Diseo de detergente a partir de amilasas psicrfilas, para zonas de baja temperatura.

Trabajo Practico: TesillaDiseo de detergente a partir de amilasas psicrfilas, para zonas de baja temperatura.Bioinformtica II

Guillermo Castillo Constanza Maruri Profesor: Mario Esparza2-7-2014

Universidad de AntofagastaFca. Ciencias del mar y Recursos Biolgicos.Biotecnologa

2. ndice.Pg.1. Portada.0.2. ndice. 1.3. Resumen.2.4. Antecedentes. 3-6.4.1. Antecedentes generales.3-4.4.2. Antecedentes especficos.4-5.4.3. Cronologa.5-6.5. Problemtica.7.5.1. Hiptesis.7.5.2. Objetivos especficos.7.5.3. Objetivos generales.7.6. Materiales y Mtodos.8-14.6.1. Flujograma.14.7. Resultados esperados.15.8. Conclusin.16.9. Proyecciones.16.10. Referencias.17-18.11. Carta Gantt.19.

3. Resumen.Los detergentes de hoy en da contienen enzimas que son capaces de remover de forma efectiva la suciedad de las prendas, la mayora de los detergentes estn diseados para funcionar a temperaturas templadas, esto inactiva las enzimas que contiene, lo que dificulta su accin a temperaturas altas o bajas de lavado, por esta razn en lugares donde las temperaturas del agua es baja, los detergentes no tienen la misma eficiencia en comparacin con reas mediterrneas. Una amilasa psicrofila aislada desde un microorganismo encontrado en la Antrtica llamado Pseudoalteromonas haloplanktis, puede constituir una nueva solucin al clonar la secuencia que codifica este gen en un microorganismo hospedador, y que este produzca la enzima en un detergente comn.

4. Antecedentes.4.1. Antecedentes generales.AmilasasLa enzima amilasa, es una enzima hidrolasa cuya funcin es la de catalizar la reaccin de hidrlisis de los enlaces 1-4 del componente -amilasa al digerir polisacridos tales como amilopectina, amilosa, glucgenos y sus productos parcialmente hidrolizados., para formar azcares ms simples. (Qian et al, 1994)Existen tres tipos de enzimas de amilasa en la naturaleza: -amilasa, -amilasa y -amilasa. La alfa-amilasa es el nico tipo que se encuentra en los seres humanos y se encuentra ya sea en el pncreas o la saliva de la boca. La amilasa salival descompone los carbohidratos en la boca, mientras que la amilasa pancretica es secretada por el pncreas en el intestino delgado y descompone los hidratos de carbono La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1-4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinognica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de maltosa. (Qian et al, 1994)Por su accin, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej. Cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0C por 15 min. El pH ptimo de accin est dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancretica. La enzima es resistente al calor, pues a 70C conserva un 70% de su actividad. Acta sobre almidones crudos y gelatinizados. La -amilasa es producida en el trigo normalmente en cantidades grandes y consistentes. La beta-amilasa se la conoce con el nombre de enzima sacarognica, pues acta sobre la amilosa, rompiendo unidades 1-4, dando maltosa. Sobre la amilopectina acta en las uniones alfa-1-4 de la cadena recta, y detiene su accin a distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa-1-6. Se trata de una exoamilasa, ya que acta sobre el terminal de la molcula; mientras la amilosa es transformada totalmente en maltosa, la cadena ramificada de la amilopectina se conserva en un 40-45% sin hidrolizar. (Mikami et al, 1994)La -amilasa es una enzima que cataliza la hidrlisis de residuos terminales de D-glucosa enlazados en alfa-1-4 sucesivamente de los extremos no reductores de cadenas de polisacridos, liberando beta-glucosa. Tambin es capaz de hidrolizar enlaces 1-6 alfa-glucosdicos cuando el siguiente enlace de la secuencia es 1-4. (Norouzian et al, 2006)

