Atlas de Histologı́a Vegetal y Animal

Técnicas histológicasCORTE

Manuel Meǵıas, Pilar Molist, Manuel A. Pombal

Departamento de Bioloǵıa Funcional y Ciencias de la Salud.Fcacultad de Bioloǵıa. Universidad de Vigo.

(Versión: Julio 2018)

Este documento es una edición en pdf del sitio

http://mmegias.webs2.uvigo.es/inicio.html.

Todo el contenido de este documento se distribuye bajo

la licencia Creative Commons del tipo BY-NC-SA

(Esta licencia permite modificar, ampliar, distribuir y usar

sin restricción siempre que no se use para fines comerciales,

que el resultado tenga la misma licencia y que se nombre

a los autores)

La edición de este documento se ha realizado con el software LATEX

(http://www.latex-project.org/), usando Texstudio

(www.texstudio.org/) como editor.

Contenidos

1 Introducción 1

2 El proceso histológico 2

3 Corte 4

4 Microtomos de parafina 5

5 Vibratomo 8

6 Criotomos 10

7 Ultramicrotomo 13

Técnicas histológicas. Corte. 1

1 Introducción

En estas páginas dedicadas a las técnicas histológicasvamos a describir los procedimientos experimentalesnecesarios para obtener secciones teñidas y listas paraobservar al microscopio partiendo de tejidos vivos ex-tráıdos de un animal o de una planta. Por tanto, dedi-caremos espacios a la obtención, fijación, inclusión,corte y tinción de los tejidos. Todos estos aparta-dos seguirán el mismo esquema que los caṕıtulos ded-icados a los tejidos o a la célula, partir de un es-quema básico y ampliar la información sucesivamenteen páginas adicionales. No dedicaremos demasiadoespacio a los instrumentos, desde el punto de vistaoperativo, pero śı a la conveniencia de su uso y asus capacidades. Además, se incluye un apartado deprotocolos y recetas donde se incorporan los tiempos,productos y manera de proceder para llevar a cabolas tinciones más comunes y cómo preparar sus reac-tivos.También se han añadido algunos v́ıdeos explica-tivos.

La mayoŕıa de las técnicas histológicas van encam-inadas a preparar el tejido para su observación con elmicroscopio, bien sea éste óptico o electrónico. Ello

es debido a que la composición de los tejidos, salvocontadas ocasiones, no tienen contraste ni colores per-mitan diferenciar sus estructuras de una manera claramediante la observación directa con los microscopios.Por ello hay procesar las muestras, primero para queno se se deterioren y después para resaltar sus estruc-turas y poder estudiarlas en detalle.

Existen procedimientos rápidos y simples para laobservación de tejidos y células vivas que reciben elnombre de vitales. Por ejemplo, la observación delflujo sangúıneo en capilares del sistema circulatorio.Otra forma de observar células o tejidos vivos es medi-ante las técnicas histológicas supravitales, en los quelas células y los tejidos se mantienen o se hacen crecerfuera del organismo, como es el caso de los cultivosde células y de tejidos.

Las técnicas histológicas postvitales son aquellas enlas que las células mueren durante el proceso, pero lascaracteŕısticas morfológicas y moleculares que poséıanen estado vivo se conservan lo mejor posible, lo quedepende del tipo de técnica. Estas páginas estarándedicadas a este tipo de técnicas, puesto que son lasmás comúnmente usadas en los laboratorios de his-toloǵıa.

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 2

2 El proceso histológico

Denominamos proceso histológico a una serie demétodos y técnicas utilizados para poder estudiarlas caracteŕısticas morfológicas y moleculares de lostejidos. Hay diversos caminos para estudiar los teji-dos, es decir, series de técnicas que se utilizarán de-pendiendo de qué caracteŕıstica deseemos observar.En el siguiente esquema se muestran los métodosy técnicas comúnmente empleados durante el proce-samiento de los tejidos para su observación con losmicroscopios óptico o electrónico. Sin embargo, hayque tener en cuenta que existen muchas variantes a es-tos ”caminos” y su elección dependerá del resultadofinal que queramos obtener.

