DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE CONCENTRACIÓN CELULAR

La medida del crecimiento y muerte de los microorganismos en el laboratorio requiere técnicas especiales. Algunas técnicas son medidas indirectas. Estas miden una propiedad - la turbidez, el peso seco, o una actividad metabólica - de la masa de células de una población. Otras técnicas son directas. Las medidas directas incluyen los recuentos directos al microscopio o recuento electrónico, el recuento en placa, o el cálculo delnúmero más probable (NMP). (A veces la filtración es una etapa preliminar en las medidas directas.)

El recuento directo al microscopio o el recuento electrónico proporcionan un recuento de todas las células, tanto las vivas como las muertas. Un recuento de viables mide sólo las células vivas de una población, es decir, aquellas capaces de reproducirse (viable significa "que puede vivir" ). Los recuentos en placa y el NMP son recuentos de viables. Cuando se usa la filtración, se obtiene un recuento de viables. Cada una de estas técnicas tienen sus ventajas y sus inconvenientes.

Recuento Directo al Microscopio El recuento directo al microscopio se puede realizar de dos maneras: con muestras teñidas o en fresco. En el caso de las observaciones en fresco se utilizan cámaras de conteo especiales que consisten básicamente en una retícula de superficie conocida grabada sobre una placa de vidrio, similar a un portabjetos. Se coloca una gota de la muestra sobre ella y se la cubre con un vidrio similar a un cubreojetos convencional; de este modo se puede contar el número de células en la retícula bajo el microscopio. Multiplicando este valor por un factor de conversión, calculado en función del volumen alojado en la cámara, se puede estimar en número de bacterias por mililitro de muestra. Este método es tedioso pero es una forma rápida de estimar la carga microbiana de una muestra. A pesar de ello el método tiene algunas limitaciones: 1) No se distinguen células muertas y vivas. 2) Las células pequeñas son difíciles de ver bajo el microscopio. 3) Poca precisión. 4) El método no es adecuado cuando la densidad de células es baja.

Recuento microscópico directo. La cámara de recuento de Petroff-Hauser se usa, junto a un microscopio, para realizar un recuento directo de células. Consta de un porta que tiene unos pocillos superíiciales (de 0,02 mm de profundidad). En el fondo del porta hay grabada una rejilla de 1 mm2, dividida en 25 cuadrados grandes, cada uno de los cuales está dividido en 16 cuadrados más pequeños. De esta manera, el volumen total de la rejilla es de 0,02 (un quinceavo) mm3, y cada cuadrado grande es un veinticincoavo de esta cantidad.

Recuento en Placa

Para realizar un recuento en placa se utilizan los métodos de extensión o de vertido en placa, empleados para cultivar los microorganismos. La técnica consiste en diluir de manera seriada, generalmente diez veces por cada dilución, una muestra del cultivo y luego sembrar una pequeña cantidad de cada dilución en una placa o bien mezclarla con el medio a sobrefusión. A continuación, la placa debe ser incubada en las condiciones adecuadas. Una vez que se han formado colonias visibles, se seleccionan para el recuento de colonias las placas en las que éstas están bien separadas. Las placas que tienen entre 30 y 300 colonias ofrecen una buena relación entre la rapidez del recuento y la precisión en el resultado obtenido. El número de colonias de una placa, junto con la dilución de la muestra que se inoculó en ella, nos permite calcular la concentración de células presente en la muestra original . El recuento en placa es un recuento de viables, Se basa en el principio de que una única célula viable originará una colonia visible, cuando se siembre en una placa de agar.

La ventaja del método de recuento en placa es su gran sensibilidad. Si se utiliza un medio y unas condiciones de incubación adecuadas, puede detectarse incluso una única célula viva. Ademas, el recuento en placa no requiere un equipo complicado.

Un inconveniente es que el recuento en placa es lento y tedioso y no es muy preciso, porque la precisión depende del recuento de un número elevado de colonias. La precisión aumenta con el número de colonias que se recuentan, ya que disminuye el error debido al muestreo.Se basa en la extensión de la muestra, agregada con un asa calibrada sobre una placa seca.

Un recuento en placa es una medida directa y proporciona un recuento de viables. En primer lugar, la muestra se diluye seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril y se mezclan adecuadamente. Este proceso se repite basta obtener una dilución apropiada en este ejemplo, 1:100000 (10-5). Posteriormente se añade 0,1 ml a una placa de agar nutritivo, bien extendiéndolo en la superficie de la misma (método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método de vertido en placa). Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan. Debido a razones estadísticas, las placas deben contener entre 30 y 300 colonias. En este ejemplo, la placa tiene 225 colonias.

