1

1 RESUMEN

Una revisión de la literatura indica que el cultivo organotípico de explantes de adrenal de

rata ha sido fundamentalmente usado para medir producción de glucocorticoides frente a

diferentes estímulos, sin abordar cambios de expresión génica frente a los mismos. En este

contexto, el presente trabajo se enfocó en el análisis de explantes de adrenal de rata incubados

hasta por 48 h, mediante técnicas histológicas básicas y la evaluación de extractos de proteínas y

RNA total. Se determinó que a lo largo del cultivo se presentaron sólo alteraciones citológicas

menores, con una mantención de la morfología inicial del cultivo. Las células esteroidogénicas de

la zona fasciculada conservaron su organización columnar, con citoplasma típicamente vacuolado

y núcleo de aspecto normal. Se midió el rendimiento de los extractos proteicos (a intervalos de 6

h, durante las 48 h de incubación), observándose una fuerte disminución con respecto a adrenales

ex vivo; pero con valores (µg proteína/mg tejido) que se mantuvieron prácticamente constantes

durante todo el período de cultivo. Mediante Western blot, se detectó ACTINA (proteína

constitutiva) y CLOCK (proteína reloj). Se obtuvieron extractos de RNA total a un tiempo fijo de

18 h de cultivo, donde también se observó una baja considerable en rendimiento con respecto a

muestras ex vivo; sin embargo, la vasta mayoría de las muestras de RNA total fue de buena

calidad, permitiendo amplificación eficiente del transcrito constitutivo -actina mediante PCR en

tiempo real. En base a estos resultados, se determinó que las condiciones de cultivo organotípico

de adrenal de rata estandarizadas en el presente trabajo, particularmente durante las primeras 24 h

de cultivo, permite monitorear la expresión de genes de interés, tanto a nivel de proteína como

mRNA, para estudiar potenciales reguladores de su expresión.

2

1.1 ABSTRACT

Published data indicate that tissue culture of rat adrenal explants has been primarily used

to ascertain glucocorticoids production under different treatments, without assessing its influence

on gene expression. In this context, the present work focused in the analyses of rat adrenal

explants incubated up to 48 h, by means of cytological techniques as well as evaluation of protein

and total RNA samples. We determined that only minor cellular changes along tissue culture

were apparent; i.e., overall morphology was maintained throughout the incubation. Thus,

steroidogenic cells from the fasciculata layer displayed a columnar arrange, characteristically

containing vacuoles in their cytoplasm and nuclei of normal appearance. The yield of protein

extracts was assessed (µg protein/mg tissue every 6 h, up to 48 h of incubation), which displayed

a strong decrease as compared to ex vivo samples; but with values keeping fairly constant during

all the incubation period. Both, ACTIN (housekeeping protein) and CLOCK (clock protein) were

detected by means of immunoblotting. Total RNA extracts were obtained (after 18 h of

incubation), which also displayed decreased yield values as compared to ex vivo samples;

however, the vast majority of these samples were of good quality. Indeed, the expression of the

housekeeping transcript -actin was readily detected by means of real-time PCR. Overall, these

results strongly suggest that the tissue culture conditions standardized hereby for the rat adrenal

(particularly during the first 24 h), are adequate to study transcription and translation changes in

response to putative regulatory signals.

3

2 INTRODUCCION

2.1 Antecedentes generales

Las glándulas adrenales son órganos endocrinos complejos que secretan

mineralocorticoides, glucocorticoides, andrógenos y catecolaminas. Anatómicamente son de

forma triangular aplanada y se encuentran en el polo superior/anterior de cada riñón, incluidas en

el tejido adiposo que las rodea. Están cubiertas por una cápsula de tejido conectivo que emite

tabiques hacia el interior de la glándula donde van lo vasos sanguíneos y nervios. El parénquima

de la glándula está compuesto de dos estratos altamente diferenciados: corteza y médula adrenal

(Ross et al, 2005).

Las células que conforman la corteza adrenal derivan del mesodermo, de esta manera

tienen características comunes con las células esteroidogénicas de las gónadas, también de origen

mesodérmico. En 1866, Arnold describió por primera vez la histología de la corteza adrenal y

notó que ésta se encuentra dividida en tres zonas concéntricas, las cuáles nombró como zona

glomerulosa, zona fasciculada y zona reticular (Ross et al, 2005). La zona glomerulosa

corresponde a la zona externa y constituye aproximadamente el 15% de la corteza, está

compuesta por una región delgada de células arregladas en islotes poco definidos, con un patrón

arqueado; esta zona produce mineralocorticoides, principalmente aldosterona, la cual es

responsable del aumento de la reabsorción de sodio y de la estimulación de la excreción de

potasio por el riñón y por lo mismo regula de manera indirecta el volumen del fluido extracelular.

La zona fasciculada o media constituye el 80% de la corteza y está compuesta por columnas

simples o dobles de células secretorias separadas por capilares prominentes. Estas células son

poliédricas y poseen muchas inclusiones intracelulares de lípidos; su producto de secreción son

4

glucocorticoides, principalmente cortisol (humanos, oveja, etc) y corticosterona (ratas y ratones),

que regulan el metabolismo de glucosa y ácidos grasos, preparan a los distintos sistemas para la

reacción lucha/huída propia de la respuesta al estrés y suprimen la respuesta inflamatoria. La

zona reticular o interna constituye sólo entre el 5-7% de la corteza y también está compuesta por

células poliédricas cuya organización es menos linear y mas cercana a nidos o aglomeraciones

celulares; éstas secretan andrógenos débiles como dehidroepiandosterona (forma sulfatada y no

sulfatada), precursores de la síntesis de estradiol y testosterona en la gónada (Rosol et al, 2001;

Rainey et al, 2004; Ross et al, 2005).

En contraste con el origen mesodérmico de la corteza, las células de la médula adrenal

derivan de la cresta neural. Las células medulares secretorias son llamadas células cromafines

debido a la formación de polímeros coloreados de catecolaminas después de ser expuestas a

agentes oxidantes, como el cromato. Las células medulares secretan epinefrina o norepinefrina

dentro de la sangre en respuesta a la acetilcolina o el ión calcio (Rosol et al, 2001).

En la mayoría de las especies, la concentración plasmática de glucocorticoides muestra un

marcado ritmo circadiano. La fase de este ritmo es opuesta en animales nocturnos y diurnos. En

la rata, un mamífero nocturno, el máximo de corticosterona plasmática (el principal

glucocorticoide en esta especie) se encuentra al comienzo de la noche, coincidiendo con el inicio

de las horas de actividad (Orth y Kovacs, 1998). Es un hecho bien establecido que la producción

de glucocorticoides involucra la acción concertada del ritmo circadiano de la hormona

hipofisiaria adrenocorticotrópica (ACTH), inervación adrenal y factores adrenales locales

(Dallman et al, 1978; Bornstein y Chrousos, 1999; Engeland y Arnhold, 2005). Sin embargo,

existe nueva evidencia que sugiere la participación de factores reguladores adicionales tales como

la capacidad oscilatoria intrínseca de la glándula adrenal como un reloj periférico (Ishida et al,

5

2005; Lemos et al, 2006; Oster et al, 2006; Torres-Farfan et al, 2006a; Watanabe et al, 2006;

Abarzúa, 2007), y la neurohormona melatonina (Torres-Farfan et al, 2003, 2004, 2006b).

2.2 Consideraciones técnicas para el cultivo de glándula adrenal

El cultivo de tejidos fue desarrollado a comienzos del siglo 20, como un método para

estudiar el comportamiento de células animales, libres de variaciones sistémicas que podrían

afectar al animal ya sea por homeostasis normal o por estar bajo el estrés de un experimento.

Dentro de los tipos de cultivos existen principalmente dos: el cultivo celular que corresponde a

cultivos derivados de células dispersas tomadas de un tejido original, como los cultivos

primarios, o de líneas o cepas celulares, por disgregación química, mecánica o enzimática; y el

cultivo organotípico, que implica un cultivo tridimensional de tejido no disgregado, que retiene

algunas o todas las características histológicas del tejido in vivo (Freshney, 1987).

El cultivo organotípico busca retener la relación estructural original entre células similares

y diferentes, y por lo tanto sus interacciones, para poder estudiar de una manera más realista el

efecto de estímulos exógenos sobre el órgano en cultivo. La mantención de la integridad

estructural del tejido original puede preservar las interacciones celulares homólogas y heterólogas

presentes originalmente, además de mantener la configuración química correcta de la matriz

extracelular. Este tipo de cultivos se emplea esencialmente cuando se desea ver el

comportamiento de un tejido integrado, por sobre el comportamiento de células aisladas

(Freshney, 1987).

A través de los años se ha desarrollado el cultivo organotípico de glándula adrenal en

distintas especies, principalmente usando explantes (Garrido et al, 1999; Torres-Farfan et al,

2003; Mohn et al, 2005), rebanadas hechas manualmente (Billiar et al, 1965; Ali y Bassett, 1991;

6

Tena-Sempere et al, 2000; Oster et al, 2006) y últimamente se han introducido las rebanadas

cortadas con alta precisión (precision-cut tissue-slice; Lindhe et al, 2001). La gran mayoría de

estos cultivos están hechos con el fin de medir la respuesta de la glándula adrenal a ACTH,

mediante la cuantificación de la producción de glucocorticoides por radioinmunoensayo (RIA), e

investigar los factores que alteran y regulan esta respuesta, ya sean de tipo endocrino, neural o

exógenos. Una parte importante de los cultivos organotípicos descritos en la literatura se han

realizado en glándulas adrenales de rata, animales de los que se dispone en nuestro laboratorio.

Recientemente Rainey et al (2004) publicaron una revisión de las características y

funcionalidad de líneas celulares adrenocorticales de roedores y humanos, encontrándose que las

líneas de roedores exhiben una alta capacidad estereoidogénica y conservan la sensibilidad a

ACTH; mientras que las líneas de humanos tienen la capacidad de producir mineralocorticoides,

glucocorticoides y andrógenos según las condiciones de cultivo.

