ATLAS de HISTOLOGIAVEGETAL y ANIMAL

TECNICAS HISTOLOGICAS

3. CORTE

Pilar MolistManuel A. Pombal

Manuel Megıas

Depto. de Biologıa Funcional y Ciencias de la SaludFacultad de BiologıaUniversidad de Vigo

(Version: Noviembre 2011)

1. Tecnicas histologicas

Denominamos proceso histologico a una serie de metodos y tecnicasutilizados para poder estudiar las caracterısticas morfologicas y molecularesde los tejidos. Hay diversos caminos para estudiar los tejidos, es decir,series de tecnicas que se utilizaran dependiendo de que caracterısticadeseemos observar. En el siguiente esquema se muestran los metodos ytecnicas comunmente empleados para el procesamiento de los tejidos. Sinembargo, hay que tener en cuenta que existen muchas variantes a estoscaminos 2su eleccion dependera del resultado final que queramos obtener.

Figura 1: Esquema del proceso histologico dicotiledonea.

El proceso histologico comienza con la obtencion del tejido objeto de

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estudio. En el caso de los tejidos vegetales se toman muestras de losdistintos organos que componen el cuerpo de la planta, mientras que paralos tejidos animales podemos optar por dos opciones: coger una porcion dedicho tejido o procesar una parte, organo o parte corporal, o el animalcompleto. En cualquier caso las muestras son habitualmente fijadas conunos soluciones lıquidas que contienen unas sustancias denominadasfijadores, las cuales mantienen las estructuras celulares y moleculares ensus posiciones iniciales durante el procesamiento posterior. Tambienpodemos fijar las moleculas de los tejidos por congelacion rapida. Fijar untejido es como si hiciesemos una fotografıa del tejido que semantendra hasta su observacion. Sin embargo, el uso de fijadores o mediosde inclusion afectan a veces las caracterısticas tisulares que queremosobservar y por tanto tenemos que recurrir a la congelacion para endurecerel tejido para despues poder obtener secciones del mismo.

Normalmente, tras la fijacion se procede a incluir el tejido paraposteriormente obtener secciones. Cuanto mas delgada queramos que seanuestra seccion mas tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto seconsigue embebiendo el tejido con sustancias lıquidas que posteriormentepolimerizaran (resinas) o se volveran consistentes (ceras). Tambien sepuede conseguir el mismo efecto mediante congelacion rapida. Cortes masgruesos de 40 µm se pueden cortar sin necesidad de inclusion usando elvibratomo. Los medios de inclusion son normalmente no hidrosolubles porlo que tenemos que sustituir el agua de los tejidos por solventes organicosliposolubles y posteriormente anadir el medio de inclusion.

Tras la inclusion o la congelacion se procede a cortar los tejidos. Existendiferentes aparatos de corte que permiten conseguir secciones ultrafinas(del orden de nanometros), semifinas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y10 µm) y gruesos (mayores a 10 µm). Estas secciones hay que procesarlaspara poder observarlas, aunque ciertos tipos de microscopıa, por ejemplocon contraste de fase, permiten observar tejidos sin tenir. Normalmente lassecciones se tinen con colorantes que son hidrosolubles, por lo que hay queeliminar el medio de inclusion para que los colorantes pueden unirse altejido. Las secciones, secciones ultrafinas, que se observan con elmicroscopio electronico se pueden contrastar con metales pesados, opacos alos electrones, sin eliminar la resina.

Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen dostipos basicos de microscopios: electronico y optico. Los primeros permitenun gran poder de resolucion, pudiendose observar caracterısticasultraestructurales, mientras que los segundos, con menor poder deresolucion, ofrecen una gran versatilidad en cuanto a modos de observar los

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tejidos : fluorescencia, contraste de fase, polarizacion o contraste deinterferencia diferencial.

Como dijimos al comienzo existen multiples variaciones sobre esteesquema general. Por ejemplo, se pueden observar tejidos con elmicroscopio electronico de barrido sin necesidad de incluir ni cortar, perosolo observaremos superficies. En las siguientes paginas veremos con ciertodetalle algunas de las tecnicas mas empleadas para la observacion de lostejidos.

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2. CORTE.

