus (Push) DC, se encontraron diferencias entre en el MIC de A (125 µg/ml) respecto a la denominada B (31.2 µg/ml), por lo que los datos sugieren que podría haber diferencias relacionadas al tipo de región donde se cultivaron, aunque esto solo se reflejo en el metodo metanólico.

5. Los estudios de plantas medicinales con potencial anti-H. pylori, como el desarrollado en esta Tesis, son importantes para la búsqueda de nuevos compuestos que permitan ya sea controlar o eliminen a la bacteria eficientemente y que no provoquen efectos secundarios, así también se podría dar un paso importante a la creación de nuevos tratamientos enfocados al control de la bacteria, para todos aquellos casos en la cual demuestren que no debe eliminarse sino que debe tener un control.

6. Se propone el uso de dos métodos para la determinación de la actividad anti-H. pylori de extractos de plantas in vitro con el objetivo de hacer mas confiable el estudio.

7. Las terapias de erradicación que actualmente se utilizan causan diversos efectos secundarios, pero estos se puede reducir o evitar mediante el uso de una terapia basada en plantas medicinales.

8. Es necesaria la comprobación de la actividad anti-H. pylori de las plantas mediante estudios in vivo.

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