En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha centrado sus esfuerzos en el

estudio de las acciones de la neurohormona melatonina sobre la función circadiana de la glándula

adrenal de rata. Para este propósito se han realizado experimentos usando muestras de adrenal de

rata ex vivo. Sin embargo, para caracterizar las acciones farmacológicas de melatonina sobre la

adrenal de rata, es necesario desarrollar modelos de estimulación y registro in vitro. Por el

momento, se ha descartado el uso de líneas celulares, dado que se han detectado niveles

relativamente bajos de expresión de receptores de melatonina en adrenal de rata; experimentos

que además indican que la isoforma 1 del receptor de membrana (acoplado a proteína G) de

melatonina se expresa en forma circadiana (Richter et al, 2008).

7

2.3 Planteamiento del problema

Varios estudios publicados recientemente muestran expresión circadiana de genes reloj in

vivo en glándula adrenal de diferentes especies: mono Rhesus (Lemos et al, 2006), ratón (Ishida

et al, 2005; Oster et al, 2006; Torres-Farfan et al, 2006a; Watanabe et al, 2006) y rata (Abarzúa,

2007). Se ha publicado que la administración de suero sincroniza la expresión circadiana de

genes reloj en cultivos de líneas celulares derivadas de fibroblastos (Balsalobre et al, 1998). Sin

embargo, existe evidencia mas reciente obtenida mediante mediciones continuas de luminiscencia

de la expresión del gen reportero Per-2-luc en cultivos organotípicos de varios tejidos de ratón en

ausencia de suero, indicando la mantención de oscilaciones sincronizadas y sostenidas por varios

días (Yoo et al, 2004).

Considerando estos antecedentes, se eligió estandarizar un sistema de cultivo organotípico

de adrenal de rata en ausencia de suero, para poder estudiar los efectos de melatonina sobre

expresión génica; en particular de genes reloj, los cuales presentan un patrón de transcripción que

oscila en las 24 h (Richter et al, 2004). Se eligieron tiempos cortos (1-2 días), dado que la

condición experimental de ausencia de suero, podría disminuir la sobrevida de las células y en

consecuencia llevar a una pérdida de función en el tiempo.

En base a estos antecedentes, la presente Tesis propone estandarizar condiciones de

cultivo en ausencia de suero (usando medio esencial mínimo), que permitan detectar cambios de

expresión de genes reloj, con y sin estímulos farmacológicos (ACTH y melatonina), tanto a nivel

de transcritos como de proteínas, obviando potenciales interferencias de otras señales endocrinas

contenidas en el suero.

8

2.4 OBJETIVOS

Objetivo General

Estandarizar condiciones de cultivo organotípico de glándula adrenal de rata, que

permitan analizar la expresión de mRNAs y proteínas de interés codificados por genes reloj.

Objetivos Específicos

1. Estudiar la preservación histológica de cultivos de adrenal de rata, cada 6 h, a lo largo de 48 h.

2. Determinar el rendimiento y calidad de extractos proteicos de explantes de adrenal de rata

obtenidos cada 6 h, a lo largo de 48 h.

3. Determinar el rendimiento y calidad de extractos de RNA total de explantes de adrenal de rata

cultivados por 18 h.

9

3 MATERIALES Y METODOS

3.1 Animales

Se utilizaron glándulas adrenales de ratas macho y hembra de la cepa Sprague Dawley de

2 a 3 meses de edad, con un peso promedio de 230 g, bajo un ciclo luz-oscuridad de 12:12 h y

con un régimen de alimentación de pellet y agua ad libitum. Los animales fueron obtenidos del

bioterio del Instituto de Anatomía, Histología y Patología de la Universidad Austral de Chile y

del bioterio de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

3.2 Equipos

Lupa conectada a sistema de luz fría (Nikon); cámara de flujo laminar (Forma Scientific

Inc); estufa de cultivo Water Jacketed Incubator (Forma Scientific Inc); balanza analítica (BL

150S Sartorius AG Göttingen); micrótomo R Jung A.G. Heidelberg; Estufa termoregulada Forma

Scientific Inc; centrífuga a 4 °C, Hettich, Zentrifugen MIKRO 200R; Ultra-Turrax T25 (JANKE

& KUNKEL, IKA-Labortechnik); sonicador Ultrasonic Homogenizer (Cole-Palmer Instrument

Corporation); espectrofotómetro Meterterk SP830 (Arquimed); Vortex Genie 2 (Scientific

Industries); Shake’N’Bake Hybridization Oven (Boekel Scientific); fuente de poder Consort

E833 (Arquimed); termobloque seco (Barnstead Thermolyne Tyse 17600 pm-Bath);

espectrofotómetro UV-1203 UV-VIS (Shimadzu); transiluminador UV Vilber-Lourmat;

termociclador GeneAmp System 2400 (Perkin Elmer); sistema de PCR en tiempo real

LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics).

10

3.3 Reactivos e insumos

Cultivo de explantes de glándulas adrenales de rata. Material quirúrgico estéril (pinzas,

hojas de bisturí, tijeras); lámpara de luz roja (<0,2 lux); placas de cultivo celular de 24 pocillos,

placas Petri de 100x20 mm y 35x10 mm (Falcon); filtros de 0,2 µm (Steritop Millipore Corp);

microtubos de 1,5 mL; puntas para micropipetas estériles. Los reactivos que siguen fueron

obtenidos de Sigma-Aldrich Corp. Solución de Hank´s; medio de cultivo DMEM-HAM F12,

conteniendo una combinación 1:1 de medio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) y la

mezcla de nutrientes F12 HAM. A este medio se le adicionó: 0.1% de BSA, bicarbonato de sodio

(2.4 g/L), D(+)glucosa (5.7 g/L), tampón HEPES 15 mM pH 7.4, penicilina G sódica (100

mg/L), estreptomicina (50 mg/L), sulfato de kanamicina (25 mg/L) y anfotericina B (2.5 mg/L).

Adrenocorticotropina 1-39 (ACTH; código A 0423); melatonina (código M 5250); luzindol

(código L 2407); etanol y dimetilsulfóxido (DMSO) fueron obtenidos en Merck.

Obtención de cortes para análisis histológico. Portaobjetos y cubreobjetos; batería de

alcoholes montada bajo campana de extracción; moldes metálicos para bloques de parafina;

fijador Bouin; parafina en pastillas Histosec (Merck); xilol (Baker); etanol y butanol (Winkler

Ltda).

Tinción con hematoxilina-eosina y con azul de toluidina. Cortes desparafinados e

hidratados de explantes de glándula adrenal de rata de 6 µm fijados en Bouin; cubreobjetos;

hematoxilina de Harris (Lerner Laboratorios); solución acuosa de eosina al 1%, solución de

borato de sodio al 1% y solución de azul de toluidina (Merck) al 0.5%, en 20% de etanol

(Winkler Ltda) pH 4.6, previamente filtrada; batería de alcoholes para desparafinar, deshidratar e

hidratar (detallada en obtención de cortes para análisis histológico); bálsamo de Canadá. Para la

digitalización de imágenes histológicas, se usó el siguiente sistema: microscopio Axioskop 50

11

acoplado a una cámara digital AxioCam MRc, y el programa computacional MRGrab 1.0 de Carl

Zeiss (Alemania).

Extracción de proteínas totales de adrenal de rata in vitro. Tubos de policarbonato de 5

mL (para uso con Ultra-Turrax); cubeta de plástico para espectrofotómetro (1 mL); micropipetas

Gilson, Nichipet y Eppendorf; puntas de micropipetas; microtubos de 1,5 mL; NaCl 0.9%

(Merck); bicarbonato de amonio (Riedel-de Haën); EDTA y cóctel de inhibidores de proteasas

(Sigma-Aldrich Corp). Reactivo de Bradford 1X (Winkler Ltda); albúmina de suero de bovino

(BSA; Sigma-Aldrich Corp).

Electroforesis discontinua en geles de poliacrilamida-SDS (PAGE-SDS). Transiluminador

de luz blanca; cámara digital OLYMPUS Camedia C4000; cámara de electroforesis Mini-

PROTEAN 3 Cell (Biorad); placas de vidrio para mini geles con espaciadores de 1.5 mm de

grosor, peineta de 10 pocillos, tampón TRIS-HCl 1.5 mM pH 8.8 para el gel espaciador; tampón

TRIS-HCl 0.5 mM pH 6.8 para el gel apilador y acrilamida 99.9% (Biorad); N,N’-Metilen-

Bisacrilamida, SDS 10%, persulfato de amonio al 10 % y TEMED 99% (Sigma-Aldrich Corp);

tampón de carga 2X conteniendo Tris-HCl 133 mM (pH 6.8), β-mercaptoetanol, glicerol, SDS

4,4% y azul de bromofenol para identificar el frente iónico; tampón de corrida Tris-HCl 0,025 M

(pH 8.3), glicina 0,192 M y SDS 0,1 % (P/V) (Sigma-Aldrich Corp), TRIS y glicina de Biorad;

Benchmark Pre-Stained Protein Ladder (Invitrogen); Coomasie R-250 (Merck); metanol y ácido

acético (Winkler Ltda).

Electrotransferencia de proteínas a membranas de PDVF. Cámara de Tranferencia Mini

Trans-Blot Electrophretic Transfer Cell (Biorad); papel filtro Whatman N°1; tampón de

transferencia, conteniendo Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), glicina 192 mM, y SDS 0,1 % (P/V). Tris y

12

glicina fueron obtenidos de Biorad; Inmobilon-P, PVDF 0.45 µm (Millipore Corporation);

metanol absoluto 99% (Merck).