El proceso histológico comienza con la obtencióndel tejido objeto de estudio. En el caso de los tejidosvegetales directamente se toman muestras de los dis-tintos órganos que componen el cuerpo de la planta,mientras que para los tejidos animales podemos op-tar por dos opciones: coger una porción del tejidou órgano y procesarla o procesar primero el animalcompleto y luego extraer la muestra que nos interese.En cualquier caso las muestras son habitualmente fi-jadas con unas soluciones ĺıquidas denominadas fi-jadores, las cuales se usan para mantener las estruc-turas celulares y moleculares inalterables durante elprocesamiento posterior y con una organización lomás parecida posible a como se encontraban en lamuestra viva. También podemos fijar las moléculas delos tejidos por congelación rápida. Fijar un tejido escomo hacer una fotograf́ıa de dicho tejido, su estruc-tura se mantendrá hasta su observación. La fijaciónpor congelación se emplea cuando la fijación qúımicao los procesos histológicos posteriores alteran las car-acteŕısticas de la muestra que queremos estudiar, porejemplo una molécula sensible a dichos tratamientos.

Normalmente, tras la fijación se procede a incluir eltejido para posteriormente obtener secciones. Cuantomás delgada queramos que sea nuestra sección mástenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se con-sigue embebiendo el tejido con sustancias ĺıquidas queposteriormente polimerizarán (resinas) o se volverán

consistentes (ceras). También se puede conseguirel mismo efecto mediante congelación rápida. Cortesmás gruesos de 40 µm se pueden cortar sin necesi-dad de inclusión usando el vibratomo. Los mediosde inclusión no son normalmente hidrosolubles porlo que tendremos que sustituir el agua de los tejidospor solventes orgánicos liposolubles y posteriormentesustituirlos por el medio de inclusión.

Tras la inclusión o la congelación se procede a cor-tar los tejidos, es decir, obtener secciones. Existendiferentes aparatos de corte que permiten conseguirsecciones ultrafinas (del orden de nanometros), semi-finas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y 10 µm)y gruesas (mayores a 10 µm). Habitualmente las sec-ciones se procesan para poder observarlas y estudiar-las, aunque ciertos tipos de microscoṕıa, por ejemplocon contraste de fase, permiten observar secciones detejidos sin procesar. Normalmente las secciones setiñen con colorantes que son hidrosolubles, por lo quehay que eliminar el medio de inclusión para que loscolorantes pueden unirse al tejido. Las secciones ul-trafinas (observadas con el microscopio electrónico)o semifinas (observadas con el microscopio óptico)se pueden contrastar con metales pesados o con col-orantes, respectivamente, sin necesidad de eliminar elmedio de inclusión.

Los tejidos procesados se observan con los micro-scopios. Existen dos tipos básicos de microscopios:óptico y electrónico. Los primeros ofrecen una granversatilidad en cuanto a modos de observar los teji-dos: campo claro, fluorescencia, contraste de fase,polarización o contraste de interferencia diferencial,mientras que los segundos permiten un gran poder deresolución, pudiéndose observar caracteŕısticas ultra-estructurales.

Como dijimos al comienzo existen múltiples varia-ciones sobre este esquema general de procesamientohistológico. Por ejemplo, se pueden observar tejidoscon el microscopio electrónico de barrido sin necesi-dad de incluir ni cortar, pero sólo observaremos su-perficies. En las siguientes páginas veremos con ciertodetalle algunas de las técnicas más empleadas para laobservación de los tejidos.

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 3

Figura 1: Esquema del proceso histológico.