Bacterias y enzimas psicrfilas.La adaptacin de los microorganismos a condiciones ambientales extremas, como las encontradas en el continente Antrtico, los obliga a desarrollar componentes celulares y estrategias bioqumicas apropiadas. En este sentido se acepta que estos microorganismos constituyen un importante reservorio de molculas de inters industrial y con aplicaciones biotecnolgicas novedosas. En particular las enzimas activas en fro o adaptadas al fro, son en general producidas por organismos que habitan un medio ambiente permanentemente fro como los que se localizan en las zonas polares, a altas altitudes y en la profundidad de los ocanos. Estas enzimas psicrfilas se caracterizan por una alta eficiencia cataltica por debajo de los 4 C y se asocian a menudo, o casi siempre, con una alta termo sensibilidad (Feller y Gerday, 2003).4.2. Antecedentes especficos:Alteromonas haloplanktis es una bacteria Gram negativa encontrada en el mar antrtico, cuya temperatura ptima est en el rango de -2 y 2, considerada un microorganismos psicrfilos solo puede crecer hasta 25C . (Nushin Aghajari, 1998) se observaron las estructuras de protenas alfa- amilasas de organismos psicrofilos y mesfilos, llegando a la conclusin de que los primeros poseen una estructura levemente diferente, son ms flexibles y poseen menos interacciones entre dominios, lo que se concluye mejora la eficiencia en la reaccin enzimtica a bajas temperaturas. En 1913 un alemn llamado Otto Roohm observ que una enzima extrada del pncreas de animales era capaz de digerir protenas y que poda optimizar el proceso de lavado de ropa. Fue entonces que fabric el primer jabn enzimtico de prelavado, un producto revolucionario que fue comercializado en Alemania. Una pequea dosis poda ser agregada a 10 litros de agua para remover manchas de la ropa. Recin a mediados del siglo XX comenz la produccin masiva de enzimas provenientes de bacterias en fermentadores, que fueron aplicadas en los detergentes enzimticos. Hoy da, es familiar el uso de polvos o lquidos detergentes con enzimas. Estos detergentes han encontrado un amplio rango de aplicaciones en lavado de ropa y vajilla e industria textil, entre otras. Las enzimas usadas en la industria son manufacturadas a gran escala a travs de la fermentacin producida por bacterias u hongos comunes. Esto ha sido posibilitado en las ltimas dcadas por el rpido avance de la enzimologa y la tecnologa de fermentacin. Desde los aos 60 el uso de enzimas se masific, y en la actualidad es comn encontrar enzimas en la formulacin de los detergentes. Las enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez que permiten el trabajo de limpieza a bajas temperaturas y perodos ms cortos de lavado, reduciendo significativamente el consumo de energa y las emisiones de CO2.Las amilasas, han sido usadas en otros mbitos como la biorremediacin pero su uso ms domstico como el lavado de prendas de uso diario, es muy importante Las enzimas que se usan industrialmente son producidas en grandes cantidades por bacterias y hongos que se cultivan en tanques llamados fermentadores. Estas enzimas se vienen usando desde hace ms de 40 aos con el objetivo de reemplazar a los compuestos sintticos, minimizar el uso del agua y el consumo de energa, ya que antes las manchas slo podan ser removidas con blanqueadores y altas temperaturas (Khemakhem et al 2009). La mayora de las enzimas que estn hoy en el mercado han sido mejoradas por tcnicas de ingeniera de protenas o provienen de microorganismos recombinantes (genticamente modificados) para optimizar su proceso de fabricacin. Una de las enzimas usadas en detergentes son las amilasas las que aceleran la degradacin de los residuos de almidn de alimentos como papa, chocolate, etc. Las amilasas no son componentes esenciales de los detergentes porque tienen una accin limitada sobre los carbohidratos. En adicin, los carbohidratos son solubles en agua y tienden a ser fcilmente removidos con la mayora de los detergentes y agua. El problema ms grande con las amilasas en la formulacin de detergentes es la oxidacin. La ingeniera de protenas ha sido usada para crear una amilasa resistente a la oxidacin (Mertens, D. R. 2002).4.3. Cronologa.La amilasa tambin llamada diastasa fue la primera enzima descubierta y aislada. En 1833 se extrajo de la solucin de malta por Anselme Payen y Jean-Franois Persoz, dos qumicos de una fbrica de azcar francesa. (Das et al. 2011).El nombre "diastasa" proviene de la palabra griega (diastasis) (una separacin), ya que cuando se calienta la mezcla de la cerveza, la diastasa hace que el almidn de la semilla de cebada se transforme rpidamente en azcar soluble y por lo tanto, la cscara se separe del resto de la semilla. El sufijo -asa es de uso comn para las enzimas delas cuales su nombre deriva de la diastasa.Aplicaciones.Existe un amplio espectro de aplicaciones biotecnolgicas, como en la industria textil, farmacutica, comida e industria del lavado, como por ejemplo:Cerveza.La cerveza es grano de cebada que se ha dejado que germine un poco, secado y tratado. La germinacin pone en marcha nuevos sistemas enzimticos, especialmente diastasas que hidrolizan el almidn dando dextrinas, con el fin de proporcionar tambin azcares como la maltosa. (Kirk et al, 2002)Miel.Enzimas digestoras de almidn. Se encuentra el alfa-amilasa que divide las cadenas de almidn al azar, produciendo dextrinas, y la beta-amilasa que divide la azcar reductora maltosa de los terminales de las cadenas de almidn. Los orgenes de sta son muy discutidos y no se sabe a ciencia cierta si vienen del polen en el nctar o de la abeja. Las mieles ms oscuras tienden a tener una mayor actividad de diastasa. La actividad de diastasa es un excelente indicador de la calidad de una miel. Por mucho tiempo los europeos han considerado miel con una actividad de diastasa baja como miel que ha sido sobrecalentada y por lo tanto no apta para consumo de mesa. Mientras mayor el contenido de esta enzima, mayor es su calidad. (Barhate et al, 2003)Tratamientos de salud.Los suplementos de diastasa se toman para ayudar a la digestin y aumentar el metabolismo de los azcares. Suplementos de amilasa se pueden tomar para subir los niveles de la enzima para controlar la psoriasis, eczema, alergias y brotes de herpes, que son el resultado de una deficiencia de asma; el enfisema tambin puede beneficiarse de suplementos de diastasa. La diastasa se incluye a menudo en los complejos de suplemento de enzimas, especficamente para los trastornos digestivos. (Darling et al. 1995)Actualmente se administra Takadiastase que es una forma de diastasa para mejorar la digestin. Como ya se ha dicho, el agente posee una propiedad diastsica y fermentativa. Su campo especfico es la correccin de las imperfecciones diastsicas. Convierte 100 veces su peso en seco de almidn en azcar. Digiere los almidones y previene el estreimiento, flatulencia, malestar general, insomnio, dolor de cabeza y vrtigo, que resultan de las tomanas de almidn no digerido que acaban descomponindose. (Sako et al. 2011)Detergentes que contienen enzimas en su frmula.En la actualidad muchos de los detergentes utilizan enzimas en su composicin con el fin de obtener un mejor resultado en el lavado, alguna de estas enzimas son proteasas y otras amilasas, por lo general estas enzimas estn contenidas en detergentes en polvo y actan a una temperatura sobre los 45C (Hagihara et al 2005 patent: 6916645).

