Tecnica histologica corta
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Escuela de Medicina Luis RazettiDepartamento de Ciencias Morfológicas
Cátedra de Histología y Embriología
Dr. Luis Alberto Isea MMédico Cirujano
Octubre 2011
HISTOLOGÍA
- Ciencia que estudia los tejidos de los seres vivos
Anatomía
Macroscópica
Microscópica
Histo + LogíaTejidos Ciencia
- Correlación Estructura - Función
Proceso Patológico
Clínica
TÉCNICA HISTOLÓGICA
Tejido
Corte Histológico
Procedimientos
Microscopio
Pasos de la Técnica Histológica
1) Obtención del material
Biopsia
Incisional
Excisional
Autopsia Citología
TÉCNICA HISTOLÓGICA2) Fijación
- Preserva morfología y estructura del tejido
- Detiene procesos celulares dinámicos
- Elimina posibles patógenos
- Aumenta la consistencia del tejido
Autolísis
- No produce Artefactos
- No dificulta etapas ulteriores de la técnica
- Buena penetración al tejido
Idealmente:
Mec. de Acción: Forman Enlaces cruzados entre las Proteínas (Grupos Amino)
Gel insoluble
TÉCNICA HISTOLÓGICA
Fijación
Inmersión
Perfusión Debe colocarse inmediatamente
Volumen de fijador de 10 a 20 veces la muestra
Dejar por 6 a 24 horas
Fijadores
Físicos
Químicos
Simples
Compuestos
a) Formolb) Alcoholc) Glutaraldehidod) Tetraóxido de Osmio
Liquido de FlemingLiquido de Zenkere) Líquido de Bouin
TÉCNICA HISTOLÓGICAa) Formol: - Mas utilizado - Mal fijador de membranas
- Bajo precio
- Buena efectividad
- Poca retracción tisular
- Disuelve el glucógeno
b) Alcohol - Fija por deshidratación
- Útil para citologías. «Lacas o spray»
c) Glutaraldehido
d) Tetraoxido de Osmio
- Excelentes fijadores
- Suelen usarse para la Microscopía Electronica
- No para coloraciones convencionales
TÉCNICA HISTOLÓGICAe) Líquido de Bouin - Ácido Pícrico + Formaldehído + Ácido Acético
- Tejidos blandos, núcleo, glucógeno
- No dejar mas de 48 hr en inmersión
- Eliminar ácido pícrico antes de la inmersión
3) Inclusión
Combinación del tejido con ceras (insolubles en agua) para formar un bloque de corte
Debe eliminarse el agua de la preparación
DESHIDRATACIÓN
Batería de alcohol etílico
Concentraciones crecientes (50-100%)
TÉCNICA HISTOLÓGICA
- Se mezcla con un líquido miscible en parafina y agua
Xilol
ACLARAMIENTOTejido Transparente
Disuelve las grasas
- Se realiza la mezcla con las ceras (Parafina)
a) Impregnación: Se pasa por parafina caliente, removiendo el xilol
b) INCLUSIÓN: Se baña completamente con parafina
Otorga la dureza al tejido para realizar el CORTE
TÉCNICA HISTOLÓGICA4) Corte
- Una vez en el bloque de parafina, se cortan rebanadas de 5 – 10 mcm (M. óptica)
MICROTOMO
- Se coloca el corte en un baño de flotación
- Se monta en una lámina portaobjeto
TÉCNICA HISTOLÓGICA5) Tinción
- Necesitamos diferenciar las estructuras del corte.
