Tema 18. Condiciones de la actividad enzimática: Dependencia de la Temperatura y el pH.

1. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción.

1.1.Teoría de Arrhenius y la Teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring: Equivalencia.

1.2. Dependencia de la temperatura en reacciones enzimáticas

2. Efecto del pH sobre la actividad enzimática

3. Deducción de los pKa de los aminoácidos del centro activo

4. Efecto del pH sobre la ionización del substrato

1. Efecto de la Temperatura sobre la Velocidad de Reacción

Según la mecanica estadística la “Energía cinética media” (Ec) de un conjunto de moléculas es función de la temperatura actual, T.

* Si la reacción tiene lugar a una temperatura T1 ==> hay un grupo de moléculas con “energía suficiente” para reaccionar después de una colisión eficaz.

* A una temperatura más elevada, T2, (T2 >T1), el número de moléculas con “energía suficiente” es mayor.

La velocidad de las reacciones químicas es fuertemente dependiente de la temperatura

La mínima energía que deben tener las moléculas para poder colisionar de manera efectiva, se denomina “Energía de activación” (Ea).

Ec f(v) = ½ mv2 ≥ Ea

Como se observa en la figura, a medida que aumenta la temperatura, aumenta el número de moléculas con energía suficiente (Ec > Ea), es decir, con velocidad

suficiente, para colisionar eficientemente

v -> Ea

-Según la Mecánica clásica:

-Por otro lado: Ec f(T)

* A partir de una serie de datos experimentales, Arrhenius observó que el ln de la cte de velocidad, lnk, era función

lineal del inverso de la temperatura absoluta, 1/T, y propuso la siguiente relación matemática:

O en forma exponencial:

k = A e- (Ea/RT)

Si representamos: lnk frente a 1/T,

y = b - mx

TR

EaAk

1lnln

* En la ec. de Arrhenius :

A es una constante que tiene las mismas unidades que la constante de

velocidad y representa la frecuencia de las colisiones eficaces entre las moléculas de los reactantes.

R es la constante universal de los gases (8,315 J K-1 mol-1)

T es la temperatura absoluta

Ea es la llamada energía de activación de Arrhenius

Energía debe suministrarse a las moléculas reaccionantes para obtener un choque eficaz.

NOTA: Es conveniente tener en cuenta no es una deducción basada en una teoría preestablecida, sino que fue expresada a partir de observaciones experimentales, sin un

modelo teórico previo.

k = A e- (Ea/RT)

En el supuesto de que A y Ea sean independientes de la temperatura, podemos calcular la razón de las dos constantes k1/k2 a dos temperaturas diferentes, T1 y T2, que difieren en 10ºC.

Aplicando logaritmos:

A la razón de las dos constantes k1/k2 a dos temperaturas diferentes, suele denominársele Q10.

Ea valor experimental 50-100 kJ/mol

Q10 2 a 4 al variar 10 C

Duplica o cuadriplica la velocidad de reacción cada 10 grados

11RT

Ea

eAk

22RT

Ea

eAk

21

21

12

2

1 TRT

TTEa

RT

Ea

RT

Ea

eek

k

21

21

2

1ln

TRT

TTEa

k

k

1.1.Teoría de Arrhenius y la Teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring: Equivalencia.

- Continuemos considerando una reacción del tipo: S PAproximación experimental de

Arrhenius

- Tomando ln de ambas ecuaciones tendremos:

R

S

RT

HB eeh

Tkk

##

TR

Ea

eAk1

Teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring (TEMA 5)

TR

EaAk

1lnln

R

S

RT

HhTkk B

##

lnlnlnln

Derivando respecto de la temperatura, (Ea, H# y S# independientes de la temperatura)

De donde,

- Esta ecuación es muy útil, desde el punto de vista práctico, pues nos permite obtener el valor de la entalpía de activación, H#

Nota: el valor de Ea lo podemos calcular experimentalmente, a partir de la pendiente de la representación de lnk 1/T

2

1ln

TR

Ea

dT

kd

2

#1ln

RT

H

TdT

kd

Aproximación experimental de Arrhenius

Teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring (TEMA 5)

2

#

2

11

RT

H

TTR

Ea

#HRTEa

- Sustituyendo el valor H# en la ecuación de Eyring:

- Comparando esta ecuación con la de Arrhenius, se obtiene el siguiente valor para la constante A∞:

La ecuación anterior nos permite calcular el valor de S#.

R

S

RT

HB eeh

Tkk

##

R

S

RT

EaB eeeh

Tkk

#

TR

Ea

eAk1

R

SB eeh

TkA

#

Valor experimental

1ln#

Tk

ARS

B

Los valores de entalpía de activación, H#, y de entropía de activación, S#, son de una gran utilidad.

