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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 1 Técnica para captar e identificar los pólenes Jordina Belmonte Laboratori d’Anàlisis Palinològiques Unitat de Botànica Universitat Autònoma de Barcelona http://www.uab.es/l-analisis-palinologiques/aerobio.htm

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 1

Técnica paracaptar e identificarlos pólenes

Jordina BelmonteLaboratori d’Anàlisis PalinològiquesUnitat de BotànicaUniversitat Autònoma de Barcelona

http://www.uab.es/l-analisis-palinologiques/aerobio.htm

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Métodos de captación polínica

Métodos basados en los principios de:

• Deposición gravitacional (no volumétrico)

• Portaobjetos• Placa de Petri• Método Durham• Trampas Tauber

• Hirst spore trap (Burkard, Lanzoni)• Impacto en cascada (Andersen)

• Filtros de fibra (Cour) y de membrana

• Muestreador Rotorod • Muestreador ciclónico

• AGI (All Glass Impinger)

• Impacto por succión• Impacto por filtración• Impacto por rotación

• Filtración en medio líquido

• Preciptación electrostática• Precipitación térmica

volumétricos

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Métodos de captación polínica. Deposición gravitacional

• Portaobjetos• Placas de Petri• Método Durham• Trampas Tauber

Captador Durham modificado

Catalunya (1983-1988)¡no gravimétrico!

Trampas TauberCaptador Durham

Sistemas no volumétricos

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Métodos de captación polínica. Impacto por succión

Esquema de muestreador Andersencon seis pisos de recogida de partículas

• Hirst spore trap (Burkard, Lanzoni)• Impacto en cascada (Andersen)

Sistemas volumétricos

Captador Andersende Lanzoni

Captador Andersen

Se presenta detalladamente más adelante

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Métodos de captación polínica. Impacto por rotación

Muestreador Rotorodimpacto por rotación mecánica

Muestreador ciclónico de Burkardimpacto por rotación de la masa de aire

• Muestreador Rotorod • Muestreador ciclónico

Sistemas volumétricos

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Estandarizado en lasredes aerobiológicas europeas

Orificio de entradaaire

Motor de succiónBomba de vacío

Veleta

Visera

Cabezal extraiblecierre hermético

Captador de poleny esporasModelo Hirst

Marcas comerciales

Burkard y Lanzoni

Sistema volumétricoImpacto por succión

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Funcionamiento captador Modelo HirstMarcas Burkard y Lanzoni

Bomba de vacío

Orificioentradaaire

Cinta adhesiva alrededor tambor

TamborMecanismo relojeríaavance 2mm/hora

Sentido de giro del tambor

Tambor

Cabezal extraible

Cuerda mécanismo relojería

Cinta adhesiva alrededor tambor

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Muestreo semanal, en captadores Hirst

HIRST-Preparación de las muestras, identificación y recuento

Muestra por dia

Recuento diario:Uniformización y estandarización de recuentos

•Número de líneas a contar•Disposición de líneas a contar• granos de polen (4 lineas)• esporas de hongos (1 linea; 2)

MON 22/02d4

N granos de polen contadosN granos de polen contados

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 9

Análisis al microscopio óptico4 lineas longitudinales

Aa Aa Área analizada Área analizada = 4 (l w) = 4 (48 w) = 192w= 4 (l w) = 4 (48 w) = 192w = 0.000192w m= 0.000192w m22

Cálculos en la metodología HIRST

N Número de granos de polen contados en área analizadaN Número de granos de polen contados en área analizada

Concentración polínica media diariaN x (Am/Aa) / 14.4 m3

Granos de polen por unidad de volumen (P/m³)

V Volumen de aire analizado por día = 14.4 mV Volumen de aire analizado por día = 14.4 m33

10 l/10 l/minmin x (24h/día x 60min/h) x 1/1000 mx (24h/día x 60min/h) x 1/1000 m33/l/l

Am Am Área muestra Área muestra == ll L = L = 48 mm48 mm x 14 mm = 672 mmx 14 mm = 672 mm22 = 0.000672 m= 0.000672 m2 2

