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TEMA 14: EL ADN, PORTADOR DE LA INFORMACIN GENTICA. REPLICACIN DEL ADN

1. El ADN como molcula portadora de la informacin gentica. 2. Flujo de la informacin gentica. 3. Replicacin del ADN.

3.1 Hiptesis sobre la duplicacin del ADN. 3.2 Experimento de Meselson y Sthal. 3.3 Mecanismo de replicacin del ADN. 3.4 Correccin de errores durante la replicacin. 3.5 Diferencias entre el proceso replicativo en procariotas y eucariotas.

1. EL ADN COMO MOLCULA PORTADORA DE LA INFORMACIN GENTICA

Hoy sabemos que la molcula que contiene la informacin de las caractersticas biolgicas de los seres vivos es el ADN, que junto con las histonas (protenas bsicas) forma los cromosomas. Sin embargo, la demostracin de que este cido nucleico constitua el material hereditario slo fue posible gracias a la paciente labor de investigacin de muchos cientficos durante la primera mitad del siglo XX.

El mdico suizo Friedrich Miescher fue el primero que consigui aislar en 1869, a partir de ncleos celulares (de leucocitos), una sustancia a la que denomin nucleina formada por una parte cida (hoy, ADN) y una parte bsica (protenas).

En 1928 cuando F. Griffith buscaba una vacuna contra la neumona provocada por la bacteria Streptococcus pneumoniae, descubri una sustancia, a la que llam principio transformante, que contena la informacin gentica.

Griffith trabajaba con dos cepas de bacterias: - La cepa S ("smooth"= liso) posea una cpsula de polisacridos y al inyectarla provocaba la muerte de los ratones. - La cepa R ("rough"= rugoso) careca de cpsula (por falta de una enzima) y resultaba inofensiva para los ratones.

Tambin comprob experimentalmente que si calentaba la cepa S hasta destruirla y la inyectaba a los ratones, stos no desarrollaban la enfermedad.

Ms sorprendente an fue el descubrimiento de que si inyectaba conjuntamente la cepa muerta S y la cepa inofensiva R, los ratones enfermaban y moran, ya que en su sangre se poda encontrar bacterias S vivas.

Griffith dedujo que las bacterias muertas haban liberado alguna sustancia ("principio transformante"), que al ser captada por las bacterias inofensivas las transformaba en virulentas. Es decir, que la informacin gentica se haba transferido de una cepa a otra.

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En esta poca se pensaba que las protenas cromosmicas eran las portadoras de la informacin gentica y que el ADN tena un papel secundario.

Tuvieron que pasar 16 aos hasta que se consigui identificar la molcula que contena el material gentico.

En 1944, O.T. Avery, C. Macleod y M. McCarty, dedujeron que el principio transformante de Griffith era el ADN, pues para que un extracto de clulas S transformara una cepa de clulas R, el nico componente que deba contener necesariamente era el ADN. Esta capacidad transformante desapareca cuando se agregaban enzimas que destruan el ADN.

La prueba definitiva fue obtenida en 1952 por Alfred Hershey y Martha Chase, quienes demostraron de forma concluyente que el ADN, y no una protena, era el material gentico del bacterifago T2, un virus que ataca a la bacteria E. coli, y que est formado nicamente por ADN y protenas (las dos sustancias de las que se sospechaba que podra estar formado el material hereditario).

Las protenas del virus poseen azufre pero no fsforo, mientras que el ADN lleva fsforo, pero no azufre. Marcaron radiactivamente un grupo de virus con 32P y el otro con 35S. Con cada grupo infectaron a un cultivo bacteriano diferente, que posteriormente se someti a agitacin y centrifugacin para separar los restos de virus de las bacterias. Se midi la radiactividad, tanto del medio extracelular como del intracelular, y se observ que el 35S haba quedado en el exterior de las clulas mientras que el 32P haba entrado en las clulas con el ADN y provocado la formacin de nuevos virus (marcados tambin).

No obstante, quedaba por demostrar cmo un compuesto tan simple poda almacenar y transmitir tanta informacin. La respuesta la proporcion el progresivo conocimiento de la estructura del ADN. Desde que, en 1953, James D. Watson y Francis Crick propusieron su modelo de estructura de doble hlice, que explicaba como se poda almacenar y transmitir la informacin gentica, ya nadie dud de la funcin y la importancia del ADN.

2. FLUJO DE LA INFORMACIN GENTICA

El ADN es el portador del mensaje gentico y debe:

Transmitir este mensaje de una generacin a otra mediante el proceso de replicacin o duplicacin. Proceso mediante el cual a partir de una molcula de ADN progenitora se sintetiza una nueva, originndose as dos molculas de ADN hijas, idnticas a la original.

