TECNICAS PARA MEDICION DE BIOMASA.Universidad de Sucre. Facultad de Ingeniería. Programa de Ingeniería

Agroindustrial. Biotecnología.Marcela González Santos

COD: 224-90122464031

Palabras Claves: Biomasa, Cámara de Neubauer, Levadura.

RESUMEN

Los métodos de recuento de células determinan directamente las células vivas y muertas presentes en una muestra; esto puede lograse utilizando una cámara especial para recuentos como la de Petroff-Hauser, la Cámara de Neubauer, siendo estos los mas conocidos puesto existen otros tipos de métodos de cuantificación como los son el UFC, membrana de filtración, Epifluorescencia directa, Coulters, Técnica del numero mas probable (NMP). Para el desarrollo de esta experiencia se realizo la medición de la biomasa microbiana en un cultivo madre a partir de levadura, hechos por conteo directo en cámara de Neubauer, tomando dos muestras de la misma a distintas concentraciones. Los resultados arrojados en la aplicación de este método, indicaron que por cada 6.25x10-2

milímetros cuadrado había un promedio de seis levaduras, lo cual indica que la dilución preparada a partir de la muestra madre, cumplió con los aspectos necesarios para un buen conteo de la biomasa, pero esta técnica no permite distinguir las células vivas de las muertas, por consiguiente no es muy útil en un recuento de poblaciones con altas o bajas concentraciones de microorganismos. ABSTRACT:

Methods directly determine cell count live and dead cells present in a sample, this can be achieved using a special camera to count as the Petroff-Hauser, the House of Neubauer, these being the best known because there are other types of methods quantification as are the UFC, membrane filtration, direct Epifluorescence, Coulters, most probable number technique (MPN). For the development of this experiment was conducted measuring the microbial biomass from a stock culture of yeast, made by direct counting in Neubauer chamber, taking two samples from the same at different concentrations. The results obtained in applying this method, indicated that for every square 6.25x10-2 mm had an average of six yeast, indicating that the dilution prepared from the mother sample, met the necessary features for a good count biomass, but this technique can not distinguish live cells from dead, therefore not very useful in populations with high counts or low concentrations of micro-organisms.

INTRODUCCION

Los métodos para estimar el número de microorganismos pueden medir la cantidad de células, la masa celular o la actividad celular. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difícil cuantificar las células individuales.

Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presenta unas señales que determinan un volumen conocido (por microlitros). Al contar bajo el microscopio el número de partículas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de particulas en la suspensión de origen. Existen distintas cámaras para el recuento directo de microorganismos, para microscopios de campo claro, entre estas tenemos, la cámara de petroof-hauser y cámara de neubauer.

La primera cámara consiste en una lámina con una depresión en la cual un volumen conocido se deposita sobre un área que esta divida en cuadros. La cámara se llena con la muestra o con una dilución de esta, se cuenta el número de bacterias en 20 cuadros y se calcula el promedio de las mismas por cuadro. Para calcular el número de bacterias/ml se debe multiplicar el número de bacterias por cuadro por 2 x 107 debido a que la cámara tiene un volumen de 0.02 mm3 y un total de 400 cuadros. La segunda es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fase. Se trata de un portaobjeto con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante la cuadricula. Es un cuadrado de 3x3 mm con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada corresponde a 1 mm cuadrado.

Para el conteo de células por la cámara de neubauer se realiza cuadro por cuadro y se hace un total. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales células son contables o cuales están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la segunda línea son contables, si la tocan o están encima de ella no se incluyen. Gráficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las células que tiene una X son las que no se deben contar.

MATERIALES Y METODOS

ESTERILIZACION DEL LUGAR DE TRABAJO

Para la adecuada esterilización se era necesaria preparar una solución de hipoclorito de Sodio (NaOCl), a partir de una concentración de 5.25% para un volumen de 200 ml a una concentración de 125 ppm, con el fin de esterilizar el área de trabajo.

5.25 ------------------ 100 gr

X-------------------- 1000 gr

X= 52.5 gr x 1000 mg/gr = 52500 mg/L= 52500 ppm

V1: Volumen de NaOClC1: Concentración de NaOClV2: Volumen de la solución a prepararC2: Concentración de la solución a preparar

V1* C1 = V2* C2

V1 = 200ml x 125 ppm/ 52500 ppm = 0.47 ml

Estos 0.47 ml de NaOCl fueron los necesarios para obtener una solución de 200 ml a una concentración de 125 ppm. Para después de preparar esta limpiar el sitio de trabajo, para crear las condiciones de esterilización necesarias en el área de trabajo.

PREPARACION DE CULTIVO MADRE

Para la preparación del cultivo madre se pesaron aproximadamente 0.4 gr de levadura seca comercial, adicionándola en un Erlenmeyer que contenía 200 ml de agua destilada estéril, agitándola y tapándola con un vidrio de reloj, dejándola reposar.