MON 22/02d4

LL=14mm=14mmw l=48mm

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Cálculos en la metodología HIRSTXarxa Aerobiològica de Catalunya, XAC

Concentración media diaria de polenNN x 0.7

Granos de polen por unidad de volumen (P/m³)

NN x (x (0.0006720.000672//0.00006720.0000672) /) /14.4 m14.4 m33

Análisis al microscopio óptico4 lineas longitudinales

MON 22/02d4

LL=14mm=14mmw = 0.35 mml=48mm

Aa Aa Área analizada = 4 (48 x 0.35) = 67.2 Área analizada = 4 (48 x 0.35) = 67.2 mm²mm² = 0.0000672 m= 0.0000672 m22N Número de granos de polen contados en área analizadaN Número de granos de polen contados en área analizada

V Volumen de aire analizado por día = 14.4 mV Volumen de aire analizado por día = 14.4 m33Am Am Área muestra =Área muestra = 48 mm48 mm x 14 mm = 672 mmx 14 mm = 672 mm22 = 0.000672 m= 0.000672 m2 2

objetivo 40X, ocular 15Xw = 0.35 mm

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EjeEje

VeletaVeletaFiltroFiltro FiltroFiltro

Protección lluviaProtección lluvia

Muestreador COURSistema volumétricoImpacto por filtración

Anemómetro totalizadorAnemómetro totalizadoro de o de recorrido recorrido de de vientoviento

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Metodología COUR

Filtro gasahidrófila

siliconada Protocolo de laboratorio:H2SO4, HCl, HF, KOH…Acetolisis (Erdtman 1960)

Sedimentopolen y esporas

Glicerogelatina

Volúmenes conocidos:

V0

VVtt

02V MO

N S31

50 50 ululBorde adhesivo

Una ligera presión hace girar los pólenes sobre si mismos LecturaLectura al al microscopiomicroscopio ópticoóptico

de 3 de 3 líneas longitudinaleslíneas longitudinales

Número de granos de polenN

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S S Surperfície Surperfície filtro = 0.02 mfiltro = 0.02 m2220 cm20 cm

20 c

m20

cm

Cálculos en la metodología COUR (1)

Número de granos de polen en el área analizada = NNúmero de granos de polen en el área analizada = N

VVtt Volumen total sedimentoVolumen total sedimentov Volumen muestra =v Volumen muestra = 50 50 ulul

02V MO

N S31

Aa Aa Área analizada = 3 Área analizada = 3 (l w)(l w)wwll

LLAm Am Área muestra=Área muestra= l l LL

Número de granos de polen en el filtro (semana)N x (Vt / v) x (Am/Aa) / S

Granos de polen por unidad de superficie (P/m²)

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Concentración polínica media semanalN x (Vt / v) x (Am/Aa) / S x (Rv/5)

Granos de polen por unidad de volumen (P/m³)

Anemómetro derecorrido de viento

El anemómetro de recorrido de viento o totalizador mide la longitud de la columna de aire (Rv) que pasa a través del filtro de gasa de 20cmx20cm durante el período de exposición.Eficiencia (resistencia del filtro) = 1/5 del recorrido de viento.

Cálculos en la metodología COUR (2)

Concentración polínica media semanalP/m³ = 9.57 x (NN x VVtt) / (n x SS x RvRv)

Formula XAC

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 15

Método Hirst Método Cour Electricidad Si (Batería) No Superfície de muestreo 14mm x 2 mm 20 cm x 20 cm Facilidad cambio periódico de muestras

Necesita atención

Fácil

Protocolo previo al análisis microscópico

Fácil

Necesita protocolo de laboratorio

Observación granos polen Buena Muy buena Observación esporas hongos Buena Algunas se pierden Pérdida de la muestra Irreparable Reparable Frecuencia de muestreo Diaria (Horaria) Semanal ((Diaria)) Economía Coste del captador Coste de funcionamiento

Caro

Barato

Barato (Anemómetro!!!)

Caro

!!! Aspectos clave

Comparación Cour/Hirst (punto de vista operativo)

Opción mejor

!!!

!!!

!!!

!!!