Expresar este mensaje gentico ya que en l se encuentra la informacin necesaria para sintetizar las protenas de la clula. La expresin del mensaje gentico se realiza en dos fases:

- Transcripcin: Proceso por el cual el ADN forma una copia de una parte de su mensaje, sintetizndose una molcula de ARN mensajero.

- Traduccin. Con la informacin contenida en el ARN mensajero se sintetiza en los ribosomas una protena.

El flujo de informacin gentica se puede expresar de la siguiente manera:

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Este esquema fue considerado durante muchos aos el "dogma central de la Biologa Molecular" (enunciado por Crick en 1970).

En la actualidad, esta forma de expresarlo ha tenido que ser modificada, debido a los mecanismos de replicacin que presentan ciertos virus:

o Algunos virus (como el del mosaico del tabaco) que tienen su informacin gentica en forma de ARN poseen una enzima, la ARN replicasa, capaz de fabricar copias de este ARN.

o Los retrovirus almacenan su informacin gentica en una molcula de ARN y cuando se introducen en una clula son capaces de sintetizar ADN utilizando como molde su ARN. Para ello emplean una enzima, la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa (el proceso se llama transcripcin inversa). Posteriormente, el ADN transcrito se integra en el ADN celular.

Tras el descubrimiento del comportamiento de estos virus, el dogma central de la Biologa Molecular hubo de ser redefinido:

3. REPLICACIN DEL ADN

El ADN, portador de la informacin gentica, debe transmitirse fielmente a cada una de las clulas hijas obtenidas tras la divisin celular. Por lo tanto, antes de producirse sta, es imprescindible que el ADN forme una rplica exacta de si mismo, para disponer de dos copias iguales. Este proceso se conoce con el nombre de replicacin o duplicacin del ADN y tiene lugar durante la fase S ("sntesis") de la interfase.

3.1 HIPTESIS SOBRE LA DUPLICACIN DEL ADN.

Cuando Watson y Crick elaboraron su modelo de doble hlice en 1953, indicaron tambin cul podra ser el mecanismo de la replicacin del ADN: separacin de las dos cadenas y cada una sirve de molde para la sntesis de una nueva cadena complementaria.

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Sin embargo hubo investigadores que propusieron otras hiptesis. Veamos las 3 hiptesis posibles:

Conservativa. La doble cadena original se mantiene y se sintetiza otra doble cadena completamente nueva.

Semiconservativa. Es la propuesta por Watson y Crick. En cada molcula hija, una cadena procede de la molcula progenitora y otra es de nueva sntesis.

Dispersiva. En cada molcula hija existen fragmentos de la progenitora y fragmentos nuevos.

Unos aos ms tarde, en 1957, Meselson y Stahl demostraron experimentalmente que la hiptesis correcta era la semiconservativa.

3.2 EXPERIMENTO DE MESELSON Y STAHL.

Meselson y Stahl cultivaron bacterias (Escherichia coli) en un medio con nitrgeno pesado, el 15N. Esto hace que las molculas de ADN sintetizadas con este istopo sean ms densas que las construidas con 14N (el istopo normal), y por lo tanto que se puedan separar mediante ultracentrifugacin.

Posteriormente, pasaron algunas bacterias cultivadas con 15N a un medio con 14N durante una media hora, que es el tiempo necesario para que se duplique el ADN bacteriano, lo extrajeron y lo centrifugaron. Este ADN form una sola banda en el tubo de centrifugacin, en una posicin intermedia entre la que ocupaba el ADN con 15N (ADN "pesado") y el ADN con 14N (ADN "ligero"). Se trataba, pues, de un ADN "hbrido" y haba que descartar la hiptesis conservativa.

Si se dejaban las bacterias durante dos divisiones (2 generacin), aparecan dos tipos de ADN, uno hbrido y otro ligero. Si se dejaban durante tres, el ADN hbrido apareca en menor proporcin, mientras aumentaba el ADN ligero. Esto descartaba la hiptesis dispersiva y demostraba la semiconservativa.

En 1963 J. Cairns visualiz este proceso con tcnicas autorradio-grficas. Para ello mantuvo bacterias (E. coli) en un medio, con timina marcada con tritio (H3). Este istopo radiactivo emite partculas capaces de impresionar una placa fotogrfica, lo que permite localizar las nuevas molculas de ADN.

3.3 MECANISMO DE REPLICACIN DEL ADN.

Aunque la replicacin fue estudiada inicialmente en clulas procariotas, luego se comprob que el mecanismo es similar en las eucariotas. En ambos casos se dan dos etapas: iniciacin y elongacin.

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Inicio de la replicacin.

