"SistemadeLecturaEléctricadeMicroarraysProteomicos"

DIANALISETTEBONILLAAGUILAR

TesisdeDoctorado

DoctoradoenIngenieríaElectrónica

Directores:

Dr.CesarFernandezSanchez

Dr.AntonioBaldiColl

DepartamentodeIngenieríaElectrónica

2013

MemòriapresentadaperaspiraralgraudeDoctorperDianaLisetteBonillaAguilar

AGRADECIMIENTOSMegustaríaexpresarmimásprofundoysinceroagradecimientoatodaslaspersonasqueconsu ayudahan colaborado en la realización de este trabajo, en especial a los doctores CésarFernández Sánchez y Antonio Baldi Coll, directores de esta tesis, por su orientación,seguimientoysupervisióncontinúa,perosobretodoporlamotivaciónyelapoyorecibidoalolargodeestosaños.UnreconocimientoespecialalaayudayapoyorecibidodeladoctoraMaríaDíaz,conlaqueme encuentro en deuda por su colaboración desinteresada y total disponibilidad paraasesorarmesiemprequehizofalta.TambiénmegustaríaagradecerprofundamentelaayudarecibidadeMaríaMallenquienhasidolabasedemuchosresultadospositivos.Quisiera hacer extensiva mi gratitud a todo el staff del Instituto de Microelectrónica deBarcelonaCNMy,muyespecialmentealGrupodeTransductoresQuímicosporsuamistadycolaboración.También quierodar las gracias al CSICpor permitirme obtener este titulo pormediode labeca JAE‐Predoc referencia: JAEPre_07_00725 y al proyecto MEC, TEC2007‐29637‐E/(Explora),conelquesefinancióestetrabajo.Y finalmente y no por ellomenos importante, un eterno agradecimiento a la comprensión,pacienciayapoyorecibidosdemifamiliaymisamigosquefueronlafuerzaparaqueestatesisseahoyunarealidad.Atodosellos,muchasgracias.

ABSTRACTAn electrical readout system of microarrays comprising an array of conductimetrictransducers, which enabledmultiplexed detection of up to 36 biological events on thesamesubstrate, is reported in this thesis. Similarly to fluorescent readoutcounterparts,regularglassslideswereappliedforcarryingoutthemicroarray.However,unlikethem,thepresentedsystemiscompactandrequiresasimpleandinexpensiveinstrumentation,thusbeingideallysuitedfordeploymentofbioarraydetectionapproaches.Othercompactelectrical readout systems previously reported are based on the immobilization of thespecific bioreceptors on the transducer surface, whichmake them single‐use and thusexpensive.Our systemcombines themerits of bothprevious electrical systemsand thefluorescencescannerapproaches.Anarrayof40μm‐pitchgoldinterdigitatedelectrodepairs(IDEs)wasfabricatedonglasssubstrates. Conductimetric measurements were carried out with these transducers byapplying urease‐based (urease labeled) immunoassay reactions. The hydrolysis of ureacatalyzedbyurease produces ionic species in solution that increase its conductivity. Inordertocarryoutsuchdetectionscheme,thebioarraywasdevelopedonaregularglassslidesubstrate,whichwas thenplacedover the IDEmicroarray leavinga fixedgapandalignedsothateachspotofthebioarrayfacedoneIDE.Therein,thedropletsofureasolutionwereplacedinthegaptocontacttheIDEsandthecorrespondingspotsofthebioarray.However, inthedevelopmentofthefirstapproach,somemajordrawbacks related todroplet evaporationandchemical cross‐talkbetweenadjacent droplets made the system to be far from achieving the performance offluorescentdetectionapproaches.Moreover,amicrodispenserwasrequiredtoaccuratelypositionthedroplets.Inasecondapproach,wefoundthesolutionforcircumventingthesedrawbacksandthedemonstration of the potential of the system as a real competitor against fluorescencebased systems in terms of analytical performance. An array structure of 36 PDMSmicrowellshavingavolumeof1.2μLwerefabricatedbymoldingandpositionedovertheIDEarray.ThegeometryofeachmicrowellincludesanO‐ringlikestructureandanemptyarea around it, which enabled first, to easily fill it without using any specificinstrumentation and second, to ensure its liquid tightness once the bioarray waspositionedoverit.Thisset‐upwasdemonstratedtocompletelyavoidtheevaporationandchemicalcross‐talkissues.Finally, a third approach is presented, where the readout automatized by means of amicrofluidic structure that includes the PDMS microwells together with those fluidiccomponentsthatenabledtheautomaticfillingwiththemeasuringsolutionaswellasthecleaning step of the system once a microarray was measured. Working in this wayimproves the throughput of the electrical readout system as well as enhanced itsreliabilitybyminimizingthemanipulationbytheuser.