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 4

3 Corte

Las caracteŕısticas tisulares y celulares finas se ob-servan con los microscopios. Sin embargo, con estosaparatos sólo se pueden observar muestras de tejidoque tengan un grosor muy pequeño, ya que de no seraśı hay problemas de difusión y penetración de la luzen el caso de los microscopios ópticos y de penetraciónde los electrones en el caso del microscopio electrónicode transmisión. Por tanto tenemos que hacer sec-ciones de los tejidos que queremos estudiar, las cualespueden ir desde un grosor de unos cuantos nanomet-ros hasta centenares de micras. Algunos tejidos comolos de las plantas, por sus caracteŕısticas celulares,permiten su observación en secciones de cientos demicras de grosor. Otros tipos de muestras, como lasangre o los cultivos celulares, pueden observarse di-rectamente puesto que las células se extienden en unacapa de una o unas pocas células de grosor.

Como hemos mencionado en las páginas anteriores,podemos decir que cuanto más delgada queramoshacer una sección de tejido más endurecido ha de es-tar dicho tejido antes de seccionarlo. La dureza delos tejidos depende de sus caracteŕısticas (por ejem-plo, las paredes celulares hacen que las plantas tengantejidos duros), de la fijación que hayamos realizado ysobre todo del material en el que hayamos incluidodicho tejido. Una manera más directa de endurecerel tejido es mediante congelación.

Los aparatos mecánicos para hacer secciones de ungrosor de micrómetros se denominan microtomos yexisten diferentes tipos según el grosor que queramosconseguir en nuestras secciones, según el medio deinclusión en el que se encuentre el tejido y según elproceso de endurecimiento de la muestra: por con-gelación o por inclusión.

Los microtomos más usados son:

Microtomo para parafina. Se utiliza principalmentepara material incluido en parafina y se obtienen sec-ciones de 5 a 20 µm de grosor. Estas secciones seobservan con el microscopio óptico.

Microtomo manual. Es un dispositivo muy sencilloque consta de un soporte para sujetar la muestra. Loscortes se realizan a mano con una cuchilla. Este mi-crotomo se usa prácticamente sólo para tejidos vege-tales, los cuales son duros gracias a las paredes vege-tales. Hace cortes gruesos, 100 µmm o más, observ-ables con el microscopio óptico.

Vibratomo. Corta material no incluido, aunque śıfijado o duro, en secciones que pueden ir desde 30hasta centenares de µmm de grosor. Estas seccionesse observan con el microscopio óptico.

Microtomo de congelación. Con él se consiguen sec-ciones de 30 a unas 100 µmm de grosor a partir dematerial congelado y se observan con el microscopioóptico.

Criostato. Consigue secciones a partir de materialcongelado y se obtienen grosores de 10 a 40 µmm,para observar con el microscopio óptico.

Ultramicrotomo. Con él se corta material inclu-ido en resinas y se obtienen secciones habitualmentede una pocas decenas de nanometros de grosor, perotambién entre 0.5 y 1 µmm. Las secciones de 0.5 µmmo más se observan con el microscopio óptico, mien-tras que las de un grosor de decenas de nanometrosvan destinadas a ser observadas con el microscopioelectrónico de transmisión.

Ultracriotomo: Su uso no está muy extendido perose suele emplear cuando se necesitan secciones del or-den de nanometros de material que no se debe incluir.Estas secciones van destinadas a su observación conel microscopio electrónico de transmisión.

Los aparatos de corte más usados tradicionalmentepara estudiar las caracteŕısticas generales de los teji-dos y de las células son el microtomo para material in-cluido en parafina para observaciones con el microsco-pio óptico y el ultramicrotomo para observaciones conel microscopio electrónico de transmisión. El criostatose usa también frecuentemente en microscoṕıa ópticapor el ahorro de tiempo que supone ya que no nece-sita incluir el tejido, incluso se puede cortar materialno fijado.

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 5

4 Microtomos de parafina

Los microtomos para cortar material incluido en para-fina son probablemente los más usados en los labora-torios de histoloǵıa. Todos poseen varias partes co-munes: una cuchilla, un portamuestras y un sistemamecánico que permite acercar el bloque de parafina,con la muestra dentro, a la cuchilla, a una distanciaque se corresponde con el grosor de la sección quepretendemos obtener, y realizar el corte.