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TESA Worcester 2003 Hirst-Cour Comparison 1

Atmospheric pollen survey:a metrological study betweenHirst and Cour sampling methods

Farrera I.1, M. Calleja 1, J. Belmonte 2, T. Almeras 1 & I. Plaisant 3

1 Unité de Palynologie. École Nationale Supérieure AgronomiqueMontpellier (ENSAM). France

2 Botany Unit. Autonomous University of Barcelona. Cerdanyoladel Vallès. Spain

3 DRASS Languedoc Roussillon. France

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 17

2211

2211

ComparisonComparisonCourCour--HirstHirst

Study design

Same experimental conditions HH Hirst samplerHirst sampler CC Cour samplerCour sampler

HH

CC

From 31/12/01to 05/08/02

31 weeks

HH

CC

From 24/06/02to 05/08/026 weeks

RepeatabilityRepeatabilityCourCour and and HirstHirst

Montpellier Montpellier ((FrFr))

Farrera et al. 2003

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Número detáxones polínicos

Hirst-1 84Cour-1 112

Taxon HIRST COUR Taxon HIRST COURABIES 0,000 LIPPIA 0,000

ACACIA 0,004 0,049 LIQUIDAMBAR 0,010 0,009ACER 1,159 0,796 MELIA 0,001

AESCULUS 0,048 0,036 MERCURIALIS 0,049 0,024AILANTHUS 0,002 0,008 MONOCOTYLEDONEAE HERBS 0,005 0,024

ALNUS 0,394 0,239 MORACEAE 3,968 2,479AMBROSIA 0,002 0,001 OLEA 0,633 0,608ARTEMISIA 0,004 0,006 APIACEAE 0,016 0,036

BETULA 0,989 0,521 OSTRYA 0,001 To be revisedBORAGINACEAE 0,020 0,006 OXALIS 0,000

BUDLEJA Not det. 0,002 PALM TREES 0,017 0,000BUXUS 0,400 0,456 PAPAVERACEAE 0,040 0,036

CANNABACEAE 0,009 0,011 PAPILIONACEAE 0,004 0,119CARPINUS 0,077 0,193 PARTHENIUM Not det. 0,007

CARYOPHYLLACEAE 0,000 0,001 PHILLYREA 0,024 0,081CASTANEA 2,224 2,062 PICEA 0,016 0,060

CEDRUS 0,003 0,002 PINUS 9,748 11,111CELTIS 0,217 0,296 PISTACIA 0,187 0,190

CENTAUREA 0,001 0,001 PLANTAGO 0,681 0,558CHENOPODIACEAE/AMARANT. 0,160 0,107 PLATANUS 7,187 6,726

CISTACEAE 0,005 0,001 POLYGONUM 0,002CONVOLVULUS 0,000 POPULUS 2,004 2,698

ASTERACEAE ECHINATE 0,023 0,015 PRIMULACEAE Not det. 0,001ASTERACEAE FENESTRATE 0,017 0,029 POTERIUM 0,006 0,006

CORIARIA 0,006 0,005 PUNICA 0,002CORYLUS 0,625 0,307 QUERCUS TOTAL 18,045 15,081

CRASSULACEAE 0,004 0,000 RANUNCULACEAE 0,016 0,037BRASSICACEAE 0,027 0,037 RESEDA 0,002 0,001

CUCURBITACEAE 0,001 RHAMNUS 0,016 0,015CUPRESSACEAE 38,468 44,956 RHEUM Not det. 0,001

CYPERACEAE 0,053 0,056 RHUS Schinus? 0,005DIOSPYROS Not det. 0,003 RICINUS 0,000

DIPSACACEAE 0,001 0,001 ROSACEAE lign. 0,002 0,209ELAEAGNUS 0,002 0,001 RUBIACEAE 0,005 0,019

EPHEDRA 0,001 RUMEX 0,178 0,145ERICACEAE TOTAL 0,113 0,080 SALIX 0,279 0,348

EUCALYPTUS (MYRTACEAE) 0,009 0,010 SAMBUCUS 0,010 0,050EUPHORBIA 0,002 0,002 SCHINUS 0,001 Rhus?