RESUMENEnestatesissepresentaunsistemadelecturaeléctricademicroarraysquecomprendenuna serie de transductores impedimétricos con los cuales realizar la detecciónmultiplexadadehasta36eventosbiológicosenunmismosustrato.Al igualquecon losmicroarrays de lectura fluorescente, se han empleado sustratos de vidrio desechablespara la fabricación del microarray. Sin embargo, a diferencia de ellos , el sistemapresentadoescompactoyrequiereuna instrumentaciónsencillaydebajocoste, loquehacequeelsistemapuedasermuyútilpararealizarladescentralizacióndeestetipodemedidas analíticas. Otros sistemas de lectura eléctricos compactos reportadosanteriormentesebasanenlainmovilizacióndelosreceptoresbiológicosespecíficossobrelasuperficiedeltransductor,loquehacequeseandeunsolousoyporlotantocostosos.Nuestrosistemacombinalasventajasdelossistemaseléctricosanterioresylosescáneresdefluorescencia.El array de electrodos interdigitados (IDEs) se fabricó sobre sustratos de vidrio. Lasmedidas conductimétricas fueron realizadas con estos transductores mediante laaplicación de reacciones de inmunoensayo que emplean la ureasa como marca. Lahidrólisis de la urea catalizada por la ureasa produce especies iónicas en solución queaumentan su conductividad. Los microarrays se fabrican sobre portaobjetos de vidrioconvencional.Paralalectura,secolocasobreelmicroarraysobreelarraydeIDEsdejandounespaciodefijoentreambos,demodoquecadapuntodelmicroarraysealineaconsuIDEcorrespondiente.EnelprocesodemedidasedepositarongotasdesolucióndemedidaquecontienenureaqueponíanencontactoelIDEyelpuntocorrespondientedelmicroarray.Sinembargo,enunprimerotrabajosepresentaronalgunosinconvenientesimportantesrelacionadosconla evaporaciónde las gotas y el cross‐talk químico entre las gotas adyacentes debido amigracióndeespeciesiónicas,loquehizoqueelsistemapresentaseunascaracterísticasdesensibilidadylímitededetecciónsensiblementemáslimitadasquelasmostradasporlos sistemas de detección fluorescente. Por otra parte, se requería de unmicrodispensadorparaposicionarconprecisiónlasgotassobrelostransductores.Enunsegundotrabajo,seencontróunasoluciónpararesolverestosinconvenientesysedemostróelpotencialdelsistemaparaseuncompetidorreal,entérminosderendimientoanalítico, frente a los sistemas basados en fluorescencia. Dicha solución se basó en elempleounaestructuradePDMSqueincluye36micropocillosde1.2µLdevolumen, loscualessedisponensobreelarraydetransductoresparacontenerelvolumendesolucióndeureaypoderrealizar la lecturadecadapuntodelmicroarraydentrodeunacavidadcerrada. Con esta configuración se consiguió evitar por completo los problemas deevaporaciónycross‐talkquímico.Por último, se presenta un tercer trabajo donde se automatizó este sistema de lecturamediante la implementación de una estructura microfluídica que incluye el array demicropocillos de PDMS así como los componentes fluídicos necesarios para realizar elllenado automático de los mismos así como su lavado posterior una vez realizada lalecturadeunmicroarray.Deestaforma,semejoróelrendimientodelsistemadelecturaalavezquesufiabilidadalminimizarlamanipulaciónporpartedeunusuario.