5. Problemtica:La temperatura ptima de las amilasas comunes usadas en detergentes es de 25C. Como la curva de temperatura ptima presenta un mximo de actividad, que en este caso corresponde a 25C las amilasas pasado esta temperatura hacia una ms baja, disminuye la actividad enzimtica y por consiguiente disminuye la efectividad de las enzimas para remover la suciedad de las prendas. Esta es la razn por la cual el mismo detergente, con la misma formulacin, no acta con la misma efectividad en un lugar clido o de temperaturas moderadas como en un lugar cuyas temperaturas son constantemente bajas.Aqu entran en juego las amilasas psicrfilas, debido a que no existen detergentes que utilizan amilasas de estas caractersticas, estas enzimas poseen temperaturas ptimas de funcionamiento muy bajas. Especficamente una amilasa obtenida de una bacteria Pseudoalteromonas haloplanktis, la cual es posible encontrar en la antrtica, esta amilasa tiene una temperatura ptima de 4C y acta a pH fisiolgico lo cual la hace ideal para el uso en detergentes.5.1. Hiptesis:La adiccin de amilasas psicrfilas proveniente de Pseudoalteromonas haloplanktis a detergentes, mejorar la eficacia en la remocin de suciedad en prendas a bajas temperaturas.5.2. Objetivo general:Disear un detergente que funcione a bajas temperaturas de lavado utilizando alfa-amilasa psicrfila preveniente de Pseudoalteromonas haloplanktis.5.3. Objetivos especficos: Obtener la secuencia de la alfa-amilasa de Pseudoalteromonas haloplanktis desde una base de datos. Analizar la estructura de la enzima. Seleccionar el vector ms adecuado para sobre expresar la enzima. Seleccionar el microorganismo ms adecuado para la recepcin del vector. Realizar la composicin del detergente.