Las caterısticas tisulares y celulares microscopicas internas se observancon microscopios opticos o electronicos de transmision (excepto siqueremos ver superficies, para lo que usamos el microscopio electronico debarrido). Con estos aparatos solo se pueden observar grosores muypequenos de tejido por problemas de difusion y penetracion de la luz en elcaso de los microscopios opticos y de penetracion de los electrones en elcaso del microscopio electronico de transmision. Por tanto tenemos quehacer secciones de los tejidos que queremos estudiar, que pueden ir desdeun grosor de unos cuantos nanometros hasta centenares de micras. Algunostejidos como los vegetales, por sus caracterısticas celulares, permiten suobservacion en secciones de cientos de micras. Como hemos mencionado enlos capıtulos anteriores, podemos decir que cuanto mas delgada queramoshacer una seccion de tejido mas endurecido ha de estar dicho tejido. Ladureza de los tejidos depende de sus caracterısticas (por ejemplo, lasparedes celulares hacen a los vegetales tejidos duros), de la fijacion quehayamos realizado y sobre todo del material en que hayamos incluido dichotejido. Una manera mas directa de endurecer el tejido es mediantecongelacion.

Los aparatos mecanicos para hacer secciones de un grosor demicrometros se denominan microtomos y existen diferentes tipos segun elgrosor que queramos conseguir en nuestras secciones, el medio de inclusionen el que se encuentre el tejido o si se ha endurecido por congelacion o porinclusion. Los microtomos mas usados son:

Microtomo para parafina: Se utiliza principalmente para materialincluido en parafina y se obtienen secciones de 5 a 20 mum de grosor, paraobservar con el microscopio optico.

Vibratomo: Corta material no incluido, aunque sı fijado o duro, ensecciones de 30 a centenares de mum de grosor, para observar con elmicroscopio optico.

Microtomo de congelacion: Con el se consiguen secciones de 30 aunas 100 mum de material congelado para su observacion con elmicroscopio optico.

Criostato: Consigue secciones a partir de material congelado y seobtienen grosores de 10 a 40 mum, para observar con el microscopio optico.

Ultramicrotomo: Con el se corta material incluido en resinas y seobtienen secciones del orden de nanometros de grosor, para observar con elmicroscopio electronico de transmision.

Ultracriotomo: Su uso no esta muy extendido pero se suele emplear

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cuando se necesitan secciones del orden de nanometro de material que no sedebe incluir, para observar con el microscopio electronico de transmision.

Los aparatos de corte mas usados tradicionalmente para estudiar lascaracterısticas generales de los tejidos y de las celulas son el microtomopara material incluido en parafina para observaciones con el microscopiooptico y el ultramicrotomo para observaciones con el microscopioelectronico de transmision. El criostato se usa tambien frecuentemente enmicroscopıa optica por el ahorro de tiempo que supone ya que no necesitaincluir el tejido, incluso se puede cortar material no fijado.

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3. MICROTOMOS de PARAFINA.

Los microtomos para cortar material incluido en parafina sonprobablemente los mas usados en los laboratorios de histologıa. Todosposeen varias partes comunes: una cuchilla, un portabloques y un sistemamecanico que permite acercar el bloque de parafina a la cuchilla unadistancia que se corresponde con el grosor de la seccion que pretendemosobtener y realizar el corte.

Hay dos tipos de microtomo para parafina: el de rotacion y el dedeslizamiento. El microtomo de rotacion provoca el corte gracias a latransformacion de un movimiento de rotacion en otro de ascenso ydescenso del portamuestras. En el movimiento de bajada sobre la cuchillase produce un acercamiento del portamuestras hacia la cuchilla segun elespacio seleccinado. En el puertamuestras existe un sistema que permiteorientar la superficie de corte de la muestra respecto a la cuchilla. En estosmicrotomos la cuchilla se mantiene fija durante el proceso de corte, peropuede regularse el angulo de ataque a la muestra. Con el microtomo dedeslizamiento se obtienen cortes mediante un movimiento de deslizamientodel bloque sobre la cuchilla, o viceversa. En estos microtomos elmovimiento lo proporciona directamente la mano y es de ida y vuelta,siendo en la vuelta cuando se eleva la posicion del bloque, o de la cuchilla,una distancia que nos dara el grosor del corte.

Figura 2: Microtomo para parafina con mecanismo de rotacion.