Hay dos tipos de microtomo para parafina: el derotación y el de deslizamiento. El microtomo derotación provoca el corte gracias a la transformaciónde un movimiento de rotación en otro de ascenso ydescenso del portamuestras. En el movimiento debajada sobre la cuchilla se produce un acercamientodel portamuestras hacia la cuchilla según el grosorde corte seleccionado. En el portamuestras existe unsistema mecánico que permite orientar la superficiede corte de la muestra respecto a la cuchilla. En es-tos microtomos la cuchilla se mantiene fija durante elproceso de corte, pero puede regularse el ángulo deataque, es decir, el ángulo de la hoja de la cuchillarespecto a la superficie de la muestra. Con el mi-crotomo de deslizamiento se obtienen cortes medi-ante un movimiento de deslizamiento del bloque so-bre la cuchilla, o viceversa. En estos microtomos elmovimiento lo proporciona directamente la mano y esde ida y vuelta, siendo en la vuelta cuando se elevala posición del bloque, o dismimuye la de la cuchilla,una distancia que nos dará el grosor del corte.

Tanto el microtomo de rotación como el de desliza-miento tienen ventajas e inconvenientes. La princi-pal ventaja del de rotación es su precisión, la posi-bilidad de obtener secciones seriadas con facilidad yla automatización del proceso de corte mediante mo-tores eléctricos. Los microtomos de deslizamiento sonmás sencillos mecánicamente y su disposición permitecortar bloques más grandes, o bloques de celoidina,aunque están cayendo en des uso.

Hay que llevar a cabo una serie de procesos sobre elbloque de parafina antes de hacer el primer corte útila nuestra muestra. En primer lugar hay que retallar elbloque hasta hacer una pirámide truncada. Antes deretallar hay que considerar cual de las caras laterales

Figura 2: Microtomo para parafina con mecanismo derotación.

Figura 3: Microtomo para parafina con mecanismo dedeslizamiento.

de esta pirámide será el frente de ataque, es decir,cual será la que primero se ponga en contacto con lacuchilla. Esta cara deberá ser más ancha que la op-uesta, y ambas han de ser paralelas. Con el retalladose consigue una buena orientación de nuestra muestraen las secciones, la diferencia en el tamaño de la caraspermite que cada nuevo corte arrastre sin problemasal previamente cortado y, por último, las caras par-alelas hacen que se obtengan tiras rectas de cortes.Una vez retallada la pirámide, y antes de obtener sec-ciones de nuestra muestra, es necesario un procesode desbastado, es decir, la eliminación del espesor deparafina que hay entre la superficie del bloque y nues-tra muestra.

Otro aspecto que hemos de tener en cuentan antesde empezar a cortar es el ángulo de ataque o incli-

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 6

Figura 4: Preparación del bloque de parafina antes de iniciar la obtención de secciones útiles.

nación de la cuchilla respeto a la superficie de cortede la pirámide. Lo normal es orientar la cuchillacon un ángulo de uno 10o respecto a la superficiede corte, aunque se puede modificar según nuestrasnecesidades.

Una vez comenzado el corte de nuestra muestra seobtienen tiras de secciones unidas por las caras parale-las a la cuchilla. Estas tiras se suelen manipular conpinceles o lancetas y, antes de su fijación definitivaen la superficie de un portaobjetos, han de estirarsepara que nuestro tejido quede perfectamente exten-dido. Aprovechando la hidrofobicidad de la parafina,las secciones se colocan sobre agua calentada a unos35 oC a 40 oC y el calor las hace extenderse sin llegara su punto de fusión, que está en torno a los 60 oC. Elestiramiento se puede realizar en baños de agua conregulación térmica o sobre los propios portaobjetos

cubiertos de agua y colocados sobre una planchatérmica regulable.