FAGUS 0,152 0,126 SCROFULARIACEAE 0,000 0,016FRAXINUS 6,166 4,541 SOLANACEAE 0,000 0,001

GINKGO Not det. 0,036 TAMARIX 0,064 0,114POACEAE CEREAL 0,008 0,022 TAXODIUM Cupressaceae 0,003POACEAE WILD 2,355 1,672 TAXUS Cupressaceae 0,514

HEDERA 0,002 0,001 TILIA 0,018 0,038HELIANTHUS 0,000 0,002 THIMELACEAE 0,000 0,000HYPERICUM 0,002 TSUGA Not det. 0,001

ILEX 0,007 0,001 TYPHA 0,017 0,018JUGLANS 0,027 0,018 ULMUS 0,225 0,238JUNCUS 0,016 Acetolysis!!! URTICACEAE 2,450 1,321

LAMIACEAE 0,007 0,003 VIBURNUM 0,002 0,037LAGERSTROMIA 0,000 VITIS 0,136 0,155

LARIX Non det. 0,004 XANTHIUM 0,000 0,000LIGUSTRUM 0,029 0,085 ZIZIPHUS Non det. 0,001

BROKEN -UNKNOWN 0,095 0,046

Percentage period w1 - w31 Percentage period w1 - w31

Farrera et al. 2003

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 19

Comparación de la riqueza taxonómica

El método Cour muestra mayor riqueza taxonómica

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31

Weeks

Cour-1

Hirst-1

Number of taxa

Farrera et al. 2003

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 20

Taxa

nu

mbe

r

0

10

20

30

40

50

60

70

80

26 27 28 29 30 31Week number

Hirst-1 / Hirst-2

Mean = 27Mean of the weekly differences = 8%

MétodoMétodo HirstHirst

Comparación de la riqueza taxonómica

Ambos métodos, Hirst y Cour son repetibles

Taxa

nu

mbe

r

0

10

20

30

40

50

60

70

80

26 27 28 29 30 31Week number

Método CourMétodo Cour

Mean = 58Mean of the weekly differences = 8%

Cour-1 / Cour-2

Farrera et al. 2003

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 21

Comparación de las concentraciones polínicasEjemplo con series diarias método Hirst

Daily data comparison - Poaceae - Montpellier 2002

0

20

40

60

80

100

120

J24 J26 J28 J30 JL2 JL4 JL6 JL8 JL10 JL12 JL14 JL16 JL18 JL20 JL22 JL24 JL26 JL28 JL30 AG1 AG3Days

P/m

³

Hirst-1 Hirst-2

Class daily data comparison - Poaceae - Montpellier 2002

0123456

J24 J26 J28 J30 JL2 JL4 JL6 JL8 JL10 JL12 JL14 JL16 JL18 JL20 JL22 JL24 JL26 JL28 JL30 AG1 AG3Days

Cla

ss

Hirst 1 Hirst 2

Concordant 71,4%Concordant 71,4%

Farrera et al. 2003

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 22

0200400600800

100012001400160018002000220024002600

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

P/m

³

Cour Hirst

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

P/m

³

Cour Hirst

05

10152025303540455055606570

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

P/m

³

Cour Hirst

0

510152025303540

4550

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 1617 18 19 2021 22 23 2425 26 27 2829 30 31

P/m

³

Cour Hirst

Poaceae

Urticaceae

Cupressaceae

Platanus

Comparación de concentraciones polínicasSeries de datos Hirst/Cour – ejemplos

Mean H 9,9 P/m³Mean C 10,4 P/m³

Mean H 10,3 P/m³Mean C 8,4 P/m³

Mean H 161,3 P/m³Mean C 266,7 P/m³

Mean H 30,1 P/m³Mean C 39,4 P/m³

Dif. r. Cour -40%

Dif. r. Cour -24%

Dif. r. Cour -5%

Dif. r. Cour +23%

Farrera et al. 2003

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 23

0200400600800

1000120014001600180020002200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