Detección inmunoquímica de las proteínas transferidas a membranas de PVDF. Scanner

Epson Perfection 1670; PBS 1X pH 7.4; tampón dilución del anticuerpo 0.05% Tween 20, 2%

BSA en PBS 1X pH 7.4, tampón de bloqueo 0.05% Tween 20 y 3% BSA (Sigma-Aldrich Corp)

en PBS 1X pH 7.4; anti ACTINA (Santa Cruz Biotechnology; código sc-7210); anti CLOCK

(Calbiochem; código 11-30); anti-IgG de conejo conjugada a peroxidasa hecho en cabra

(Immunopure, Pierce); anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa hecho en cabra (Immunopure,

Pierce); sistema de quimioluminiscencia Luminol (Supersignal West Dura Extended Duration

Substrate y Supersignal West Pico Chemiluminiscent Substrate, Pierce); película de exposición

Kodax Biomax MR Film 20.3 x 25.4 cm; revelador D-72 y fijador U-3 (Kodak).

Extracción de RNA total de explantes de adrenal en cultivo. Tubos de policarbonato de 5

mL (para uso con Ultra-Turrax); microtubos de 1,5 y 0,6 mL; micropipetas Gilson, Nichipet y

Eppendorf; puntas de micropipeta estériles con filtro, certificadas como libres de nucleasas,

proteasas y pirógenos (AXYGEN); Sub-Cell GT Agarose Gel Electrophoresis System (Biorad);

cámara digital Olympus Camedia Master 4.1; Trizol (Invitrogen); cloroformo (Winkler Ltda);

etanol absoluto (Merck); iso-2-Propanol (alcohol isopropílico, Winkler Ltda); agua libre de

nucleasas (Invitrogen).

Transcripción reversa y PCR en tiempo real (qPCR). Microtubos de pared delgada de 0,2

mL; Capilares LightCycler de 20 μL (Roche Diagnostics); LightCycler FastStart DNA Master

SYBR Green I (Roche Diagnostics). Puntas de micropipeta estériles con filtro, certificadas como

libres de nucleasas, proteasas y pirógenos (AXYGEN) y micropipetas de uso exclusivo en qPCR

marca Nichipet (rango 2-100 µL).

13

3.4 Cultivo de explantes de glándulas adrenales de rata

Se realizaron dos tipos diferentes de cultivo, en un caso para medir proteínas en

condiciones basales a distintas horas de cultivo y en el otro para medir la expresión de mRNA

bajo estímulos farmacológicos. La justificación del uso de grupos experimentales asimétricos

para la obtención de proteínas y RNA, es que la disposición de ratas macho se vió limitada en

nuestra Universidad y se tuvo que recurrir al Bioterio de la Pontificia Universidad Católica de

Chile. Ello explica por qué se usaron ratas macho y hembra para obtener proteínas y sólo machos

para RNA (cuyos explantes fueron a su vez sometidos a tratamientos farmacológicos para medir

producción de corticosterona; ver García, 2007).

Para la obtención de proteínas se sacrificaron animales por decapitación en dos días

diferentes a las 2000 h, un día fueron sacrificadas 18 ratas hembras y en el otro se sacrificaron 27

ratas machos. Se obtuvieron inmediatamente las glándulas adrenales, las cuales se depositaron en

solución de Hank´s a 4°C, luego fueron desgrasadas (con la ayuda de una lupa) y cortadas en

cuartos (utilizando hojas de afeitar estériles), sobre una placa petri ubicada en una fuente con

hielo. Tanto en hembras como machos se tomaron inmediatamente adrenales (4 en hembras y 5

en machos) para realizar extracción de proteínas in vivo, además en el caso de los machos se

fijaron 4 cuartos sin cultivar en Bouin que fueron sometidos a las tinciones histológicas

hematoxilina-eosina o azul de Toluidina. El procedimiento fue realizado con material quirúrgico

estéril. El cultivo se llevó a cabo utilizando el protocolo descrito por Torres-Farfan et al (2003),

con algunas modificaciones menores.

Se realizaron lavados repetidos con solución de Hank´s a los cuartos de adrenal.

Posteriormente los explantes fueron preincubados (128 cuartos en hembras y 192 cuartos en

machos) en medio de cultivo DMEM-HAM F12 0.1% BSA durante 1 h. Luego de preincubarse,

14

los explantes de ratas hembras fueron dispuestos en grupos de 8 en 16 placas de cultivo

conteniendo cada una 10 mL de medio DMEM-HAM F12 0.1 % BSA fresco; en el caso de los

explantes de ratas machos, éstos fueron dispuestos en grupos de 6 en 32 placas de cultivo

primario conteniendo cada una 5 mL de medio DMEM-HAM F12 0.1 % BSA.

Los cuartos de adrenal fueron cultivados a 37 °C , 100% humedad, 5% CO2, 95% aire,

desde las 0100 h en adelante, considerando el tiempo utilizado en el sacrificio de los animales y

las preincubaciones.

Los explantes se recolectaron cada 6 h a partir de las 0200 h en adelante, por un período

de 2 d. En el caso de los cuartos de hembras se cosecharon 16 en cada punto horario; mientras

que en los machos se tomaron 24, de los cuales 3 fueron fijados inmediatamente en Bouin y

sometidos a las tinciones histológicas hematoxilina-eosina y azul de toluidina. Una vez

recolectados, los explantes fueron pesados en balanza analítica y se descartó el medio de

incubación.

Para la obtención de RNA se sacrificaron ratas macho por decapitación en dos horarios

diferentes, 1 h después de encender la luz (0800 h) y 1 h después de apagarla (2200 h). Las

glándulas adrenales fueron obtenidas, desgrasadas y cortadas en cuartos (utilizando material

quirúrgico y hojas de afeitar estériles), encima de una placa Petri ubicada sobre una fuente con

hielo. A las 2200 h los animales fueron sacrificados bajo luz roja. Para el cultivo se siguió el

protocolo descrito por Torres-Farfan et al (2003), con algunas modificaciones menores.

Los cuartos de adrenal fueron lavados 2 veces por 15 min con suero fisiológico estéril y

frío. Se preincubó cada cuarto en 500 uL de medio de cultivo DMEM-HAM F12 0.1% BSA por

6 h y luego el medio fue cambiado por uno con el tratamiento farmacólogico correspondiente

según se indica en la Figura 1. Cada tratamiento se realizó en los dos horarios indicados, se

15

utilizó un número de animales igual a seis en cada punto horario y se realizó un seguimiento por

animal, es decir, un cuarto de adrenal de cada animal se sometió a cada uno de los ocho

tratamientos diferentes. Los cuartos de adrenal fueron cultivados por 12 horas a 37 °C , 100%

humedad, 5% CO2, 95% aire. Considerando el tiempo involucrado en el sacrificio de los animales

y los lavados del tejido (aproximadamente 1 h), los tratamientos se extendieron desde las 1500 h

hasta las 0300 h para los explantes correspondientes a ratas sacrificadas a las 0800 h y desde las

0500 h hasta las 1700 h para el caso de los explantes provenientes de ratas sacrificadas a las 2200

h.

Las soluciones de trabajo se prepararon por dilución seriada a partir de un stock

concentrado. Para el caso de melatonina se utilizó un stock 1mg/mL en etanol absoluto y se

realizaron diluciones sucesivas en medio DMEM-HAM F12 0.1% BSA para alcanzar las

concentraciones de trabajo (1-100 nM); para luzindol se diluyó un stock (1 mg/mL en DMSO) en

DMEM-HAM F12 0.1% BSA hasta una concentración final de trabajo de 1 µM; el stock de

ACTH usado fue de 1mg/mL en agua destilada, diluído posteriormente en DMEM-HAM F12

0.1% BSA hasta una concentración de uso 100 nM.

Una vez finalizado el cultivo, los explantes fueron pesados individualmente en balanza

analítica.

16

Figura 1: Esquema de los tratamientos farmacológicos de los explantes de glándula adrenal

de rata utilizados para extracción de RNA total a las 18 h de cultivo. Se indica la

concentración final de cada fármaco en el volumen de cultivo utilizado por explante (500 µL).

07 08 09 15 21 03 07

Luces encendidas

Muestreo

adrenales

Pre-incubación

Luces apagadas

Extracción de RNA

Transición tarde-noche

Tratamientos

21 22 23 05 07 17 21

Luces apagadas Luces encendidas

Transición noche-mañana

Tratamiento 1 2 3 4 5 6 7 8

ACTH (nM) - 100 100 100 100 100 100 -

Melatonina (nM) - - 1 10 100 10 100 10

Luzindol (µM ) - - - - - 1 1 -

Luces encendidas

Luces apagadas

Muestreo

adrenales

Pre-incubación Extracción de RNATratamientos

07 08 09 15 21 03 07

Luces encendidas

Muestreo

adrenales

Pre-incubación

Luces apagadas

Extracción de RNA

Transición tarde-noche

Tratamientos

21 22 23 05 07 17 21

Luces apagadas Luces encendidas

Transición noche-mañana

Tratamiento 1 2 3 4 5 6 7 8

ACTH (nM) - 100 100 100 100 100 100 -

Melatonina (nM) - - 1 10 100 10 100 10

Luzindol (µM ) - - - - - 1 1 -

Tratamiento 1 2 3 4 5 6 7 8

ACTH (nM) - 100 100 100 100 100 100 -

Melatonina (nM) - - 1 10 100 10 100 10

Luzindol (µM ) - - - - - 1 1 -

Luces encendidas

Luces apagadas

Muestreo

adrenales

Pre-incubación Extracción de RNATratamientos

17

3.5 Obtención de cortes para análisis histológico

Los explantes en Bouin (ver punto 3.4) fueron fijados por 24 h, luego se deshidrataron

pasando sucesivamente por alcohol 70%, alcohol 96%, alcohol 96%, alcohol 100%, alcohol

100%, solución alcohol: butanol 1:1, butanol, butanol (40 min en cada uno). La inclusión se

realizó dejando sucesivamente 1 h en solución butanol-histosec 1:1, histosec, histosec, histosec.

