Tema 11.2-Estudio de La hemostasia Primaria, Coagulacion y Fibrinolisis

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Bioquímica Clínica i Hematologia – curs 2006-07

Tema 11.2Tema 11.2

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ESTUDIO DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA, LA COAGULACIÓN Y LA

FIBRINÓLISIS

BioquBioquíímica Clmica Clíínica i Hematologianica i Hematologia


Tema 11.2Tema 11.2

Estudios inespecíficos de hemostasia primariaRecuento de plaquetas

Método manualMétodo automático

Tiempo de sangriaMétodos de filtrado a elevado shear stress

ESTUDIO DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA

ESTUDIO DE LA COAGULACIÓN SANGUÍNEAEstudios coagulativos

Generalidades de la fase preanalítica. Generalidades de la fase analíticaTiempo de protombina (TP): explora vía extrínsecaTiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA): explora vía

intrínsecaFibrinógeno.Tiempo de trombina.Tiempo de reptilaseDeterminación de la actividad de los factores de la coagulaciónValoracion de los inhibidores de la coagulación

(antitrombina, proteína C, proteína S)ESTUDIO DE LA FIBRINOLISISValoracion de activadores e inhibidores de la fibrinolisis

(plasminógeno, t-PA, antiplasmina, PAI-1)Valoracion de los productos de degradacion de la fibrina estabilizada..

Dímero-D


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ESTUDIO DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA

Estudios inespecíficos de hemostasia primaria

Recuento de plaquetasMétodo manualMétodo automático

Tiempo de sangriaMétodos de filtrado a elevado shear

stress


Tema 11.2Tema 11.2

METODO MANUALSangre venosa (EDTA) o capilarDilución a 1/100, mediante Unopette® o capilar

aforado, en oxalato amónico (solución hemolizante)Lectura en cámara cuentaglóbulos: Burker,

Neubauer.Microscopio para contraste de fases y objetivo x

40.(CV: 11 %)

METODOS AUTOMATICOSMétodos de resistencia eléctricaMétodos ópticos (CV: 2-4 %)


Recuento de plaquetas

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Tema 11.2Tema 11.2

Método manualCámara cuentaglóbulos

ZONA LECTURA


Tema 11.2Tema 11.2

ZONA LECTURA

Método manualCámara cuentaglóbulos


Tema 11.2Tema 11.2

Contadores automáticosPrincipio de medida

Las células se distribuyen en diferentes cámaras o canales

LEU

HBERI

PLT

MUESTRA ASPIRADA


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Principio de la impedancia o corriente eléctrica

Se reconocen impulsos eléctricos por unidad de tiempo:- número de partículas- volumen de las mismas

Contadores automáticosPrincipio de medida

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Contadores automáticosRepresentación gráfica de las poblaciones

Histogramas Paquetas, VPM, IDP


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Recuento automático de plaquetasCausas de error

No se cuentan las plaquetas de gran tamañoRecuento de eritrocitos microcíticos o esquistocitosPseudotrombocitopenia por aglutinación “in vitro” en presencia de EDTA: observar el frotis de sangre y comprobar recuento con sangre extraída en el tubo de citrato (tapón azul -coagulación)


Tema 11.2Tema 11.2Contadores automáticosLímites de alarma

Presencia de agregados de plaquetasPresencia de esquistocitos o hematíes pequeñosPresencia de eritroblastos

LL


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Plaqueta gigante

Plaqueta dismórfica

PSEUDOTROMBOCIOPENIA EDTA DEPENDIENTE

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Definición :

Es el tiempo que se obtiene al medir la duración del sangrado que se produce tras aplicar una incisión cutánea de unas características precisas.Significado :Su prolongación puede reflejar alteraciones:

Cualitativas de las plaquetas o del factor von WillebrandCuantitativas de las plaquetas o del factor von WillebrandDefecto en la función de la pared vascular

Limitaciones :Procedimiento de escasa reproductibilidadFactores que contribuyen a su alargamiento: temperatura de la

superficie corporal, o características de la piel, la incisión,etc


Tiempo de sangria


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Método de DukeNo aconsejable por su escasa sensibilidad y reproductibilidad

Método de IvyDurante la prueba se mantiene un esfigmomanómetro a 40 mmHg.Realización de un corte en la parte superior de la cara anterior del antebrazo, poniendo en marcha el cronómetro. La sangre que brota se recoge cada 30 s, sin tocar los bordes de la herida. Anotar el tiempo que tarda en cesar la hemorragia.