La replicacin comienza en ciertas zonas del ADN donde existen determinadas secuencias de nucletidos (abundan las secuencias GATC). A estos puntos se les llama "origen de replicacin".

El proceso se inicia con una enzima denominada helicasa que separa las dos hebras de ADN al romper los puentes de H entre las bases nitrogenadas complementarias.

Las separaciones de las cadenas, provoca superenrollamientos en las zonas vecinas, por lo que existen otras enzimas, las topoisomerasas, que eliminan la tensin. Para ello cortan una de las dos hebras (topoisomerasa I) o las dos (topoisomerasa II o girasa en procariotas) y una vez eliminadas las tensiones, las empalman nuevamente.

Una vez separadas las dos hebras se mantienen as por la unin de unas protenas SSB ("single strand binding proteins", protenas de unin a la hebra sencilla).

En el lugar de origen de la replicacin se ha formado una burbuja de replicacin en la que hay dos zonas, con forma de Y, denominadas horquillas de replicacin, donde se van a sintetizar las nuevas hebras de ADN. La burbuja de replicacin se va extendiendo a lo largo del cromosoma en los dos sentidos, de ah que se diga que la replicacin es bidireccional.

Alargamiento.

A continuacin comienza la sntesis de las hebras complementarias sobre cada una de las originales. El proceso se lleva a cabo mediante la enzima ADN polimerasa III, que tiene las siguientes caractersticas:

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- Recorre la hebra molde en sentido 3' 5'. - Va uniendo los nuevos nucletidos en sentido 5' 3'. Para ello utiliza nucletidos

trifosfato. La energa necesaria para el proceso, la proporcionan los propios nucletidos, al perder dos de su grupos fosfato (PPi).

- Ninguna ADN polimerasa puede iniciar la sntesis por si misma, pues slo puede aadir nucletidos sobre el extremo 3' libre de una cadena de polinucletidos. Por este motivo es necesario que exista una cadena corta de ARN (de unos 40 o 50 nucletidos) denominada cebador o primer.

El cebador es sintetizado por la enzima primasa (una ARN-polimerasa).

Dado que la ADN polimerasa III recorre el ADN molde en sentido 3' 5', la sntesis de una de las hebras es continua y se denomina hebra conductora. Sin embargo, la otra hebra es antiparalela, por lo que la ADN polimerasa debera recorrerla en sentido 5' 3', aadiendo nucletidos a la hebra en formacin en sentido 3' 5', lo cual no es posible. La sntesis, en este caso, es discontinua y se produce en segmentos separados. Esta cadena se llama hebra retardada, pues su sntesis es ms lenta que la hebra conductora. Los segmentos de ADN sintetizados de este modo se conocen como fragmentos de Okazaki (cada fragmento est formado por el cebador de ARN y unos 1000 o 2000 nucletidos de ADN).

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Posteriormente, interviene la ADN polimerasa I, que primero elimina los segmentos de ARN cebador, gracias a su accin exonucleasa (rotura de enlaces fosfodister a partir de un extremo libre), y luego, gracias a su actividad polimerasa, rellena los huecos con ADN.

Finalmente, hay otra enzima, la ADN ligasa que une todos los fragmentos.

Por ltimo, cada hebra recin sintetizada y la que ha servido de molde se enrollan originando una doble hlice.

A pesar de todas estas etapas, el proceso de replicacin es muy rpido. En E. coli, por ejemplo, se unen 45.000 nucletidos /minuto.

3.4 CORRECCIN DE ERRORES DURANTE LA REPLICACIN.

Durante la replicacin es frecuente que se produzcan errores y se incorporen nucletidos que no tengan correctamente apareadas sus bases. La ADN polimerasa I y III actan entonces como exonucleasas eliminando los nucletidos mal colocados (la I y III tienen actividad exonucleasa 3' 5' y la I adems 5' 3', lo que le permite eliminar el ARN cebador).

Aunque el mecanismo de correccin de errores es muy eficiente, a veces queda alguno sin corregir. Esos errores (mutaciones) pueden ser importantes en la evolucin.

3.5 DIFERENCIAS ENTRE EL PROCESO REPLICATIVO EN PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS.

El proceso de replicacin es similar en las bacterias y en las clulas eucariotas. Cabe destacar algunas diferencias:

- El ADN en los eucariotas est asociado a histonas. Se ha comprobado que las histonas originales se mantienen en la hebra conductora, mientras que se forman nuevas histonas que se unen a la hebra de ADN retardada.

- El tamao de los fragmentos de Okazaki es menor en los organismos eucariotas (100 a 200 nucletidos) que en los procariotas (1000 a 2000) nucletidos).