P/m

³

Cour Hirst

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

P/m

³

Cour Hirst

05

101520253035404550556065

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

P/m

³

Cour Hirst

0

510152025303540

4550

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 1617 18 19 2021 22 23 2425 26 27 2829 30 31

P/m

³

Cour Hirst

Mean H 9,9 P/m³Mean C 8,7 P/m³

Mean H 10,3 P/m³Mean C 7,0 P/m³

Poaceae

Urticaceae

Cupressaceae

Platanus

Mean H 161,3 P/m³Mean C 222,2 P/m³

Mean H 30,1 P/m³Mean C 32,8 P/m³

EficienciaEficiencia ((resistenciaresistencia filtrofiltro) 1/6 del ) 1/6 del recorridorecorrido de de vientoviento

Dif. r. Cour -27%

Dif. r. Cour -8%

Dif. r. Cour +14%

Dif. r. Cour +47%

Farrera et al. 2003Comparación de concentraciones polínicas

Series de datos Hirst/Cour – ejemplos

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 24

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

2600

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31Weeks

P/m

³

Cour Hirst

Cupressaceae2385

1394

Series Hirst/Cour– otras consideraciones

Montpellier 2002

Farrera et al. 2003

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 25

0200400600800

100012001400160018002000

2200240026002800300032003400360038004000

D31

Ja10

Ja20

Ja30 F9 F19 M1 M11

M21

M31

A10

A20

A30

My10

My20

My30 Ju9

Ju19

Ju29 Jl9 Jl1

9

Jl29

Days

P/m

³

Cour Week Hirst Week Hirst Day

2385

1394

CupressaceaeMontpellier 2002

Farrera et al. 2003

Series Hirst/Cour– otras consideraciones

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 26

0200400600800

1000120014001600180020002200240026002800300032003400360038004000

F1 F3 F5 F7 F9 F11

F13

F15

F17

F19

F21

F23

F25

F27 M1 M3 M5 M7 M9 M11

M13

M15

M17

M19

M21

M23

M25

M27

M29

M31

Days

P/m

³

Cour Week Hirst Week Hirst Day

2385

1394

Week 8

190

3720

CupressaceaeMontpellier 2002

Farrera et al. 2003

Series Hirst/Cour– otras consideraciones

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 27

Conclusiones

Se debe continuar investigando en aspectos metrológicos(por ejemplo por tipo polínico)

Los métodos Hirst y Cour han demostrado:- ser metrológicamente aceptables- cuantificar el contenido polínico atmosférico deforma bastante parecida

La elección del método de muestreo debe basarse enlos objetivos que se persiguen.

Farrera et al. 2003

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 28

Identificar pólenesCupressaceae

Cupressaceae

Poaeae

Plantago

Pinus

OleaUrticaceae

Urticaceae

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 29

El polen visto al microscopio ópticoEl polen visto al microscopio óptico

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 30

El polen visto al microscopio ópticoEl polen visto al microscopio óptico

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 31

El polen visto al microscopio ópticoEl polen visto al microscopio óptico

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 32

El polen visto al microscopio ópticoEl polen visto al microscopio óptico

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 33

El polen visto al microscopio electrónico de barridoEl polen visto al microscopio electrónico de barrido

Polen de Dactylis glomerataPoáceas o Gramíneas

El polen visto al microscopio ópticoEl polen visto al microscopio óptico

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 34

El polen visto al microscopio ópticoEl polen visto al microscopio óptico

El polen visto al microscopio electrónico de barridoEl polen visto al microscopio electrónico de barrido

Polen de Olea europaeaOleáceas

Superficie FondoCorte óptico

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 35

Polaridad del grano de polen

PP

¿Como es el polen?

