TEMA 19- ESTRATEGIAS DE CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA II.

1. Introducción regulación por Cambios Conformacionales.

2. Interacción proteína-ligando. 2.1. Función de Scatchard. 2.1.1. Linearización de la ecuación de Scatchard. 2.2. Ecuación de Hill. 2.2.1. Linearización de la ecuación de Hill. 2.2.2. Razón de saturación Rs.

3.Modelo Proteínas alostéricas. 3.1.Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeux (MWC) 3.1.1. Enzimas alostéricas tipo K 3.1.2. Enzimas alostéricas tipo V 3.1.3. Modelo alostérico mixto 3.2. Modelo secuencial (KNF).

i) Observaciones experimentales que condujeron al desarrollo de la idea sobre los cambios conformacionales y su papel en

la regulación de la actividad enzimática.

ii) Modelos teóricos empleados para la descripción de este sistema de control.

iii) Significado biológico/bioquímico de este tipo de control.

- Observaciones experimentales

- Modelo de Monod-Wyman-Changeux

- Modelo de Koshland-Nemethy-Filmer

Regulación por Cambios Conformacionales

I) Observaciones experimentales

* Muchas de las ideas sobre el control conformacional de la actividad enzimática se desarrollaron como consecuencia del trabajo sobre las vías biosintéticas de los aminoácidos en microorganismos, especialmente en E.

coli.

* A mediados de la década de los años 50 se descubrió que la Treonina-dehidratasa, primera enzima de la vía biosintética de la Ile, en E. coli, se inhibía fuertemente por Ile, producto final de la vía, que tiene muy pocas

analogías estructurales con el sustrato de la enzima, la Thr.

Threonine dehydratase

L-Thr ---------> 2-Oxo-butyric acid ---> ---> --->... ---> ---> L-Ile-

- Sólo la primera enzima de la vía, la “treonina-dehidratasa”, muestra este tipo de inhibición.

* Un ejemplo, semejante, se encontró en el caso de la enzima Carbamoiltransferasa o Aspartato Transcarbamilasa

(ATCasa), enzima que cataliza la primera reacción de la vía biosintética de las bases pirimidínicas, en E. coli, la cual se inhibe

también por el producto final de la vía, especialmente por CTP.

CCC

+

Active relaxed form

Inactive tense form

ATCase

RR

RR

RR

CCC

COO-

CH2

HN-C-COO-

H H-

---

OH2N-C-O-PO3

2-

= OH2N-C-

=

COO-

CH2

N-C-COO-

H H

---

-

Catalytic subunits

Catalytic subunits

Regulatory subunits

ATP

CTP

Nucleic acidmetabolism

Feedback inhibition

AspartateCarbamoylphosphate

Carbamoyl aspartate

CTP

CTP

CTP

CTP

CTP

CTP

Quaternary structure

* En este caso, también se observó que el ATP podía actuar activando a la enzima, la ATCasa; proporcionando así un

mecanismo para conseguir el balance entre la producción de nucleótidos purínicos y pirimidínicos, necesarios para la

biosíntesis de ácidos nucleicos.

* A principios de los años 60, ya se habían descrito varios sistemas que presentaban este tipo de regulación, en los que

únicamente la primera enzima de la vía era inhibida por “retroalimentación” o “feed-back”.

* El primer intento serio de unificar todas estas observaciones fue realizado por Monod, Changeux y Jacob, y constituye uno de

los trabajos “clásico” de la Enzimología.

- Monod, Changeux and Jacob (1963). J. Mol. Biol. 6, 306

- En este trabajo se resaltan los siguientes puntos o características comunes a este tipo de sistemas:

a) El ligando implicado en la regulación de la actividad enzimática (molécula reguladora o efector), generalmente, es

estructuralmente diferente del sustrato o el producto de la reacción que cataliza la enzima retroinhibida.

b) La mayor parte de las enzimas cuya actividad se controla/regula por este tipo de regulación, no muestran cinéticas

hiperbólicas clásicas cuando se representa v [S], sino que muestran una cinética de tipo sigmoidal.