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- Existen 3 ADN polimerasas en los procariotas (I, II y III, la II interviene en procesos de reparacin del ADN) y 5 en los eucariotas: , , , , y , (la interviene en la replicacin del ADN mitocondrial).

- Teniendo en cuenta que la longitud del ADN de un cromosoma eucaritico es mucho mayor que la del ADN bacteriano, y que, seguramente debido a la presencia de histonas, el proceso es bastante ms lento, en los eucariotas no hay un solo origen de replicacin, sino cientos. Cada unidad de replicacin se denomina replicn.

Los cromosomas de las clulas eucariotas al ser lineales presentan un problema aadido, que no se da en el ADN circular de las bacterias.

En eucariotas el proceso de replicacin del ADN se va completando normalmente hasta llegar a los extremos del cromosoma, los telmeros. En ellos, cuando se elimina el ltimo ARN cebador, la hebra retardada quedar incompleta, ya que la ADN polimerasa no podr rellenar el hueco, al ser incapaz de sintetizar en direccin 3' 5'. Este acortamiento de los telmeros (calculado entre 50 y 200 pb por cada divisin celular) supone la disminucin progresiva de la longitud del cromosoma, fenmeno asociado a los procesos de envejecimiento y muerte celular.

El ADN de los telmeros est constituido por secuencias de seis nucletidos que se repiten numerosas veces. La hebra de extremo 3' es rica en guanina (AGGGTT en la especie humana) y lgicamente, la del extremo 5' es rica en citosina. A medida que las clulas se van dividiendo (y envejeciendo), los telmeros se van acortando. Pero dado el carcter repetitivo y no codificante de stos, inicialmente esa prdida de los extremos de cada cromosoma no tiene consecuencias, pero llega un momento en que afecta a regiones codificantes, entonces la funcin celular se ve perjudicada y la clula termina por morir.

En las clulas madre de los gametos, las clulas cancerosas o las de los tejidos embrionarios, que se dividen continuamente, existe una enzima, llamada telomerasa y constituida por una parte proteica y un ARN, que acta como molde para alargar la hebra del extremo 3' (saliente). Esta prolongacin, catalizada por la telomerasa, sirve como molde, para la sntesis, por parte de la ADN polimerasa alfa, del extremo 5' que qued incompleto.

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ACTIVIDADES

1.- Es siempre el ADN la molcula portadora de la informacin gentica? Justifica tu respuesta. 2.- En qu consiste, bsicamente, la duplicacin del ADN y cul es su importancia biolgica? Se puede considerar este proceso como sinnimo de sntesis de ADN? Razona la respuesta. 3.- En el experimento de Meselson y Stahl, qu porcentaje de ADN de densidad hbrida se obtiene despus de una generacin de crecimiento de las bacterias en 14N?

a) 0 b) 25 c) 50

d) 75 e) 100

4.- Colorea las cadenas en cada uno de los casos descritos en el experimento de Meselson y Stahl. Utiliza para ello el esquema que aparece en la pgina 4. 5.- Cul habra sido el resultado del experimento de Meselson y Stahl si el ADN se replicase segn la hiptesis conservativa? 6.- Explica que resultados se habran obtenido en la 2 y 3 generacin del experimento anterior si la hiptesis correcta fuese la dispersiva. 7.- En la replicacin de una molcula de ADN de doble hebra, y despus de tres ciclos de replicacin, cuntas hebras de nueva sntesis habrn aparecido? Razona la respuesta. 8.- La ADN polimerasa precisa nucletidos trifosfato a pesar de que los incorpora a la cadena que se est sintetizando, como nucletidos monofosfato. Sabiendo que los enlaces entre los grupos fosfato son muy ricos en energa, qu explicacin puedes dar a este hecho? 9. En el siguiente esquema de una horquilla de replicacin identifica las letras:

A. B. C. D. E.

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10.- En este esquema se observa una doble cadena de ADN en la que una hebra ha sufrido la prdida de un segmento:

a) Qu tipo de enlaces se han roto? b) Cules sern los nucletidos que se aadirn, en qu orden, y a partir de qu extremo? c) Qu enzimas actuaran?

11.- Completa la tabla siguiente sobre las enzimas que intervienen en la duplicacin del ADN bacteriano:

ENZIMA

FUNCIN

ADN polimerasa I

Topoisomerasa I

Topoisomerasa II

Primasa

ADN ligasa

Helicasa

ADN polimerasa III

12.- Actualmente, una de las lneas de investigacin ms importante es la bsqueda de inhibidores de la telomerasa humana. Sabras explicar por qu?

ACTIVIDADES PAU 13.- Indique qu es la replicacin. Describa este proceso. Qu significa que la replicacin es semiconservativa? (Junio 2003- Opcin A)