Tema 9. Mutaci n, reparaci n y Objetivos recombinaci...

Tema 9. Mutación, reparación yrecombinación

Genética CC. Mar 2004-05

Genética CC Mar 2004/5 • D. Posada, Universidad de Vigo 2

Objetivos

• Tipos de mutación

• Detección de las mutaciones

• Reparación

• Recombinación

• Elementos genéticos transponibles


Mutaciones

• El DNA puede cambiar de muchas maneras,incluyendo cambios espontáneos, errores en elproceso de replicación, o por la acción de productosquímicos o radiación

• Las mutaciones cromosómicas implican el cambio desecciones de cromosomas o de cromosomas enteros

• Las mutaciones puntuales: cambios de una o unaspocas pares de bases

Concepto de mutación


Mutación puntual

• Mutación (puntual) es el proceso por el cual lasecuencia de pares de bases en un molécula de DNA esalterada.– Las mutaciones somáticas afectarán solamente al individuo en

el que se produce la mutación y no serán transmitidas a lasiguiente generación.

– Las mutaciones germinales se producen en la línea germinal deorganismos con reproducción sexual, y por lo tanto sí serántransmitidas a la siguiente generación a través de los gametos.

• La tasa de mutación es la probabilidad de una mutaciónparticular en función del tiempo.

• La frecuencia de mutación es el número de mutacionesexpresada como la proporción de células o individuosafectadas en una población.


Tipos de mutaciones puntuales

• Substitución: una base del DNA esreemplazada por otra.

• Inserción/Deleción (indel): una base del DNAañadida o eliminada. Pueden originarmutación de cambio de pauta de lectura.


Tipos de substituciones

• Cambio nucleotídico– Transiciones: entre purinas (A<>G) o entre

pirimidinas (C<>T)

– Transversiones: cuando ocurren de purina apirimidina o viceversa (A<>C, A<>T, C<>G, G<>T)

• Efecto– Sinónima (o silenciosa): cuando no cambia el

aminoácido

– No sinónima: cuando cambia el aminoácido

– Sin sentido: cuando la substitución resulta en laaparición de un codón de terminación

– Neutral: cuando no hay un cambio detectable enla función de la proteína.


Tipos de substituciones (I)



Tipos de substituciones (II)



Mutaciones reversas y supresoras• Las reversiones cambian el fenotipo de mutante a salvaje.

• Las mutaciones supresoras enmascaran o compensan elefecto de la mutación inicial, pero sin revertirla.

Mutación supresora en un gen tRNA


Mutaciones espontáneas e inducidas

• Las mutaciones espontáneas ocurren de formanatural durante la replicación del DNA odurante las fases G1 y G2 del ciclo celular.Pueden se causadas por elementostransponibles.

• Las mutaciones inducidas ocurren cuando seexpone un organismo a un agente físico oquímico, denominado mutágeno.


Mutaciones espontáneas

• En eucariotas, la tasa de mutación espontánea(“fijadas”) oscila entre 10-4 y 10-6 por gen ygeneración. La mayoría de las mutacionesespontáneas son corregidas.

• Tipos:– Errores en la replicación del DNA

– Cambios químicos espontáneos: despurinización ydesaminación


Errores en la replicación del DNA

• Si durante lareplicación se produceun apareamientoincorrecto y no escorregido, seproducirá un mutaciónen la siguiente rondade replicación.

Apareamiento incorrecto del DNA


Mutación por apareamiento incorrecto

Producción de una mutación por apareamiento incorrecto


Indeles en la replicación

• Desplazamiento de bases de la hebra molde o de la hebra que se estásintetizando, generalmente en regiones dónde la misma bases estárepetida.

• También se puede producir cuando se forman pequeños lazos en algunade las hebras.

Adiciones y deleciones


Cambios químicos espontáneos

• En la despurinización, serompe el enlace entre unaadenina o una guanina y ladesoxirribosa.

• Una desaminación es laeliminación del grupo aminode una base (p.e., ladesaminación de una Tproduce U). Ladesaminación de 5-metilcitosina (5mC), produceT, que no es reparada, deforma que los sitios 5mC sonpuntos calientes demutación.

Desaminación


Mutaciones inducidas

• Radiación– Rayos X

– Radiación UV

• Mutágenos químicos– Análogos de bases: 5BU, AZT

– Modificadores de bases: ácido nitroso,hidroxilamina, metilmetano sulfonato

– Intercalantes: proflavina, acridina, bromuro deetidio


Radiación

• Los rayos X pueden romper los enlaces covalentesentre los azúcares y los fosfatos de la cadena de DNA.Sus efectos son acumulativos.

• La radiación UV en dosis más o menos altas inducemutaciones puntuales en el DNA -> dímeros detimina (T^T), que pueden causar problemas gravesdurante la replicación.