c) Es relativamente fácil distinguir entre la unión del efector a la enzima y la unión del sustrato. Varios tratamientos químicos y físicos nos

permiten “desensitizar” la enzima, es decir, hacerle perder su respuesta ante las moléculas reguladoras o efectores sin que ello lleve parejo la perdida de la actividad catalítica. Así en el caso de la ACTasa un tratamiento térmico, suave, da lugar a una enzima activa no inhibible por CTP. La enzima “desensitizada” muestra una cinética hiperbólica semejante a la que presentan las enzimas

michaelianas.

d) Generalmente las enzimas que se regulan por este mecanismo son “oligómeros”, es decir, proteínas formadas por varias subunidades iguales o distintas, unidas entre si por fuerzas

débiles.

* Monod, Changeux y Jacob propusieron que la molécula reguladora o efector se une a un sitio de la enzima diferente del

centro activo, de manera que la interacción entre la molécula reguladora y el sustrato tiene lugar de manera indirecta o

“alostérica”, (del griego otra estructura).

* La unión de la molécula reguladora al “sitio de regulación” induce un cambio conformacional reversible en la enzima que

causa una alteración de la estructura del centro activo y los consiguientes cambios en sus propiedades cinéticas.

-+

Sitio regulador

Centro activo

2. INTERACCIÓN PROTEÍNA-LIGANDO

Una proteína une más de una molécula de un mismo ligando

P PP PPL

L L

L

LL

L

L

LL

LK1 K2 K3 K4

K1 < K2< K3< K4 Cooperatividad positivaK1> K2> K3> K4 Cooperatividad negativa

K1 = K2 = K3 = K4 No cooperatividad

Tratamiento de Scatchard permite calcular el número de sitios de unión por molécula de proteína, la constante de unión proteína-ligando y el tipo de cooperatividad

La función de Scatchard, , se define como la razón entre la concentración de ligando-unido y la concentración total de

proteína

[Ligandounido} = ------------------------ [Proteína]

- Esta función es diferente de la función de saturación, que representa el número de sitios ocupados partido por el número

total de sitios de unión que tiene la macromolécula.

Nº Sitiosocupados Y = ------------------------ Nº totalsitios

2.1. FUNCION DE SCATCHARD

Nº sitios = (concentración de proteína) x (numero de sitios por mol de proteína)

No total sitios = [P] n

= Y nEn esta ec.

--> función de Scatchard

Y --> función de saturación

n --> nº sitios por mol de proteína

Para deducir la ecuación de Scatchard consideraremos una proteína P, con dos sitios de unión para el mismo ligando, L, que se unen independientemente

y con la misma afinidad a ambos sitios.

Se deduce la relación función de Scatchard

y Saturación

LL P

L

L

L

L

P

P P

P

K1 K3

K4K2

En el sistema no existe cooperatividad, K1 = K2 = K3 = K4=K

[Ligandounido} = ------------------------ [Proteína]

2

2

22

PLPLPP

PLPLP

PLPLv

o

La función de Scatchard para dos lugares equivalentes viene definida por:

K[L] = n ----------------- 1 + K[L]

Deducción Enzimología. Página 224 Nuñez de Castro 2001

K[L] = 2 ----------------- 1 + K[L] Para un número n de lugares equivalentes de unión

n número de ligandos que pueden unirse por molécula de proteína

K es la constante de equilibrio de unión del ligando a cada centro (es la misma para todos los lugares de unión n que tenga la proteína

[L] es la concentración de ligando libre

2.1.1. Linearización de la ecuación de SCATCHARD

[L]

= nK - K

K[L] = n ----------------- 1 + K[L]

LnKLvKv

LnKLKv

)1(

Dividendo por [L] y despejando

m = - K [L]

mM-1

1 2 3 4

n

No cooperatividad

Representación de Scatchard para una proteína que tiene 4 lugares de unión equivalentes

K es la constante de equilibrio de cada uno de los sitios de unión

PERMITE CALCULAR NÚMERO DE LIGANDOS QUE SE UNEN POR MOLÉCULA DE PROTEÍNA

[L]

mM-1

1 2 3 4 5 6

n

Linearización de la ecuación de SCATCHARD

Cooperatividad positiva

Cooperatividad negativa

Cuando las gráficas se desvían de la linealidad Proteínas presentan cooperatividad