Tanto el microtomo de rotacion como el de deslizamiento tienenventajas e inconvenientes. La principal ventaja del de rotacion es supresicion, la posibilidad de obtener secciones seriadas con facilidad y laautomatizacion del proceso de corte. Los microtomos de deslizamiento sonmas sencillos mecanicamente y su disposicion permite cortar bloques mas

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grandes o bloques de celoidina, aunque estan cayendo en deshuso.

Figura 3: Microtomo para parafina con mecanismo de deslizamiento.

Hay que llevar a cabo una serie de procesos sobre el bloque de parafinaantes de hacer el primer corte util a nuestra muestra. En primer lugar hayque retallar el bloque hasta hacer una piramide truncada. Antes de retallarhay que considerar cual de las caras de esta piramide sera el frente deataque, es decir, cual sera la que primero se ponga en contacto con lacuchilla. Esta cara debera ser mas ancha que la opuesta, y ambas han deser paralelas. Con todo ello se consigue una buena orientacion de nuestramuestra en las secciones, que cada nuevo corte arrastre sin problemas alpreviamente cortado y que se puedan obtener tiras rectas de cortes. Unavez retallada la piramide nuestra muestra queda dentro de ella pero noesta en contacto directo con la cara superior o de corte, por lo que esnecesario un proceso de desbastado, es decir, la eliminacion del espesor deparafina que hay entre la superficie del bloque y nuestra muestra.

Otro aspecto que hemos de tener en cuentan antes de empezar a cortares la orientacion de la cuchilla respeto a la superficie de corte de lapiramide. Lo normal es orientar la cuchilla con un angulo de uno 10◦

respecto a la superficie de corte, aunque se puede modificar segun nuestrasnecesidades.

Una vez comenzado el corte de nuestra muestra se obtienen tiras desecciones unidas por las caras paralelas a la cuchilla. Estas tiras se suelenmanipular con pinceles o lancetas y, antes de su fijacion definitiva en lasuperficie de un portaobjetos, han de estirarse para que nuestro tejidoquede perfectamente extendido. Aprovechando la hidrofocidad de laparafina, las secciones se colocan sobre agua calentada a unos 35 ◦C a 40◦C y el calor las hace extenderse sin llegar a su punto de fusion, queesta en torno a los 60 ◦C. El estiramiento se puede realizar en banos de

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Figura 4: Preparacion del bloque de parafina antes de iniciar la obtencion de secciones

utiles.

agua con regulacion termica o sobre los propios portaobjetos cubiertos deagua y colocados sobre una plancha termica regulable.

La superficie del portaobjetos donde se colocan las tiras de cortes ha deestar previamente tratada para que nuestro tejido quede adherido duranteel procesamiento posterior. Para ello los portaobjetos se recubren consoluciones de gelatina, albumina, u otras sustancias y se dejan secar, demanera que hacen de adhesivo entre el cristal y nuestro tejido.

Una vez que el agua se ha evaporado y estan extendidas las tiras decortes de parafina sobre el portaobjetos, se procede a un secado exahustivoen una estufa a una temperatura de entre 35 ◦C y 40 ◦C durante toda lanoche. Una vez secos, los portaobjetos con las secciones estan listos para elprocesamiento posterior.

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Figura 5: Una vez se ha retallado y desbastado el bloque se obtienen las secciones en

tiras que seran colocadas sobre un portaobjetos cubierto con agua calentada a unos 40◦C. El portaobjetos ha sido tratado previamente son soluciones adhesivas. El calor y la

hidrofobicidad de la parafina hace que las secciones se estiren sobre la superficie del agua

y una vez evaporada queden adheridas al portaobjetos.

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4. VIBRATOMO.

Puede haber varias razones para evitar la inclusion de un tejido del queposteriormente obtener secciones. Durante los procesos de inclusion, comolas inclusiones en parafina o en resinas tipo epoxy, se ha de someter a lasmuestras a deshidratacion. Esto ocasiona a veces dano en algunasmoleculas o regiones moleculares que son las que queremos detectarposteriormente con tecnicas como la inmunocitoquımica. Ademas, paraobservar algunas caracterısticas tisulares o celulares se requieren seccionesgruesas del orden de 50 mum, a veces de 100 o 200 mum. Por ejemplo,para estudiar la organizacion espacial de determinadas celulas como lasneuronas es recomendable hacer cortes de un grosor superior a las 50 mumy emplear inmunocitoquımica o histoquımica para ponerlas de manifiesto.La obtencion de secciones gruesas sin necesidad de inclusion se puedenconseguir de dos manera diferentes: mediante congelacion de la muestra ycorte en un microtomo de congelacion o mediante el uso del vibratomo.