6. Materiales y Mtodos.Obtencin de la secuencia de la enzima alfa-amilasa de Pseudomona haloplanktis: Para obtener la secuencia de la enzima se busca la secuencia en trabajos publicados en la base de datos de NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/)Secuencia de la alfa amilasa de Pseudoalteromonas haloplanktis en formato FASTA.Nucletidos:AGGCTAAACTAGGGACAATTACCCTGATATACGCGCTATGCTGCGCTTGGTGAATGAAAAGGTGAAAAAATGTCTGGTTTTGTATTTAAACAATTTAAAGTTGAACACGACCACTGTGCAATGAAAGTTTCTACCGATGGCATTTTGCTTGGCGCATGGGCTAATTTAAGCGGTGCAAAGTCATTACTTGATATAGGCACAGGCACCGGCTTACTAGCATTAATGTGTAAGCAGCGCAGTAATGAGCTTGATATAACTCGGTAGAAATTGACGAAAGCGCCTATACCCAAGGCATTACAAAATGTAGCTAATAGTCCGTGGCCAACAATAAGTATTAAGCACCAAACTATTCAAAGCTTTAGTAGTGAAGTTAAGTTTGATGTTGTTTATCTCCAATCCACCGTATTTTAATCACAGTTTTAAAAGGCGATAATGCTGCGCGTAATACCGCGCGCCATACCGACGGCTTAAGTTTTGAAGAGTTAATAAATGCCTTTAAACGCTTAAGCCATAGTGGTTCTCGCTTTAGCTTAATACTCCCAAGCGTTGAAGGCGCATTATTTATAGAGCTTGCTACTCAAAATGGGCTTTATTTAAATGCTCATTGCCAAGTAAAAGCCACGCCTAATAAAGATATTAGCCGCAGTTTAATGGCATTTAGCTATGTAAAAAGCGATTTAGAATCATCAACCCTGTGTATTAGAAACTTAATAATACCTACACCGCTGATTATATAGCCCTGTGCAAAGCATTTTATTTGAAAATGTAAATTGCCAAGTTATGTAGGTTATCTAGTAATAAAGGATAATTTACCTATTATGCATACGTATTCAGTTTTTATTTAATCAATTCTCAATCTAGTGTTAACCACTTGTAAATAATGTCGAGTAGTTGTTTTGCTCGCTCAACAGTTGGATCACACACTATGAAACTCAATAAAATAATCACCACCGCAGGTTTAAGCCTAGGGTTGCTCTTACCGAGTATTGCCACAGCTACGCCCACCACATTTGTGCATTTGTTTGAATGGAATTGGCAAGATGTAGCGCAAGAATGTGAGCAATACCTAGGACCAAAAGGCTACGCTGCAGTACAGGTCTCGCCGCCTAATGAGCACATTACAGGAAGCCAATGGTGGACACGTTATCAGCCAGTAAGTTATGAACTGCAAAGTCGTGGCGGAAACCGTGCGCAGTTTATCGATATGGTAAATCGCTGTAGTGCAGCTGGGGTTGATATTTACGTTGATACGCTTATTAACCATATGGCAGCAGGAAGTGGCACAGGCACAGCGGGAAATAGCTTTGGTAATAAAAGCTTTCCTATTTATAGCCCACAAGATTTTCATGAAAGTTGTACCATTAATAGCTCTGACTATGGCAACGATCGCTACCGAGTTCAAAATTGTGAACTCGTTGGACTTGCCGATTTAGATACCGCTTCAAACTATGTACAAAATACCATTGCAGCATATATTAACGACTTGCAAGCTATTGGCGTAAAAGGCTTTCGGTTTGATGCTTCTAAACATGTTGCAGCAAGCGATATCCAAAGTTTAATGGCTAAAGTAAATGGCTCGCCAGTGGTTTTTCAAGAAGTGATTGATCAAGGTGGGGAGGCTGTTGGTGCCTCTGAATATTTAAGCACAGGTTTAGTAACTGAATTTAAATATAGCACTGAGCTTGGTAACACTTTTAGAAACGGCTCGCTTGCATGGCTGAGTAATTTTGGCGAAGGGTGGGGCTTTATGCCAAGCTCTTCTGCGGTGGTTTTTGTAGATAATCACGACAATCAACGTGGTCATGGCGGCGCTGGTAATGTAATTACCTTTGAGGATGGCCGCTTATATGACTTAGCCAATGTATTTATGTTGGCTTATCCGTACGGTTATCCAAAAGTAATGTCGAGTTATGATTTCCATGGTGATACAGATGCTGGTGGGCCAAATGTACCGGTACATAATAATGGTAACTTAGAGTGTTTTGCTAGTAATTGGAAGTGTGAGCATCGCTGGTCATATATTGCAGGCGGGGTCGATTTTAGAAATAACACGCCCGACAATTGGGCAGTAACAAACTGGTGGGATAACACAAATAATCAAATTTCATTTGGCCGAGGTAGCTCGGGTCATATGGCTATTAACAAAGAAGACTCAACACTTAGTGCAACTGTGCAAACCGATATGGCGCCAGGGCAATACTGTAATGTGTTAAAAGGCGAGTTGTCAGCTGATGCTAAAAGTTGTAGTGGCGAGGTTATAACGGTTAATTCCGACGGTACTATTAATCTTAATATTGGCGCTTGGGATGCGATGGCAATTCATAAAAATGCCAAGTTAAATACAAGTTCAGCGCCAAGCACTGAAAGTGACTGGCAGCGAACGGTTATTTTTATTAATGCACAAACACAAAGTGGACAAGATATGTTTTTGCGCGGTGGAATTGACCACGCTTATGCAAACGCAAATCTGGGTCGAAATTGCCAAACAAGTAATTTTGAGTGTGCAATGCCTATTCGTCATAATAATTTAAAAAACGTAACAACAAGCCCTTGGAAAGCAAATGATAACTACCTTGATTGGTATGGTATAGAAAATGGGCAAAGTAGCGAAGCAGAAGGTTCTGCTACCGACTGGACAACGAATGTTTGGCCTGCAGGTTGGGGCGCTGAAAAAACGCTAAACACAGATGGTTTTGGTGTAACACTATTAAATATATGGGGCGAACACTATTGGATGCTTGATGTGGATATGGATTGTAGTAAAGCGGTTAATGGATGGTTTGAACTAAAAGCATTCATTAAAAATGGCCAAGGATGGGAGACTGCTATTGCTCAAAACAATACACCTTATACAAGCACTAATCATATGGCGCAATGCGGAAAAGTTAATAAATTTGAGTTTAATAATTCAAGTGTAGTAATTCGTAGTTTTTAAAAGTAAACAAAAAAGCTCATATGAAAACCTGAACTAATGATTATTAGTTTAGGTTTTTTGCTTTTTAACCTGAACTCTGGTTAAGAGATTTACTAACATATGAATCAGGGTGATATTTAAATTTATTTTCTCTAGCCAGAGATTTTCAGTGAAAACAAGGCGAATTTACGCGTCAATAGCTGGCCTATTGCAAGTAAATTCAACGCAGTTAGCGCTGAAAATAGCTGCTCGAGATAGATTTATTATCCAGAGTTCAGGTTTATTATTTTAAGTACAGTGCTTTAATAGTGTGTTTATAAATCACCTGTTATGATTTAACCATTGGCCACTTAATTTTAAAGACAACACAATGAAAAAGTTAAATAAATTAGCATTACTTAGCACGCTAACAGCCACCATTTTTGCAAGCCAAGGTGTGTTTGCTGCTATTACGCCAGTAGGCCTTTGGAAAACAATTGATGAGGATACAAACCAAGCTAAGTCGGTATGTACGGTATTACCCAAACCAACGGTACTTTAAGCGGTAAAGTTGAAACTATTCTAGACCCTACAAAACAAAATGATATATGCAGTAAGTGTGATGATGAGCTAAA