Dímeros de timina


Mutágenos químicos: análogos de bases• Los análogos de bases son bases muy parecidas a las bases del

DNA. Se pueden hallar en estado normal o en estado raro(tautómero). En los dos estados se pueden aparear con basesdiferentes del DNA.

• El 5-bromouracil (5BU) es una timina con bromina en vez de ungrupo metilo. En su estado normal, el 5BU se aparea con A.Como tautómero se aparea con G.

Mutaciones producidas por el 5-bromouracil (5BU)


Mutágenos químicos: modificadoresde bases

• El ácido nitroso (HNO2) esuna agente desaminizante. G!X (xantina) (sin efecto); C!U; A!H (hipoxantina)

• La hidroxilamina puedecausar la adición de ungrupo hidroxilo (OH) a lacitosina, de forma que éstase aparea entonces conadenina.

• El metilmetano sulfonato(MMS) introduce gruposalcalino en las bases. G!O6-alcalino-G, que se apareacon T.

Agentes modificadores de bases


Mutágenos químicos: intercalantes

• Los mutágenos intercalantes,como la proflavina, acridina, obromuro de etidio, se insertanentre bases adyacentes en unao en ambas hebras del DNA.

• Pueden producir inserciones odeleciones.

• Pueden ser revertidas por unsegundo tratamiento con elagente intercalante.

Agentes intercalantes


Mutagénesis dirigida

• Es posible mutar un gendeterminado en unlugar particular, porejemplo mediante PCR

• Genes clonadosmutados (nofuncionales) seintroducen en ratones“knockout” paraestudiar sus efectos

Mutagénesis In Vitro de sitios específicos usando PCR


Mutágenos químicos en el ambiente

• Medicinas, cosméticos, aditivos de la comida,pesticidas, tabaco, etc., tienen efectosmutagénicos.

• Muchos mutágenos químicos resultan encáncer (carcinógenos).– Substituciones no sinónimas o sin sentido, o

indeles que alteran la pauta de lectura del gen.

– Es importante recordar que el desarrollo del cáncerimplica la acumulación de mutaciones en variosgenes durante un período significativo.


La prueba de Ames

• Habilidad de un producto químico para revertir cepasmutantes de Salmonella typhimurium a su estado salvaje.

Prueba de Ames


Tipos de mutaciones

• Las mutaciones visibles afectan la morfología o laapariencia de los organismos, por lo que son fácilesde detectar

• Las mutaciones nutricionales o auxotróficas afectanla habilidad de un organismo para sintetizar unamolécula esencial para el crecimiento.

• Las mutaciones condicionales afectan a la habilidadde un organismo a adaptarse a cierta condiciones(p.e., temperatura)

• Las mutaciones de resistencia confieren la habilidadde resistir a virus, productos químicos omedicamentos.


Replicado de placas

• El replicado de placases una técnica sencillay eficaz para ladetección de mutantesauxotróficos (porejemplo) enmicroorganismos quecrecen en coloniasdiscretas en mediossólidos

Replicado de placa para la detección de mutaciones


Anemia falciforme

• Anemia falciforme:cambio A!T, queresulta en Val en vez deGlu

• El alelo mutado en la "-globina (Hb-S) eliminauna diana derestricción, presente enla proteína normal (Hb-A)

Alelos Hb-A y Hb-S


Diagnóstico molecular (“molecularscreen”)

• Anemia falciforme: alcortar con la enzimaDdeI el alelos Hb-Sresulta en una banda de376 pb., mientras queal cortar Hb-A seforman dos bandas de175 y 201 pb.

• Actualmente se utilizantécnicas molecularescomo la PCR, RFLPs osondas de DNA para ladetección demutaciones

Detección de la mutación de la anemia falciforme por RFLPs


Mutación y adaptación

• ¿Mutación pre o post adaptativa?

• Prueba de fluctuación de Luria y Delbrück (1943)

Prueba de fluctuación de Luria y Delbrück


La mutación es pre-adaptativa

• Experimento de placareplicada de Lederberg yLederberg (1952): en todaslas placas de réplica eranlas mismas colonias las quemostraban resistencia ! lamutación es pre-adaptativa


Mecanismos de reparación del DNA• Corrección directa: actúa revertiendo el efecto de la

mutación.– Reparación por la DNA polimerasa

– Fotorreactivación

– Reparación de la alquilación

• Reparación por eliminación: elimina la parte dañaday repara el hueco dejado mediante la síntesis deDNA. Es la reparación principal en eucariotas.– Reparación por escisión

• Reparación postreplicativa: si los sistemas anterioresde reparación fallan…– Reparación de apareamientos erróneos

– Reparación por recombinación (de rescate)

– Reparación SOS


Reparación por la DNA polimerasa

• En genes de bacteria se producen entre 10-7 – 10-11

substituciones por generación. Sin embargo la DNAcomete errores a una frecuencia de 10-5 porgeneración.