La superficie del portaobjetos donde se colocan lastiras de cortes ha de estar previamente tratada paraque nuestro tejido quede adherido durante el proce-samiento posterior. Para ello los portaobjetos se re-cubren con soluciones de gelatina, albúmina, u otrassustancias y se dejan secar, de manera que hacen deadhesivo entre el cristal y nuestro tejido.

Una vez que el agua se ha evaporado y están ex-tendidas las tiras de cortes de parafina sobre el por-taobjetos, se procede a un secado exhaustivo en unaestufa a una temperatura de entre 35 oC y 40 oC du-rante toda la noche. Una vez secos, los portaobjetoscon las secciones están listos para el procesamientoposterior.

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 7

Figura 5: Una vez se ha retallado y desbastado el bloque se obtienen las secciones en tiras que serán colocadas sobreun portaobjetos cubierto con agua calentada a unos 40 oC. El portaobjetos ha sido tratado previamente son solucionesadhesivas. El calor y la hidrofobicidad de la parafina hace que las secciones se estiren sobre la superficie del agua y unavez evaporada queden adheridas al portaobjetos.

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 8

5 Vibratomo

Puede haber varias razones para evitar la inclusión deun tejido del que posteriormente obtener secciones.Durante los procesos de inclusión, como las inclu-siones en parafina o en resinas tipo epoxy, se ha desometer a las muestras a deshidratación. Esto oca-siona a veces daño en algunas moléculas o regionesmoleculares que son las que queremos detectar pos-teriormente con técnicas como la inmunocitoqúımica.Además, para observar algunas caracteŕısticas tisu-lares o celulares se requieren secciones gruesas del or-den de 50 µ;m, a veces de 100 o 200 µ;m. Por ejem-plo, para estudiar la organización espacial de deter-minadas células como las neuronas es recomendablehacer cortes de un grosor superior a las 50 µ;m y em-plear inmunocitoqúımica o histoqúımica para poner-las de manifiesto. La obtención de secciones gruesassin necesidad de inclusión se puede conseguir de dosmaneras diferentes: mediante congelación de la mues-tra y corte en un microtomo de congelación o medi-ante el uso del vibratomo.

Figura 6: Vibratomo. La cubeta, de color negro, ha deestar llena de tampón de trabajo durante el proceso decorte de manera que la cuchilla y la muestra, de color rojo,y las secciones que se obtienen están sumergidos.

El vibratomo es un aparato con el que se obtienensecciones de un grosor que puede oscilar entre las 40-50 µ;m hasta varios centenares de µ;m partiendo deuna muestra animal o vegetal endurecida sólo me-diante fijación. El mecanismo de corte consiste deuna plataforma sobre la que se sitúa la muestra,que puede regularse en altura y nos permite selec-cionar el grosor del corte, y de una cuchilla de borde

muy afilado que se desplaza horizontalmente sobre lamuestra realizando el corte. La caracteŕıstica del vi-bratomo es que la cuchilla, además de avanzar sobrela muestra, posee un movimiento de vibración laterala modo de sierra que facilita el corte y evita arras-trar el tejido. La muestra se encuentra adherida, nor-malmente mediante pegamento de contacto, directa-mente a un bloque portamuestras que se coloca sobrela plataforma elevadora.

Figura 7: Vista lateral de la cubeta de un vibratomo.

No todas las muestras son apropiadas para ser cor-tadas en un vibratomo. Aśı, aquellas que sean muyblandas o que posean porciones demasiado duras oelásticas son normalmente arrastradas por la cuchilla,a pesar de que disminuyamos la velocidad de avancey aumentemos la oscilación de la cuchilla. Es decir,la muestra ha de tener una cierta consistencia y noposeer elementos distorsionadores del corte.

Figura 8: Pegado de la muestra al bloque portamuestras.

