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OBJETIVOS:

GENERAL

Analizar las técnicas moleculares

ESPECÍFICOS

Comparar las técnicas clásicas con las técnicas moleculares. Determinar las técnicas moleculares más relevantes con funcionamiento y su área de

aplicación. Analizar la técnica del PCR (La reacción en cadena de la polimerasa) de forma

detallada.

MARCO TEÓRICO:

Métodos moleculares

Permiten la detección de porciones de ácidos nucleicos (DNA o RNA) que son específicos de cada microorganismo, en diferentes materiales clínicos. Su aplicación, surge como una necesidad para poder detectar microorganismos de difícil crecimiento en cultivos o desarrollos tardíos y donde las técnicas serológicas de detección de antígenos y anticuerpos carecen de suficiente sensibilidad y especificidad diagnóstica.

Las técnicas moleculares en este tiempo se refieren al último escalón de desarrollo de estas técnicas, aportando las ventajas , nos permiten además de la detección, cuantificación de AN, también detectar mutaciones, genotipos, translocaciones, determinaciones que aportan a diferentes especialidades dentro de la Medicina.

VENTAJAS

En la actualidad las técnicas moleculares para la identificación de microorganismos están teniendo un auge muy importante debido a :

Especificidad, pueden detectar solo la molécula o microorganismo de interés Sensibilidad, son capaces de detectar la presencia de un solo microorganismo Rapidez, se puede identificar un microorganismo en menos de 24 horas Pueden ser automatizadas, permiten tener un diagnóstico en un menor tiempo y reducir

los costos.

El uso de técnicas moleculares ha permitido identificar nuevos microorganismos, los cuales no había sido posible su cultivo e identificación por técnicas tradicionales Además permiten estudiar las poblaciones microbianas  sin hacer aislamientos, por lo tanto, se evitan los sesgos que pueden surgir con el cultivo de microorganismos . Así mismo estas técnicas permiten la detección de microorganismos altamente patógenos, los cuales pueden ser identificados muertos evitando así los riesgos de infección del analista.

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Las técnicas moleculares han demostraron ser muy útiles en situaciones clínicas donde los métodos convencionales son muy insensitivos, lentos o muy complicados para ser usados a gran escala

DESVENTAJAS

Algunas de las desventajas asociadas a las técnicas moleculares son:

No distinguen entre organismos vivos y muertos, aunque algunas veces esto no es precisamente una desventaja en el caso de Staphylococcus aureus la bacteria muere a temperaturas que no degradan la toxina así la detección de la bacteria muerta es un indicativo de la presencia de toxinas en la muestra.

Se tiene que contar con conocimientos de secuencias de nucleótidos especificas del patógeno diagnosticar.

Se requiere de personal altamente capacitado para el desarrollo  de las pruebas de identificación

Se requiere equipo más especifico para el diagnostico, lo cual eleva la  inversión inicial, Se desarrollan procedimientos con múltiples etapas, lo que incrementa la posibilidad de

errores, además de la posibilidad de obtener falsos positivos y falsos negativos.  El alto costo de las técnicas moleculares tendera a bajar a medida que se incremente el uso de estas técnicas.

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ANÁLISIS MOLECULAR DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS

Para obtener resltados confiables sobre la biota microbiana de un hábitat es necesario conocer que clase de organismos están presentes y en qué número. La tinción celular ayuda a obtener esos números, así tenemos Tinción fluorescente con DAPI, Tinción de viables, Anticuerpos fluorescentes, Proteínas fluorescentes verdes para el etiquetado celular.

Tinción fluorescente con DAPI Las células teñidas con DAPI presentan fluorescencia azul brillante y son muy fáciles de ver y enumerar, esta técnica se usa en muestras clínicas, del ambiente y de alimentos. Tiene la ventaja de no ser específicas (tiñen todos los microorganismos de una muestra), pero con el inconveniente de que no diferencian entre células vivas y muertas, ni permiten el rastreo de organismos específicos en el ambiente.

Tinción de viablesA la muestra se añaden dos colorantes, verde y rojo; el colorante fluorescente verde penetra en todas las células, viables o no, mientras que el rojo, penetra sólo en aquellas células cuya membrana ya n o se encuentra intacta y, por tanto, están muertas. Las células verdes estaban vivas y las rojas muertas. Este método se utiliza con cultivos bacterianos de laboratorio, pero no es adecuado para el examen microscópico de hábitats naturales

Anticuerpos fluorescentesPuede explotarse para identificar o rastrear u n organismo en u n hábitat complejo; por ejemplo, suelo o una muestra clínica que contenga una mezcla de muchos organismos. Es utilizado en laboratorios de microbiología clínica.

Proteínas fluorescentes verdes para el etiquetado celular.

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Se basa en la ingeniería genética y vuelve fluorescentes a los microorganismos. Se utiliza para estudiar in situ la competencia microbiana, con la ayuda de luz UV se puede encontrar a las cepas con esta proteína fluorescente (GFP.)