INDICE

AGRADECIMIENTOSABSTRACTRESUMENCAPITULOI 1Introducción 1.1Microarraysysusaplicaciones 1 1.2SistemasdeLecturademicroarrays 10 1.3Deteccióndeimpedemetria 19CAPITULOII 34CAPITULOIII 36LecturaEléctricadeMicroarraysdeProteínasrealizadasenportaobjetosdevidrio 3.1Resumen 36 3.2Introducción 37 3.3Secciónexperimental 38 3.4Resultadosydiscusión 48 3.5Conclusiones 56CAPITULOIV 59ImplementacióndeunArraydeMicropocillosenelSistemadeLecturaEléctrica.AplicaciónalaDeteccióndeBoldenona 4.1Resumen 59 4.2Introducción 60 4.3Secciónexperimental 61 4.4Resultadosydiscusión 69 4.5Conclusiones 77CAPITULOV 78

Fabricación de un Dispositivo Fluídico para el Llenado Automático del Array deMicropocillos:AutomatizacióndelSistemadeLectura

5.1Resumen 78 5.2Introducción 79 5.3Secciónexperimental 80 5.4Resultados 84 5.5Conclusiones 87

CAPITULOVI 89

Conclusiones 89 

1  

CapituloI

INTRODUCCION

EnestecapítulosedescribenconceptosfundamentalesaplicadosenestetrabajodeTesisDoctoral.

1.1Microarraysysusaplicaciones

1.1.1Funcionamientogeneral:

Ladecodificacióncompletadelgenomahumanosehaconsideradocomouno de los mayores logros científicos de la humanidad. Ha permitidocaracterizarcadaunodelosgenesquecontieneelserhumano.Paracadagen se ha precisado las secuencias de ADN que lo conforman y se hadefinidosufuncióndentrodelorganismo[1].Unade las funcionesde los genes es sintetizarproteínas. Lasproteínasson componentes básicos de las células, son imprescindibles para elcrecimientodelorganismoy entre susmuchas funciones sedestacan laestructural, inmunológica, enzimática y homeostática, entre otras. Laproteómica es un campode investigación cuyo objetivo es identificar ycaracterizarlasproteínassintetizadasoexpresadasporungendentrodeun organismo. Ofrece una visión global e integral del estado de unaenfermedad y procesos celulares mediante el estudio del conjunto deproteínasdeunacélula,tejidouorganismoenunmomentodado[1].Los microarrays son una herramienta analítica fundamental para laproteómica. Se emplean para la detección e identificación de nuevasproteínasybiomarcadores.Unbiomarcadoresunamoléculaque indicauncambioenlaexpresiónoelestadodeunaproteínaquesecorrelacionaconelriesgoolaprogresióndeunaenfermedad,oconlasusceptibilidadde la enfermedad a un determinado tratamiento. Un biomarcadortambién puede ser cualquier otramolécula, por ejemplo, una hebra deADN mutado, que se pueda correlacionar con el estado de una

2  

enfermedad particular. No obstante, dentro de una célula existenmillonesymillonesdeproteínasygenesdiferentes.De forma concreta, unmicroarray esun conjuntode áreasopuntosdeensayo de pequeñas dimensiones (desde pocos nm a pocos mm)desarrolladossobreunsubstratoplano,detalformaquepermiterealizarmuchosensayosenparalelo,aumentandoenormementelavelocidadylacapacidad de análisis respecto a sistemas de análisis en serie. En laactualidadexistenmúltiplesformatosparamicroarraysquepermitenunanálisismultiplexadodediferentesparámetrosenunnúmeroelevadodemuestras simultáneamente [5]. Los microarrays de alta densidad sonensayos en paralelo donde se pueden inmovilizar un número muyelevado de biomoléculas de reconocimiento para diferentesbiomarcadores. De esta manera es posible analizar el perfil de unaenfermedado la interaccióndemilesdeproteínasconunmedicamentodeterminado. Esta técnica de alto rendimiento permite obtener undiagnósticoprecoz,sofisticadoydebajocosto[2‐4].Los microarrays permiten trabajar con muestras biológicas decomposición desconocida de muy variada naturaleza, desde células,tejidoslisados,sueros,etc.Elformatodemicroarraymáscomúnconllevala inmovilización de las muestras sobre el sustrato y la posteriorincubación de los puntos de ensayo generados con una solución quecontienenbiomoléculasdereconocimiento(obioreceptores)queseunende formaespecíficaa lamoléculaquesequiereanalizar (analito)yquepermitenrealizarladeteccióny/ocuantificacióndelamismaempleandoalgún método de análisis instrumental adecuado. Para realizar dichadetección las biomoléculas de reconocimiento están marcadas conespecies coloreadas o con propiedades fluorescentes oquimioluminiscentes vienen marcadas con moléculas que permitenrealizar la lectura del microarray [6]. De forma habitual se utilizanmarcas colorimétricas, fluorescentes o quimioluminiscentes para lalecturaópticadelarray [7]ypara la lecturaeléctricaseutilizanmarcasenzimáticas, magnéticas, o nanopartículas funcionalizadas [8], como seexplicarámásendetalleenlasección1.2.LaFigura 1muestraunesquemadeunmicroarray.