- Los colorantes presentan diferente afinidad por ciertos elementos, dando CONTRASTE al preparado histológico
- La mayoría de los colorantes son HIDROSOLUBLES
Rehidratar el tejido
- Se elimina la parafina con xileno
- Se añade alcohol a concentraciones decrecientes
Colorantes
Ácido - Básico
Especializados (MEC)
Sales Metálicas (M. Electronica)
TÉCNICA HISTOLÓGICAHematoxilina – Eosina (Coloración mas utilizada)
- Se basan en las propiedades de BASOFÍLIA y ÁCIDOFILIA
Hematoxilina: - Colorante Básico (al unirse con una Laca)
- Carga Positiva
- Es Hidrosoluble, colocar antes de deshidratar
Tiene afinidad por estructuras con carga NEGATIVA (BASOFILICAS)
ÁCIDOS NUCLEICOS (NÚCLEO CELULAR)
COLOR PÚRPURA
TÉCNICA HISTOLÓGICAEosina: - Colorante Ácido
- Carga Negativa
- Tiene afinidad con estructuras de Carga Positiva (ÁCIDOFILAS)
- Unión con componentes CITOPLASMATICOS
COLOR ROJO - ROSADO
TÉCNICA HISTOLÓGICA
6) Montaje
- Antes de ver el preparado al microscopio, debe colocarse una lámina cubreobjetos
- Debe colocarse una sustancia conservadora a la muestra, para fijar ambas láminas
HIDROFÓBICA
- Volver a deshidratar el tejido y colocar xileno
TÉCNICA HISTOLÓGICADesventajas de la H - E
- No permite evaluar: a) Elastina b) Fibras reticulares c) Membranas basales d) Lípidos
Coloraciones Especiales (Histoquímica)
TÉCNICA HISTOLÓGICASudan III Tinción Lípidos (Corte Congelado)
Rojo Sudan (TAG) Negro Sudan (Neuronas)
Tricrómico de Mallory Fibras Colágenas (Azul)
Wright y Giemsa Células Hemáticas
Azul de Toluidina Metacromasia
- La coloración depende de la agregación de las moléculas
- Se ve en tejidos con gran cantidad de polianiones
- Azul --------------------- Púrpura
-Glucosaminoglicanos MEC, Gránulos Mastocitos
Reactivo de Schiff
(Reacciona con grupos aldehídos)
PAS: Carbohidratos, Glucogeno (Rojo)
Feulgen: DNA
TÉCNICA HISTOLÓGICA
Inmunohistoquímica
- Se basa en la interacción ANTÍGENO – ANTICUERPO para la identificación de moléculas
Antígeno: Toda sustancia capaz de desencadenar una respuesta inmune
Anticuerpo: Sustancia capaz de unirse a un antígeno de manera específica
- Se colocan anticuerpos, de laboratorio, específicos para la molécula que queremos Identificar
- Una vez producida la interacción debe colorearse o demostrarse su presencia
Enzimas Radiación Fluorescencia
TÉCNICA HISTOLÓGICA
- Puede ser
a) Directa: El anticuerpo colocado esta marcado dando directamente la coloración
b) Indirecta: Se coloca un Auto-anticuerpo, el cual interactúa con el anticuerpo colocado inicialmente, de darse la reacción
TÉCNICA HISTOLÓGICAHibridación
- Capacidad de hebras monocatenarias de DNA o RNA de unirse a hebras complementarias
- Se aísla DNA o RNA de la célula a examinar, y se mezcla con una sonda Con nucleotidos conocidos, con un marcaje (fluorescencia, radiación)
- El fragmento de la sonda interactuara con su hebra complementaria identificandoSu presencia en la célula a estudiar
TÉCNICA HISTOLÓGICAArtefactos
- Falla en la preparación histológica
- Errores en metodología (falla en el calculo de tiempos o selección de colorantes)
- Equipo inadecuado (cuchillas desafiladas)
- Reactivos con poca pureza
TÉCNICA HISTOLÓGICAInterpretación del Corte histológico
MICROSCOPÍAMicroscopio. Concepto
- Permite ver imágenes ampliadas y detalladas de estructuras no visibles a simplevista
Clasificación
Óptico (Luz)ElectrónicoEfecto TúnelFuerza Atómica
M. Óptico
Simple (1 lente)
Compuesto(2 o más lentes)
(fuente de luz)
a) Campo Clarob) Campo Oscuroc) Contraste de Fased) Luz Polarizadae) Fluorescenciaf) Confocal
MICROSCOPÍAMicroscopios Ópticos
a) Campo Claro
- La luz atraviesa la muestra (Transiluminación)
- El corte debe ser delgado (5 – 10 mcm)
- La coloración permite el contraste entre las estructuras
Partes
Mecánica Óptica
Da soporte y estructura
Iluminación y aumento
MICROSCOPÍAParte Mecánica
Pie
ColumnaRevolver
Tubo
Platina
TMacrometrico
TMicrometrico
MICROSCOPÍAParte Óptica Observación
1) Objetivo: - Tubo metálico constituido por varias lentes
- Forman una imagen aumentada, dan resolución
Límite de resolución
Capacidad de una lente de distinguir dos objetos cercanos como independientes
Poder de resolución
Distancia mínima entre 2 objetos para que sean identificados como objetos separados
A MAYOR PODER DE RESOLUCIÓN
MENOR LÍMITE DE RESOLUCIÓN
MAS NÍTIDEZ EN LA IMAGEN
0,2 – 0,5 mcm (M. óptica)0,2 mm (Ojo humano)
MICROSCOPÍA
Número de Aumento: Depende de las lentes, es el grado de magnificación de la imagen