Tinción filogenética con FISHLos colorantes filogenéticos son oligonucleótidos fluorescentes complementarios en la secuencia de base a las secuencias «signatura» en el rRNA 16S (en procariotas) o 18S (en eucariotas) . Permite identificar o rastrear un organismo particular, caracterizar filogenéticamente un hábitat completo

Tinción de cromosomas y transcripción inversa in situLa tinción de cromosomas es útil para identificar bacterias que contienen genes específicos, como los que codifican la nitrogenasa, responsable de la fijación de nitrógeno, los componentes del centro de reacción fotosintético u otros. La transcripción inversa in situ busca si un organismo está expresando un gen o genes determinados en la naturaleza en un momento determinado.La principal ventaja es que permite al investigador explorar los factores que controlan la expresión génica en poblaciones naturales y observar cómo las alteraciones experimentales en una muestra afectan a la transcripción de genes específicos.

PCR

Esta técnica es una amplificación enzimática resulta en una acumulación de la secuencia blanco (target). La PCR consiste de un número de ciclos cambios de temperatura que producen:

separación de las hebras de ADN; unión del oligonucleótido (partidor o primer) al segmento ADN; extensión que permite a la ADN polimerasa sintetizar el resto de la hebra

complementaria.

Estos ciclos se repiten habitualmente 30 ó 40 veces para obtener un producto que puede ser fácilmente detectado por medio de un gel de agarosa o por hibridación en microplacas.

Con esta técnica, prácticamente cualquier segmento de ADN de una determinada bacteria, hongo o virus puede ser amplificado y detectado. Sin embargo, los laboratorios deben analizar varios factores, entre los cuales destaca la aplicación clínica que podría tener la detección de un determinado organismo, así como los costos, sensibilidad y especificidad del examen en comparación con las técnicas tradicionales. En general, las técnicas de diagnóstico molecular están indicadas cuando un organismo no puede ser cultivado in vitro, o cuando requiere de un medio complejo y largos períodos de incubación.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la amplificación enzimática in vitro de un segmento de ADN específico del microorganismo blanco. Esta es la técnica más utilizada para la detección de microorganismos,  se basa principalmente en realizar millones de copias de un segmento de ADN  específico de un microorganismo. En esta técnica  la cadena doble de ADN 

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es separada en dos cadenas sencillas sometiéndola a temperaturas mayores a 92 grados centígrados  después  se hibridiza o alineen dos   pequeños segmento de ADN complementarios  uno a una cadena y el otro a la otra.

Inmunomagnetica PCR

En esta técnica un anticuerpo primario se encuentra unido a perlas metálicas las cuales se colocan dentro de la muestra a analizar, se deja incubar para la unión antígeno-anticuerpo, posteriormente se extraen estas perlas metálicas con un magneto, se lavan y  se colocan en un tubo en el cual se realiza la PCR. Esta técnica se  ha utilizado para la detección de Listeria monocytogenes en alimentos.

PCR-múltiple.

Uno de los problemas de las técnicas de PCR  es que solo permiten la identificación de un solo patógeno a la vez. Con la finalidad de solucionar este problema  se ha diseñado la técnica conocida como PCR-múltiple la cual permite la detección de diferentes moléculas  o microorganismo de interés en una sola reacción. En esta técnica se incorporan a la reacción un par de iniciadores por cada uno de las moléculas o microorganismos a detectar, lo cual permite un ahorro en tiempo y costo para la detección de diferentes microorganismos simultáneamente. Esta técnica presenta retos como el de diseñar todos los iniciadores que se deseen agregar a la reacción con similar temperatura de alineamiento,  no deben de presentar homología entre ellos, además de  amplificar fragmentos de diferentes  longitudes.

PCR-RFLP

Esta técnica consiste en amplificar por PCR un segmento específico de un microorganismo y posteriormente digerir el ADN amplificado con enzimas de restricción, esto permite poder determinar diferencias entre los patrones de  bandas amplificadas entre los patrones de los fragmentos resultantes de la digestión del  ADN. Existen diferentes variantes de esta técnica dependiendo del fragmento específico amplificado y digerido. Entre los segmentos más comúnmente amplificados y posteriormente digeridos se encuentran los genes ribosomales , los espacios entre el conjunto de genes ribosomales 

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7.-CONCLUSIONES

Se determinó que las técnicas clásicas por si solas no son suficientes para apreciar de forma correcta la ecología microbiana, se necesita emplear técnicas o métodos moleculares como un complemento indispensable.

Se determinó que las técnicas moleculares más importantes incluye la tinción fluorescente con DAPI, Anticuerpos fluorescentes, Tinción filogenética con FISH, PCR

Se pudo conocer que el método PCR es la técnica más utilizada para determinar microorganismos, basado en el material genético específico de cada Microorganismo.

8.-BIBLIOGRAFÍA

Molecular Biotechnology.Principles and Applications of Recombinant DNA. (3ª Edición).B.R. Glick y J.J. Pasternak. ASMPress. 2003.Disponible en: [http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/MMMA.PDF] 2012-06-29

BROCK BIOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS traducido por Pearson Education Madrid PEARSON PRENTICE HALL 2003 p.pp. 634-640

http://site.ebrary.com/lib/espochsp/docDetail.action?docID=10090898&p00=METODOS+MOLECULARES[Consulta: 2 julio 2012]

Diagnóstico molecular de agentes infecciososhttp://www.scielo.cl/scielo.php?pid=s0716-10182003000100004&script=sci_arttext[Consulta: 2 julio 2012]

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