Cálculo: EQUILIBRIO DE DIÁLISIS, CENTRIFUGACIÓN

2.2. TRATAMIENTO DE HILL

Enzimas presentaban cinéticas de saturación respecto al substrato se desviaba del comportamiento hiperbólico michaeliano

Cinética sigmoidal Curva de saturación de la hemoglobina

K [Po2]nh

Y = ------------------ 1 + K [Po2]nhY es saturación

Po2 presión parcial de oxigenoK constante de formación del complejo oxihemoglobina

[Po2]nh

Y = ------------------ K` + [Po2]nh

K` = [Po2]nh0.5

[Po2]0.5 Presión da una saturación de 0,5

nh índice de Hill valor experimental (hemoglobina 2,8)

Semejanza

Tratamiento de Hill

Snh

Y = ------------- Snh

0,5 + Snh

Aplicada a las enzimas con cinética sigmoidal

vY = ------------ Vmax

Saturación de la enzima [Po2]nh

Y = --------------- K` + [Po2]nh

S0,5 Concentración substrato la saturación es igual ½ Vmax

nh igual a 1 es una saturación hiperbólica michaeliana

S0,5 = Km

S

Y = ----------- = S0,5 + S

v------------ Vmax

S

= ----------- Km + S

nh>1 Cooperatividad positiva

nh<1 Cooperatividad negativa

nh>1

nh<1

nh=1

S

vo

Vmax Snh

vo = ----------------- Snh

0,5 + Snh

1/S1/S1/S

1/vo

nh=1 nh<1nh>1

2.2.1-Linearización de la ecuación de Hill

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

loglogmax

log

max1

loglog1

log

11

SnhSnhvoV

vo

voV

vo

Y

Y

SnhSnhY

Y

S

S

SSS

SSS

Y

Ynh

nh

nhnh

nh

nhnh

nh

maxV

vY

Reacción enzimática la fracción de saturación

Representando la ecuación lineal

log [S]

0

Log[S0,5]

m = nh

La ecuación de una recta pendiente es el índice de Hill

S0,5 Concentración substrato para la cual la saturación es igual a ½ de la velocidad máxima

voV

vo

maxlog

Obtención valor experimental del índice de HillDeducir la existencia de cooperatividadValor de S0,5

2.2.2. Razón de saturación Rs. Significado biológico de la cooperatividad positiva y negativa.

Rs, la razón de las concentraciones de substrato que dan como resultado el 10% y 90% de saturación

S 0,9

Rs = -----------

S 0,1

Snh 0,1

Y = 0,1= ------------------

Snh 0,5 + Snh 0,1

0,1 Snh 0,5 = 0,9 Snh 0,1

Snh 0,9

Y = 0,9= ------------------

Snh 0,5 + Snh 0,9

0,9 Snh 0,5 = 0,1 Snh 0,90,1 Snh 0,9

0,9 Snh 0,1

9 =

S 0,9

Rs = ---------- =

S 0,1

Enzima michaelianas es constante e independiente de Km y Vmax

nh 81

nh = 1,0 valor de Rs es igual a 81 No cooperatividad

nh = 2,0 el valor de Rs es igual a 9,0 Cooperatividad positiva

nh = 0,5 el valor de Rs es igual a 6531 Cooperatividad negativa

Enzimas con cooperatividad positiva, un cambio en la concentración de sustrato de 9 veces hace que la enzima pase de una saturación del 10% al 90% Interruptores metabólicos

Enzimas con cinética hiperbólica, índice de Hill 1 se necesita aumentar 81 veces

Enzimas con cooperatividad negativa, para que la enzima pase de una saturación del 10% al 90% se necesita aumentar 6561 veces. Amortiguadores de las variaciones de la [S].

Ej fosfatasa alcalina de E.coli suministra fosfato inorgánico.

3.MODELOS PROTEÍNAS ALOSTÉRICAS.

Efecto alostérico: Cambios conformacionales en una enzima dan lugar a aumento o inhibición de la actividad

Proteína alostéricas actividad esta regulada por la unión no covalente y reversible de moduladores: Se unen a sitios distintos al sustrato

Hill no era posible determinar con exactitud las constantes de disociación y las constantes alostéricas

Transición alostérica hace referencia a transducción de una señal a un lugar diferente ocupado por esa señal en la proteína.