• Cuando la polimerasa inserta un nucleótido erróneoy lo detecta, se para, elimina en nucleótidoincorrecto e inserta el correcto.

• En eucariotas esta actividad de reparación existe,pero no la lleva a cabo la DNA polimerasa


Fotorreactivación

• Los dímeros depirimidina puedenrepararse al serexpuesto a luz UV a320-370 nm.

• La enzima fotoliasa esactividad por losfotones y escinde eldímero de pirimidina

• Esta enzima aparece enprocariotas y eucariotassimples, y parece sermuy efectiva.


Reparación de la alquilación

• Enzimas específicas son capaces de eliminar losgrupos etilos o metilo añadidos a las bases. La O6-metilguanina metiltransferasa reconoce la O6-metilguanina y la revierte a guanina al eliminar elgrupo metilo


Reparación por escisión

• El sistema de reparaciónde nucleótidos porescisión (NER) de E. colirepara no sólo dímerosde pirimidinas sinotambién otros posibledaños en el DNA.

• El sistema NERinvolucra cuatroproteínas (UvrA, UvrB,UvrC, UvrD).

• Este tipo de mecanismoes común en la mayoríade organismos.

Reparación por escisión


Reparación de apareamientoserróneos (“mismatch repair”)

• Este sistema reconoce basesmal apareadas, las corta yrepara.

• En E. coli, este tipo dereparación es llevada acabo por los productos detres genes, mutS, mutL ymutH

• La nueva hebra tarda unpoco más en ser metilada

• Este tipo de mecanismosexiste en eucariotas, aunqueno está claro como sedistingue la hebra parental.

Reparación de apareamientos erróneos


Reparación por recombinación

• En E. coli estos sistemasestán mediados por laproteína RecA y es unproceso similar a larecombinación

• Si la DNA polimerasase “salta” la lesión, elhueco se llena con unsegmento procedentede la hebra moldecomplementaria que noesta dañada

Reparación por recombinación


Respuesta SOS

• En E. coli, genes lexA y recA.

• Cuando no hay daño en el DNA, LexA reprime latranscripción de unos 17 genes involucrados en lareparación.

• Cuando hay bastantes lesiones en el DNA, la RecA esactivada, la cual a su vez activa a LexA para que seescinda a sí misma, de forma que se libera larepresión sobre los genes reparadores.

• Una vez que el daño ha sido reparado, RecA esinactivada, de forma que LexA vuelve de nuevo areprimir los genes reparadores.

• En varios casos se introducen nucleótidos al azar, porlo que la respuesta SOS induce una alta tasa demutaciones.


Recombinación del DNA

• El modelo de Hollyday es el básico, pero no es completamentecorrecto

• El modelo de doble rotura parece ser más real– Se cortan ambas hebras de una misma cromátida.

– Una de las hebras se desplaza e invade la otra cromátida, formandoun bucle.

– Reparación de la hebra invasora y de la no invasora mediante lasíntesis de DNA.

– Se ligan las zonas de corte y se forman las estructuras intermediariasde Hollyday.

• El intermediario de Hollyday se puede resolver de dos formasalternativas. Sólo en un caso se produce entrecruzamiento.

• Las proteínas que intervienen en estos procesos son RecA yRecBCD.


Modelo de doble rotura

Modelo de recombinación de doble rotura


Elementos genéticos transponibles

• Los elementos genéticos transponibles omóviles son secuencias de ADN capaces decambiar de posición dentro del genoma.

• Su presencia se detecta generalmente porcambios en la expresión y actividad de losgenes en los que se integra (o en genespróximos).

• Procariotas: secuencias de inserción ytransposones

• Eucariotas: clase I (retrotransposones) y clase II


Secuencias de inserción (IS)

• Sencillos, 768-500 pb.

• Transposasa

• Secuencias terminales invertidas (IR)

• Se duplican e insertan a nueva copia en unpunto al azar del genoma.

Elemento transponible IS1


Integración de IS

Integración de un IS en un cromosoma


Transposones (Tn)

• Contienen varios genespara su inserción ymovilización

• Los transposonescompuestos contienenvarios genes flanqueadospor elementos IS..

• Los transposones nocompuestos contienenvarios genes, pero notienen elementos IS en losextremos si no repeticionessimples invertidas de 38-40 pb.

Transposón compuesto Tn10

Transposón no compuesto Tn3


Cointegración

Cointegración y transposición replicativa


Elementos transponibles eneucariotas

• Muchos y variados

• Clase I o retrotransposones:Se transponen portranscripción inversa.Algunos se asemejan aretrovirus: Ty en levaduras,copia en Drosophila. SINEsy LINEs en humanos. 8%del genoma humano.

• Clase II. Se transponendirectamente a DNA sinRNA intermediario. No sereplican solo cambian deubicación.

Elemento Ty de levaduras


Introducción de genes conelementos móviles

Uso de elementos P para introducir genes en el genoma de Drosophila

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