0.4 gr de levadura + 200 ml de agua destilada

Para la preparación de las soluciones problemas, se determino en primera instancia la concentración de la solución madre de la siguiente forma:

1. Convertir los gramos de levadura a miligramos

0.4 gr x 1000 mg/gr = 400mg

2. Para obtener la concentración en unidades de ppm se divide el peso de la levadura entre el volumen de agua en litro, obteniendo asi la concentración madre

Cm = 400 mg/0.2 L= 2000 ppm

El cultivo madre tenia una concentración de 2000ppm.

Posteriormente de este cultivo madre tomamos dos muestras que fueron depositadas en dos tubos de ensayo las cuales tenían diferentes concentraciones

Cultivo madre

2000ppmEn el primer tubo de ensayo preparamos la solución 10 ml a una concentración de 100 ppm, determinando el volumen que debe tomarse de la solución madre, con los siguientes cálculos:

V1* C1 = V2* C2

V1: Volumen MadreC1: Concentración MadreV2: Volumen de la solución a prepararC2: Concentración de la solución a preparar

V1 = 10ml x 100 ppm/ 2000 ppm ; V1= 0.5 ml

Tomando así el cultivo madre un volumen de 0.5ml de la solución y completamos con agua destilada hasta un volumen de 10ml (volumen de agua: 9.5ml)

Para la preparación de la segunda solución se utilizo el mismo procedimiento, teniendo en cuenta que su concentración fue de 120 ppm y su volumen de 10 ml,

V1* C1 = V2* C2

V1 = 10 ml x 120 ppm/ 2000 ppm ; V1= 0.6 mlA este tubo también se le adiciono agua destilada (9.4 ml)

MEDICION DE LA BIOMASA MICROBIANA POR CONTEO DIRECTO EN CAMARA DE NEUBAUER

Para preparar la solución problema se toma una alícuota de un volumen aproximado de 0.1 ml y se deposito en la superficie pulida de la cámara de neubauer, cubriéndola con un portaobjeto. Luego se llevo al microscopio y se hizo un conteo directo teniendo en cuenta el campo de conteo de la misma.

C2 : 100 ppmV2:10ml

C2 : 120 ppmV2:10ml

RESULTADOS Y ANALISIS

De acuerdo al resultado obtenido se puede afirmar que la cámara de Neubauer permite hacer un recuento superficial de las células de levadura, sin embargo no permite distinguir las células viables de las no viables, como se muestro en la anterior imagen. Las levaduras se encuentran inactivas al no estar en contacto con el agua es decir en estado de latencia, mientras que al estar en contacto con ella pasan a la fase exponencial, ya que estas células han sufrido un proceso de liofilización, por lo que hace necesario diluirlas permitiendo así el conteo de las mismas.

Teniendo en cuenta que en esta técnica, uno de los factores que afecta la observación de las células de levadura es la correcta dilución de la muestra empleada, se puede decir que si durante el conteo se observan aproximadamente 69 células la muestra se encuentra muy concentrada, mientas que si se observan menos de 20 células, la muestra se encuentra muy diluida. Por tanto, de acuerdo a los resultados obtenidos la muestra se encuentra en último rango.

CONCLUSION

El método de conteo por cámara de neubauer permite un análisis cuantitativo de las células en estudio, por medio del depósito de la alícuota en la superficie de la Cámara para ser observada en el microscopio. Este método permite contabilizar las células sin distinción de viabilidad, lo cual se convierte en una desventaja para la aplicación de este en el conteo de poblaciones con baja concentración.

Esta técnica está fundamentada en aspectos cuya buena aplicación permiten un óptimo proceso de conteo, como son una dilución adecuada, la precisa concentración de la muestra y los instrumentos indicados.

CUESTIONARIO

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1. Consulte ventajas y desventajas de cada una de las tecnnicas utilizadas en el experimento

Las ventajas de este tipo de recuentos son el equipo sencillo y escaso que se requiere, la rapidez para obtener los resultados y la facilidad para observar la morfología de los microorganismos presentes. Sus desventajas se dan porque no se diferencian los microorganismos vivos de los muertos, es tedioso y no es útil para recuento de poblaciones con baja concentración de bacterias.

2. ¿Que son los colorantes supravitales y para que se usan?

Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo del que proceden. 3. ¿cuales son los métodos utilizados para la medición de la biomasa microbiana?

Método de placa (standard plate count), Turbidimetría Contaje por laminilla Petroff-Hauser Bioluminicencia.

Los métodos más utilizados son el método de placa y el de turbidometría.

BIBLIOGRAFIA

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Walker, J.M. Biología Molecular y biotecnología. Editorial Acribia. Zaragoza España. 475 pg.