Figura 6: Vibratomo. La cubeta, de color negro, ha de estar llena de tampon de trabajo

durante el proceso de corte de manera que la cuchilla y la muestra, de color rojo, y las

secciones que se obtienen estan sumergidos.

El vibratomo es un aparato con el que se obtienen secciones de ungrosor que puede oscilar entre las 40-50 mum hasta varios centenares demum partiendo de una muestra animal endurecida solo mediante fijacion.El mecanismo de corte consiste de una plataforma sobre la que se situa lamuestra, que puede regularse en altura y nos permite seleccionar el grosordel corte, y de una cuchilla de borde muy afilado que se deplazahorizontalmente sobre la muestra realizando el corte. La caracterıstica delvibratomo es que la cuchilla, ademas de avanzar sobre la muestra, posee unmovimiento de vibracion lateral a modo de sierra que facilita el corte y

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evita arrastrar el tejido. La muestra se encuentra fijada, normalmentemediante pegamento de contacto, directamente a un bloque portamuestrasque se coloca sobre la plataforma elevadora.

Figura 7: Vista lateral de la cubeta de un vibratomo.

No todas las muestras son apropiadas para ser cortadas en unvibratomo. Ası, aquellas que sean muy blandas o que posean porcionesdemasiado duras o elasticas son normalmente arrastradas por la cuchilla, apesar de que disminuyamos la velocidad de avance y aumentemos laoscilacion de la cuchilla. Es decir, la muestra ha de tener una ciertaconsistencia y no poseer elementos distorsionadores del corte.

Figura 8: Pegado de la muestra al bloque portamuestras.

Otra caracterıstica del vibratomo es que todo el proceso de corte serealiza bajo una solucion acuosa que normalmente es una soluciontamponada o una solucion salina. Para ello tanto la muestra como el bordede corte de la cuchilla han de estar sumergidos y los cortes que se obtienen

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se denominan cortes en flotacion, es decir, no sujetos a ningun soporte.Estos cortes se pueden procesar de esta manera, flotando, o adherirse a unportaobjetos y procesarlos despues. Sin embargo, el proceso de secadonecesario para la adhesion al portaobjetos suele conllevar alteraciones de lacalidad del tejido. Ası, los cortes se suelen procesar durante toda la tecnicaen flotacion y posteriormente se montan sobre portaobjetos para suobservacion con el microscopio optico.

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5. MICROTOMOS de CONGELACION.

La congelacion de los tejidos es una manera rapida de endurecerlos sinnecesidad de inclusion, por lo que la preservacion molecular es maxima.Muy importante si el procesamiento posterior requiere el reconocimientomolecular. Igual preservacion se consigue con los cortes de vibratomo, perolas muestras congeladas pueden cortarse en secciones mas finas, del ordende varias mum, cosa muy difıcil con el vibratomo. Otra ventaja de laobtencion de secciones mediante congelacion es que la calidad de lassecciones no depende del tipo de tejido (excepto tejidos mineralizadoscomo el hueso o aquellos excesivamente cornificados). Por ultimo, esposiblemente la manera mas rapida de obtener secciones puesto que esposible congelar la muestra sin necesidad de fijacion y cortarla deinmediato, como las biopsias. Pero para preservar correctamente laestructura del tejido ha de ser una congelacion muy rapida, normalmenteen isopentano enfriado con nitrogeno lıquido, lo que evita la formacion decristales de hielo que deterioran las estructuras celulares.

Figura 9: Microtomo de congelacion. El tubo negro de la derecha es el encargado de

enfriar el portabloques a temperaturas inferiores a -20 ◦C, lo cual congela a su vez a la

muestra (color rojo). Las secciones se recogen de la cuchilla con un pincel y se colocan en

tampon de trabajo.

En el caso de que no se requiera un corte rapido las muestras se fijan yposteriormente se incuban en una solucion anticogelante que contienesacarosa y glicerol. Con ello se evita que durante la congelacion se formencristales de hielo grandes que puedan danar las estructuras celulares. Comodijimos anteriormente, se puede congelar de manera muy rapida connitrogeno lıquido. Dicha congelacion permite preservar incluso la

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ultraestructura celular y observarla al microscopio electronico, siempre conel uso previo de anticongelantes. Pero normalmente se suele realizar lacongelacion de la muestra a temperaturas superiores que dependen delaparato empleado para realizar los cortes, lo cual hace necesario el uso deanticongelantes.