3  

Figura 1: Esquema de un microarray y su funcionamiento.  

Se han desarrollado microarrays para aplicaciones muy diversas,pudiendo clasificarse en función de las biomoléculas aplicadas: ADN,peptídicos, de proteínas, y celulares. Esta herramienta analítica se haexpandido más allá del campo de la genómica y la proteómica,revolucionandotambiénelámbitoclínico[9]yfarmacéutico[10].Enelcasodelagenómica,lasaplicacionesdelosmicroarraysvandesdela identificación de nuevos genes, sitios de unión de los factores detranscripción,cambiosenelnúmerodecopiasdeADN,hastaladetecciónde variaciones de la secuencia base [11]. En proteómica, se analiza elcontenido proteico, las interacciones proteína‐proteína, proteína‐ADNoproteína‐ligando[5].

Dondeestácreciendoelinterésporestatecnologíaesenelcampoclínico.Elmercado global demicroarrays fue valorado enEstadosUnidos en $2.6milmillones en2010y se esperaque alcance $5.6milmillones en2015;creciendoaunatasaanualdel16,7%.Estecrecimientoseatribuyealaumentode lasaplicacioneseneldiagnósticodelcáncerydeperfilesdeexpresiónasícomoelaugedelamedicinapersonalizada.

Los microarrays podrían constituir una herramienta poderosa paraponer en marcha la llamada “medicina a la carta”, en el pasado unautopía, pero a día de hoy está convirtiéndose en una realidad quepermitirá disminuir almínimo los efectos secundarios de los fármacos,tan destacables, por ejemplo, en oncología mediante el análisis de lasvariacionesgenéticasdelpaciente[2,12].

4  

Para la industria farmacéutica también son muy atractivas estastecnologíasquepermitenpodertestaragranescalanuevosfármacoscondiferentes dianas, e incluso, poder encontrar nuevas indicaciones odianasparafármacosyaexistentes[10].

ElprocedimientotradicionalparalosensayosmultiplexadosdeproteínashasidodurantedécadaselllamadoinmunoensayotipoELISA(delinglésenzyme‐linked immunosorbent assay), realizado comúnmente sobreplacas de poliestireno con una matriz de 96 pocillos, cada uno de loscuales conunvolumende350µl.Lamayoríade losELISAsebasanenmodos de detección óptica, fluorescente o quimiluminiscente, conequiposde laboratoriovoluminosos.Laapariciónde losmicroarrayshapermitido el escalado de este tipo de ensayos. Estas herramientasanalíticas han reducido drásticamente los volúmenes de muestrarequeridos para realizar un análisis, aumentado significativamente elnúmerodeparámetrosquesepuedenanalizarsimultáneamenteenunamuestraasícomoincrementadoengranmedidalafrecuenciadeanálisis.Enunportaobjetosdevidrio,conlasherramientasadecuadas,esposibleinmovilizar 50.000 muestras de 0.2 µl cada una, pasando así de 96pocillos en las placas de ELISA amiles de puntos, los cuales requierenvolúmenes para todo elmicroarray tan pequeños como10 µl. Como sepuedeobservarenlaFigura2,elmundodelosmicroarrayshaabiertolaspuertas a la miniaturización de los inmunoensayos y con ello eldesarrollodesoportesparasufabricaciónysistemasapropiadosparasulectura[1].

Figura2:MicroarraydeADNdelaempresaArrayitquecontienenlos25.000genesdelcuerpohumano.

