Amplificación de Plásmidos

A) Transformación:

1) Esterilizar el material.- Tips amarillos, azules y 0.1- Probeta de 100 ml- Tubos- Erlenmeyer- Eppendorf

2) Preparar medio LB (20 g/l) y autoclavar.

3) Tener bacterias competentes.

4) Preparar placas LB-ATB. Se usa el ATB al cual la bacteria adquiere la resistencia al incorporar el plásmido.Placas: 3g agar/200 ml de LB. Autoclavar y una vez que termina esperar que llegue a temperatura sin que solidifique el agar (aproximadamente cuando uno puede tocar el frasco). En ese momento agregar el ATB que corresponda.

Solución------------------------------Concentración

Stock------------------------------Almacenamiento

Concentración--------------------------------Plásmido astringente

de trabajo--------------------------Plásmido relajado

Ampicilina 50 mg/ml H2O -20ºC 20 g/ml 60 g/ml

Carbenicilina 50 mg/ml H2O -20ºC 20 g/ml 60 g/mlCloranfenicol 34 mg/ml EtOH -20ºC 25 g/ml 170 g/mlKanamycina 10 mg/ml H2O -20ºC 10 g/ml 50 g/mlStreptomycina 10 mg/ml H2O -20ºC 10 g/ml 50 g/ml

Tetraciclina 5 mg/ml EtOH -20ºC 10 g/ml 50 g/ml

La soluciones stock de ATB disueltas en H2O deben ser esterilizadas por filtración a través de un filtro de 0.22. Los ATB disueltos en EtOH no necesitan ser esterilizados.Los iones Mg2+ son antagonistas de las tetraciclinas. Usar medio sin sales (ej: medio LB) para la selección de bacterias resistentes a tetraciclinas.Esperar a que el agar solidifique y guardar en la heladera hasta el momento de plaquear

5) Transformación de bacterias.

- 100 l bacterias competentes + 1 l Plásmido (200 ng/ml). Para transformar el volumen del plásmido no puede ser mayor que el volumen de bacterias (que no supere el 10% del volumen).

- Incubar 30 min. a 4ºC (hielo).

- Incubar 1 min. a 42ºC.

- Incubar 2 min. a 4ºC (hielo).

- Agregar 300 l LB sin ATB.

- Incubar 1h 37ºC agitándose.

- Plaquear 50 l.

B) Minipreps ClLi para plásmidos:

1) De cada placa de bacterias que han sido transformadas se pican 3-4 colonias para realizar un cultivo en 3ml de LB-ATB, ON a 37ºC.

2) Del cultivo realizado se toman aproximadamente 1.5 ml y se centrifuga 2 min 10000 xg.

3) Buffer TELT

50 ml 10 mlTris/HCl 1M pH: 7.5 2.5 ml 0.5 mlEDTA 250 mM 12.5 ml 1.5 mlTriton X-100 0.2 ml 40 lClLi 5.3 g 1.1 g

Composición final del buffer: - Tris/ClH pH: 7.5 50 mM - EDTA 62.5 mM - Triton X-100 0.4% - ClLi 2.5 M

4) Preparar la mezcla Telt-Lisozima.90 l de Telt + 10 l de Lisozima (10 mg/ml). Se utiliza de la mezcla 100 l por tubo. Se agrega la mezcla a las bacterias, luego se vortexea bien de manera que queden todas las bacterias bien resuspendidas.

5) Se deja 5 min. a temperatura ambiente.

6) Hervir 1 min. ( agujerear la tapa del eppendorf antes de hervir)

7) Dejar en hielo 2 min.

8) Centrifugar entre 10-20 min. 10000xg.

9) Recoger el sobrenadante.

10) Agregar 1 volumen de isopropanol, dejar 20 min. a temperatura ambiente.

11) Centrifugar 20 min., descartar el sobrenadante.

12) Lavar el pellet con 100 l de EtOH 70%.

13) Centrifugar 5 min. 10000xg.

14) Secar en bomba de vacío.

15) Resuspender en 10 l de agua estéril (se usan 5 l para la digestión enzimática).

16) Conservar a –20ºC hasta el momento de realizar el gel.

C) Gel Agarosa 1% - Bromuro de etidio:

Gel1) Se prepara 50 ml: - 0.5 g Agarosa.

- 50 ml de TBE 0.5 x.

2) Calentar hasta que la solución este transparente.

3) Dejar enfriar, hasta que se pueda tocar.

4) Agregar 4 l de Bromuro de etidio.

6) Armar el gel.

7) Correr con 300 ml de TBE 0.5 x.

Muestras

5l de la muestra + 2l buffer loading + 3l de agua.Se siembra la totalidad.

20 l de muestra digerida + 4 l buffer loading 6x.Se siembra la totalidad.

Standar DNA/HindIII Markers.10 l DNA/HindIII.16.7 l buffer loading.23.3 l Agua.Se siembra 1-3 l.

D) Midiprep:

1) El día anterior se realizan precultivos de las colonias elegidas por los resultados del gel.4ml LB + ATB + 20l de bacterias de la mini. Incubar ON 37ºC.