Método de Breed

Es un método directo para cuantificar células totales en el cual un volumen conocido de la muestra diluida se extiende uniformemente sobre la superficie de un portaobjetos normal en una superficie conocida. Se observa al microscopio el campo de observación contando los microorganismos en diversos campos microscópicos. Se obtiene el valor medio de células por campo que se logra multiplicando el número de campos microscópicos comprendidos en la preparación. Ello da el número de microorganismos existentes en el volumen conocido que a su vez al multiplicarse por 100 indica el total de microorganismos /ml o g de muestra. Ventajas:

1. Es un método rápido 2. Es un método económico

Desventajas

1. Es imposible diferenciar a las células vivas de las 2. muertas. 3. Cuando se tienen muestras que contienen poblaciones 4. pequeñas, el margen de error es grande. 5. El método no suele ser adecuado para suspensiones 6. con baja densidad celular. 7. Las pequeñas células son difíciles de ver.

Recuento Electronico Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a través del pequeño conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de éste se incrementa debido a que la conductividad de la célula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados. Turbidez En una suspensión microbiana, la cantidad de m.o está directamente relacionada con la turbiedad de la misma, e inversamente relacionada con la cantidad de luz que pasa por la misma. A mayor turbidez mayor número de bacterias. Un espectrofotómetro mide la cantidad de luz que transmite una solución o un cultivo líquido de células microbianas. Cuanto mayor masa de células tenga un cultivo, mayor será su turbídez, se transmitirá menos luz y la lectura en el espectofotómetro será mayor Método de Filtración

El método del número más probable (NMP)

Es un método estadístico que se fundamenta en la teoría de la probabilidad. En él se preparan múltiples series de diluciones decrecientes, con cada dilución se inoculan varios tubos que contienen el medio de cultivo adecuado. Este método se utiliza para contar microorganismos difíciles de cultivar en medio sólido, o para determinar el número de células que pueden crecer en un medio líquido determinado, como el análisis para determinar la contaminación del agua potable.

Al igual que el método de recuento en placa, nos proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio.

Métodos de determinación del número de microorganismos.

Método Microorganismos

para los que se utiliza

Tipo de recuento Usos / Limitaciones

Indirecto

Turbidez La mayoria de las bacterias y levaduras

Total Determina la turbidez con un espectrofotómetro; rápido y reproducible; la suspensión debe contener más de unos l0 millones de células por ml; se requiere

una curva patron

Peso seco Cualquier microorganismo

Total Tedioso y requiere un cierto tiempo, pero preciso y reproducible

Actividad metabólica

Cualquier microorganismo

viable

Viables Requiere un cierto tiempo y puede ser impreciso; puede utilizarse con

materiales complejos

Directo

Recuento microscópico

Cualquier microorganismo

unicelular

Total Muy útil para el recuento de un tipo de células de una mezcla; requiere un cierto

tiempo; no es adecuado para cultivos diluidos

Recuento electrónico

Cualquier microorganismo

unicelular

Total Muy útil para el recuento de células de un cultivo axénico; rápido y preciso; no

debe estar presente material extralio

Recuento en placa

Cualquier microorganismo unicelular viable

Viables Muy sensible - puede detectar incluso una célula; lento y tedioso; para evitar el

error debido al muestreo, se debe recontar un gran número de colonias

Numero más problable

Cualquier microorganismo

viable

Viables Utilizado para microorganismos que son dificiles de cultivar en medio sólido y

para determinar contaminación por Escherichia coli en aguas; requiere

un cierto tiempo

Filtración Cualquier microorganismo

viable

Viables Se concentra una muestra, de manera que se puede recontar un pequeño número de células a partir de grandes volúmenes de

un líquido o de un gas

La transmitancia se define como la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en determinada cantidad de tiempo. La Ley Lambert Beer es un medio matemático de expresar cómo la materia absorbe la luz. Esta ley afirma que la cantidad de luz que sale de una muestra es disminuida por tres fenómenos físicos:

1. La cantidad de material de absorción en su trayectoria (concentración) 2. La distancia que la luz debe atravesar a través de la muestra (distancia de la

trayectoria óptica) 3. La probabilidad de que el fotón de esa amplitud particular de onda sea absorbido

por el material (absorbencia o coeficiente de extinción) Esta relación puede ser expresada como:

A E l C Log T= ⋅ ⋅ = −

Donde: A= Absorbencia E = Coeficiente de extinción específica l = Distancia C = Concentración molar T= Transmitancia

Cuestionario

3) 4) Un volumen conocido de muestra es extendido sobre un cuadrado de 1 cm (1 a 4 cm) de lado de un portaobjeto. Posteriormente, la muestra es secada, fijada y teñida y se determina el número de microorganismos en varios campos del microscopio. Conociendo el área de los campos del microscopio es posible determinar el número total de microorganismos. Para bacterias (Para la leche) 5) En la curva se ubica el máximo pico que corresponda a un máximo de absorvancia el cual corresponde a una longitud de onda determinada; a esta longitud se denomina longitud de onda analítica 7) Por el método Redox (Técnica de cuenta directa). Son colorantes sensibles a los cambios de potencial redox del medio, nos informa sobre la capacidad de los microorganismos a aceptar o ceder electrones. El azul de metileno, cuando se oxida por completo, llega a 78 y es azul, mientras que si se reduce por completo, tiene un poder redox de -49 y es incoloro 8)