Información sobre la naturaleza del estado de transición y del mecanismo de reacción.

- El valor de H#, generalmente es positivo, lo que significa que para formar el estado de transición deben tensionarse o distorsionarse algunos enlaces, consumiendo calor

(energía).

- Generalmente, un valor de entropía de activación, S#, alto y negativo sugiere que en el estado de transición las moléculas que han reaccionado adoptan conformaciones

mucho más ordenadas que las que tenían en el estado elemental.

Cálculo de la energía libre de Gibbs G# a una T determinada

1.2. Dependencia de la temperatura reacciones enzimáticas

Vmax función lineal de la [E] y de la kcat función lineal de la temperatura ??

Kcat es función de la temperatura (Ecuación de Eyring)

Naturaleza proteica de las enzimas Procesos de desnaturalización

Incremento de temperatura reacción enzimática

1. Aumento de la velocidad (reacción química) Ley de Arrhenius

2. Desnaturalización proteica

[N] [D]

[N] [D]

R

oDS

RT

oDH

oD

eeeK

KRTG

N

DK

RT

G

D

DoD

D

ln

DK

EoN

1

Entalpia y Entropia estandar de desnaturalización de la enzima

Ensayamos el efecto de la temperatura en condiciones de velocidad máxima

Vmax= kcat [N]

[Eo] = [N] + [D]

Equilibrio de desnaturalización:Constante de equilibrio

ND

KD

Kcat y KD Función de la temperatura

R

oDS

RT

oDH

R

oDS

RT

oDH

ee

Aekcat

ee

EoAeV

RT

Ea

RT

Ea

1

1

1

max

Vmax= kcat [N]

KD es grande

Temperatura>>>>

Vmax y la Kcat

Temperaturas >Temperatura de transición

50% N y 50% D

KD es muy pequeña

Varian según Arrehnius

Tiende a 0

R

oDS

RT

oDH

ee

Eo

K

EoN

D1

1

TR

Ea

eAk1

Temperaturas <<

Enzima de un cangrejo de alaska

Quimiotripsina porcina

Enzima Bacteria de Yellowstone

Vmax

Temperatura

Desnaturalización

Comportamiento según Arrhenius

Energía de activación y parametros termodinámicos de la reacción enzimática:

Se obtienen en el rango de temperaturas donde no hay fenómenos de desnaturalización

Temperatura

Ln Vmax

1/T1/Tc

R

Em a22

R

Em a11

Graficas de Arrhenius discontinuas: Cambios conformacionales asociados a la temperatura

Enzimas asociadas a membranas. Tc temperatura cambio de conformación de los fosfolipidos asociados a la proteína en la membrana

2. Efecto del pH sobre la actividad enzimática

Vmax

pH

1 3 5 7 9 1 3 5 7 9 1 3 5 7 9

pH pH

Enzimas: Ácidas Neutras Alcalinas

pKa

-COOH 3,0-3,2

- -COOH 3,0-5,0

-imidazolio 5,5-7,0

-NH3 7,5-8,0

SH 8,0-8,5

Fenol 9,8-10,5

Guanidinio 11,6-12,6

pKa de aminoácidos que pueden estar implicados en el centro activo

Interior de la proteína

pKa cambios de hasta 2 unidades

Modelo comportamiento de una enzima con dos residuos ionizables que interviene en el centro activo.

EEHHEH 121

SESEHSHEH 121

PEH 1

+ S + S + S

K1 K2

Ks1 Ks2kcat

Substrato no ionizable en el rango de pH

K1 y k2 constantes de disociación de los grupos protonizables

Ks1 y Ks2 constantes de disociación de las diferentes especies químicas forman complejos la E y S

Km constante de Micaelis de formación del único complejo que da el producto EH1-

H

Ks

Ks

HSEH

H

K

K

HEHEo

SEH

EHSKm

KsH

KsSEHSE

Ks

HSEHSHEH

H

KEHE

K

HEHHEH

SESEHSHEHEEHHEHEo

21

11

1

21

12

11

1

1

1

121

21

1121

121121

Los diferentes complejos se expresan en función de [H+] y las contantes de disociación