Aminocidos:MKLNKIITTAGLSLGLLLPSIATATPTTFVHLFEWNWQDVAQECEQYLGPKGYAAVQVSPPNEHITGSQWWTRYQPVSYELQSRGGNRAQFIDMVNRCSAAGVDIYVDTLINHMAAGSGTGTAGNSFGNKSFPIYSPQDFHESCTINSSDYGNDRYRVQNCELVGLADLDTASNYVQNTIAAYINDLQAIGVKGFRFDASKHVAASDIQSLMAKVNGSPVVFQEVIDQGGEAVGASEYLSTGLVTEFKYSTELGNTFRNGSLAWLSNFGEGWGFMPSSSAVVFVDNHDNQRGHGGAGNVITFEDGRLYDLANVFMLAYPYGYPKVMSSYDFHGDTDAGGPNVPVHNNGNLECFASNWKCEHRWSYIAGGVDFRNNTADNWAVTNWWDNTNNQISFGRGSSGHMAINKEDSTLSATVQTDMAPGQYCNVLKGELSADAKSCSGEVITVNSDGTINLNIGAWDAMAIHKNAKLNTSSAPSTESDWQRTVIFINAQTQSGQDMFLRGGIDHAYANANLGRNCQTSNFECAMPIRHNNLKNVTTSPWKANDNYLDWYGIENGQSSEAEGSATDWTTNVWPAGWGAEKTLNTDGFGVTLLNIWGEHYWMLDVDMDCSKAVNGWFELKAFIKNGQGWETAIAQNNTPYTSTNHMAQCGKVNKFEFNNSSVVIRSF