El histosec se aplica líquido calentándose previamente hasta 60 °C. Se dejó a temperatura

ambiente para que solidifique la parafina y se realizaron cortes en micrótomo con un grosor de 6

µm, los cuales fueron montados sobre portaobjetos gelatinizados.

Los cortes fueron desparafinados e hidratados pasando sucesivamente 10 min por xilol,

xilol, alcohol 100%, alcohol 96%, alcohol 70%, agua. Posteriormente los cortes se utilizaron

para análisis histológico mediante tinción con hematoxilina-eosina y azul de toluidina.

3.6 Tinción con hematoxilina eosina y con azul de toluidina

La tinción con azul de toluidina se realizó una vez desparafinados e hidratados los cortes,

los cuales se lavaron con agua y trataron con la solución de tinción por 10 min; luego se lavaron

nuevamente con agua, se deshidrataron utilizando alcohol de 95º y alcohol absoluto, ambos 2

veces por 1 min. Luego los cortes se deshidrataron y se montaron utilizando bálsamo de Canadá.

Para el caso de la tinción con hematoxilina-eosina, luego de desparafinados, hidratados y

lavados con agua, los cortes se incubaron por 5 min con hematoxilina de Harris, se lavaron con

agua por 10 min y con solución de borato de sodio al 1% por 2 min. Luego se incubó con

solución acuosa de eosina por 5 min. Los cortes se lavaron nuevamente con agua por 1 min, para

luego ser deshidratados y montados utilizando bálsamo de Canadá.

18

Los cortes fueron fotografiados utilizando el siguiente sistema: microscopio Axioskop 50

acoplado a una cámara digital AxioCam MRc, y el programa computacional MRGrab 1.0 de Carl

Zeiss (Alemania).

3.7 Extracción de proteínas totales de adrenal de rata in vitro

Para realizar la extracción de proteínas totales se utilizaron explantes obtenidos cada 6 h

de cultivo durante dos días, más las adrenales obtenidas ex vivo (ver punto 3.4). Una vez pesados,

estos explantes/adrenales fueron lavados rigurosamente con suero fisiológico estéril y luego

traspasados a tubos de policarbonato, a los cuales se les agregó 1 mL de tampón de extracción

(bicarbonato de amonio 50 mM, EDTA 1mM) adicionado con 10 µL de cóctel inhibidor de

proteasas 2X (10 uL de inhibidor por 1 mL de Tampón). Las muestras se homogenizaron en

Ultraturrax alternando 3 rotaciones de 15 s con reposo en hielo. Luego se sonicaron alternando 3

rondas de 20 s con reposo en hielo. Posteriormente las muestras fueron traspasadas a microtubos

de 1,5 mL y centrifugadas a 12.000 g por 45 min a 4 °C. El sobrenadante obtenido se consideró

como extracto total de proteínas solubles, el cuál se almacenó inmediatamente a -20 °C.

Para determinar la concentración proteica de los extractos se utilizó el método de

Bradford (1976), el cual se basa en la afinidad de las proteínas por el colorante azul de

Coomassie. Se preparó una solución de albúmina de suero bovino (BSA) 2 mg/mL y a partir de

ésta se prepararon una serie de diluciones de 1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mL y 0.125 mg/mL.

Las diferentes concentraciones de BSA se utilizaron para construir una minicurva de calibración.

Cabe consignar que tanto para preparar como para realizar las diluciones de albumina se utilizó el

tampón ocupado en la extracción. Tanto para la curva de BSA, como para el extracto, se midió un

volumen de 5 µL al cual se le agregaron 95 µL de agua destilada y finalmente 1.000 µL de

19

reactivo de Bradford 1X, usando como blanco el tampón de extracción. Todo lo anterior se

realizó por duplicado. Se incubó por 15 min y se leyó absorbancia a 595 nm. La reacción es

estable por aproximadamente 1 h. La curva de calibración se construyó mediante regresión lineal

y se calculó la concentración proteica interpolando en la curva y multiplicando por el factor de

dilución de la muestra.

3.8 Electroforesis discontinua en geles de poliacrilamida-SDS (PAGE-SDS)

La separación electroforética de proteínas se realizó en geles de poliacrilamida al 10%, en

el sistema de electroforesis Mini Protean III. Los geles separador y espaciador de 1,5 mm de

espesor, se prepararon a partir de una solución de acrilamida:bisacrilamida al 30%. El gel

separador se preparó a una concentración final de poliacrilamida al 10%, conteniendo Tris-HCl

375 mM pH 8.8, SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,05% y TEMED 0,198 %. El gel espaciador

se preparó a una concentración final de poliacrilamida del 4%, conteniendo Tris-HCl 125 mM pH

6.8, SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,05% y TEMED 0,198%. Se tomó un volumen equivalente

a 50 µg de proteínas de las muestras correspondientes a proteínas totales, las que fueron

mezcladas con tampón de carga 2X (Tris-HCl 133 mM pH 6.8, β-mercaptoetanol, glicerol, azul

de bromofenol, 4,4% SDS) y calentadas a 100 °C por 5 min, posteriormente las muestras fueron

cargadas en los surcos del gel. En caso de realizar electrotransferencia, fue necesario además

sembrar en uno de los surcos 5 µL de marcador de peso molecular. Luego que las muestras

fueron cargadas en el gel, se realizó la electroforesis en tampón de corrida 1X (Tris, glicina, SDS)

con un voltaje de 100 V por un tiempo aproximado de 1.5 h. Concluída la electroforesis el gel se

tiñó con azul brillante de Coomassie o se electrotransfirió a membranas de PDVF.

20

La tinción con azul de Coomasie sirve para verificar la calidad de los extractos proteicos y

la eficiencia de la electrotransferencia (ver punto 3.9), concluida la electroforesis y la

transferencia según corresponda. El procedimiento llevado a cabo fue el siguiente: los geles se

tiñeron con una solución de azul brillante de Coomasie R-250 0,1 % (P/V), metanol 50 % (V/V)

y ácido acético 7,5 % (V/V) durante 30 min y luego se lavaron en una solución de metanol 30 %

(V/V) y ácido acético 10 % (V/V) para eliminar el exceso de colorante. Los resultados obtenidos

fueron documentados mediante fotografía digital del gel sobre un transiluminador de luz blanca.

3.9 Electrotransferencia de proteínas a membranas de PDVF

Una vez concluída la separación electroforética, las muestras de proteínas fueron

transferidas a una membrana de PVDF, cortada del tamaño necesario, previamente activada en

metanol absoluto de alto grado por 15 s y equilibrada en tampón de transferencia por entre 15-20

min. Los geles se equilibraron durante 5 min en el tampón de transferencia. Posteriormente el gel

se colocó sobre papel de filtro y sobre éste se ubicó la membrana del mismo tamaño del gel

eliminando cuidadosamente todas las burbujas de aire entre el gel y la membrana. Sobre la

membrana se colocó nuevamente papel de filtro y el “sandwich” resultante se aprisionó entre dos

placas de acrílico cubiertas con esponjas en sus dos caras interiores asegurándose que el gel

quede hacia el catódo y la membrana hacia el anódo, de modo que las proteínas cargadas

negativamente se tranfieran a la membrana. Las condiciones de transferencia fueron 4 h a 75 mA

o 15 h a 50 mA. Para verificar la transferencia a las membranas, finalizado el período de

transferencia los geles de poliacrilamida-SDS se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250 o

alternativamente, una vez terminada la transferencia, las membranas se dejaron secando a

temperatura ambiente y luego se guardaron a 4 °C para el análisis inmunoquímico posterior.

21

3.10 Detección inmunoquímica de las proteínas transferidas a membranas de PVDF

Para realizar el análisis inmunoquímico se trataron las membranas con metanol absoluto y

luego con solución de bloqueo (PBS 1X, BSA 3%, Tween 20 0,05%) por 40 min. Luego se

lavaron 15 min con PBS 1X pH 7.4. Una vez terminado el lavado, se incubaron a 37 ºC con

primer anticuerpo en su dilución y tiempo de incubación correspondiente. En este caso para las

proteínas totales se utilizaron como primer anticuerpo anti-CLOCK 1:200 por 1 h 45 min o anti-

ACTINA 1:200 por 18 h. Finalizados estos tiempos se lavó 4 veces por 5 min con PBS 1X pH

7.4 y se dejó secar la membrana en estufa a 37 °C. Posteriormente se incubó a 37 ºC con el

segundo anticuerpo correspondiente; anti IgG conejo 1:50.000 por 45 min para las membranas

incubadas con anti-CLOCK o anti IgG ratón 1:25.000 por 1 h para las incubadas con anti-

ACTINA. Una vez finalizada esta etapa, se lavó nuevamente 4 veces por 5 min con PBS 1X pH

7.4. En este momento se utilizó el kit comercial Supersignal West Pico Chemiluminiscent

Substrate (para anti-CLOCK) o el kit Supersignal West Dura Extended Duration Substrate (para

anti-ACTINA), en el cual se mezclaron partes iguales de los dos reactivos y se vertieron sobre la

membrana, dejándolo actuar por 15 min en oscuridad a 37 °C. Posterior a la incubación con el

sustrato SuperSignal, las membranas se expusieron inmediatamente a película BioMax durante

períodos de tiempo variable (5 s-10 min). Las películas se revelaron con solución D-72 y se

fijaron con solución fijadora U3. El control de la inmunotinción se realizó incubando la

membrana sin el primer anticuerpo. Esta parte final del procedimiento se realizó en condiciones

de oscuridad (cuarto de revelado fotográfico). Las imágenes de las películas fueron

posteriormente digitalizadas en un scanner Epson Perfection 1670.