Valores de los distintos complejos

Sustituyendo y sacando factores comunes

SEH

HSEKs

SHEH

HSEHKs

EH

HEK

HEH

HEHK

1

21

1

12

21

11

2

1

Valor de la constante de Michaelis

HKs

KsH

HK

KH

SKm

kcatEovo

HKs

KsH

HK

KH

SKm

EoSEH

S

KmSEHEH

SEH

EHSKm

21

11

1

21

11

1

2

1

2

1

1

11

1

1

De esta expresión tenemos que obtener el valor de

SEHkcatvo 1

SEH 1

H

Ks

Ks

HSEH

H

K

K

HEHEo

21

11 1

2

11

A partir de la ecuación de balance de masas de la enzimas y el valor de Km

Multiplicando y diviendo por la expresión

S

HKs

KsH

HK

KH

Km

S

HKs

KsH

Vvo

H

Ks

Ks

H

21

1

12

11

max

21

1

2

1

Expresión general que representa el comportamiento de la velocidad de una enzima con dos restos aminoácidos protonizables y su forma activa es

pH puede modificar tanto la Vmax como la Km

SEH 1

Eo

EH

f

HK

KHf

HK

KH

VVmpH

SKm

S

HK

KH

Vvo

KsK

KsK

1

2

1

1

21

1

11

21

1

max

21

1

max

2

1 Presencia de Substrato no modifica los pKa de los grupos ionizables de la enzima

No se modifica la Km sólo la Vmax

f - Función de Michaelis

A [S] saturantes

Fracción de la enzima en la forma EH1-

Da los productos de la reacción

Valor entre 0 y 1

f

1

pH

1

0,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

pK1 pK2

[H+]<<<K1 y [H+]>>>K2

Vmax no se modifica [H+] muy altas ó muy bajas

Vmax tiende a 0

f

1

pH

1

0,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

pK1

f

1

pH

1

0,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

pK2

Otras Formas activas

EH1H2E=

22111

H

KK

H

Kf

221

2

1K

H

KK

Hf

3. Deducción de los pKa de los aminoácidos del centro activo

A pH bajo

f

11

0,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

pK1 pK2

2

1

11

15,0

1

21

1

11

pKpH

pKpH

KHf

HK

KHf

A pH alto

Para el modelo enzima diprótica y en su forma EH1-

Sólo pueden hacerse cuando la diferencia entre los dos pK sea al menos 3,5 unidades

de pH de diferencia

pH

Linearización de la ecuación de la velocidad máxima en función de la variación de pH

2max

log

1max

log

1

max

21

1

max

pKpHV

VmpH

pKpHV

VmpH

H

K

V

VmpH

HK

KH

VVmpH

Se desprecia 1 como sumando y K2/[H+]

A pH bajos

A pH altos

Se desprecia 1 como sumando y [H+]/K1

maxlogV

VmpH0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

pK1 pK2

pH

}{ -log2

Confirmados por otras técnicas:

Modificación química específica de aa, mutagenesis dirigida, etc

HEEH

EHS PEH + S

K1

kcat

Km

max

1

maxmax

1

max

111

11

max

VSV

Km

V

K

SV

KmK

Hv

SKm

S

KH

Vv

pH

pH

Cálculo del pKa para una Enzima monoprotica

1/[H+]

1/vpH-1/K1

4. Efecto del pH sobre la ionización del substrato

HSSH

EHS PE + S Km

KH

kcat

Sólo se ioniza el substrato

So= S- + SH

H

H

H

H

H

pKpHKm

KmpH

HKSo

Km

HKSo

Vv

H

KSHSo

H

KSHS

log

1

1max

1

Sólo varia la Km

Obtener el pKH

H

KKmKmpH H1

SoHK

Km

SoV

H

1

max

Generalmente fenómenos poco frecuentes

¿Y si se ionizan tanto la enzima como el subtrato? Tarea

RESUMEN

El calor aumenta la velocidad de las reacciones. Arrhenius descubrió experimentalmente la ley de dependencia de la constante de velocidad de una reacción con la temperatura. Para la mayoria de las reacciones químicas la constante de velocidad aumenta de 3,0 a 4,0 veces al aumentar 10° C la temperatura.Mediante la ecuación experimental de Arrhenius puede determinarse la Ea o energía de activación de Arrhenius, energía que ha de comunicarse a las moléculas para que tengan un choque eficaz.

Las reacciones catalizadas por enzimas siguen la ley de Arrhenius. La naturaleza proteica limita el calentamiento progresivo para aumentar la velocidad, pues se puede llegar a la desnaturalización de la proteínaExperimentalmente, se obtiene Ea y a partir de ella se puede obtener el valor de los parámetros termodinácos de la reacción enzimática como la entalpia, entropía y energía libre de activación.

TEMPERATURA

pHLas enzimas ensayadas in vitro a diferentes pH se comportan como: enzimas ácidas, neutras y básicas.Las curvas de actividad enzimática frente a variaciones de pH puede darnos información sobre los pKa de los residuos de aminoácidos implicados en la catálisis.La función de Michaelis de las enzimas con residuos ionizables se ajustan muy bien a los comportamientos experimentalesCuando el substrato no influye en la ionización de la enzima, solamente la Vmax se verá afectada.En el caso de que sea solamente el substrato el que se ionice en el rango de pH estudiado, solamente se verá modificada la constante de Michaelis.