PCR en infecciones por EBV 11

trabajos originales

TAMIZAJE DE INFECCIONES POR VIRUS EPSTEIN BARR EN MUESTRAS DE SANGRE MEDIANTE EL USO DE UNA PCR EN TIEMPO REAL PREVIO A LA CUANTIFICACION DE LA CARGA VIRAL

Bioqs. M. E. Venuta1, E. Rosales1, D. Viale1, D. Borgnia1, L. Irazu2, M. Rodríguez2, C. Hernández3

1 Servicio de Microbiología. Hospital de Pediatría Dr. Juan P. Garrahan.2 Departamento de Parasitología. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán.3 Jefa del Servicio de Microbiología.Hospital de Pediatría Dr. Juan P. Garrahan.Recicido: 10/12/14 — Aceptado: 11/02/15Correspondencia: María Elena Venuta – mevenuta@yahoo.com.arPichincha 1850, CABA (1245), Argentina.

RESUMENEl desorden linfoproliferativo postrasplante es una de las complicaciones más importantes producidas por el virus Epstein Barr (EBV) en pacientes trasplantados de órganos sólidos y de médula ósea ya que afecta la sobrevida del paciente y del injerto. En estos pacientes se han reportado altos niveles de carga viral en sangre periférica que preceden al desarrollo del desorden linfoproliferativo postrasplante. Por esto el monitoreo de la carga viral (CV) permite detectar pacientes en riesgo a desarrollar esta patología para iniciar una terapia preventiva. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una técnica de PCR en tiempo real cualitativa (RT PCR) que permitiera ser utilizada como prueba de tamizaje previo a la determinación de CV EBV. De esta manera se podrían minimizar el costo que implicaría la utilización de un método cuantitativo comercial para todas las muestras que ingresaran al monitoreo viral. Teniendo en cuenta el desempeño de la RT PCR desarrollada, se estableció Ct ≤ 37 como valor límite para evitar amplificación inespecífica y seleccionar las muestras candidatas a la determinación de CV EBV. Dicho punto de corte presentó una sensibilidad diagnóstica relativa de 80%, una especificidad diagnóstica relativa de 85%, un valor predictivo positivo (VPP) de 53% y un valor predictivo negativo (VPN) de 95%. Para ello se consideró que valores de CV EBV< 4000 copias/ml sangre eran bajas o no presentaban riesgo de desarrollar complicaciones. El límite de detección LoD 95% fue de 280 copias de EBV/ml sangre (66 – 1184, IC 95%). Esta técnica demostró tener una buena performance analítica, ser de fácil implementación y el punto de corte seleccionado nos permitió realizar un buen tamizaje de muestras de pacientes trasplantados que resultaban ser candidatas a la determinación de CV, con la consiguiente disminución de costos

Palabras clave: virus Epstein Barr, carga viral, PCR en tiempo real.

Medicina Infantil 2015; XXII: 11 - 15.

ABSTRACTPost-transplant lymphoproliferative disorder is one of the main complications caused by the Epstein Barr virus (EBV) in solid-organ and bone-marrow transplantation patients affecting sur-vival of both the patient and the graft. High levels of viral load (VL) in peripheral blood preceding the development of post-transplant lymphoproliferative disorder have been reported in these patients. Therefore, VL monitoring allows detection of patients who are at risk of developing this disease to start preventive treatment. The aim of this study was to develop a qualitative real-time PCR technique to use as an early scree-ning test to determine EBV VL. This test may minimize costs related to the use of a commercial quantitative method for all the samples that enter for viral screening. Considering the performance of the RT PCR method developed, a Ct ≤ 37 was established as the cut-off limit to avoid unspecific ampli-fication and select the samples that are candidates for EBV VL determination. This cut-off point had a relative diagnostic sensitivity of 80%, a relative diagnostic specificity of 85%, a po-sitive predictive value (PPV) of 53% and a negative predictive value (NPV) of 95%. Thus, an EBV VL< 4000 copies/ml blood was considered to be low and not to be a risk for developing complications. The 95% limit of detection was 280 copies of EBV/ml blood (66–1184, 95%CI). The technique showed to be of good analytical performance and easy implementation. The cut-off point allowed a good screening of the samples of transplanted patients to detect those who are candidates for VL determination at a lower cost.

Key words: Epstein Barr virus, viral load, real-time PCR.