22

3.11 Extracción de RNA total de explantes de adrenal en cultivo

Para realizar la extracción de RNA se ocuparon explantes obtenidos anteriormente (ver

punto 3.4). De acuerdo a los tratamientos administrados, se juntaron los explantes en grupos,

obteniéndose un peso cercano a los 30 mg de tejido por grupo, los cuales fueron sometidos al

proceso de extracción de RNA total usando 500 µL de solución de extracción (Trizol,

Invitrogen), en un tubo de policarbonato estéril de 5 mL. Las muestras se homogenizaron en

Ultraturrax, alternando rotaciones de 15 s con reposo en hielo. Los homogenizados fueron

dejados 5-10 min a temperatura ambiente (inactivación de las RNasas y destrucción de

membranas celulares). Por cada mL de solución de extracción se agregaron 200 µL de

cloroformo y las muestras fueron mezcladas 15 s en vortex a potencia máxima. Luego se

incubaron las muestras a temperatura ambiente por 5 min. Se traspasaron las muestras a

microtubos de 1,5 mL y se centrifugaron a 4 °C, 12.000 rpm, por 15 min. La fase superior que

contiene el RNA total se traspasó a un nuevo microtubo (máximo 600 µL por tubo). Las fases

inferiores se eliminaron (contienen las proteínas y el DNA). Se agregaron 500 µL de alcohol

isopropílico por cada 500 µL de fase acuosa, mezclando los tubos varias veces por inversión y

posteriormente se incubaron 10 min a temperatura ambiente (precipitación del RNA). Se

centrifugó a 4 °C, 12.000 rpm, por 10 min; se eliminaron los sobrenadantes y se lavaron los pellet

con 500 µL de etanol pro-análisis al 75%, seguido de agitación breve en vortex y centrifugación a

4 °C, 10.000 rpm, por 5 min (este proceso de lavado se realizó dos veces). Se eliminó el

sobrenadante y se dejó secar el pellet de RNA a 37 °C por 10 min con la tapa del microtubo

abierta en el termobloque seco. Los pellets fueron resuspendidos cuidadosamente en H2O libre de

nucleasas (30 µL-50 µL-100 µL, según el tamaño del pellet), mediante pipeteo repetido. Las

resuspensiones de RNA total resultantes fueron incubadas a 55 °C por 5 min en termobloque seco

23

(esta incubación ayuda a disolver mejor el RNA). Finalmente se midió absorbancia para

determinar concentración del RNA, a 260 nm (ácidos nucleicos) y 280 nm (proteínas), para

obtener la razón 260/280 que teóricamente debe ser 1.8-2.0 para muestras de óptima calidad.

Cada muestra se midió en dos diluciones (1:50 y 1:100). Luego se promedió y se obtuvo la

concentración final. Cálculo de la concentración:

Para RNA existe la relación: 1 OD 260 = 40 µg/mL

Entonces para el cálculo de concentración se utilizó:

A260 de la muestra x 40 x factor de dilución de la muestra = µg/mL de RNA

Se determinó la integridad del RNA por medio de un gel de agarosa no denaturante al 1,5

% preteñido con bromuro de etidio, en corrida de electroforesis lenta (45 V, 25 mA). Este

experimento permite un chequeo rápido y eficiente de la calidad de muestras de RNA total,

obviando el uso de paraformaldehído y temperatura. Los parámetros medidos en el gel son:

probable contaminación con DNA genómico, eventual degradación de la muestra y cantidad de

RNA total relativa entre las muestras (vale decir, si existe correspondencia con las

concentraciones medidas espectrofotométricamente). Finalmente, se prepararon soluciones de

trabajo de 1 µg/µL de cada muestra de RNA total.

3.12 Digestión de trazas de DNA genómico con DNasa I

Para evitar la interferencia de trazas de DNA genómico en las muestras de RNA total,

éstas fueron tratadas con DNasa I, Amplification Grade (Invitrogen). La reacción se llevó a cabo

en microtubos de 0,5 mL y en donde por cada 1 μg de RNA se adicionó 1 μL del 10X DNase I

24

Reaction Buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 2 mM MgCl2, 50 mM KCl), 1 μL DNasa I

Amplification Grade (0,1 U), llevándose a un volumen total de 10 μL con agua libre de nucleasas.

Se incubó por 15 min a temperatura ambiente, después de lo cual se inactivó la DNasa I a través

de la adición de 1 μL de EDTA 25 mM. Inmediatamente después se calentó por 10 min a 65 °C.

Después de este tratamiento, las muestras pueden ser utilizadas directamente en RT-PCR.

3.13 Transcripción Reversa

Se sintetizó primera hebra de cDNA por transcripción reversa de muestras de RNA

digeridas con DNasa I, previamente obtenidas a partir de los explantes sometidos a distintos

tratamientos farmácologicos.

Se usó transcriptasa reversa y reactivos para síntesis de primera hebra de cDNA

comprados a Invitrogen (Bioschile). La transcripción reversa se realizó a partir de 2 g de RNA

(2 L de las diluciones de trabajo a 1 g/ L), utilizando 100 ng de partidores al azar (hexámeros;

Promega), tampón de síntesis de primera hebra 1X, DDT 10 mM, deoxinucleótidos trifosfato 0,5

mM y SuperScript II RNase H- 10 U, en un volumen final de 20 L. Las muestras de RNA total

fueron llevadas a 10 L en agua libre de nucleasas y denaturadas a 70 ºC durante 10 min.

Enseguida la reacción de transcripción reversa fue montada en hielo e incubada en el

termociclador con el siguiente programa: 25 ºC durante 10 min, 42 ºC durante 60 min, 90 ºC

durante 5 min y 4 ºC como temperatura de mantención.

3.14 PCR en tiempo real (qPCR)

La expresión relativa de los mRNAs codificantes para el gen constitutivo -actina fue

medida por RT-PCR cuantitativo (qPCR) en cDNAs de muestras de explantes de adrenal

25

sometidas a estímulos farmacológicos (ver punto 3.4). De cada pool sometido a su respectivo

tratamiento farmacológico se usó 2 µg de RNA para sintetizar la primera hebra de cDNA. Las

correspondientes muestras de RNA total fueron digeridas con DNasa I como se describió mas

arriba. Para amplificar por PCR en tiempo real un fragmento de 75 pb de -actina, se usaron

partidores previamente publicados por Dijk et al (2004): forward o sentido 3’-

GCTCCTCCTGAGCGCAAG-5’ y reverse o antisentido 5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3’

(bases 1072-1146 del mRNA de -actina; número de acceso GenBank: NM_031144).

Para los fines de qPCR se usó el sistema LightCycler 1.5, junto al kit LightCycler

FastStart DNA Master SYBR Green I . La reacción de PCR se realizó en un volumen de 10 μL en

presencia de 0,3 μM final de partidores sentido y antisentido para -actina, 5,2 μL de H2O PCR-

grade, 1,2 μL de solución de MgCl2 25 mM, 1 μL LightCycler FastStart DNA Master SYBR

Green I y 2 μL de cDNA (sintetizado a partir de 2 μ g de RNA). Como en toda reacción de PCR,

fue necesario estandarizar la temperatura y tiempos de annealing y extensión: denaturación 95 ºC

por 8 s, annealing 60 ºC por 8 s y extensión 70 ºC por 6 s hasta completar 40 ciclos (los pasos de

annealing y extensión se realizaron en un sólo segmento de temperatura y tiempo; esto es,

modalidad de PCR conocida como Touchdown).

El seguimiento de los resultados para el gen -actina se facilitó por el empleo del

programa computacional LightCycler3 Front Screen (Roche Diagnostics). Para esta corrida de

PCR, se incorporó una curva estándar la cual se obtuvo por dilución seriada de los productos de

PCR purificados del transcrito. La pendiente de la curva estándar fue utilizada para calcular la

eficiencia de la reacción, E = 10 – (1/slope). Los valores para los Crossing points (Cp) de cada

muestra, se emplearon para calcular el E –Cp de β-actina (Pfaffl, 2001).

26

4 RESULTADOS

4.1 Preservación histológica de los cuartos de adrenal de rata en cultivos de hasta 48 h

4.1.1 Tinción de explantes sin cultivar (tiempo cero) con azul de toluidina y hematoxilina

eosina

Se fijaron en Bouin cuartos de adrenal inmediatamente después de ser disecados. Estas

muestras fueron analizadas usando tinción con azul de toluidina para verificar integridad de los

núcleos celulares o alternativamente, con hematoxilina eosina para estudiar la preservación

histológica del tejido. En la Figura 2A, se observa un cuarto de adrenal con los núcleos celulares

preservados en todas las capas aparentes de la glándula (glomerulosa, fasciculada, reticular y

médula). Las Figuras 2B y C, muestran una tinción con hematoxilina eosina comparable a la que

se obtiene sin disecar la adrenal en cuartos; todas las capas están bien definidas y la relación

núcleo-citoplasma es normal. Al usar un mayor aumento (Figuras 2D-F), se aprecia que la

citoarquitectura de la adrenal se mantiene, sin espacios artefactuales o indicios de muerte celular.

27

Figura 2. Tinciones básicas (azul de toluidina y hematoxilina eosina) de explantes de

adrenal de rata sin cultivar (tiempo cero). (A) tinción con azul de toluidina; (B-F) tinción con hematoxilina eosina. Aumentos del microscopio: A y B, 5X; C, 10X; D-F, 20X. ZG, Zona Glomerulosa; ZF, Zona Fasciculada; ZR, Zona Reticular.

A B C

D E F

Médula

Corteza ZG

ZF

ZR

Médula

28

4.1.2 Tinción de explantes cultivados por 6 a 48 h con hematoxilina eosina y azul de

toluidina

Se fijaron en Bouin cuartos de adrenal inmediatamente después de ser cosechados

sucesivamente cada 6 h de cultivo (6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 y 48 h). Estas muestras fueron

analizadas usando tanto tinción con hematoxilina eosina para observar la preservación histológica

del tejido (Figura 3 y 5), como tinción con azul de toluidina (Figura 4 y 5) para observar la

integridad de los núcleos celulares del tejido a medida que van aumentando las horas en cultivo.