Otra caracteŕıstica del vibratomo es que todo elproceso de corte se realiza bajo una solución acuosaque normalmente es una solución tamponada o unasolución salina. Para ello tanto la muestra como elborde de corte de la cuchilla han de estar sumergidosy los cortes que se obtienen se denominan cortes enflotación, es decir, no sujetos a ningún soporte. Estoscortes se pueden procesar de esta manera, flotando,

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 9

o adherirse a un portaobjetos y procesarlos después.Sin embargo, el proceso de secado necesario para laadhesión al portaobjetos suele conllevar alteracionesde la calidad del tejido. Aśı, los cortes se suelen pro-

cesar durante toda la técnica en flotación y posteri-ormente se montan sobre portaobjetos para su obser-vación con el microscopio óptico.

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 10

6 Criotomos

La congelación de los tejidos es una manera rápidade endurecerlos sin necesidad de inclusión. Esto tieneuna serie de ventajas. a) La preservación moleculares máxima, lo cual es muy importante si el proce-samiento posterior requiere el reconocimiento molec-ular. b) Las muestras congeladas pueden cortarse ensecciones finas, del orden de 5-15 µ;m, y más gruesasdel orden de cientos de µ;m. El vibratomo permitetambién cortes sin incluir pero no se pueden conseguirsecciones finas. c) La obtención de buenas seccionesno depende del tipo de tejido (excepto tejidos mineral-izados como el hueso o aquellos excesivamente cornifi-cados). d) Por último, es posiblemente la manera másrápida de obtener secciones puesto que es posible con-gelar la muestra sin necesidad de fijación y cortarlade inmediato, como las biopsias. Pero para preser-var correctamente la estructura del tejido ha de seruna congelación muy rápida, normalmente en isopen-tano enfriado con nitrógeno ĺıquido, lo que evita laformación de cristales de hielo que deterioran las es-tructuras celulares.

Figura 9: Microtomo de congelación. El tubo negro de laderecha es el encargado de enfriar el portabloques a tem-peraturas inferiores a -20 oC, lo cual congela a su vez a lamuestra (color rojo). Las secciones se recogen de la cuchillacon un pincel y se colocan en tampón de trabajo.

En el caso de que no se requiera un corte rápido lasmuestras normalmente se fijan y posteriormente seincuban en una solución anticogelante que contienesacarosa y glicerol. Con ello se evita que durantela congelación se formen cristales de hielo grandes

que puedan dañar las estructuras celulares. Tambiénse evitan daños tisulares con una congelación muyrápida, por ejemplo, con nitrógeno ĺıquido. Dichacongelación permite preservar incluso la ultraestruc-tura celular y observarla al microscopio electrónico,siempre con el uso previo de anticongelantes. Paraobservaciones que no necesiten una preservación ul-traestructural se suele realizar la congelación de lamuestra a temperaturas superiores (entre -80 oC y-20 oC) que dependen del aparato empleado para re-alizar los cortes, lo cual hace necesario el uso previode anticongelantes.

Figura 10: Criostato. El compartimento de color azul es lacámara refrigerada a la temperatura seleccionada. En estacámara se encuentra la muestra, la cuchilla y es donde serecogen las secciones.

Los dos aparatos más usados para realizar cortespor congelación son el microtomo de congelación yel criostato. El microtomo de congelación realizacortes de decenas de µ;m de grosor y consiste enuna plataforma que se enfŕıa a bajas temperaturassobre la que se coloca la muestra. Tras cada cortela plataforma se eleva un espacio correspondiente algrosor de corte seleccionado. En los microtomos decongelación antiguos se produćıa la congelación me-diante gas carbónico que hab́ıa que suministrar regu-

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 11

larmente. Actualmente se produce la congelación (de-30 oC a -40 oC) de la plataforma mediante tubos queparten de un sistema de refrigeración externo al pro-pio dispositivo de corte. Además, existe la posibilidadde congelar también la cuchilla si se desea. En losaparatos actuales la muestra se congela por contactodirecto con la plataforma y su temperatura es con-stante durante todo el tiempo de corte. Las seccionesque se obtienen, de decenas a cientos de |mu;mm, serecogen con un pincel, se añaden a un recipiente contampón de trabajo y se trabaja con ellas en flotación,igual que en el caso del vibratomo.