Anlisis de la estructura terciaria de la enzima: Para analizar la estructura de la enzima se utiliza la base de datos de PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), luego se analiza la estructura 3D de la enzima utilizando Swissmodel (http://swissmodel.expasy.org/) o VMD (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/).Perfil de la protena:Nombre: Alfa-amilasa de Pseudoalteromonas haloplanktisPDB: 1AQHLongitud: 453 residuos.Cadenas: A (solo 1 cadena)Dominios: 2Estructura primaria de la protena:MKLNKIITTAGLSLGLLLPSIATATPTTFVHLFEWNWQDVAQECEQYLGPKGYAAVQVSPPNEHITGSQWWTRYQPVSYELQSRGGNRAQFIDMVNRCSAAGVDIYVDTLINHMAAGSGTGTAGNSFGNKSFPIYSPQDFHESCTINSSDYGNDRYRVQNCELVGLADLDTASNYVQNTIAAYINDLQAIGVKGFRFDASKHVAASDIQSLMAKVNGSPVVFQEVIDQGGEAVGASEYLSTGLVTEFKYSTELGNTFRNGSLAWLSNFGEGWGFMPSSSAVVFVDNHDNQRGHGGAGNVITFEDGRLYDLANVFMLAYPYGYPKVMSSYDFHGDTDAGGPNVPVHNNGNLECFASNWKCEHRWSYIAGGVDFRNNTADNWAVTNWWDNTNNQISFGRGSSGHMAINKEDSTLSATVQTDMAPGQYCNVLKGELSADAKSCSGEVITVNSDGTINLNIGAWDAMAIHKNAKLNTSSAPSTESDWQRTVIFINAQTQSGQDMFLRGGIDHAYANANLGRNCQTSNFECAMPIRHNNLKNVTTSPWKANDNYLDWYGIENGQSSEAEGSATDWTTNVWPAGWGAEKTLNTDGFGVTLLNIWGEHYWMLDVDMDCSKAVNGWFELKAFIKNGQGWETAIAQNNTPYTSTNHMAQCGKVNKFEFNNSSVVIRSF

pH ptimo: 7.0Temperatura ptima: 4C Funcin de la enzima: cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas.

Estructura secundaria de la protena alfa amilasa de Pseudoalteromonas haloplanktis:

Fuente: PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)

Estructura en 3D de la enzima alfa-amilasa de Pseudoalteromonas haloplanktis utilizando el software VMD 1.9.1, las alfa hlices se pueden observan de color verde y en color azul las lminas beta, para obtener la estructura se pego la secuencia de aminocidos en formato FASTA en el software VMD y se ajustaron las opciones grficas para observar las estructuras alfa hlices de color azul y las hojas beta de color verde.

