Técnicas de Ingeniería Genética
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Técnicas de Ingeniería Genética
REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA: PCR
Kary Mullis de Cetus Corporation……….1985
Video PCR
Termociclador
Tapa que calienta
Taq polimerasa
Taq polimerasa: ADN polimerasa termoestable aislada de la bacteria
termofílica Thermus acuaticus por Thomas Brock en 1965
Características:
Temperatura óptima 75-80 ºC., vida media 9 min. a 97,5 ºC.
No tiene actividad 3´a 5´exonucleasa baja fidelidad
Deja A en extremos 3´
Otras ADN polimerasas:
Pfu ADN polimerasa, aislada la bacteria termofílica Pyrococcus
furiosus .Tiene actividad 3´a 5´exonucleasa alta fidelidad
Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase
Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase
Error rates of different DNA polymerases. Fidelity assays were done
using lac I-based method modified from Frey & Suppmann, 1995.
FIDELIDAD
A 3.8 kb human beta globin gene was amplified according to supplier's
recommendations using varying extension times.
PROCESSIVITY
Extreme processivity: The Phusion polymerase has the highest
processivity of all thermostable DNA polymerases tested
Templado 1 μg ADN humano, copia simple
ADN: 105-106 moléculas blanco 10 ng ADN de levadura
1 ng ADN E. coli
Taq: 1-2,5 u
dNTPs : 20- 200 μM
Mg++ : 0.5-2.5 mM
Primers: 0.1-0.5 μM
Diseño de primers
Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG)
Evitar fragmentos largos de Gs (problema en síntesis)
Largo 18-30 nuc.
El largo de los primers no debe diferir en más de 3 n.
Extremo 3´: G o C, pero evitar 3 o más Gs o Cs seguidas
Tm 50-60 ºC
Contenido de GC: 40 -60 %
Evitar palindromos y repeticiones invertidas
Evitar complementariedad entre los pares de primers
Controlar la formación de dímeros y horquillas : evitar
estructuras con ΔG<-5kcal/mol
Primers muy largos, > 50 b deben, ser purificados
Verificar que los primers estén diseñados y encargados
en la orientación correcta
Sitios de corte en extremos, agregar bases extra.
Amplificación de un mismo gen de
distinto organismo
Primers degenerados Diseño de primers basado en la sec. de
aa. de la proteína
Buscar zonas conservadas para ubicar los primers
Largo de primers 6 a 7 aa, (agregar colas)
Buscar el primer menos degenerado
Fragmento de PCR: alrededor de 400 pb
Desventaja: baja especificidad
Touchdown PCR: gradual de la temperatura
1 opción M W
2 opciones F Y H Q N K D E C
3 opciones I
4 opciones V P T A G
6 opciones L S R
Cálculo de “degeneración”
DEWVP: 2x2x1x4x4= 64
Condiciones de reacción
Temperatura de Annealing /hibridación: 5ºC por debajo de
la Tm
Elongación: 0,5-3 min (2 min para 1 kb), 68-72 ºC
Ciclos: el número depende de la cc. del ADN blanco
Causas del plateau: degradación de dNTPs y enzima, depleción de primers y
dNTPs, inhibición por formación de producto (pirofosfato), competición por
reactivos por productos inespecíficos,
Impureza Concentración inhibitoria
SDS > 0.005 % (p/v)
Fenol > 0.2 % (p/v)
Etanol > 1 % (v/v)
Isopropanol > 1 % (v/v)
Acetato de sodio > 5 mM
Cloruro de sodio > 25mM
EDTA > 0.5 mM
Hemoglobina > 1 mg/ml
Heparina > 0.15 UI/ml
Urea > 20 mM
Mezcla de reacción de RT > 15 % (p/v)
IMPUREZAS QUE INHIBEN LA PCR
Agentes desestabilizantes y aditivos
Condiciones de desnaturalización del ADN más fuertes: para ADN con alto
contenido de G+C
DMSO
DMF hasta 10 % (V o P/P)
UREA
FORMAMIDA
Para amplificar secuencias muy largas se pueden usar aditivos
DMSO ………….ayuda en productos >1 kb
FORMAMIDA …… mejora especificidad
GLICEROL ………templados con alto contenido de G+C
PEG ………………cc. de templado muy baja
ALGUNOS TIPOS DE PCR
PCR ANIDADA
PCR IN SITU
PCR MULTIPLEX
RT-PCR
PCR EN TIEMPO REAL
PCR ANIDADA = NESTED PCR
Especificidad
1º: amplificación del ADN blanco. 2º: hibridación in situ con sonda
PCR in situ
PCR multiplex
Uso de varios primers al mismo tiempo
RT PCR
(archivo RT-PCR)
AAAAAAA m7Gppp
AAAAAAA m7Gppp TTTTTTT
TTTTTTT AAAAAAA m7Gppp
AAAAAAA TTTTTTT
Síntesis de la
primera cadena
Oligo dT AMV reverse transcriptase
Síntesis de la
segunda cadena
RNAsa H DNA polimerasa I
mRNA/DNA duplex
AAAAAAA TTTTTTT
T4 DNA polim. dNTPs
Rellenado
de extremos
cDNA duplex
T4 Ligasa
Construcción de una biblioteca de ADNc
Síntesis de ADNc
PCR en tiempo real
• Amplificación y detección simultánea, en el
mismo vial cerrado
