Técnicas de Reproducción Asistida en Humanos · 2021. 2. 10. · Proceso mecánico y enzimático....
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Tema 7. Inseminación in vitro
Técnicas de Reproducción Asistida en Humanos
Dra. Virginia García-Láez Moreno
© Virginia García-Láez Moreno
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A) Fecundación in vitro convencional (FIV)
B) Microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)
Inseminación in vitro
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Coincubación de los gametos masculino y femenino en una placa de cultivo.
A) Fecundación in vitro convencional (FIV)
Indicaciones: No problemas de fertilidad mayores (Ej. Solo hay patología tubárica bilateral)
Sospecha de inmadurez ovocitaria (cultivo con CC ! MII)
Semen buena calidad ! capacitado con recuento y calidad óptima. Fresco o cong.
Inseminación in vitro
Ovocito permanece con CC
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A) Fecundación in vitro convencional
❑ Seminograma ❑ Capacitación ❑ Nuevo seminograma (EMP/ml) ❑ Dilución de la muestra
de semen (mc con GLU) ❑ Recuento de
comprobación
Protocolo:
80.000 -100.000 EMP/mL Si >[ ] ! TPN
Inseminación in vitro
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A) Fecundación in vitro convencional
❑ Preparación de la placa de inseminación
Protocolo:
80.000 -100.000 EMP/mL
10 ml aceite
1h antes
Inseminación in vitro
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A) Fecundación in vitro convencional
❑ Inseminación de los ovocitos
❑ Decumulación para evaluar la fecundación
4h post-punción Coincubación 16-20 horas
Protocolo:
Reacción acrosómica
Inseminación in vitro
Reacción en cadena en el ovocito! Bloqueo de la polispermia Entrada de un único spz ¿Entra entero?
Hialuronidasa 80UI/ml
Pipeteo mecánico
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B) Microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)
Inseminación in vitro
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B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
Antecedentes del ICSI
1. Disección Parcial de la Zona Pelucida (PZD: Parcial Zona Dissection o Parcial Zona Drilling)
1989
Inseminación
Semen de mala calidad ! No FIV
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Antecedentes del ICSI
2. Inseminación bajo la Zona Pelúcida (SUZI: Sub-Zonal Insemination)
1991
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
Inseminación
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Introducción de un espermatozoide dentro del ovocito
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
Inseminación
¿error o a conciencia?
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DecumulaciónLiberar a los ovocitos de las CC que lo rodean.
Seleccionar los ovocitos en estadio MII para ICSI.
A las 4h post punción ! ICSI 2 h ! vitrificación Hialuronidasa
80 UI/ml
Inseminación
Preparación de la placa (37ºC y 5.5% CO2)
Añadir 50 µl
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Proceso mecánico y enzimático.
Aspirar y soltar los ovocitos repetidamente a través de la pipeta para que las células de la granulosa de alrededor se suelten.
Usamos pipeta pasteur estirada o micropipeta de 100 µl.
Pasamos por las 3 gotas NO >1 minuto en la hialuronidasa. (daño y activación del ovocito)
Decumulación más fina con pipeta pasteur más estirada o punta de stripper
Inseminación
Decumulación
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Inseminación
Estadios de maduración de los ovocitos
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Ovocitos latentes en Profase I o VG Pico de LH: reanuda la meiosis ! MII Ovulación Entrada del espermatozoide Activación del ovocito (Ca intracel) Reactivación del ciclo celular para terminar la meiosis Extruye el 2do CP Continuar con los siguientes ciclos de división celular.
Ovocito MII
Ovocito MI
Ovocito VG
Ciclo de maduración de los ovocitos
Inseminación
Zigoto Mitosis
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Clasificación de los ovocitos
¿¿Ovocito MII??
Inseminación
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Indicaciones.