Dinmica molecular. -amilasa de la bacteria Pseudoalteromonas haloplanktis es un paradigma para el estudio de los determinantes moleculares de las enzimas de adaptacin al fro. En particular, la enzima fue una de las primeras enzimas psicrfilas para el que se resolvi la estructura 3D, revelando la presencia de tres dominios estructurales distintos. Se ha sugerido que la alfa amilasa adquiere una estabilidad conformacional de baja y alta flexibilidad a travs de una reduccin o debilitamiento de las interacciones inter-e intra-dominio, as como cuenta con entalpa de activacin disminuido y una mejora concomitante en relacin a otras alfa amilasas de organismos mesfilos (Papaleo, et al 2011).

Seleccin de un vector adecuado al gen:Para ello se utilizar el programa vector (http://www.lifetechnologies.com/cl/es/home/life-science/cloning/vector-nti-software.html) y tambin se har uso del software Artemis (https://www.sanger.ac.uk/resources/software/artemis/).Construccin del vector.

Figura 1: Vector pET302 con cola de histidina con la enzima de intereses alfa amilasa de Pseudoalteromonas haloplanktis para transformacin de microorganismo seleccionado. Seleccin de un microorganismo adecuado:Utilizando apoyo bibliogrfico se seleccionar de acuerdo a criterios importantes para la expresin correcta del gen de amilasa psicrfila.Cultivo del microorganismo:Con el fin de obtener las grandes cantidades de la enzima, se cultiva el microorganismo seleccionado en un biorreactor. Realizacin fsica de los componentes del detergente:Una vez transformado el microorganismo selecto se pasar a la etapa final, donde se utilizaran los microorganismos transformados con el gen de amilasa en la preparacin de un detergente de lavado comn y se comprobar la eficiencia del detergente en la remocin de suciedad para lavados con aguas muy fras para ellos se utilizar un detergente con amilasa psicrofila basado en las patentes de Bettiol, 1998 U.S. Patent No. 5,783,54 y Speckmann Et al 2001 Patent No. 6380147.6.1. Flujograma.

7. Resultados.Obtencin de la enzima.En la etapa de cultivo se espera que la produccin de la enzima sea exponencial y que adems vaya acorde a la curva de crecimiento de la bacteria, el experimento consiste en medir el crecimiento bacteriano en ufc/mL en determinados lapsos de tiempo y a su vez realizar un ensayo enzimtico para observar la concentracin de la enzima alfa-amilasa.

Figura 2: grfico esperado sobre el crecimiento de la bacteria en contraste con la generacin de la enzima alfa amilasa.

Realizacin del detergente:Un vez que el detergente este hecho, se comprobar su eficiencia realizando un test, este consistir en la comparacin entre un detergente comn utilizado en lavados con aguas muy fras y el modelo de detergente con amilasas psicrfilas. Se espera que la eficacia en la remocin del mismo tipo de suciedad mejore utilizando el nuevo detergente debido a la resistencia a las bajas temperaturas de las enzimas utilizadas. En contraposicin el detergente no sera de tal eficiencia en aguas a temperaturas medias ni calientes, debido precisamente a las enzimas amilasas cuya temperatura ptima es 4C. Se espera una disminucin considerable en la eficiencia del producto, por debajo de un detergente normal a la misma temperatura. Por lo tanto su xito est dado en regiones de clima muy fro, cuyas aguas oscilan entre 0 y 10 C con el fin de no inhibir la actividad enzimtica. La composicin de este consiste bsicamente en sodio tri fosfato y sodio silicato, como anhidro, sodio carbonato, TAED el cual es un surfactante no inico, la alfa amilasa y proteasas en grnulos, mezclados de forma

8. Conclusin: La capacidad de los detergentes comunes para quitar suciedad es menor en climas fros, debido precisamente a la temperatura en que se encuentra el agua de lavado. el uso de enzimas psicrofilas en detergentes mejorar la eficiencia del lavado a bajas temperaturas. el detergente creado usando estas enzimas funcionan en temperaturas bajas a medias bajas, mas no en un lavado con agua caliente lo que denaturaria las protenas. el detergente creado requiere ser almacenado a una baja temperatura, para mantener en condiciones ptimas a las enzimas.

9. Proyecciones:El detergente elaborado usando enzimas que resisten las bajas temperaturas genera un aporte en lo domstico, ms an, la alfa amilasa de pseudoalteromonas haloplanktis puede generar una opcin para biorremediacin de desechos contenedores de materia orgnica, lo que repercute directamente al medio ambiente de forma positiva.