simple vesiculado díada tétrada políadas

Forma del grano de polen

Belmonte y Roure (2002) Menarini

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 36

¿Como es el polen?Belmonte y Roure (2002) Menarini

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 37

Vesiculat

Belmonte y Roure (2002) Menarini

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 38

EsporopoleninaEsporopolenina

Una característica del polen: la paredUna característica del polen: la pared

AcetolisisAcetolisisFosilizaciónFosilizaciónGerminaciónGerminación

PAR

EDBelmonte y Roure (2002) Menarini

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 39

Belmonte y Roure (2002) Menarini

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 40

Interpretar una ornamentación reticuladaInterpretar una ornamentación reticulada

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 41

Interpretar una ornamentación reticuladaInterpretar una ornamentación reticulada

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 42

Interpretar una ornamentación reticuladaInterpretar una ornamentación reticulada

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 43

Interpretar una ornamentación reticuladaInterpretar una ornamentación reticulada

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 44

Se Se puedepuede identificar la identificar la procedenciaprocedencia floral de los floral de los granosgranosde de polenpolen, , graciasgracias a a susu combinacióncombinación de de característicascaracterísticasmorfológicasmorfológicas..

La La precisiónprecisión de la de la identificaciónidentificación varíavaría::-- nivelnivel específicoespecífico Plantago lanceolataPlantago lanceolata-- nivelnivel grupogrupo especiesespecies QuercusQuercus tipotipo perennifolioperennifolio-- nivelnivel génerogénero SalixSalix-- nivelnivel famíliafamília PoáceasPoáceas o o GramíneasGramíneas-- nivelnivel grupogrupo famíliasfamílias QuenopodiáceasQuenopodiáceas//AmarantáceasAmarantáceas

Conclusiones sobre la morfología del polenConclusiones sobre la morfología del polen

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 45

¿Es fácil identificar el polen?

Posible confusión con

BrassicaceaeLigustrum SalixFraxinus Phillyrea

tricolporado (tricolporoidado)Exina de 2-3.5 µmTamaño medioOrnamentación reticulada (1-2 µm)Periodo de floración Mayo-Junio

Descripción

Olea

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 46

Manresa 1996-1999. Pollen dynamics along the year

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

week number

P/m³

Olea, mean 96-99 Ligustrum, max 96-99 Fraxinus, max 96-99 Phillyrea, max 96-99 Brassicaceae, max 96-99 Salix, max 96-99

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 47

Cupressus (Cupresáceas)

InaperturadoExina de 1 µmTamaño pequeño a medioOrnamentación psilada con gránulosFloración año entero excepto verano

Posible confusión con

Descripción

Populus

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 48

Bellaterra 1994-1999. Pollen dynamics along the year

0

50

100

150

200

250

300

350

400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

week number

P/m³

Cupressaceae, mean 94-99 Populus, max 94-99 Cyperarceae, max 94-99

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 49

MonoaperturadoExina de 1-1.5 µm.Tamaño pequeño a grandeOrnamentación granuladaFloración año (primavera-verano)

Posible confusión con

Descripción

Celtis Coriaria

Poáceas o Gramíneas

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 50

Barcelona 1994-1999. Pollen dynamics along the year

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

week number

P/m³

Poaceae, mean 94-99 Coriaria, max 94-99 Celtis, max 94-99

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 51

3-zonoporadoExina de <1 µmTamaño pequeñoOrnamentación Psilada Floración todo el año (Febrero-Junio)

Posible confusión con

Descripción

MorusBroussonetia Urtica membranacea

Parietaria (Urticáceas)

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 52

Barcelona 1994-1999. Pollen dynamics along the year

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

week number

P/m³

Urticaceae, mean 94-99 Moraceae, max 94-99 Palm trees, max 94-99

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 53

System Architecture

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 54

System Hardware

A light microscope driven automatically by a computer

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 55

Pollen Grain Detection and Localisation

Segmentation Localisation

Automatic pollen grain detection

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 56

Validation of the LASMEA image acquisition module:Aerobiological slides

Btu2100d3 Btu1700d1

Btu1201d2 Btu1901d7

Aerobiological slides - “Good slides”

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 57

Btu1100d5

Btu1101d2

Validation of the LASMEA image acquisition module:Aerobiological slides

Btu1100d4

Btu1101d2

Aerobiological slides - “Bad slides”

ASTHMA project

??

?

??