• Se puede medir en cada momento la cantidad
de ADN sintetizado, por lo tanto permite conocer
la cinética de la reacción de amplificación
• Se mide la fluorescencia emitida por agentes
intercalantes o por sondas específicas marcadas
con fluorocromos
FASES DE LA PCR
Nº DE CICLO
Log [ADN]
3 replicados de una misma muestra
Curva de amplificación
El programa calcula el número de ciclo en el que el lector empieza a
detectar un incremento de fluorescencia significativo con respecto a la
señal de base : ciclo umbral (CT: threshold cycle)
PCR EN TIEMPO REAL
Curva patrón para cuantificación
Colorantes que se unen a ADN ds:
SYBR Green, fluoresce al unirse al ADN
Barato
Se une a productos inespecíficos como dímeros de primers
Sondas de hibridación
Caras
Específicas
Se puede usar en PCR multiplex
PCR EN TIEMPO REAL sondas de hibridación específicas
Sondas de hidrólisis Molecular beacons Sondas FRET
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
VECTOR CON ORI DE BACTERIÓFAGO
Preparar DNA del fago e hibridar con oligo
Mutagénico (dot blot) para identificar positivos
+ - + + -
Vectores con ori de fago: se
coinfectan con fago helper
para generar viriones simple
cadena
MUTAGÉNESIS POR PCR
Phusion™ Site-Directed Mutagenesis Kit
New England BioLabs
DpnI
Primers
mutagénicos
Stratagene
CASSETTE MUTAGÉNESIS
SECUENCIACIÓN DE ADN
SECUENCIACIÓN DE ADN
Degradación química: Maxam y Gilbert
Terminación de cadena: Sanger didesoxi
SECUENCIACIÓN DE ADN
POR DEGRADACIÓN QUÍMICA- MAXAM Y GILBERT
Corte específico de bases por reactivos químicos de una molécula de ADN
marcada en el extremo y posterior electroforesis
1º se modifican las bases (G, G+A, C+T, C) y luego se incuban con
piperidina caliente que rompe el enlace azúcar fosfato
Ventajas.
La secuencia se obtiene de la molécula original
Se puede determinar la sec. muy cerca del extremo marcado (2 o 3 bases)
Se puede determinar la sec. de ADN totalmente desconocido
Desventajas
Diferentes condiciones para cada reacción….+ lento y menos reproducible
Sec. Más cortas
Modificaciones químicas específicas de bases en el ADN
Base modificada Modificación específica
G Metilación de base con dimetil sulfato a pH 8.0. –Corte con alcali
A + G Tratamiento con piperidina formato a pH 2.0.
- remoción de purinas
C + T Hydracina abre los anillos de pirimidinas
causando su remoción del ADN
C En alta fuerza iónica (1.5 M NaCl) solo la
citosina reacciona con hidracina
A > C
Tratamiento con 1.2 M NaOH a alta
temperatura (90°C) provoca mayor corte en A y
menos en C
Cuando las bases son modificadas y destruídas se hace un tratamiento
con piperidina a 90 ºC para cortar el enlace azúcar- fosfato del sitio
Dirección 5´ a 3´
DNA footprinting
Maxam
MÉTODO DE TERMINACIÓN DE LA CADENA:
SANGER DIDESOXI
Emplea a la ADN polimerasa para extender la hebra de ADN hasta
que se termina por incorporación de un 2´,3´-didesoxinucleótido
(ddNTP)
Marcación de la hebra de ADN
☻Extremo 5´: primer marcado con [γ-32P]ATP por T4 polinucleótido
quinasa
☻Hebra sintetizada: se usa un dNTP radiactivo (en general 35S)
☻Extremo didesoxi. Cada didesoxi está marcado con un colorante
fluorescente distinto. Para sec. automático.
AZT
Gel de secuencia
Video secuenciación
Secuenciación de ADN (automática en gel)
a) Reacción de secuenciación b) Análisis de la reacción
Secuenciación de ADN
(automática en capilar)
Video sec. automática
http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/
PRIMER WALKING
SHOT GUN
Método para determinar secuencias de fragmentos de ADN muy grandes
Strand Sequence
Origin AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA
First shotgun sequence AGCATGCTGCAGTCATGCT-------------
---------------------------------------TAGGCTA
Second shotgun
sequence
AGCATG----------------------------------------
------------CTGCAGTCATGCTTAGGCTA
Reconstruction AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA
Principio general de los diferentes sistemas de pirosecuenciación
Ronaghi M Genome Res. 2001;11:3-11
©2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press
APS: adenosina fosfo sulfato
PIROSECUENCIACIÓN
Library Preparation Sample Input and Fragmentation
PCR
One Fragment = One Bead emPCR (Emulsion PCR) Amplification
PIROSECUENCIACIÓN
APS:Adenosina
fosfo sulfato
Se agregan los dNTPs secuencialmente. Después de cada agregado se lava
Data Analysis