5  

Porúltimo,unaventajaañadidadelosmicroarraysesquepuedenllegaraser dispositivos “Point‐of‐Care”, es decir, dispositivos de análisis dediagnóstico inmediato donde con una muestra de sangre o saliva delpacientesepuedeobtenerunanálisisrápidodelparámetroquesequiereobservarsinnecesidaddellevarlamuestradelpacienteytratarlaenunlaboratorioespecializado,loqueimplicatiemposdelargosdesdelatomade muestra hasta la obtención de los resultados del análisis de dichamuestra[4],[8].

1.1.2Bioensayos

Hasta la fecha, los microarrays se basan en dos tipos de bioensayos,principalmente:directoe indirecto [13]. Los indirectospuedensera suvez, competitivos y no competitivos, dividiéndose a su vez los nocompetitivos en los llamados “forward”y “reversephase”.UndiagramadeestaclasificaciónserecogeenlaFigura3.

Figura3:Formatosdebioensayoaplicadoseneldesarrollodemicroarrays.

En el ensayo directo, como se muestra en la Figura 4, se modifica elsustratoconel receptorselectivo (elementodereconocimiento),el cualinteraccionaconelanalitoyen lamuestra,yesta interacciónpuedeserdetectada directamente mediante un cambio de masa, índice derefracción,conductividad,opH,entreotros[13].

Ensayos

Directo

Indirecto

Competitivo

No Competitivo 

"Forward"

"Reverse Phase"

6  

Figura4:Esquemadeunbioensayodirecto.

Enelensayo indirectoserealizaunareacciónadicionalparadetectar launiónentrelabiomoléculadereconocimientoyelanalito.Estareacción,quepuedesercompetitivaonocompetitiva,incluyeunreactivomarcadonecesario para realizar la lectura del ensayo. El tipo de lectura de estemicroarraydependedelanaturalezadelamarca[13].

En el caso de los ensayos competitivos, como se puede observar enlaFigura5,elanalitocompiteporlabiomoléculadereconocimientoconelmismo analitomarcado, el cual se añade en una concentración fija a ladisolución.De esta forma, cuantomayores la concentracióndel analitoenlamuestra,menoreslaconcentracióndeanalitomarcadoqueseunealsustrato,ymenoresentonceslaseñalregistrada.Porlotantolaseñalobtenida es inversamente proporcional a la concentración del analito[13].

Figura5:Esquemadeunformatodebioensayocompetitivo.

En los bioensayos no competitivos el analito reacciona con unabiomolécula de reconocimiento inmovilizada sobre el sustrato, para a

Biomolécula de 

reconocimiento Sustrato        

Analito           Otros componentesde la muestra

Biomolécula de 

reconocimiento Substrato      

Analito                          

Otros componentesde la muestra

Analito 

marcado 

7  

continuación tener lugar una segunda reacción con otra biomoléculamarcada. En este caso la señal registrada, debida a la presencia de lamarca,esdirectamenteproporcionala la cantidaddelanalito [13].Estetipo de ensayos son los más comunes (Figura 6) y se conocencomúnmentecomoensayostipo“sándwich”.

Figura6:Esquemadeunensayonocompetitivo.

Aunquesehandesarrolladomúltiplesformatosparalosbioensayostiposandwich,sondoslosmásgeneralizados:“Forward”y“Reversed‐phase”.

En el casode los “Forward”, como sepuedeobservar en la Figura7, seinmovilizan diferentes biomoléculas de reconocimiento en la superficiedel microarray para después ser incubado todo el microarray con unamisma muestra y de esta manera detectar múltiples parámetros paradichamuestra[4].

Figura7:Esquemadeunensayonocompetitivo“forward”.

Muestra 

Biomolécula de 

reconocimiento 

Substrato                      

Analito       

Otros componentes de la muestra 

Biomolécula 

marcada 

Substrato       

Biomoléculas  de 

reconocimiento           

8  

Enlosensayostipo“Reversed‐phase”,comosepuedeverenlaFigura8,seinmovilizan múltiples muestras en la superficie del microarray, que seincubanposteriormente conunasolabiomoléculadeuniónespecíficayasí analizar simultáneamente un único parámetro para diferentesmuestras[4].

Figura8:Esquemadeunensayonocompetitivo“reversed‐phase”.