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INTRodUCCIoNEl virus de Epstein Barr (EBV) es un Herpesvirus

ampliamente diseminado en la población humana. Es el agente causal de la mononucleosis infecciosa y está asociado con enfermedades benignas y ma-lignas. Estas últimas ocurren especialmente en indi-

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viduos inmunocomprometidos e incluyen: desorden linfoproliferativo postransplante (PTLD), linfoma de Burkitt, enfermedad de Hodgkin, carcinoma nasofa-ríngeo, carcinoma gástrico, carcinoma hepatocelular, etc1,2.

Algunas enfermedades malignas por EBV pueden ocurrir en el sistema nervioso central, especialmente en pacientes HIV positivos. También se lo ha mencio-nado como que podría contribuir a la patobiología de la esclerosis múltiple en niños3.

El desorden linfoproliferativo postransplante es una de las complicaciones más importantes en pa-cientes trasplantados de órganos sólidos y de médula ósea, ya que afecta la sobrevida del paciente y del injerto e involucra un amplio rango de estadios de enfermedad con diferentes presentaciones clínicas y pronóstico4,5.

Numerosos autores han reportado altos niveles de carga viral (CV) de EBV en sangre periférica de pacientes trasplantados con PTLD, comparados con aquellos presentes en portadores sanos o subclínicos (infección reactivada). Además, se ha observado que estos niveles elevados de CV preceden al desarrollo del PTLD. Así, el monitoreo de los niveles de ADN viral en sangre permite detectar pacientes en riesgo de desarrollar esta patología para iniciar una terapia preventiva y evaluar la respuesta terapéutica6,7,8.

En este punto, la reacción en cadena de la polime-rasa en tiempo real (RT-PCR) ha constituido un paso crucial, tanto para el diagnóstico de múltiples infeccio-nes virales como en el monitoreo de la respuesta te-rapéutica, especialmente cuando se investigan infec-ciones por patógenos latentes como los Herpesvirus en pacientes trasplantados.

Si bien para estas situaciones clínicas es crucial la cuantificación del ADN de EBV, el ensayo cualitativo podría reducir el número de muestras evaluables por CV con la consiguiente disminución de costos.

El objetivo del presente trabajo fue desarrollar una técnica de PCR en tiempo real para el diagnóstico de infección por EBV en sangre entera de pacientes trasplantados de órganos sólidos (TOS) y de médula ósea (TMO), y utilizarla como prueba de tamizaje du-rante el curso de monitoreo postrasplante, previo a la determinación de la CV.

MATERIALES Y METodoSPara el desarrollo del diagnóstico molecular se

decidió emplear un método de PCR en tiempo real cualitativa, con iniciadores dirigidos a secuencias conservadas del gen BALF5 que codifica para la DNA polimerasa viral de EBV, de acuerdo a un trabajo pu-blicado por Kimura y col9.

Extracción de ácidos nucleicosEl ADN utilizado en esta técnica se obtuvo em-

pleando el método comercial de QIAGEN Inc. (QIA-amp DNA Mini Kit, Tecnolab) realizando el protocolo

de purificación de sangre y fluidos corporales para muestras de sangre (recogidas con EDTA como an-ticoagulante), según las instrucciones del fabricante. El extracto de ADN puro (100 µl) se conservó a -20ºC hasta la realización del ensayo.

PCR multiplex cualitativa en tiempo realEl ensayo se realizó utilizando un equipo de PCR

en Tiempo Real ABI PRIS TM7500 de Applied Biosys-tems, con detección simultánea para dos fluoróforos diferentes (FAM para la secuencia blanco y VIC para β-globina utilizada como control interno, para deter-minar la calidad de las muestras y descartar presen-cia de inhibidores.

En la reacción de RT-PCR, los procesos de am-plificación y detección se producen de manera simul-tánea en el mismo tubo de reacción sin necesidad de manipulación posterior, minimizando el riesgo de con-taminaciones. Este método se basa en que la unión de las sondas específicas a los productos de PCR genera fluorescencia, la cual es detectada por el sis-tema óptico del equipo y monitorizada conforme pro-gresa la amplificación. La cantidad de fluorescencia generada en cada ciclo es proporcional a la cantidad de producto de amplificación sintetizado. El ciclo de amplificación, en el cual la fluorescencia generada en la reacción cruza una línea de base (threshold line) es llamada threshold cycle o valor de Ct.

La química fluorescente empleada en esta técnica se produce a través de sondas específicas TaqMan o de hidrólisis, marcada en el extremo 5’con un fluoro-cromo donador (FAM) y un fluorocromo aceptor (TA-MRA) en el extremo 3’.