Tiempo de sangria


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Tiempo de sangría – método de ivyRealizacion


Tema 11.2Tema 11.2

Definición :Método ex vivo alternativo al tiempo de sangría que se basa en un sistema de flujo sanguíneo sometido a un elevado coeficiente de cizalladura, que simula el flujo arteriolar, mediante el paso de sangre total citrada a través de una membrana cubierta por agonistas plaquetares: colágeno+ADP(col/ADP) o colágeno+epinefrina (Col/Epi). El valor a medir es el tiempo que tarda en obturarse la membranaSignificado :

El alargamiento del tiempo de obturación Col/Epi detecta:Disfunción plaquetar por defectos plaquetares intrínsecos (enfermedad von

Willebrand) o presencia de agentes antiagregantes plaquetaresEl alargamiento del tiempo de obturación Col/ADP detecta

Disfunción plaquetar por defectos plaquetares intrínsecos (enfermedad von Willebrand)

No es sensible a la acción de antiagregantes plaquetares: aspirina y análogos. Por tanto si este es normal el alargamiento Col/Epi se debe a la presencia de estos.

Estudios inespecíficos de hemostasia primariaMétodos de filtrado a elevado shear stress: PFA-100

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Limitaciones :Se altera por disminución en la cifra de plaquetas Se altera por disminución en el hematocrito

Ventajas :

No es sensible a la heparinización: permite el estudio de la función plaquetar en pacientes heparinizados

Para el estudio de la enfermedad von Willebrand posee una sensibilidad y una especificidad claramente superiores a la del tiempo de sangria

Estudios inespecíficos de hemostasia primariaMétodos de filtrado a elevado shear stress: PFA-100


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Hemostasia primaria Valores de referencia

Recuento de plaquetas:

150 – 400 x 109 / L

Tiempo de sangría (Ivy):

≤ 8 minutosPFA- 100

Col/Epi 65 - 161 segundosCol/ ADP 51 - 123 segundos


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ESTUDIO DE LA COAGULACIÓN SANGUÍNEA

Estudios coagulativos Generalidades de la fase preanalítica.

Generalidades de la fase analíticaTiempo de protombina (TP): explora vía extrínsecaTiempo de tromboplastina parcial activado

(TTPA): explora vía intrínsecaFibrinógeno.Tiempo de trombina.Tiempo de

reptilaseDeterminación de la actividad de los factores de la

coagulaciónValoracion de los inhibidores de la coagulación

(antitrombina, proteína C, proteína S)


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Estudios coagulativos Generalidades El estudio de la coagulación según el esquema clásico (vía intrínseca,

vía extrínseca y vía común) sigue teniendo su utilidad práctica en el diagnóstico de síndromes hemorrágicos

Dos pruebas coagulativas inespecíficas como el tiempo de protombina(TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) permiten detectar la mayor parte de síndromes hemorrágicos

Únicamente el factor XIII no queda explorado por dichas pruebas

Definición Se trata de estudios realizados generalmente sobre plasma pobre en plaquetas (PPP) en el que se induce la fibrinoformación bajo ciertas condiciones físicas y químicasLa formación de fibrina se puede valorar por:1. Métodos mecánicos: capacidad de la fibrina de atrapar partículas2. Métodos ópticos: medición del cambio de la turbidez del plasma

producido al consumirse el fibrinógeno

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Generalidades de la fase preanalíticaObtención de sangre:Punción venosa limpiaAspirarse la sangre en contenedores que no activen el sistema de

contacto: polipropileno, cristal siliconadoSe ha de mezclar con citrato trisódico (0,109mol/L (3,2%)-

0,129mol/L (3,8%)) en proporción de volúmenes 9:1, se bloque asíla actividad coagulativa del calcio

Se transporta entre 5-20 ºC, si se enfría a 4 ºC se induce la activación del factor VII

Se centrifuga (lo antes posible) para obtener PPP a 2000xg durante 10-15 minutos

Se procesa en un plazo breve (<2horas): más tiempo deteriora algunos factores

Si no se puede procesar se ha de congelar : 2 semanas a –20 ºC o 6 meses a -70 ºC


