Procedimiento de estudio de proteínas

Cromatografía

• Cromatografía en capa fina

• Cromatografía en columna

• Cromatografía de intercambio iónico

• Cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel

• Cromatografía de afinidad

Electroforesis

Tema 6

Cuantificación de proteínas

• Selección de fuente

• Fraccionamiento de células

• Centrifugación

• Electroforesis en acetato de celulosa

• Electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE)

1º) Aislamiento de las proteínas

Procedimiento estudio de proteínas

3º) Determinación de la

estructura primaria

Selección de la fuente

Disgregación del tejido

Ruptura celular

Cromatografía

Electroforesis2º) Purificación

3º) Determinación de sus

niveles de expresión

3º) Determinación de su

actividad

Tejido

Disgregación del tejido: (Colagenasa, quelantes del Ca++....... )

Separación de las células

Cultivos celularesCultivos primarios

Líneas celulares

Selección de la fuente

Químicos Mecánicos

Lisis osmótica Homogenización

Detergentes Sonicación

Disolventes orgánicos Congelación

(acetona, etanol, TCA)

Fraccionamiento de las células

• Homogenado se somete a altas velocidades de giro

• Separación por tamaño y densidad

• Las moléculas mayores se depositan antes

Estabilización de las proteínas:

• pH

• Degradación proteolitica

• Temperatura

Separación componentes celulares por CENTRIFUGACIÓN

Fraccionamiento celular por CENTRIFUGACIÓN

Homogenado

c. enteras, núcleos

y citoesqueleto

mitocondrias,

lisosomas

y peroxisomas

microsomas y

pequeñas vesículas

ribosomas, virus y

grandes macromoléculas

1000g x 10 min

20.000g x 20 min

150.000g x 3h

80.000g x 1h

Separación en función del tamaño

Aumento de la velocidad de

centrifugación

Se basa en la diferente:

Solubilidad

Tamaño

Carga eléctrica

Densidad

Afinidad por otras moléculas

Separación y purificación de proteínas

CROMATOGRAFÍA

ELECTROFORESIS

Cromatografía sobre papel

(Cromatografía de reparto)

CromatografíaPapel (capa fina): Aminoácidos y Azúcares

Columna: Aminoácidos y Proteínas

Cromatografía

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Las diferentes proteínas se retrasan según sus interacciones con la matriz, de

acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamaño o unión a grupos químicos

http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html

Cromatografía

Muestra

aplicada

El solvente se aplica

contínuamente a la

boca de la columna

Matriz

sólida

Tapón

poroso

Tubo de

ensayo

tiempo

Moléculas fraccionadas

eluídas y recogidas

TRES CLASES DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

A) Intercambio iónico:en base a la carga

B) Filtración en gel:

en base al tamaño

C) de Afinidad:en base a interacción

Flujo de solvente

Partícula

cargada

positivamente

Molécula

cargada

negativamente

unida

Molécula

cargada

positivamente

libre

Flujo de solvente Flujo de solvente

Partícula con

sustrato unido

covalentemente

Molécula de

enzima unida

Otras proteínas

pasan de largo

http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html

Cromatografía

Partículas

porosas

Molécula

pequeña

retrasada

Molécula grande

no retrasada

Cromatografía de intercambio iónico

Las proteínas se separan según

su carga a un pH determinado

(Ej: intercambio catiónico)

Proteínas cargadas

positivamente se unen

a la matriz cargada

negativamente

Proteínas cargadas

negativamente pasan

sin unirse

Cromatografía de filtración en gel o exclusión molecular

Las proteínas se separan según su tamaño

Matriz de polímeros

de carbohidratos

Moléculas pequeñas

entran entre los

espacios acuosos

dentro de la matriz

Moléculas grandes no

entran dentro de los

espacios de la matriz

Cromatografía de afinidad

Las proteínas se separan en función de la especificidad de unión a un ligando

Moléculas que unen

glucosa se unen a

residuos de glucosa

(G) de la matriz

Adición de glucosa

(G)

Moléculas se liberan

tras la adición de

glucosa

Enzima - Sustrato

Antígeno - Anticuerpo

Hormona - Receptor

Electroforesis

Gel: proteínas (SDS-PAGE) y ac. nucleicos

Papel, acetato de celulosa

Electroforesis

Electroforesis en acetato de celulosa

Albúmina 45-55% total

Globulinas: a1 5-8%

a2 8-13%

b 11-17%

g 15-25 %

Proteínas plasmáticas

Formación de un gel de

poliacrilamida

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

Dodecil sulfato sódico

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

Marcadores de peso molecular

Proteínas teñidas con

Azul de Comassie

tras SDS-PAGEDeterminación de las

masas moleculares

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

Proteínas presentes en los sucesivos estadios de purificación de una enzima

Carril 1: extracto de partida

Resto de carriles: proteínas obtenidas después

de fraccionamiento cromatográfico

de la muestra del carril anterior

Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)