Factor masculino grave (OAT)
Azoospermia (BT o AE)
Mala recuperación del semen tras capacitación (No IA o FIV)
Aglutinación de spz por causa inmunitaria
Sémenes valiosos (no desperdiciar)
Fallo de gestación tras IA (½ FIV y ½ ICSI)
Fallo de fecundación en FIV
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
Inseminación
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Indicaciones Diagnóstico preimplantacional (no spz pegados) Congelación y descongelación de ovocitos ! Decumulados
Ovocitos MIV
Esterilidad de origen desconocido
Mala calidad ovocitaria
Pocos ovocitos
Edad materna avanzada
¿¿¿ICSI de rutina???
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
No arriesgar
Inseminación
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1. Preparación de la placa de ICSI
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
10 ml
(Polivinil Pirrolidona)
Inseminación
ProtocoloDía anterior o en el momento
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2. Colocación de las pipetas de microinyección ! Holding e ICSI
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
40x
Inseminación
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B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
Microinyectores ! Subir y bajar medio Micromanipuladores ! Desplazarnos en las direcciones de los ejes x-, y-, z-
Inseminación
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3. Selección del espermatozoide
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
40x Spz+PVP ! ralentizar movimiento Mejor morfología y movilidad Desestabilizar la cola
Inseminación
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3. Selección del espermatozoide
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
Lavado del spz en PVP solo Introducción en pipeta por la cola
Inseminación
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4. Microinyección del espermatozoide
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
1er CP lejos de la zona de inyección (12 horarias) ! no dañar huso meiótico Rotura de ZP ! presión Rotura de mb plasmática ! presión o aspirado Depositar el spz + citoplasma aspirado Retirada lenta
Inseminación
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Inseminación y Decumulación
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
Spz en zona 3 Si viscoso o succión ! zona 4
¿Anotación o pérdida de tiempo?
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POLSCOPE
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
Birrefringencia de estructuras organizadas
Microscopio con luz polarizada
1. Indicador de la calidad de los ovocitos ! visualizar presencia del huso meiótico ! Comprobar MII
2. Indicador de la posición del huso ! ayuda a la microinyección
Muy útil en ovocitos congelados ! movimiento.
Inseminación
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Dismorfismos ovocitarios
35%Ovocito: 110-115 micras, esférico
Mb pl (oolema) turgente
Citoplasma (Mit, REL, Ap Golgi) homogéneo
ZP: 15-20 micras, esférica
EP mínimo
CP único, aplanado y homogéneo.
Inseminación
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Dismorfismos ovocitarios
¿¿¿Las anomalías morfológicas de los
ovocitos pueden afectar a la calidad de
los ovocitos y a las tasas de reproducción
asistida???
Inseminación
¿Anotación o pérdida de tiempo?
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Tipos de ruptura de la membrana plasmática
Tipo SS (Sin Salto)
Tipo A1
Tipo A2
Tipo A3
Tipo Stirring
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
¿Anotación o
pérdida de tiempo?
Inseminación
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Se pasan los ovocitos desde la placa de ICSI a una placa con medio de cultivo de crecimiento.
Incubador a 37ºC y 5%CO2.
Al día siguiente se evalúa la fecundación.
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
Inseminación
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Patologías del semen
Bajo nº de EMP ! problema de movilidad
Pentoxifilina Activa las mitocondrias del spz Solución salina isotónica + Pentoxifilina + m.cultivo ! Concentración de 50 mg/mL
Se le añade a la gota con spz sin PVP Gota más grade y más aplanada
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
Inseminación
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Patologías del semen
Ningún spz móvil ¿Astenozoospermia total o Necrozoospermia?
Solución hipoosmótica (Evaluación de la vitalidad) Suero salino (300 mOsm) y agua tetradestilada. Proporción 1:1 ! concentración de 150 mOsm. Los spz vivos ! permeabilidad de mb Incorporan solución en la cola y se enrolla. Incorporan solución en cabeza y se hinchan.
B) ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides)
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FIN !!!
Gracias por su atención
Inseminación