La citoarquitectura de los explantes de adrenal de rata no sufre cambios aparentes, aún

incluso después de incubación por 2 d (máximo tiempo estudiado; Figura 3 H). De esta forma, a

las 42 y 48 h, todavía se distingue fácilmente el arreglo columnar de las células de la capa

fasciculada teñidas con hematoxilina eosina (Figuras 3G y H).

El análisis de los cuartos de adrenal de rata a un aumento de 20X y teñidos con azul de

toluidina, indica que la densidad de los núcleos tiende a disminuír sólo moderadamente (Figuras

4G y H).

Finalmente, al usar un aumento mayor (40X) para analizar tiempos seleccionados de

cultivo (6, 24, 30 y 48 h), se determinó que los cuartos de adrenal de rata efectivamente

mantuvieron un arreglo columnar de células secretoras de glucocorticoides de la capa fasciculada

de la glándula (Figura 5). Tanto con tinción de hematoxilina eosina (Figura 5A, C, E y G) como

azul de toluidina (Figura 5B, D, F y H), se observó un número reducido de núcleos picnóticos.

La densidad celular relativa va disminuyendo a medida que aumenta el tiempo de incubación de

los explantes (comparar Figura 5A con 5G). Las células esteroidogénicas conservan un

citoplasma de aspecto vacuolado a lo largo del cultivo, típico de este linaje celular (Figura 5A,

C, E y G).

29

Figura 3. Cortes de explantes de adrenal de rata cultivados por 6-48 h, teñidos con

hematoxilina eosina. (A) 6 h; (B) 12 h; (C) 18 h; (D) 24 h; (E) 30 h; (F) 36 h; (G) 42 h; y (H) 48 h de cultivo. Aumentos del microscopio: A-H, 20X.

30

Figura 4. Cortes de explantes de adrenal de rata cultivados por 6-48 h, teñidos con azul de

toluidina. (A) 6 h; (B) 12 h; (C) 18 h; (D) 24 h; (E) 30 h; (F) 36 h; (G) 42 h; y (H) 48 h de cultivo. Aumentos del microscopio: A-H, 20X.

31

Figura 5. Cortes de explantes de adrenal de rata cultivados por 6, 24, 30 y 48 h, teñidos con

hematoxilina eosina (HE) y azul de toluidina (AT). (A) HE, 6 h; (B) AT, 6 h; (C) HE, 24 h; (D) AT, 24 h; (E) HE, 30 h; (F) AT, 30 h; (G) HE, 48 h; y (H) AT, 48 h de cultivo. Aumentos del microscopio: A-H, 40X.

32

4.2 Rendimiento y calidad de las proteínas totales obtenidas de cuartos de adrenal de

rata cultivados por 0-48 h

Los extractos de proteínas totales de los explantes de adrenal de ratas machos y hembras,

obtenidos a tiempo cero y sucesivamente cada 6 h de cultivo, fueron cuantificados con el método

de Bradford. Los grupos de explantes correspondientes a 6 adrenales para los machos y 4 para las

hembras fueron pesados a cada hora de recolección, de esta manera fue posible calcular el

rendimiento de los extractos proteicos durante el curso de tiempo del cultivo (µg proteína/mg

tejido; Tabla 1, machos y Tabla 2, hembras). El análisis del rendimiento de proteínas en el

tiempo, tanto para machos como para hembras, mostró una fuerte caída después de las primeras 6

h en cultivo en relación a los valores obtenidos para cuartos de adrenal sin cultivar. El valor del

rendimiento se mantuvo dentro de parámetros constantes desde las 6 a las 18 h en cultivo, para

nuevamente disminuír, esta vez de una manera moderada desde las 24 h en adelante. Una vez

producida esta disminución final, los valores de rendimiento nuevamente variaron

marginalmente, manteniéndose constantes hasta las 48 h en cultivo. El patrón de decaimiento fue

similar para machos y hembras; sin embargo, las hembras alcanzaron valores mayores en cada

punto de tiempo (Figura 6).

33

4.2.1 Cuantificación de proteínas totales y determinación del rendimiento a lo largo del

cultivo de 48 h

Tabla 1. Cuantificación y rendimiento de extractos proteicos totales de explantes de adrenal

de ratas macho cada 6 h a lo largo del cultivo (0-48 h). DIV, días in vitro.

DIV Horas de

cultivo

Concentración (µg/µL)

Volumen

(µL)

Proteínas totales (µg)

Tejido (mg)

Rendimiento

(µg prot/mg tej)

0 0 5,01 1500 7515 105,8 71,03

1

6 2,15 1000 2150 148,0 14,53

12 2,09 1000 2090 165,4 12,64

18 1,96 1000 1960 159,4 12,30

24 1,43 1000 1430 150,7 9,48

2

30 1,25 1000 1250 177,5 7,04

36 1,23 1000 1230 149,5 8,23

42 1,28 1000 1280 136,0 9,41

48 1,17 1000 1170 158,5 7,38

34

Tabla 2. Cuantificación y rendimiento de extractos proteicos totales de explantes de adrenal

de ratas hembra cada 6 h a lo largo del cultivo (0-48 h). DIV, días in vitro.

DIV Horas de

cultivo

Concentración (µg/µL)

Volumen

(µL)

Proteínas

totales (µg)

Tejido (mg)

Rendimiento

(µg prot/mg tej)

0 0 13,32 1000 13320 142,8 93,28

1

6 5,27 1000 5270 178,7 29,49

12 5,27 1000 5270 178,6 29,51

18 4,48 1000 4480 195,0 22,97

24 2,18 1000 2180 179,6 12,14

2

30 2,06 1000 2060 182,9 11,26

36 1,96 1000 1960 178,6 10,97

42 1,99 1000 1990 154,8 12,86

48 1,45 1000 1450 141,2 10,27

35

A

B

Figura 6. Rendimiento de proteínas en cultivo (µg proteína/mg tejido) versus horas en

cultivo (0-48 h). Curso de tiempo del rendimiento de proteínas en cultivo para explantes de ratas macho (n=6 adrenales por punto de tiempo) (A) y ratas hembra (n=4 adrenales por punto de tiempo) (B).

Curso de tiempo del rendimiento de proteínas en cultivo

(adrenales de ratas macho; n=6 por punto de tiempo)

0.0 6.0 12.0 18.0 24.0 30.0 36.0 42.0 48.0

0

15

30

45

60

75

90

105

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Horas en cultivo

Ren

dim

ien

to

(µg

pro

teín

a/m

g t

ejid

o)

Curso de tiempo del rendimiento de proteínas en cultivo

(adrenales de ratas hembra; n=4 por punto de tiempo)

0.0 6.0 12.0 18.0 24.0 30.0 36.0 42.0 48.0

0

15

30

45

60

75

90

105

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Horas en cultivo

Ren

dim

ien

to

(µg

pro

teín

a/m

g t

ejid

o)

Curso de tiempo del rendimiento de proteínas en cultivo

(adrenales de ratas macho; n=6 por punto de tiempo)

0.0 6.0 12.0 18.0 24.0 30.0 36.0 42.0 48.0

0

15

30

45

60

75

90

105

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Horas en cultivo

Ren

dim

ien

to

(µg

pro

teín

a/m

g t

ejid

o)

Curso de tiempo del rendimiento de proteínas en cultivo

(adrenales de ratas hembra; n=4 por punto de tiempo)

0.0 6.0 12.0 18.0 24.0 30.0 36.0 42.0 48.0

0

15

30

45

60

75

90

105

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Horas en cultivo

Ren

dim

ien

to

(µg

pro

teín

a/m

g t

ejid

o)

36

4.2.2 Perfil electroforético de proteínas totales de cuartos de adrenal de rata en cultivo

La calidad de los extractos de proteínas totales de explantes de ratas macho y hembra en

cultivo se analizó mediante tinción de corridas electroforéticas con azul de Coomassie.

Los extractos de proteínas totales de explantes de ratas macho y hembra presentaron un

patrón de bandas idéntico para cada sexo. A medida que aumentó el tiempo en cultivo, en general

se observó una disminución en la intensidad de las bandas originalmente obtenidas sin cultivar

(Figuras 7A y 7B). Sin embargo, en el caso de las ratas hembra se detectó un aumento de la

intensidad en diversas bandas a medida que transcurrió el tiempo de cultivo (Figura 7B). No se

observan indicios de degradación, puesto que en todos los tiempos de cultivo, se observa el

mismo patrón de bandas, en todo el rango del gel.

37

Figura 7. Evaluación electroforética de los extractos de proteínas totales de explantes de

ratas macho y hembra, cultivados por 0-48 h. Gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes (SDS-PAGE) al 10%, teñido con azul de Coomasie. En cada surco se cargaron 50 µg de proteína; los carriles corresponden a los extractos totales obtenido para cada tiempo de incubación, de explantes de ratas macho en A y ratas hembra en B.

0 6 12 18 24 30 36 42 48 h

A

B

Machos

Hembras

38

4.3 Análisis inmunoquímico de muestras de proteínas totales obtenidas de cuartos de

adrenal de rata en cultivo

Se realizó análisis de Western blot para la proteína constitutiva ACTINA en los extractos

totales de proteínas de los explantes de macho y hembra en cultivo (Figura 8). Para ambos sexos,

la proteína ACTINA (43 kDa) presentó un patrón inmunoquímico homogéneo, con una expresión

constante en las primeras 24 h de cultivo y una baja significativa desde las 30 h de cultivo en

adelante, manteniéndose una señal que no varía significativamente hacia el final del cultivo.

La Figura 9 muestra análisis preliminar de Western blot para la proteína reloj CLOCK,

realizado con los extractos de explantes de glándula adrenal de ratas macho en cultivo (6-48 h).