Figura 11: Criostato. El mecanismo de rotación y corte delcriostato se encuentra dentro de una cámara refrigerada.

El criostato se utiliza para obtener secciones porcongelación de 10 a 30 µ;m de grosor, aproximada-mente. En este aparato todo el sistema de corte seencuentra encerrado en una cámara refrigerada cuyatemperatura se puede regular, normalmente entre -20 y -30 oC. La congelación se suele hacer en unaplataforma dentro de la propia cámara refrigerada quese encuentra a una temperatura inferior, en torno a-50 oC. También se puede congelar el tejido exter-namente con la rapidez que deseemos, por ejemplocon nitrógeno ĺıquido, pero es conveniente colocar lamuestra en la cámara del criostato hasta que consigaigualar su temperatura con la de ésta para obtenersecciones homogéneas. Antes de la congelación, la

Figura 12: Criostato. Proceso mediante el que se peganlas secciones a un portaobjetos.

muestra se encastra en un medio que es ĺıquido atemperatura ambiente y sólido a la de corte. Portanto, tenemos nuestra muestra en un bloque sólido,encastrada pero no incluida. Esto permite manipu-lar la muestra y adherirla a un soporte portamues-tras, el cual se fijará a un eje que avanza sobre lacuchilla. La preparación del bloque y el mecanismode corte es similar al que se describió para el micro-tomo de rotación para parafina. Las secciones que sevan obteniendo se adhieren por contacto a portaobje-

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 12

tos con superficies adhesivas. Las secciones se descon-gelan rápidamente en este proceso de pegado puestoque los portaobjetos están a temperatura ambiente yuna vez secas pueden procesarse para las técnicas quedeseemos.

Todav́ıa existe un tipo de criotomo mucho mássofisticado denominado ultracriotomo. Este aparato

se emplea para obtener secciones ultrafinas, del ordende decenas de nanometros, para su observación con elmicroscopio electrónico de transmisión. La ventaja deeste aparato respecto al ultramicrotomo (ver en sigu-iente página) es que los tejidos no pasan por solventesorgánicos y no temperaturas elevadas y por tanto lapreservación molecular es mayor.

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 13

7 Ultramicrotomo

Para la observación con detalle de la ultraestructuracelular es necesario realizar secciones muy delgadas,del orden de nanometros, denominadas ultrafinas, yobservarlas con el microscopio electrónico de trans-misión. Para ello se incluye la muestra en resina,generalmente de tipo epoxy, que una vez polimer-izada resulta en un bloque de gran dureza. La ob-tención de secciones ultrafinas se lleva a cabo con unaparato denominado ultramicrotomo. Otra maneramenos habitual de obtener secciones ultrafinas es me-diante el ultracriotomo, para lo cual la muestra secongela y se corta en una cámara refrigerada a muybajas temperaturas. Este último es un mecanismosimilar al visto para el criostato. Es un aparato quesólo se usa cuando queremos detectar con microscoṕıaelectrónica moléculas que son dañadas durante el pro-ceso de inclusión.

Figura 13: Ultramicrotomo

El ultramicrotomo tiene un diseño para cortar deun modo similar al microtomo de parafina de rotación,pero mucho más preciso y sofisticado. Quizá el sis-tema más delicado sea el que hace avanzar el bloquesobre la cuchilla pues debe hacerlo a intervalos de var-ios nanometros. Actualmente este sistema de avancees mecánico pero en los ultramicrotomos más antiguosera por calor, que produćıa dilatación del eje sobre elque se sujetaba la muestra. También tiene un sistemacompleto de orientación de la muestra sobre el bordede la cuchilla para que el plano de corte se pueda ori-

entar perfectamente a la superficie de nuestra mues-tra. Al realizar cortes muy delgados cualquier vi-bración o cambio de temperatura afecta la homogenei-dad del grosor del corte, por tanto el ultramicrotomodebe situarse en una habitación donde no haya vi-braciones y mantenerla a temperatura constante paraevitar dilataciones del brazo que porta la muestra,dentro de lo posible. Además, estos aparatos se colo-can sobre mesas especiales para disminuir las vibra-ciones. Todos los ultramicrotomos actuales tienen unpanel de control externo al aparato desde donde secontrola electrónicamente el proceso de corte: iniciode corte, grosor de la sección, velocidad de corte, ven-tana de corte, iluminación de la muestra, etcétera.