Figura 10: Criostato. El compartimento de color azul es la camara refrigerada a la

temperatura seleccionada. En esta camara se encuentra la muestra, la cuchilla y es donde

se recogen las secciones.

Los dos aparatos mas usados para realizar cortes por congelacion son elmicrotomo de congelacion y el criostato. El microtomo de congelacionrealiza cortes de decenas de mum de grosor y consiste en una plataformaque se enfrıa a bajas temperaturas sobre la que se coloca la muestra. Trascada corte la plataforma se eleva un espacio correspondiente al grosor decorte seleccionado. En los microtomos de congelacion antiguos se producıala congelacion mediante gas carbonico que habıa que suministrarregularmente. Actualmente se produce la congelacion (de -30 a menos -40◦C) de la plataforma mediante tubos que parten de un sistema derefrigeracion externo al propio dispositivo de corte. Ademas, existe laposibilidad de congelar tambien la cuchilla si se desea. En los apartosactuales la muestra se congela por contacto directo con la plataforma y sutemperatura es constante durante todo el tiempo de corte. Las seccionesque se obtienen, de decenas a cientos de mum, se recogen con un pincel, seanaden a un recipiente con tampon de trabajo y se trabaja con ellas en

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Figura 11: Criostato. El mecanismo de rotacion y corte del criostato se encuentra dentro

de una camara refrigerada.

flotacion, igual que en el caso del vibratomo.El criostato se utiliza para obtener secciones por congelacion de 10 a 30

mum, aproximadamente. En este aparato todo el sistema de corte seencuentra encerrado en una camara refrigerada cuya temperatura se puederegular, normalmente entre -20 y -30 ◦C. La congelacion se suele hacer enuna plataforma dentro de la propia camara refrigerada que se encuentra auna temperatura inferior, en torno a -50 ◦C. Tambien se puede congelar eltejido externamente con la rapidez que deseemos, por ejemplo connitrogeno lıquido, pero es conveniente colocar la muestra en la camara delcriostato hasta que consiga igualar su temperatura con la de esta paraobtener secciones homogeneas. Antes de la congelacion, la muestra seencastra en un medio que es lıquido a temperatura ambiente y solido a lade corte. Por tanto, tenemos nuestra muestra en un bloque solido,encastrado pero no incluido. Esto permite manipular la muestra yadherirla a un soporte portamuestras, el cual se fijara a un eje que avanzasobre la cuchilla. La preparacion del bloque y el mecanismo de corte essimilar al que se describio para el microtomo de rotacion para parafina.Las secciones que se van obteniendo se adhieren por contacto aportaobjetos con superficies adhesivas. Las secciones se descongelanrapidamente en este proceso de pegado puesto que los portaobjetos estan atemperatura ambiente y una vez secas pueden procesarse para las tecnicasque deseemos.

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Figura 12: Criostato. Proceso mediante el que se pegan las secciones a un portaobjetos.

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6. ULTRAMICROTOMO.

Para la observacion con detalle de la ultraestructura celular es necesariorealizar secciones muy delgadas denominadas ultrafinas, del orden denanometros, y observarlas con el microscopio electronico de transmision.Para ello se incluye nuestra muestra en resina, generalmente de tipo epoxy,que una vez polimerzada resulta en un bloque de gran dureza. Laobtencion de secciones ultrafinas se lleva a cabo con un aparatodenominado ultramicrotomo. Otra manera menos habitual de obtenersecciones ultrafinas es mediante el ultracriotomo, para lo cual la muestra secongela y se corta en una camara refrigerada a muy bajas temperaturas.Este ultimo es un mecanismo similar al visto para el criostato. Es unaparato que solo se usa cuando queremos detectar con microscopıaelectronica moleculas que son danadas durante el proceso de inclusion.