Se observó expresión de la proteína CLOCK en los extractos correspondientes a todo el curso

temporal del cultivo. Sin embargo, debido a la presencia de una burbuja en la electrotransferencia

de los surcos correspondientes a las 30, 36 y 42 h, estas bandas resultaron extremadamente

deformadas. La banda detectada con el anticuerpo policlonal comercial contra CLOCK, presentó

el peso molecular esperado (100 kDa).

39

4.3.1 Detección inmunoquímica de la proteína constitutiva ACTINA en explantes de ratas

macho y hembra, cultivados por 0-48 h

Figura 8. Detección inmunoquímica de la proteína constitutiva ACTINA en extractos de

explantes de ratas macho y hembra, cultivados por 0-48 h. En A se presentan los resultados para ratas macho y en B para ratas hembra. El patrón de expresión a medida que aumenta el tiempo de cultivo es similar para ambas muestras (macho y hembra).

43 kDa

43 kDa

B

0 6 12 18 24 30 36 42 48 h

A Machos

Hembras

40

4.3.2 Detección inmunoquímica de la proteína reloj CLOCK en explantes de ratas macho

cultivados por 6-48 h

Figura 9. Detección inmunoquímica de la proteína reloj CLOCK en extractos de explantes

de ratas macho cultivados por 6-48 h. En las diferentes muestras, se observa una banda del peso molecular esperado (100 kDa), pero debido a problemas en la electrotransferencia, no se puede ver con claridad la magnitud e intensidad de las bandas en las surcos correspondientes a las 30, 36 y 42 h.

100 kDa

06 12 18 24 30 36 42 48 h

41

4.4 Extracción, evaluación y análisis de muestras de RNA total de cuartos de adrenal de

rata tratados farmacológicamente

4.4.1 Análisis electroforético de las muestras de RNA total

Se realizó un cultivo masivo de cuartos de adrenal de rata (n=240), en microplacas de 96

pocillos, conteniendo cada uno un explante en 500 µL de DMEM, con o sin tratamiento

farmacológico. Todos los explantes fueron preincubados en DMEM por 6 h y posteriormente

sometidos a uno de los tratamientos descritos en la Figura 1 (ver Material y Métodos). Se

realizaron 6 repeticiones usando 40 pocillos de cada placa de 96 posiciones (5 explantes x 8

tratamientos = 40 posiciones por repetición).

Experimentos preliminares indicaron que la población de muestras de RNA total

obtenidas a partir de grupos (pools) de 5 explantes de aproximadamente 5 mg de tejido cada uno,

rinden resultados que no son completamente homogéneos. Por esta razón, antes de continuar los

análisis de las muestras de RNA total, se realizó una evaluación electroforética de las 48 muestras

de RNA total generadas. Para el análisis electroforético, cada uno de los surcos del gel de agarosa

1,5% preteñido con bromuro de etidio, fue cargado con 2 μg de extractos de RNA total de grupos

de 5 explantes (Figura 10). Efectivamente, se determinó que el perfil electroforético varió desde

calidad óptima hasta indetectable (Figura 10). La integridad del RNA se evidencia al observar

los rRNA 28/18S, ya que ambos constituyen mas del 70% del RNA presente en las células. Una

muestra de trabajo óptima es aquella donde la banda correspondiente al rRNA 28S es mayor que

la del 18S; si se da la condición inversa, o simplemente no se observa banda alguna entonces la

muestra puede ser desechada por degradación del RNA.

42

Las muestras de RNA total seleccionadas en base a este parámetro, están incorporadas en

la Tabla 3. Las determinaciones de absorbancia a 260 y 280 nm permitieron determinar que la

cantidad relativa concuerda con el perfil electroforético. Tanto los rangos de pureza como de

concentraciones y rendimientos de RNA total obtenidos fueron apropiados para su análisis

mediante qPCR (A260/280: 2.1-4.7; concentración final: 0.38-1.52 µg/µl; rendimiento: 0.317-1.169

µg RNA/mg tejido). La presencia de trazas de DNA genómico fue posteriormente controlada por

digestión con DNasa I.

43

1

2

3

4 5

6 7

8

9

1

0

11

1

2 1

3 1

4 1

5

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1

7 1

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23

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3

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8

39

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31

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1

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5

16

1

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8

19

20

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2

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25 2

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2

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29

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0

31

32

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3

34

35

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8

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4

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7 4

8

28S

18S

4S

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44

4.4.2 Razones de absorbancia, concentraciones y rendimiento por mg de tejido

Tratamiento

A260/280

Concentración

( g/ L)

RNA

(µg)

Peso tejido

(mg)

Rendimiento

(µg RNA/mg tejido)

DMEM

3,8 0,73 14,6 27 0,541

2,3 0,38 7,6 24 0,317

4,7 0,64 12,8 29 0,441

ACTH 100nM

3,9 0,73 14,6 29 0,503

3,4 0,85 17,0 29 0,586

4,0 0,75 15,0 32 0,469

ACTH 100 nM + melatonina 10 nM

2,8 0,84 16,8 26 0,646

2,5 1,12 22,4 31 0,723

3,3 0,73 14,6 29 0,503

ACTH 100 nM + melatonina 10 nM + luzindol 1 µM

2,4 1,25 25,0 28 0,893

2,4 1,23 24,6 23 1,070

3,7 0,68 13,6 25 0,544

Melatonina 10 nM

2,2 1,19 23,8 24 0,992

2,1 1,52 30,4 26 1,169

2.2 1,34 26,8 25 1,072

Tabla 3. Análisis espectrofotométrico de las muestras de RNA total seleccionadas.

45

4.4.3 Amplificación del transcrito del gen constitutivo -actina por qPCR

Se realizó digestión de trazas de DNA genómico y se sintetizó primera hebra de cDNA a

partir de 2,0 g de muestras de RNA total de explantes de adrenales de rata tratados

farmacológicamente, que fueron seleccionadas como se describió anteriormente. Las muestras de

cDNA fueron sometidas a amplificación mediante PCR en tiempo real (qPCR), con el fin de

amplificar el gen constitutivo -actina, para verificar si las condiciones de cultivo y extracción de

RNA total son apropiadas para realizar estudios de una serie de genes de interés mediante qPCR.

Usando partidores de qPCR publicados por Dijk et al (2004), se estandarizaron las

condiciones de amplificación por qPCR (SYBR Green I/LightCycler 1.5) para el gen constitutivo

β-actina, hasta obtener una alta eficiencia (101%; Figura 11). Bajo estas condiciones de

amplificación, no existió formación importante de dímeros y el melting point del amplímero de β-

actina fue de ~ 85 °C (Figura 12). Finalmente, el chequeo electroforético de los productos finales

de amplificación a los 45 ciclos (saturante), indicó la presencia de una banda única del tamaño

esperado (75 pb; Figura 13).

46

Figura 11. Amplificación del gen -actina usando el sistema de qPCR SYBR Green I / Light

Cycler 1.5. Los partidores de PCR usados fueron publicados por Dijk et al (2004). Estos resultados indican que la reacción de amplificación presenta una alta eficiencia (101%) con un CP entre 21 y 26 ciclos.

47

Figura 12. Determinación del melting point del amplímero de -actina (Tm = 85 °C). Estos resultados indican que la reacción de amplificación en tiempo real no presenta formación importante de dímeros y que además rinde un producto de PCR único, consistente con la banda única mostrada a continuación (ver Figura 13).

48

Figura 13. Electroforesis del producto de PCR en tiempo real de -actina (75 pb)

amplificado en cultivos de adrenal de rata tratados farmacológicamente. Los cuartos de adrenal fueron preincubados por 6 h en DMEM y enseguida tratados por 12 h según se indica (n=5 cuartos por surco). Los partidores de PCR usados fueron publicados por Dijk et al (2004). Imagen digital monocromática invertida o negativa del gel de agarosa al 2 % preteñido con bromuro de etidio. Surcos: Kb, indicador de tamaño de DNA (escala de 100 pb); T1, medio de incubación (DMEM) solo; T2, 100 nM ACTH; T3, 100 nM ACTH + 10 nM melatonina; T4, 100 nM ACTH + 10 nM melatonina + 1 µM luzindol; y T5, 10 nM melatonina.

ACTH 100 nM - - - + + + + + + + + + - - -

Melatonina 10 nM - - - - - - + + + + + + + + +

Luzindol 1 µM - - - - - - - - - + + + - - -

75 pb

1000 pb

500 pb

100 pb

Kb T1 T2 T3 T4 T5

ACTH 100 nM - - - + + + + + + + + + - - -

Melatonina 10 nM - - - - - - + + + + + + + + +

Luzindol 1 µM - - - - - - - - - + + + - - -

75 pb

1000 pb

500 pb

100 pb

Kb T1 T2 T3 T4 T5

49

5 DISCUSION

El objetivo central de la presente Tesis fue la estandarización de un cultivo organotípico

de glándula adrenal de rata por períodos cortos de tiempo (1-2 días), en base a tres parámetros:

preservación histológica de los explantes cultivados (0-48 h); calidad y rendimiento de extractos

proteicos a medida que aumentan las horas en cultivo (0-48 h); y calidad y rendimiento de RNA

total de explantes sometidos a tratamientos farmacológicos en un tiempo fijo de horas en cultivo

(18 h). Adicionalmente, se investigó en forma preliminar la posibilidad de monitorear la

expresión de la proteína de interés CLOCK.