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Generalidades de la fase analítica

Técnicas coagulativas:

Extraordinariamente sensibles a factores como temperatura o pH

Los métodos automatizados y los reactivos comercialesoptimizan la realización de éstas técnicas

Concentración de citrato usada (proporción de volúmenes 9:1) resulta crítico

Fundamental seguir las indicaciones dadas por el laboratorio sobre preparación y conservación de reactivos

El efecto resultante a medir será la formación de fibrina


Tema 11.2Tema 11.2

PrincipioEl plasma (PPP) en presencia tromboplastina(factor tisular y fosfolípidos) y CaCl2 coagula en un tiempo dependiente de la actividad de los factores de la vía extrínsecaProcedimiento

Incubar durante 2 minutos a 37ºC 100 μL de plasma problemaAñadir 200 μL de tromboplastina cálcica a 37ºC y medir el tiempo de coagulación.Obtener el tiempo del plasma control (comercial o mezcla de, al menos, 10 donantes sanos).

Tiempo de protombina. Exploración de la vía extrínseca


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Vía intrínsecaVía extrínsecaPK.XII

HMWK FT, Ca++

Fosfolípidos

X

VII

Xa

V

VIII

IXa

XIa

IX

XI VIIa

II IIa

Fibrinógeno Fibrina

Vía común


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Tema 11.2Tema 11.2

Interpretación Depende de la actividad de los factores VII, X, II (protrombina) y VNo es influido por los factores VIII y IX (antihemofílicos A y B)Es muy poco sensible a la heparinadebido a la presencia de un inhibidor de la misma en los productos comerciales



Tema 11.2Tema 11.2

Expresión de los resultados

Valoración de la coagulaciónTiempo controlTiempo pacienteRazón simple: T. Paciente / T. Control

Control del tratamiento con cumarínicosRazón normalizada internacional (INR): Es la única forma correcta de expresión de resultados para este control.INR = (Razón simple P/C) ISI

ISI: índice de sensibilidad internacional del lote de tromboplastina.

NOTA: El tiempo de Quick expresado como actividad porcentual (%) y calculado por extrapolación del valor obtenido (en segundos) frente a una curva de calibración NO ES ACTUALMENTE ACEPTADO



Tema 11.2Tema 11.2

Reactivo Razón simple I S I I N R . A 2,0 1,0 2,0 1 = 2,0B 1,8 1,18 1,8 1,18 = 2,0C 1,4 2,1 1,4 2,1 = 2,0

Las tres determinaciones están realizadas sobre una misma muestra de plasma de paciente tratado con cumarínicos: varía la razón simple en función de la sensibilidad de la tromboplastina, pero no la INR.

Relación entre la razón simple y la INR en función del ISI



Tema 11.2Tema 11.2

PrincipioEl plasma, tras ser incubado con fosfolípidosy un activador de contacto, coagula al añadirle CaCl2 en un tiempo dependiente de la actividad de los factores de la vía intrínsecaProcedimiento

Incubar durante 2 minutos a 37ºC 100 μL de plasma problemaAñadir 100 μL de tromboplastina parcial con el activador e incubar unos 3 minutosAñadir 100 μL de CaCl2 (25 mmol/L) a 37ºC y medir el tiempo de coagulación

Tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA). Exploración de la vía intrínseca

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Tema 11.2Tema 11.2

Expresión de los resultadosObtener el tiempo del plasma control (comercial o mezcla de, al menos, 10 donantes sanos). Valoración de la coagulación

Tiempo controlTiempo pacienteRazón simple: T. Paciente / T. Control

Control del tratamiento con heparina no fraccionada Tiempo controlTiempo pacienteRazón simple: T. Paciente / T. Control



Tema 11.2Tema 11.2

Vía intrínseca

Vía extrínsecaPK.XIIHMWK

FT

X

VII

Xa

V

VIII

IXa

XIa

IX

XI VIIa

II IIa


Vía común

Tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA). Exploración de la

vía intrínseca


Tema 11.2Tema 11.2Tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA). Exploración de la vía intrínseca


Tema 11.2Tema 11.2

Interpretación Depende de la actividad de los factores XI, IX, VIII, X, V, II (protrombina) y de los componentes del sistema de contacto no relacionados con la coagulación “in vivo”(F.XII, precalicreina y quininógeno de alto peso molecular)No es influido por el F.VIIEs muy sensible a la presencia de heparina