Figura 13: Ultramicrotomo

El ultramicrotomo tiene un diseno de corte similar al microtomo deparafina de rotacion, pero mucho mas preciso y sofisticado. Quiza elsistema mas delicado sea el que hace avanzar el bloque sobre la cuchillapues debe hacerlo a intervalos de varios nanometros. Actualmente estesistema de avance es mecanico pero en los ultramicrotomos mas antiguosera por calor, que producıa dilatacion del eje sobre el que se sujetaba lamuestra. Tambien tiene un sistema completo de orientacion de la muestrasobre el borde de la cuchilla para que el plano de corte se pueda orientarperfectamente a la superficie de nuestra muestra. Al realizar cortes muydelgados cualquier vibracion o cambio de temperatura afecta lahomogeneidad del grosor del corte, por tanto el ultramicrotomo debe

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situarse en una habitacion donde no haya vibraciones y mantenerla atemperatura constante para evitar dilataciones del brazo que porta lamuestra, dentro de lo posible. Ademas, estos aparatos se colocan sobremesas especiales para disminuir las vibraciones. Todos los ultramicrotomosactuales tienen un panel de control externo al aparato desde donde secontrola electronicamente el proceso de corte: inicio de corte, grosor de laseccion, velocidad de corte, ventana de corte, iluminacion de la muestra,etcetera.

Antes de realizar el primer corte ultrafino de una muestra, al igual queocurrıa con los cortes de parafina, es necesario retallar y desbastar elbloque para crear una piramide truncada. Aunque todo este proceso sepuede hacer con una cuchilla se suele utilizar un aparato denominadopiramitomo que lima y crea las caras de la piramide con un disposivo amodo de torno, ademas de producir el desbastado para obtener lasuperficie de corte. Hay que tener en cuenta que este proceso ha de serpreciso porque la superficie de corte debe ser muy pequena, en torno aunos 0,5 mm2. Los lados de la superficie de corte deben ser similares a losdescritos para el corte en inclusiones de parafina, dos lados han de serparalelos y uno mas grande que el otro. Con esto nos aseguramos que unanueva seccian empujara a la previa del borde de la cuchilla y queconseguiremos tiras rectas de secciones. Antes de hacer las seccionesultrafinas se suele hacer una seccion semifina, de 1 o 2 mum para teneruna imagen de la muestra observable al microscopio optico.

Las cuchillas empleadas para hacer secciones ultrafinas son especıficaspara este tipo de aparatos puesto que han de tener unos filos muy agudos.Las mas comunmente usadas son de vidrio especial y se otienen medianteunos aparatos que mediante ralladuras con puntas de diamante y golpessecos sobre barras de vidrio son capaces de producir dichas cuchillas. Sinembargo, la mejor calidad de corte se consigue con cuchillas con filo dediamante, pero son mucha mas caras. Aunque los ultramicrotomos actualestienen mecanismos de corte precisos, durante el proceso de corte se puedenobtener secciones de distinto grosor. El grosor de una seccion ultrafina seconoce por el color que produce el reflejo de la luz sobre su superficie. Estecolor puede ser gris (menos de 60 nm), plata (60 a 90 nm), oro palido (90 a120 nm), oro intenso (120 a 150 nm), purpura (150 a 190 nm), etcetera.

Las secciones ultrafinas recien obtenidos quedan flotando sobre unabalsa de agua que posee la propia cuchilla y no se recojen sobreportaobjetos sino directamente sobre soportes de nıquel o cobredenominados rejillas. Son discos circulares con un enrejado de hilos quedejan cavidades, las cuales son de distino tamano segun el tipo de rejilla,

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Figura 14: Proceso por el que se obtiene una cuchilla para hacer cortes en el ultrami-

crotomo.

Figura 15: Corte y recogida de secciones en una rejilla.

normalmente desde 100 a varios cientos de mum cuadradas. Estas rejillastienen la ventaja de que permiten una gran nitidez de las imagenes deltejido que ofrece el microscopio electronico puesto que los electrones soloatraviesan la seccion antes de incidir sobre la pantalla de visualizacion. Sinembargo, presentan el problema de que la porcion de seccion que caiga

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sobre el hilo de la rejilla quedara oculto. Por ello existen las rejillas”deojal, que tienen una sola cavidad y suficientemente grande como para quequepa un corte entero. Obviamente es necesario suministrar un soportepara que la seccion no se cuele por la cavidad que es normalmente unamembrana muy fina hecha de una sustancia denominada formvar, la cualdeja pasar los electrones y sostiene a las secciones.

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