En la Tabla 1 se detallan la secuencias de iniciado-res (primers) y sondas fluorescentes empleados para amplificar el gen BALF5 de EBV y el de la β-globina.

Para poner a punto la técnica se empleó un pool de extractos de ADN provenientes de muestras de sangre que presentaban un alto número de copias para EBV, ensayadas previamente por un equipo co-mercial cuantitativo Alert Q-PCR EBV Nanogen Ad-vanced Diagnostic SRL. Se determinó por triplicado la carga viral del pool y de este modo se pudo conocer el número de copias inicial. Luego se procedió a rea-lizar seis diluciones seriadas al décimo para construir una curva y así evaluar la eficiencia de la reacción (pendiente de la curva) y la distribución lineal (coefi-ciente de regresión r). Cada dilución se analizó por triplicado en forma simple y posteriormente en forma múltiple con β-globina.

Luego de varios ensayos, se optimizó la reacción de PCR en las siguientes condiciones: 2x Taqman Universal PCR Master Mix (con dUTP y AmpErase UNG, ROX como referencia pasiva de fluorescencia) de Applied Biosystems, con concentraciones finales de primers y probe para EBV de 900 nM y 250 nM respectivamente, mientras que para β-globina se em-plearon 50 nM y 100 nM de primers y probe respec-

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tivamente. La PCR fue realizada en un volumen final de reacción de 25 µl en un ABI PRISM 7500 AB con 5 µl de ADN como templado, bajo condiciones de ci-clado universal: 2 min a 50ºC (para la degradación de amplicones contaminantes potencialmente pre-sentes, que contenían dUTP), 10 min a 95ºC (para la inactivación de la uracil N’- glicosilasa o UNG y activa-ción de la AmpliTaq Gold DNA polimerasa) y 45 ciclos de 15 seg a 95ºC y 1 min a 60ºC (para la amplificación de la secuencia blanco específica).

Para validar el ensayo, la muestra debió arrojar un Ct ≤ 35 para el gen β-globina.

Posteriormente se compararon 116 muestras de sangre, a las que se les realizó en forma paralela, el ensayo de RT PCR EBV cualitativo aquí desarrollado y el ensayo de carga viral con la plataforma comercial Alert Q- PCR EBV de Nanogen Advanced Diagnostics S.R.L, con el fin de establecer un valor de corte, que permitiera determinar a qué muestras de sangre se le debería realizar la determinación de carga viral. Este último método es el que se utiliza de rutina para la determinación de CV de EBV en el hospital, con una sensibilidad de 10 copias EBV/tubo de reacción o su equivalente a 1000 copias EBV/ml sangre entera.

Tratamiento estadísticoPara estimar el grado de correlación entre los Ct

de la RT-PCR EBV cualitativa desarrollada y el ensa-yo cuantitativo comercial, se utilizó el coeficiente de correlación lineal de Pearson. Se estimaron los pa-rámetros diagnósticos: sensibilidad diagnóstica relati-va, especificidad diagnóstica relativa, valor predictivo positivo (VVP) y valor predictivo negativo (VPN) para un intervalo de confianza del 95% e índice de con-cordancia kappa de acuerdo a CLSI/NCCLS 200810, considerándose método de referencia el método co-mercial CV EBV. Para la estimación de la concordan-cia entre los métodos se utilizó el Test de Mc Nemars con una significación del 95%. La estimación de LoD 95% se realizó de acuerdo a Wilrich et al11.

RESULTAdoSPara verificar el rango lineal y conocer el límite de

detección del ensayo se realizaron seis diluciones se-

riadas al décimo del pool. Como en las tres últimas di-luciones no replicó el Ct o no hubo detección de ADN de EBV, se procedió a realizar seis diluciones seria-das al medio luego del último punto en que se detectó ADN de EBV con valores similares de Ct (Tabla 2). To-das las diluciones se analizaron por triplicado en las condiciones descritas anteriormente y se determinó como límite de detección, a la última dilución con la que se obtenía amplificación en todos los replicados y con Ct similar.

Posteriormente se confeccionó una curva están-dar o patrón, graficando los Ct promedio de las distin-tas diluciones (eje y) en función del log 10 del núme-ro de copias de EBV/ml sangre (eje x) (Figura 1). Se observó que el ensayo poseía una fuerte correlación lineal (r2= 0,9986) a lo largo de cinco magnitudes de concentración, con una eficiencia cercana al 100% (pendiente = -3,23). En base a los resultados obte-nidos, el límite de detección del ensayo resultó ser de 1000 copias EBV/ml sangre con un Ct de 36,6.