Transición alostérica homotrópica cuando induce cambios en la unión del mismo tipo de ligando

Transición alostérica heterotrópica cuando induce cambios en la unión del otro tipo de ligando

3.1. Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeaux

2. Las subunidades (protomeros) ocupan posiciones equivalentes, de manera que dentro del oligómero, existe al menos un eje de

simetria. 3. Cada protomero posee un sitio de unión (solo uno) para cada

uno de los diferentes ligandos: Activadores o inhibidores

3. El oligómero puede existir en dos estados conformacionales, que designaremos por R (relajada, alta afinidad) y T (tensa,

baja afinidad) y que presentan afinidad diferente por un ligando dado.

1. Las proteínas alostéricas son proteínas oligoméricas

R TTensa, baja afinidadRelajada, alta afinidad

4. La conformación de la proteína cambia de de la forma R a la forma T (o viceversa) se conserva la simetría del oligómero.

* Si representamos la conformación de las subunidades en forma T y R por un circulo y un cuadrado respectivamente, existe el

siguiente equilibrio:

T RTensa, baja afinidad Relajada, alta afinidad

Los cambios R T son concertados, no hay formas híbridas, compuestas por subunidades (R-T)

R

TL

5. No existirán especies híbridas (TR) ya que en tal caso se perdería la simetría del oligómero.

*En otras palabras, todas las subunidades cambian de conformación de una manera “concertada”, lo que le ha dado

también nombre al modelo: Modelo concertado.

6. Las formas R y T pueden poseer diferente capacidad catalítica (siendo kcR y kcT las constantes catalíticas de las formas R y T,

respectivamente) o diferentes afinidades por los ligandos sustratos, activadores o inhibidores.

KR y KT constantes de disociación intrínsecas de cada uno de los protómeros de las formas R y T y el Substrato.

* En la siguiente figura, se representa el modelo concertado más sencillo de una proteína dimérica que tiene un activador A, y un inhibidor I:

RT

SS

II

LA A

L cte de equilibrio entre las dos formas R y T.

S

S S

KT

KT

[T] L = ------------

[R]Saturación por ligando

0.0

0.5

1.0

S

S S

KR

KR

SS

II

A A

Cálculo de YEnzimología. Nuñez de CastroPg 237

kcRkcT

P P

Y La función de saturación, la hemos definido anteriormente como la razón entre el número de sitios ocupados partido por el

número total de sitios. Y= v/Vmax

Parámetros describen el estado de un sistema alostérico

L c (1+ c )n-1 + (1 + )n-1

Y =

L (1+ c )n + (1 + )n-1

L cte de equilibrio entre las dos formas R y T en ausencia de ligando. [T] L = ------------

[R]

n número de sitios de unión

c constante ratio de las dos constantes de disociación KR

c = ------------

KT

Concentración de ligando libre [S]

= ------------

KR

3.1.1.Enzimas alostéricas modelo tipo K

R TTensaRelajada

Misma constante catalítica kcR = kcT

R mayor afinidad por el sustrato KR <<<KT

L c (1+ c )n-1 + (1 + )n-1

Y =

L (1+ c )n + (1 + )n

KR

c = ------------

KTC O

(1 + )n-1

Y =

L + (1 + )n

Y

1Ecuación sigmoidal

L= 0

L= 10

L = 100

L =1000

L = 0 No hay equilibrio de transconformación

(Todo esta como R)

la ecuación queda reducida a Ec. M-M

Y

La presencia del ligando afecta la afinidad del enzima por el sustrato

Modifica la Km Cambia la concentración de substrato para la cual la saturación es semimáxima

Inhibidor desplaza el equilibrio hacia la forma T (KR <<<KT) Km

Activador desplaza el equilibrio hacia la forma R Km

Y =

(1 + )