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Tema 11.2Tema 11.2

FUNCIONALMétodo coagulativo de Clauss: El logaritmo del tiempo de coagulación del plasma diluido es inversamente proporcional al logaritmo de la concentración de fibrinógeno, cuando se añade trombina a una elevada concentraciónTURBIDIMETRICAFibrinógeno derivado: Está disponible en la mayoría de coagulómetros automáticos y se calcula a partir del incremento de DO al formarse el coágulo

Valoración del fibrinógeno: explora vía común


Tema 11.2Tema 11.2

Vía intrínseca

Vía extrínsecaPK.XIIHMWK

FT

X

VII

Xa

V

VIII

IXa

XIa

IX

XI VIIa

II IIa


Vía común

Valoración del fibrinógeno: explora vía común


Tema 11.2Tema 11.2

Determinación turbidimétrica del FibrinógenoREGISTRO DE LA COAGULACIÓN


Tema 11.2Tema 11.2

Pruebas de coagulacion basicasValores de referencia

2 – 4

0,8 – 1,2

0,8 – 1,2(120 – 80)

Margen

g / LFibrinógeno

Razón P / CT.T.P.A.

Razón P / C(%)

T. Protrombina

ExpresiónPrueba

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Consiste en la adición al plasma de trombina a baja concentración

Es sensible a la concentración y a la calidad del fibrinógeno

Es sensible a la elevación de los productos de la proteólisis del fibrinógeno (PDF) y de la fibrina (Dímero-D)

Muy sensible a la presencia de heparina: lo prolonga marcadamente

Tiempo de trombina (TT)


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Consiste en la adición al plasma de una proteasa procedente del veneno de víboras del género Bothrops, que libera el fibrinopéptido A de la molécula de fibrinógeno

Es sensible a la concentración y a la calidad del fibrinógeno

Es sensible a la elevación de los productos de la proteólisis del fibrinógeno (PDF) y de la fibrina (Dímero-D)

No es sensible a la presencia de heparina

Tiempo de reptilase (TR)

NOTA: el marcado alargamiento del TT corregido en el TR es diagnóstico de presencia de heparina


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Determinación de la actividad de los factores de la coagulación

Factores exclusivos de la vía intrínseca

Mediante una modificación del TTPAque incluye el uso de plasma carente en el factor a valorar

Factores de vía extrínseca y comúnMediante una modificación del TP que incluye el uso de plasma carente en el factor a valorar


Tema 11.2Tema 11.2

Factores de la coagulaciónValores de referencia

70 - 130

50 – 150

80 – 120

Margen

U / dLV, XII, XI

U / dLVIII

U / dLII, VII, IX, X

ExpresiónFactor

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Tema 11.2Tema 11.2

Valoracion de los inhibidores de la coagulación (antitrombina, proteína C, proteína S)

FUNCIONALColorimétrica mediante sustratos cromogénicos*. Método de preferencia para antitrombina y proteína C.

INMUNOLÓGICASobre soporte sólido (ELISA) o en medio líquido(coagulómetros especiales)Método de preferencia para proteína S libre y total.

*péptidos sintéticos, específicos para cada enzima, que por acción de éste liberan p-nitroanilina (colorante).


Tema 11.2Tema 11.2

ESTUDIO DE LA FIBRINOLISIS

Valoracion de activadores e inhibidores de la fibrinolisis(plasminógeno, t-PA, antiplasmina, PAI-1)

Valoracion de los productos de degradacion de la fibrina estabilizada.. Dímero-D


Tema 11.2Tema 11.2

Valoracion de activadores e inhibidores de la fibrinolisis (plasminógeno, t-PA, antiplasmina, PAI-1)

FUNCIONALMediante sustratos cromogénicos

INMUNOLÓGICAELISA


Tema 11.2Tema 11.2

Valoracion de los productos de degradacionde la fibrina estabilizada.. Dímero-D

La valoración inmunológica cuantitativase realiza mediante anticuerpos monoclonales, sobre soporte sólido (ELISA)o en medio líquido (coagulómetros especiales)

Existen métodos rápidos,semicuantitativos, que se realizan sobre placas de lectura inmediata, observando la aglutinación de partículas de látex.

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