Gen Primer / sonda Secuencia de primer 5´— 3´

BALF 5 EBV Fw CGGAAGCCCTCTGGACTTC

EBV Rv CCCTGTTTATCCGATGGAATG

EBV P* FAM –TGTACACGCACGAGAAATGCGCC - TAMRA

β-globina βglob Fw GGCAACCCTAAGGTGAAGGC

βglob Rv GGTGAGCCAGGCCATCACTA

βglob P* VIC – CATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCT - TAMRA

TABLA 1: SECUENCIAS DE INICIADORES (PRIMERS) Y SONDAS (PROBES) PARA LOS BLANCOS DE DETECCION (EBV Y β-GLOBINA).

Nº copias EBV/ml sangre Log10 CV EBV Ct promedio

400.000 5,6 28,2

40.000 4,6 31,3

4.000 3,6 35,1

400 2,6 ----

40 1,6 ----

4 0,6 ----

4.000 3,6 34,4

2.000 3,3 35,7

1.000 3,0 36,6

500 2,7 ----

250 2,4 ----

125 2,1 ----

TABLA 2: VALORES DE CT PROMEDIO PARA LAS DIFEREN-TES DILUCIONES REALIZADAS DEL POOL.

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El LOD 95% fue de 280 copias EBV /ml sangre (66 - 1184 IC 95%).

Para alcanzar los objetivos del presente trabajo, se decidió evaluar cuál sería el valor de Ct de la reac-ción desarrollada para diferenciar las muestras clíni-cas positivas de aquellas en las que EBV no resultaba detectable y además determinar a qué muestras de sangre se les realizaría la determinación de CV.

Para ello se graficaron los Ct obtenidos a partir de las 116 muestras analizadas en paralelo con cada uno de los ensayos (RT-PCR cualitativa desarrollada y la plataforma comercial cuantitativa de Nanogen) (Figura 2) y se observó que existía una moderada co-rrelación entre ambos valores (coeficiente de correla-ción de Pearson: 0,74162687) a pesar de que ambos métodos utilizan secuencias blanco diferentes para la detección de EBV (gen BALF 5 para el ensayo cua-litativo y gen EBNA-1 para el ensayo cuantitativo co-mercial). El índice de concordancia kappa resultó ser de κ 0,55 por lo que ambos métodos presentaron una moderada concordancia estadística. El test de de Mc Nemar con una significación del 95% (Z=2,42) indicó que no hay diferencia estadísticamente significativa entre los métodos comparados.

Para establecer el punto de corte o valor de Ct que discrimine entre muestras positivas de las no detec-tables, se agruparon las 116 muestras de sangre en cuatro grupos de acuerdo al Ct de la reacción: A (Ct ≤ 37), B (37 < Ct ≤ 38), C (38 < Ct < 39) y D (Ct ≥ 39). Teniendo en cuenta lo publicado por diversos auto-res que establecieron una carga viral > 1000 copias/ml sangre para considerar una reactivación de EBV, se las clasificó en dos grupos de acuerdo al nivel de carga viral de EBV: < 1000 y > 1000 copias EBV/ml sangre. (Figura 3, Tabla de la Figura 3).

En la Tabla de la Figura 3 se puede observar que de un total de 116 muestras de sangre analizadas, 20 presentaban carga viral de EBV > 1000 copias/ml sangre y 96 un valor de carga viral < 1000 copias/ml sangre. Por otra parte, 16 de las 20 muestras con carga viral > 1000 copias/ml sangre, presentaban un valor de Ct ≤ 37 y 82 de las 96 muestras con carga viral < 1000 copias/ml sangre, presentaban valores de Ct > 37. Sólo 4 de 20 muestras superaban una carga viral > 1000 copias EBV/ml sangre con valores de Ct > 37 (2 del grupo B, 1 del grupo C y 1 del grupo D) con valores de carga viral ≤ 3000 copias EBV/ml sangre (Figura 3).