10. Referencias. Qian, M., Haser, R., Buisson, G., Duee, E., & Payan, F. (1994). The Active Center of a Mammalian. alpha.-Amylase. Structure of the Complex of a Pancreatic. alpha.-Amylase with a Carbohydrate Inhibitor Refined to 2.2-. ANG. Resolution. Biochemistry, 33(20), 6284-6294. Mikami, B., Degano, M., Hehre, E. J., & Sacchettini, J. C. (1994). Crystal Structures of Soybean. beta.-Amylase Reacted with. beta.-Maltose and Maltal: Active Site Components and Their Apparent Roles in Catalysis. Biochemistry, 33(25), 7779-7787. Norouzian, D., Akbarzadeh, A., Scharer, J. M., & Moo Young, M. (2006). Fungal glucoamylases. Biotechnology advances, 24(1), 80-85. Feller G., Gerday, C.H., 2003. Psychrophilic Enzymes: Hot topics in cold adaptation. Nature Reviews, Microbiology, 1: 200-208. Das, S., Singh, S., Sharma, V., & Soni, M. L. (2011). Biotechnological applications of industrially important amylase enzyme. International Journal of Pharma & Bio Sciences. Barhate, R. S., Subramanian, R., Nandini, K. E., & Umesh Hebbar, H. (2003). Processing of honey using polymeric microfiltration and ultrafiltration membranes. Journal of food engineering, 60(1), 49-54. Kirk, O., Borchert, T. V., & Fuglsang, C. C. (2002). Industrial enzyme applications. Current opinion in biotechnology, 13(4), 345-351. Darling, J. C., Kitundu, J. A., Kingamkono, R. R., Msengi, A. E., Mduma, B., Sullivan, K. R., & Tomkins, A. M. (1995). Improved energy intakes using amylase-digested weaning foods in Tanzanian children with acute diarrhea. Journal of pediatric gastroenterology and nutrition, 21(1), 73-81. Sato, H., Toyoshima, Y., Shintani, T., & Gomi, K. (2011). Identification of potential cell wall component that allows Taka-amylase A adsorption in submerged cultures of Aspergillus oryzae. Applied microbiology and biotechnology, 92(5), 961-969. Nushin Aghajari, Georges Feller, Charles Gerday, Richard Haser (1998)Structures of the psychrophilic Alteromonas haloplanctis -amylase give insights into cold adaptation at a molecular level. Elena Papaleo, Marco Pasi, Matteo Tiberti,Luca De Gioia (2011) Molecular Dynamics of Mesophilic-Like Mutants of a Cold-Adapted Enzyme: Insights into Distal Effects Induced by the Mutations Mertens, D. R. (2002). Gravimetric determination of amylase-treated neutral detergent fiber in feeds with refluxing in beakers or crucibles: collaborative study. Journal of AOAC International, 85(6), 1217-1240. Bettiol, J. L. P., Boyer, S. L., Jeffrey, J., Moss, M. A. J., Showell, M. S., & Thoen, C. A. J. K. (1998). U.S. Patent No. 5,783,546. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office. Khemakhem, B., Ali, M. B., Aghajari, N., Juy, M., Haser, R., & Bejar, S. (2009). Engineering of the amylase from Geobacillus stearothermophilus US100 for detergent incorporation. Biotechnology and bioengineering, 102(2), 380-389. Hagihara, Hiroshi (Haga-gun, JP), Kitayama, Kaori (Haga-gun, JP), Hayashi, Yasuhiro (Haga-gun, JP), Igarashi, Kazuaki (Haga-gun, JP), Endo, Keiji (Haga-gun, JP), Ozaki, Katsuya (Haga-gun, JP). 2005 Amylases United States Kao Corporation (Tokyo, JP) 6916645. Speckmann, Horst-dieter (Langenfeld, DE), Kottwitz, Beatrix (Duesseldorf, DE), Maurer, Karl-heinz (Erkrath, DE), Nitsch, Christian (Duesseldorf, DE) 2002 Detergents containing amylase and protease United States Henkel, Kommanditgesellschaft Auf Aktien (Duesseldorf, DE) 6380147.

11. Carta Gantt.

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