10X, 40X, 100X
Abertura Numérica: Capacidad de captar rayos luminosos
10X40X100X
0,300,651,30
LR = K x λ / AN MAYOR ABERTURA MAYOR RESOLUCIÓN
Objetivo
MICROSCOPÍADistancia mecánica:
- Longitud máxima en mm del tubo
Medio de inmersión: (Secos vs. Húmedos)
- Presenta un índice de refracción similar al del vidrio
- Disminuye la desviación de los rayos de luz
Espesor del cubreobjetos:
- Grosor máximo de la lámina cubreobjetos
2) Ocular
- Cilindro hueco con un lente convergente en cada extremo
- Amplifica 10 X la imagen, no da resolución
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MICROSCOPÍAAumento total = Aumento del Ocular x Aumento del objetivo
Aumento vacío = Aumento sin resolución
MICROSCOPÍAParte Óptica Iluminación
3) Condensador y Diafragma
- Reciben la luz y la enfocan a la platina por medio de lentes
- Diafragma: Regula la cantidad de luz que pasa a la preparación
4) Fuente de luz
- Bombillo de halógeno. Ilumina la muestra
MICROSCOPÍARecomendaciones al utilizar el microscopio:
1) Coloque el preparado con el cubre objetos hacia ARRIBA
2) Use siempre el objetivo de MENOR aumento primero
3) Use ambos ojos para ver la preparación
4) Realice un primer enfoque con el tornillo MACROMETRICO
5) Si desea enfocar aun mas, oriente la región hacia el centro de la lámina
MICROSCOPÍAOtros microscopios…
b) Campo Oscuro
- Utiliza un filtro en el condensador que evita que los rayos centrales lleguen a lamuestra
- Solo llegan rayos difractados, indirectos
- Partículas brillantes sobre un campo oscuro
- Igual resolución, pero mayor contraste
IMPORTANCIA MÉDICA?
MICROSCOPÍAc) Contraste de Fase
- Diferente índice de refracción de las estructuras retrasan (desfasan) los rayos
Diferencia de amplitud
Diferencia de intensidad
- Se una en células vivas
- Puede compararse con un rayo de referencia
M. De Interferencia
Cuantitativo
MICROSCOPÍAd) Luz Polarizada
- Orientación molecular de los componentes del material
- La luz incidente viaja en un solo plano (polarizador)
Muestra
Birefringente (anisotropa)
Isotropa
Divide a la luz en 2 componentes
- Diferencia estructuras en base a su refringencia.
- Musculo estriado y Cel. De Leydig (testiculo) muestran birrefringencia
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MICROSCOPÍAe) Fluorescencia
Fluorescencia
Natural
Colorantes (fluoresceína)Absorbe Luz AzulIrradia Luz Verde
- Se usan filtros para la λ incidente e irradiada
- Usos: - Marcaje molecular
- Estudios celulares
- Inmunología
Para evitar distorsión de rayos de luz M. Confocal
MICROSCOPÍAf) Confocal
- Evita la distorsión provocada por los rayos reflejados desde otros planos de corte
- Se excluye la luz no emitida por el plano focal
- Se coloca un detector con una hendidura en conjunción con el plano focal de la lente
- Puede dar imágenes 3D
MICROSCOPÍAMicroscopio Electrónico
- Se calienta un filamento de tungsteno (cátodo)
- Se genera una ΔV entre cátodo y ánodo Haz de electrones
(Baja λ)
Mayor ResoluciónLR = 0,2 nm
- Se usan bobinas electromagnéticas como guía
Lente condensadora Lente objetivo
- Requiere una preparación especial
Fijadores: Glutaraldehído + Tetraóxido de Osmio Dan Densidad Electrónica
Infusión: Se usan Resinas epoxi plásticas
Corte: Cuchillas de diamante. Cortes muy delgados (25-100 nm)
Tinción: Metales Pesados. Resaltan la estructura
MICROSCOPÍA
M. Electrónico
Transmisión (El haz atraviesa la muestra)
Barrido (No atraviesa la muestra)
Transmisión:
- Los elementos celulares y la tinción le restan energía a los e-, los cuales chocancon una pantalla fluorescente o placa fotográfica
- Su energía cinética se interpreta en relación a las características del tejido
Barrido
- Se tiñe la superficie de la muestra con materiales pesados
- Los e- chocan contra la superficie y se reflejan, siendo captados y procesados
MICROSCOPÍAM. de Efecto Túnel
- Se coloca una punta afilada a corta distancia de la muestra
- Se le da voltaje a la punta, creando una ΔV en relación a la muestra (conductor)
- Se crea un flujo de electrones (túnel)
- Puede operar en 2 modos: Altura o Corriente constante
M. de Fuerza Atómica
- Se coloca una punta pequeña, adherida a una barra flexible (cantilever)
- La punta experimenta fuerzas de atracción o repulsión con la muestra generando flexiones del cantilever, que son medidas con un laser
- Se puede estudiar cualquier tipo de muestra
- LR: 50 pm
GRACIAS!
@Luisalbertoisea
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