2) Batch para miniprep: 80 ml LB + ATB + 4 ml de bacterias en erlenmeyer esterilizado. Incubar a 37ºC ON.

3) Obtención del lisado bacteriano:

- Pelletear las bacterias a 10000 xg 10 min a 4C (tubos gordos Sorvall). Se hace en dos veces, o sea se pelletea, se elimina el sobrenadante, cargar el resto y pelletear.

- Eliminar el sobrenadante y secar el tubo sobre papel.

- Resuspender completamente el pellet en 3 ml de solución de Suspensión. (vortexear bien).

- Agregar 3 ml de Solución de lisis. Mezclar por inversión 4 veces. La solución se aclara. (Algunas bacterias son más resistentes a la lisis y requieren una incubación de 3-5 min. para una lisis eficiente. Lo mismo ocurre con cultivos de más de 50 ml. No extender la lisis por más de 3-5 min. porque el ADN puede pasar a simple cadena.

- Agregar 3 ml. de Solución de neutralización. Mezclar por inversión 4 veces.

- Centrifugar el lisado a 14000 xg por 15 min. a 4ºC. Si al final de la centrifugación no se obtiene un pellet bien firme, centrifugar 15 min. más.

- Pasar el sobrenadante a otro tubo evitando tocar el precipitado.

4) Purificación del Plásmido.

- Disolver los agregados de la Resina, si es necesario, calentando a 25-37ºC 10 min. Enfriar a 30ºC antes de usar. Agitar antes de cargar ya que es una suspensión.

- Mezclar el sobrenadante anterior con 10 ml de Resina. No se requiere una incubación muy excesiva del Plásmido con la resina porque a esa concentración el Plásmido se pega a la resina inmediatamente. No dejar la resina en contacto con el lisado más del tiempo que se requiere para cargar las minicolumnas.

- Colocar la columnita en un kitasato con tapón de goma. Si no queda bien justo sellar con parafilm. Aplicar vacío. Bomba De Vació: abrir canilla, encender interruptor, conectar manguera. Para sacar el vacío es al revés.

- Una vez que pasó toda la resina se realizan 2 lavados con 15 ml de Solución de lavado cada uno. No permitir que la columnita se seque.

- Secar la Columnita 30 seg. No superar ese tiempo.

- Cortar la columnita con un cutter y colocarla en un eppendorf.

- Centrifugar 2 min. a 10000 xg para extraer los restos de solución de lavado.

- Pasar la columnita a otro eppendorf estéril. Agregarle 300 l de agua destilada estéril y centrifugar 20 seg. para eluir el plásmido.

- Centrifugar el eppendorf 5 min. a 10000 xg para pelletear las partículas de resina que queden en suspensión y pasar el sobrenadante a otro eppendorf estéril.

- Se puede lavar con 50-100 l de agua destilada estéril si al cuantificar la cantidad de ADN es poca. Tener en cuenta que el Plásmido se conserva bien en la columnita hasta 30 min., al cabo de los cuales existe riesgo de que se nickee.

- Conservar a 4ºC o –20ºC.

D) Cuantificación:

1) Gel de Agarosa grande para cuantificar.

- Buffer TBE 1x. Se usan 250 ml que se reparten, 210 ml para buffer de corrida y 40 ml para hacer el gel.

- Para un gel 1% poner 0.4 g de agarosa en 40 ml de TBE 1x.

- Calentar hasta que la solución este transparente. Dejar enfriar.

- Agregar 1l de Bromuro de Etidio a los 40 ml de TBE 1x con agarosa. Agitar suavemente y volcar en la cubeta a la que se le coloca el peine. Es importante que no se formen burbujas.

- Agregar 5l de Bromuro de Etidio a los 210 ml restantes de TBE 1x y está listo para usar como buffer de corrida.

2) Muestra

Plásmido sin digerir.Dilución 1/10: 1l de ADN + 10l de agua.De la dilución se toman alícuotas de 3 y 5 l, se le agrega 5 l de buffer loading BPG y se lleva a 10l de volumen final con agua. Se siembra la totalidad de la muestra.

E) Digestión enzimática:

Cualitativo: 5l ADN + 1l ARNasa + 10l agua + 2l EZ + 2l buffer.2h a 37ºC.(volumen final 20l)Todo lo digerido 20l se le agrega 4l de buffer loading y se siembra la totalidad o lo que se pueda según lo que permita la calle.

Cuantitativo:1l ADN + 1l EZ + 1l ARNasa + 2l buffer + 15l agua.2h a 37ºC. (Volumen final 20l)Se toman alícuotas de 1,3 y 5l del digerido, se agrega 5l de buffer loading BPG y se lleva a 10l con agua. (Volumen final 10l).

F) Glicerol Stock:

- 40l del cultivo (mini) + 4 ml LB + ATB Crecer ON 37ºC.

- 850l del cultivo ON + 150l de glicerol estéril. Vortexear y guardar a –70ºC.