Velocidad máxima no se ve alterada

max1 V

v

SKm

S

KmS

KmS

Y

SKm

SVv

max

(1 + )n-1

Y =

L + (1 + )n

Enzimas alostéricas modelo tipo V3.1.2. Enzimas alostéricas modelo tipo V

Diferente constante catalítica kcR = kcT

Igual afinidad por el sustrato KR = KT

L c (1+ c )n-1 + (1 + )n-1

Y =

L (1+ c )n + (1 + )n

KR

c = ------------

KTC 1

Y =

1 +

R TTensaRelajada

Saturación hiperbólica

Acción de los moduladores (activadores e inhibidores) sobre la Vmax maxV

vY

Vmax = kcR R + kcT T

Fosforilasa b activada por AMP

Aspartato quinasa (EC 2.7.2.4) de E.coli inhibe por lisina

vo

S

A

I

Km

Vmax

Vmax I

VmaxA

Suma de la contribución a la velocidad de la forma transconformada R y de la forma transconformada T

Resumen modelo MWC

- Sencillo

-Modelo da cuenta del comportamiento de proteínas que muestran cinética sigmoide y que son oligomericas.

- Se adecua a la acción de activadores e inhibidores alostéricos

Limitación

No explica el compartamiento cinético de aquellas proteínas que tienen cooperatividad negativa.

3.1.3.Enzimas alostéricas modelo tipo K mixto

Tanto la constante catalítica como la afinidad (Km) cambian

NOTA: Cinética sigmoide no es sinónimo de alosterismo. Hay proteínas con cinética sigmoide no alestericas y enzimas alostericas con cinética hiperbólica (enzimas alostéricas tipo V puro)

3.2.Modelo secuencial de Koshland, Nemethy y Filmer

Ligando unido a uno de los protomeros induce un cambio conformacional

Entrada de un segundo ligando

Cooperatividad positiva

Cooperatividad negativa

+

-

1. Permite la presencia de formas híbridas, (prohibido en el modelo concertado)

2. Explica tanto la cooperatividad positiva como negativa

3. Modelo concertado , sería un caso particular del modelo secuencial, en el que se explica únicamente la cooperatividad positiva.

Ajuste inducido de Kosland

TRATAMIENTO DE SCATCHARD

El tratamiento de Scatchard permite el estudio de la unión de una proteína con varios ligandos.

La representación linealizada de la ecuación permite obtener el número de ligando que se unen por mol de proteína, así como la afinidad de los lugares de unión.

El signo de la cooperatividad se puede obtener de la representación linealizada

ECUACIÓN DE HILL

Derivada del estudio de la saturación de la hemoglobina es útil para explicar la saturación no hiperbólica que se da en enzimas que se desvían del comportamiento Michaeliano, monstrando curvas sigmoidales, con cooperatividad positiva, o hipérbolas no equiláteras (curvas de cooperatividad negativa).

El índice de Hill (nh) es un parámetro experimental y no tiene que ser un número entero.

RESUMEN

RAZON DE SATURACIÓN La razón de saturación (Rs) entre concentraciones de substrato para dar una saturación del 90% a una concentración de substrato para la obtención de una saturación del 10% es 81, en el caso de las proteínas con cinéticas michaelianas; es mucho menor para proteínas con cooperatividad positiva, y muchísimo mayor para proteínas con cooperatividad negativa.Enzimas con cooperatividad positiva puede comportarse como un interruptor metabólico; por otra parte, una proteína con cooperatividad negativa puede servir para mantener el mismo flujo a pesar de las posibles variaciones en la concentración de substratos.

MODELO ALOSTÉRICO CONCERTADO

Modelo propuesto por Monod, Wyman y Changuex. Explica de forma clara y elegante la mayor tipo de procesos alostéricos de regulación.Esquema mecánico simple, proteínas oligoméricas, con ejes de simetria

Clasifica en tres tipos de enzimas alostéricas.Tipo K, son proteínas oligoméricas que presentan cooperatividad positiva, asi como la acción de inhibidores y activadores.Tipo V explica igualmente la acción de activadores e inhibidores sobre la velocidad máxima sin cambiar la constante de afinidad por el substrato.Tipo mixto, una mezcla de ambos modelos.

MODELO ALOSTÉRICO CONCERTADO

Modelo más potente , tiene mayor complejidad , no es muy utilizado en Enzimología .

Práctica el instrumento más utilizado es el índice de Hill