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 58

3D pollen grain digitisation

• 3D acquisition of pollen grains– set of images at different depths

Features may appear on different heights

• 100 optical sections• step = 0.5 microns

For each grain

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 59

Palynological knowledge

• The system tries to mimic the palynologists• Knowledge is necessary to identify pollen grains

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 60

• 3D search in optical slices (key images - less blurred)• 2D search in possible zones (regions of interest)

Search in a blurred image sequence

Image Mask

Interior Exine

Blur measure (SML) vs image number

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 61

Above central image Below central image

Sum of bright regions Sum of dark regions

Example: Cupressaceae cytoplasm

Segmentation of bright regions Segmentation of dark regions

cytoplasm

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 62

Example: Olea reticulum

– Network located on the external surface– Visible on top and bottom images – Detection steps:

• Check if the grain is reticulated • Localise the reticulum (3D) • Analyse the reticulum

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 63

Example: Poaceae Pore

Image 35 /100 Image 50 / 100 Image 65 / 100 Image 80 / 100

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 64

Results

• Test on a database of 350 pollen grains– Reference images (pollen grains without dust and pollution)– Simulation of the sampling date – Leave-one-out method used for validation – Results of recognition

• Recognition rate between 4 allergenic types + others (5 classes) : 99,7%• Recognition rate between 31 pollen types + others (32 classes) : 77,7%

• Test on a new set of images (different conditions)– Low recognition rate between 4 allergenic pollen types (5 classes) : 45 % !!– Problem of calibration and robustness for colour variation

• Need to improve colour processing (more flexible system)• Need to normalise image acquisition conditions

ASTHMA project

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 65

Specific detection of pollenby solid phase

Cytometry.(Feasibility study)

THIBAUDON M. (RNSA)

RABILLON J. (Institut Pasteur)

DROCOURT J-L. (Chemunex)

T.E.S.A. Worcester - 2003

RNSA - FRANCE

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 66

ObjectiveObjective

Specific detection of pollen species in air, for the prevention of allergy,using FITC conjugated antibodies

combinedwith laser scanning cytometry

T.E.S.A. Worcester - 2003

RNSA - FRANCE

AIM AIM :Feasability study of a new

system to:- Collect the pollen in a soluble filter

or on a 10 micron filter.

- Analyse the filter in a few minutes by immunofluorescence scanning.

T.E.S.A. Worcester - 2003

RNSA - FRANCE

Labelling Labelling ProcedureProcedure

:

sample

Saturated pad With labelling solution

Filter transfertScan RDI

analysis™

Labelling:1H/37°C

1. Filtration 2. labelling 3. Laser scanning

T.E.S.A. Worcester - 2003

RNSA - FRANCE

Laser Laser sanningsanningT.E.S.A. Worcester - 2003

RNSA - FRANCE

POLLEN DETECTED

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Zaragoza 2003 Captar e identificar pólenes 67

Results Results displaydisplayT.E.S.A. Worcester - 2003

RNSA - FRANCE

Pollen Pollen detection using detection using FITCFITCconjugatedconjugated AntiAnti--parietariaparietaria antibodyantibody

control w/o antibody with Discrimination RATIO

labelling 1H at 37°C with Discrimination RATIO

Pollen parietaria 147 0 152

Pollen dactylis 165 0 0

Pollen betula 195 1 15

POLLEN type

labelling with FITC conjugated Anti-parietariaw/o labelling w/o

discriminatiion (autofluorescnce)

T.E.S.A. Worcester - 2003

RNSA - FRANCE

Pollen Pollen detection using detection using FITCFITCconjugatedconjugated AntiAnti--dactylisdactylis antibodyantibody

control w/o antibody with Discrimination RATIO

labelling 1H at 37°C with Discrimination RATIO

Pollen dactylis 165 0 138

Pollen betula 195 1 26

POLLEN type

labelling with FITC conjugated Anti-dactylisw/o labelling w/o

discriminatiion (autofluorescnce)

T.E.S.A. Worcester - 2003

RNSA - FRANCE

ConclusionsConclusions

1) Pollen bloom (all taxa) can be detected in air within minutes.

2) Specific allergenic pollen can be selectively detected using appropriate immunological probes and accurately counted using laser scanning cytometry.

T.E.S.A. Worcester - 2003

RNSA - FRANCE