Antes de realizar el primer corte ultrafino de unamuestra, al igual que ocurŕıa con los cortes de para-fina, es necesario retallar y desbastar el bloque paracrear una pirámide truncada. Aunque todo este pro-ceso se puede hacer a mano con una cuchilla, se sueleutilizar un aparato denominado piramidotomo con elque se liman y crean las caras de la pirámide con undispositivo a modo de torno, además de producir eldesbastado para obtener la superficie de corte. Hayque tener en cuenta que este proceso ha de ser precisoporque la superficie de corte debe ser muy pequeña,en torno a unos 0,5 mm2. Los lados de la superfi-cie de corte deben ser similares a los descritos parael corte en inclusiones de parafina, dos lados han deser paralelos y uno más grande que el otro. Con estonos aseguramos que una nueva sección empujará a laprevia del borde de la cuchilla y que conseguiremostiras rectas de secciones. Antes de hacer las seccionesultrafinas se suele hacer una sección semifina, de 0,5o 1 µ;m para tener una imagen de la muestra al mi-croscopio óptico.

Las cuchillas empleadas para hacer secciones ul-trafinas son espećıficas para este tipo de aparatospuesto que han de tener unos filos muy agudos. Lasmás comúnmente usadas son de vidrio especial y seobtienen mediante unos aparatos que mediante ral-laduras con puntas de diamante y golpes secos so-bre barras de vidrio son capaces de producir dichascuchillas. Sin embargo, la mejor calidad de corte seconsigue con cuchillas con filo de diamante, pero sonmucha más caras. Aunque los ultramicrotomos ac-tuales tienen mecanismos de corte precisos, durante

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 14

Figura 14: Proceso por el que se obtiene una cuchilla para hacer cortes en el ultramicrotomo.

el proceso de corte se pueden obtener secciones dedistinto grosor. El grosor de una sección ultrafina seconoce por el color que produce el reflejo de la luzsobre su superficie. Este color puede ser gris (menosde 60 nm), plata (60 a 90 nm), oro pálido (90 a 120nm), oro intenso (120 a 150 nm), púrpura (150 a 190nm), etcétera.

Las secciones ultrafinas recién obtenidas quedanflotando sobre una balsa de agua que posee la propiacuchilla y no se recogen sobre portaobjetos sino direc-tamente sobre soportes de ńıquel o cobre denomina-dos rejillas. Son discos circulares con un enrejado dehilos que dejan cavidades, las cuales son de distintotamaño según el tipo de rejilla, normalmente desde100 a varios cientos de µ;m cuadradas. Estas rejillas

tienen la ventaja de permitir una gran nitidez delas imágenes del tejido que ofrece el microscopioelectrónico puesto que los electrones sólo atraviesanla sección antes de incidir sobre la pantalla de visual-ización. Sin embargo, presentan el problema de quela porción de sección que caiga sobre el hilo de la re-jilla quedará oculto. Por ello existen las ”rejillas” deojal, que tienen una sola cavidad y suficientementegrande como para que quepa un corte entero. Obvi-amente es necesario suministrar un soporte para quela sección no se cuele por la cavidad. Este soporte esnormalmente una membrana muy fina hecha de unasustancia denominada formvar, la cual deja pasar loselectrones y sostiene a las secciones.

Atlas de la Universidad de Vigo

Técnicas histológicas. Corte. 15

Figura 15: Corte y recogida de secciones en una rejilla.

Atlas de la Universidad de Vigo

IntroducciónEl proceso histológicoCorteMicrotomos de parafinaVibratomoCriotomosUltramicrotomo