Teniendo en cuenta el desempeño del ensayo, junto con los datos observados en la tabla de la fi-gura 3, se estableció como punto de corte un valor de Ct ≤ 37 como valor límite para evitar la amplifica-ción inespecífica y seleccionar las muestras candida-tas a la realización de carga viral para EBV. Dicho punto de corte presenta una sensibilidad diagnóstica relativa del 80% (IC 95% 58- 92), una especificidad diagnóstica relativa del 85% (IC95% 77- 91), un valor predictivo positivo (VVP) de 53% y un valor predictivo negativo (VPN) de 95%.

dISCUSIoN Y CoNCLUSIoNESSi bien no existe un valor de corte absoluto que

pueda predecir con precisión aquellos pacientes que van a desarrollar desorden linfoproliferativo postras-plante, hay consenso que el monitoreo individual de

Curva EBV Cualitativa Multiplex

y = 3,2342x + 46,242R2 + 0,9986

05

10152025303540

0 1 2 3 4 5 6Log CV EBV

Ct

Figura 1: Curva estándar de la PCR cualitativa para EBV. En el eje y: Ct promedio de las diluciones del pool. En eje x: log10 número de copias EBV/ml sangre.

CV EBV Log CV Ct medio

400000 5,6 28,2

40000 4,6 31,3

4000 3,6 34,4

2000 3,3 35,7

1000 3 36,6

Figura 2: Correlación de la PCR en tiempo real cualitativa con la determinación de la carga viral. Coeficiente de correlación de Pearson: 0,74162687.

Correlación Ct Cuali vs Ct CV EBV

05

101520253035404550

0 10 20 30 40 50CV Cualitativa

CT

CV

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PCR en infecciones por EBV 15

la cinética viral en pacientes de riesgo de desarrollar complicaciones es la mejor herramienta para una in-tervención terapéutica temprana y así poder disminuir la incidencia y la mortalidad (10-20%).

La técnica de PCR cualitativa en tiempo real desa-rrollada para EBV, demostró ser rápida, de fácil imple-mentación y tener una buena performance analítica con un LoD 95% de 280 copias /ml (IC 95% 66 -1184) y con una moderada concordancia estadística con el ensayo cuantitativo comercial (κ = 0,55; Z =2,42)

La experiencia clínica desarrollada en el hospi-tal, en concordancia con lo publicado por diversos autores nacionales e internacionales8,12,13,14, permite considerar que valores de carga viral de EBV< 4000 copias/ml sangre son bajos o no indican riesgo de de-sarrollar complicaciones. Por ello consideramos que el punto de corte seleccionado (Ct ≤ 37) nos permi-te realizar un buen tamizaje (S 80%, VPN 95%) de muestras candidatas a la determinación de la carga viral para EBV. Esto determina una consiguiente dis-minución de costos por tratarse de una plataforma comercial, sobre todo para aquellas muestras monito-rizadas rutinariamente como sucede con la población trasplantada.

A partir de su implementación en nuestro hospital, la monitorización de los pacientes trasplantados cum-ple el siguiente algoritmo:- Pacientes monitorizados con antecedentes de CV

EBV positiva, se controlan directamente con el método cuantitativo comercial hasta la negativiza-ción de su carga viral

- Pacientes trasplantados nuevos o con anteceden-tes de CV EBV negativa, se controlan con la RT-PCR cualitativa desarrollada. Si el resultado de la misma detecta la presencia de EBV, se procede a la cuantificación de la carga viral por el método comercial. De lo contrario, si el resultado detecta ausencia de EBV en sangre, se sigue el monitoreo del paciente con la RT-PCR cualitativa.Además, esta técnica podría emplearse para el

diagnóstico cualitativo de infección por EBV en dife-

rentes muestras clínicas pediátricas, como por ejem-plo: biopsias de tejido, líquido cefalorraquídeo, mate-rial respiratorio, entre otros.

AgradecimientoLos autores agradecen al Dr. Horacio A. Lopardo (Con-

sultor Honorario del Servicio de Microbiología) por su inva-lorable aporte y colaboración en la revisión de este trabajo.

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Figura 3: Correlación entre Ct RT-PCR vs. log CV EBV. Están señalados en línea de puntos el valor de corte seleccionado (Ct ≤ 37) y 3 log10 CV EBV como marcador de reactivación viral.

CT cuali CV EBV Total

< 1000 > 1000

Ct ≤ 37 14 16 30

37 < Ct ≤ 38 23 2 (≤2200) 25

38 < Ct < 39 28 1 (< 2000) 29

Ct ≥ 39 31 1 (2300) 32

Total 96 20 116

Correlación entre Ct Cualitativa vs Log CV EBV

05

101520253035404550

0 1 2 3 4 5 6 7Log CV EVB

Ct C

ualit

ativ

a E

BV Multiplex

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