En lo que concierne a la evaluación histológica, al observar los explantes sin cultivar

teñidos con hematoxilina-eosina y azul de toluidina, podemos decir que la disección no tendría

efectos inmediatos sobre la histología de la glándula adrenal de rata, ya que lo observado

coincide con lo visto en glándulas adrenales intactas. A medida que van aumentando las horas en

cultivo de los explantes y como se describió anteriormente en los resultados, la integridad

histológica del tejido cultivado se mantiene, distinguiéndose aún al finalizar los cultivos la

organización columnar de las células pertenecientes a la zona fasciculada. Sin embargo, se

observó un aumento en el número de núcleos picnóticos a lo largo del cultivo, acompañado de

una disminución en la cantidad total de núcleos observados; fenómenos que se presentaron en

una fracción menor del total de células por campo de observación. Se ha descrito evidencia de

degradación temprana de la zona fasciculada (Kendall et al, 1960); sin embargo, recientemente

también se ha descrito buena conservación histológica de cortes de adrenal de rata cultivados

durante 24 h (Lindhe et al, 2001). Podemos decir que la histología de los explantes de adrenal de

rata cultivados durante dos días, se encuentra dentro de los parámetros esperados; manteniendo

50

cualitativamente su aspecto morfológico inicial y sin cambios notables en su composición celular.

Una forma de cuantificar los cambios discutidos, sería realizar un recuento de células por campo,

para generar una razón núcleos de aspecto normal versus núcleos picnóticos.

El rendimiento de proteínas de los explantes de adrenal de ratas macho y hembra, presentó

un patrón similar de decaimiento a través del tiempo para ambos sexos. La intensa disminución

inicial del rendimiento de proteínas con respecto a los explantes que no fueron cultivados, estaría

en gran parte dada por el tiempo que pasó entre el sacrificio de los animales y la puesta en

preincubación de los explantes. Si bien se trabajó con soluciones a 4º C, el tiempo que las

adrenales estuvieron expuestas a temperatura ambiente mientras fueron cortadas para obtener los

explantes, podría incidir en la viabilidad posterior de los mismos. Por otra parte, el gran número

de adrenales a cortar dificultó una mayor rapidez al momento de trasladar los explantes frescos al

medio de cultivo. Adicionalmente, la manipulación sufrida por las adrenales al realizar los

sucesivos cambios de soluciones hasta llegar a la incubación definitiva, podría afectar aún más el

rendimiento obtenido. Por lo tanto, existe un compromiso entre la calidad de los explantes que

pueden ser disecados eficientemente en una serie experimental y el número de explantes

requeridos para realizar estudios poderosos desde el punto de vista estadístico. Una vez iniciado

el cultivo, no se observa una baja brusca en el rendimiento de proteínas, pero si una tendencia

general a la baja acentuada en el cambio entre las 16 y 24 h de cultivo, donde se puede ver que el

rendimiento vuelve a disminuir, para mantenerse relativamente constante hasta terminar el

período de cultivo a las 48 h. Este fenómeno básicamente puede ser explicado por una

disminución progresiva del número de células viables que aportan proteínas al extracto, lo cual es

esperable dado el aumento de las horas en cultivo. Debido a la constitución tridimensional y el

grosor de los explantes, el medio de cultivo no difunde lo suficientemente bien al interior de

51

éstos, generándose zonas necróticas en el centro de los explantes, que se relacionan directamente

con el tamaño inicial de los explantes: a mayor tamaño mayor necrosis y a menor tamaño ocurre

la situación contraria. Dado que los explantes fueron cortados manualmente es imposible

asegurarse de que todos posean el mismo tamaño y por lo mismo la intensidad de la necrosis de

un explante a otro varía. Las zonas del explante más cercanas a la superficie en su gran mayoría

están compuestas por células viables pero que no se dividen al ser un tejido diferenciado, lo que

es común a la mayoría de los cultivos organotípicos; en caso de llegar a producirse división

mitótica, ésta estaría muy limitada y ocurriría solo en las capas periféricas, sin aportar mucho al

rendimiento total de proteínas (Freshney, 1987). Al momento de revisar la calidad de los

extractos proteicos mediante geles de integridad teñidos con azul de Coomassie a lo largo de los

días de cultivo, si bien el patrón general de proteínas se mantuvo a través de las horas en cultivo

en ambos sexos, se observaron cambios en la intensidad de tinción de proteínas específicas.

Interesantemente, a nivel de rendimiento existen diferencias entre ambos sexos; observándose

mayor rendimiento en todos los puntos estudiados por parte de las hembras. Tentativamente, se

podría plantear una respuesta especifica para cada sexo, debido a un pre-condicionamiento

hormonal de la respuesta al estrés, que podría reflejarse en los niveles de expresión de proteínas

involucradas en diferentes vías regulatorias (tales como: apoptosis, degradación proteosómica,

autofagia y activación lisosomal, así como también proteínas involucradas en estrés celular y

cambios generales en factores de transcripción).

Los resultados obtenidos para el Western blot realizado a la proteína constituitiva

ACTINA, muestran un patrón similar para ambos sexos, expresión pareja durante el primer día

de cultivo y una disminución notable durante el segundo día. Se requieren estudios adicionales

para verificar si este patrón es reproducible. Esta variación se explicaría por cambios en el

52

contenido de las proteínas totales durante el segundo día de cultivo, dados principalmente por el

aumento de células necróticas en el cultivo y la consiguiente degradación de la ACTINA presente

en ellas. Lo observado en el Western blot correspondería a lo aportado por las células viables

presentes en el cultivo. Estos resultados sugieren que las presentes condiciones de cultivo podrían

ser útiles para determinar cambios de expresión en proteínas de interés dentro de las primeras 24

h de cultivo, donde se observó una expresión mayor y relativamente constante para la proteína de

referencia ACTINA.

En el caso de la extracción de RNA, ésta se realizó en conjunto con un experimento de

una tesis paralela (García, 2007), en la cual se realizó el procedimiento de cultivo por 18 h en

lugar de 24 o 48 h. Los valores obtenidos de rendimiento de RNA de explantes cultivados por 18

h, fueron considerablemente bajos al compararlos con los valores obtenidos de extracción de

glándulas adrenales ex vivo (Abarzúa, 2007); la explicación a este fenómeno estaría dada al igual

que en el caso de las proteínas por una disminución de las células viables durante el cultivo. En

cuanto a la calidad de los extractos, se observó en un número limitado de muestras la presencia

de contaminación por DNA genómico y/o degradación de RNA, obligando a descartarlas para

análisis de qPCR posteriores. Esto estaría dado por la presencia de algún grado de necrosis

celular, dándose un fenómeno similar al ocurrido con la proteína ACTINA. Sin embargo, usando

las muestras seleccionadas, fue posible amplificar de manera exitosa el gen constitutivo -actina,

abriendo las puertas a futuras amplificaciones de genes de interés en muestras de RNA total de

adrenal de rata in vitro.

Complementando estos resultados, cabe decir que los ensayos de funcionalidad de los

explantes de adrenal de rata, midiendo la producción de corticosterona mediante

radioinmunoensayo resultaron exitosos (Richter et al, 2008); indicando de esta manera que en los

53

explantes, si bien su contenido de proteínas y RNA total disminuye en el tiempo, aún conservan

la capacidad de llevar a cabo sus funciones al menos hasta 18 h in vitro.

En nuestro laboratorio, la estandarización de estos cultivos tiene por objetivo estudiar las

potenciales acciones de melatonina sobre la función circadiana de la glándula adrenal de rata in

vitro. Andrews y Folk (1964) midieron consumo de oxígeno y producción de glucocorticoides en

cultivo de glándula adrenal de hamster y demostraron que estas variables fisiológicas mantienen

un ritmo circadiano por varios días. Esta capacidad oscilatoria intrínseca de la función adrenal en

cultivo podría explicarse por la presencia de un reloj periférico con un cierto grado de autonomía

en este tejido, dado por la expresión de los llamados genes reloj. Recientemente, se ha

demostrado expresión circadiana de genes reloj in vivo en glándula adrenal de rata (Abarzúa,

2007; Fahrenkrug et al, 2008); además evidencia preliminar mostrada en la presente Tesis

indicaría que estos genes continuarían expresándose durante el período en que se realizó el

cultivo, en particular la proteína CLOCK. Como referencia tenemos que en la glándula adrenal

del mono capuchino se han detectado transcritos de los genes reloj Clock, Bmal1, Per2 y Cry2 en

condiciones in vitro (Torres-Farfan et al, 2006a). Además existe evidencia obtenida mediante

mediciones continuas de luminiscencia de la expresión del gen reportero Per-2-luc en cultivos

organotípicos de varios tejidos de ratón en ausencia de suero, indicando la mantención de

oscilaciones sostenidas por varios días (Yoo et al, 2004).

Considerando todas las variables anteriormente mencionadas, se puede concluir que si

bien se presentó una disminución progresiva del rendimiento tanto de proteínas como de RNA, la

estandarización de un cultivo organotípico de glándula adrenal de rata, se puede considerar

exitosa; ya que se pueden obtener cantidades apropiadas de proteínas durante al menos las

54

primeras 24 h de cultivo y de RNA a las 18 h de cultivo, además de contar con explantes que

retienen una de las funciones características de la adrenal, como lo es la producción de

glucocorticoides (Richter et al, 2008); algo descrito previamente por muchos autores en la

literatura tanto en cultivos organotípicos como celulares (Malendowick et al, 2004; Macho et al,

1999; Mohn et al, 2005; Tena-Sempere et al, 2000; Andreis et al, 1992; Hung et al, 1988). Sin

embargo, estos cultivos presentan desventajas como son el excesivo número de animales a

sacrificar, debido al pequeño tamaño de las glándulas adrenales de rata (~ 20 mg cada una), lo

que genera problemas tanto a nivel económico (costo y mantención de los animales), como a

nivel práctico (excesivo tiempo en el sacrificio y obtención de explantes).

Por lo tanto, la presente investigación indica que el uso de cuartos de adrenal de rata

cultivados por no más de 24 h representa un modelo apropiado para investigar no solo

regulación de la producción de hormonas adrenales (Richter et al, 2008), sino también

cambios en expresión de mRNA y proteínas de interés (presente investigación).

55

6 REFERENCIAS

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