1.1.3Eventodebioreconocimiento

En un organismo vivo tienen lugar de forma natural multitud deinteracciones biológicas entre biomoléculas, siendo probablemente lasmásconocidaslasquetienenlugarentreunanticuerpoproducidoporelsistemainmunitario deunorganismoyunantígenoomoléculaextrañaal mismo, así como las reacciones de hibridación entre secuenciascomplementarias de nuestro material genético. Ambas han sidodesarrolladasinvitrodurantedécadasparaladetecciónycuantificacióndemoléculasdeinterés.

ReacciónANTIGENO‐ANTICUERPO

Los anticuerpos, también conocidos como inmunoglobulinas (Ig), sonproteínas. Su función biológica es identificar las moléculas extrañas ymarcarlasparasuposteriordestrucción.Lasmoléculasreconocidasporlos anticuerpos se llaman antígenos. Prácticamente, cualquiermoléculaexternaalorganismovivopuedeserreconocidacomounantígeno.Cadaantígeno se unen con su anticuerpo en una interacción altamenteespecífica[14].

Substrato       

Biomolécula de unión 

especifica Marcada 

Diferentes 

muestras  

9  

DNA‐cDNA

Elácidodesoxirribonucleico(DNA)esunabiomoléculaque formapartede todas las células y algunos virus. Contiene la información genéticausadaeneldesarrolloyelfuncionamientodelosorganismosvivos,yesresponsabledesutransmisiónhereditaria.

Desde el punto de vista químico, el DNA es un polímero, con unaestructuradedoblehélice.Cadahebradeladoblehéliceseconocecomocadena simple de DNA. Cada cadena está formada por nucleótidos quecontienen cuatro tipos de bases nitrogenadas diferentes (adenina,guanina, timina y citosina), las cuales, para formar la doble hélicainteraccionan de forma complementaria con las bases presentes en lacadenacomplementaria,detalformaquelaadeninaseunealaguanina,y la timina a la citosina (Figura 9). La disposición secuencial de estascuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la informacióngenética. Esta interacción altamente selectiva se ha empleado in vitroparadetectarmutacionesenelcódigogenéticodeunservivo.

Figura9:EsquemadelamoléculadeDNA

1.1.4Estrategiasdeinmovilizaciónselectivadebiomoléculasaunsubstrato

Lossustratoscomúnmenteempleadosenlapreparacióndemicroarrayssondevidrio,sinembargo,losplásticosymembranaspoliméricasestánganando popularidad. La inmovilización estable de biomoléculas sobredichossustratosconllevalamodificaciónpreviadelosmismosconalgún

hebra de DNA  

hebra de DNA complementaria DNA de doble hélice

10  

reactivo que aporte una funcionalidad química adecuada [1]. Si noscentramosenlossustratosdevidrio,lamodificaciónmásextendidaeslasilanización empleando organoalcoxisilanos que permiten la obtencióndesuperficiesmodificadascongruposcomoaldehídooepoxi(Figura10)aloscualessepuedenunirdirectamentelasbiomoléculasatravésdesusgruposamino.Dichauniónesdetipocovalenteyesmuyestable.

Figura10. Silanización de un sustrato de vidrio con un epoxi‐silano y posterior unióncovalente aunabiomolécula, en este casounanticuerpo, a travésde sus grupos aminoprimarios.

Algunos microarrays emplean geles, como la poliacrilamida, el cualabsorbe directamente las biomoléculas. Esta técnica se utiliza para lafabricacióndearraysde3dimensionesdondees importanteanclarunagran cantidad de biomoléculas en la misma área y mantenerlas en unmedio húmedo para impedir su desnaturalización. Este procedimiento,sin embargo, encarece sensiblemente el coste de los microarraysdesarrollados[1].

1.2SistemasdelecturademicroarraysElprogresoenlatecnologíaparaleermicroarraysdependedeldesarrollode métodos e instrumentos cada vez más precisos, sensibles, baratos,automatizables y con capacidad para la detección de múltiplesparámetros en la muestra de unmismo paciente. Estos sistemas estánligados a la marca que se utilizan para la lectura, pudiendo ser

11  

principalmentedetipoópticooeléctrico.EnlaTabla1sepuedeobservardiferentestiposdesistemasdelectura,queseexplicaranmásadelante.

Tabla1:Tiposdesistemasdelecturaparamicroarrays

1.2.1SistemasÓpticosLos métodos de lectura de microarrays basados en sistemas ópticos,utilizan dispositivos capaces de detectar un cambio en las propiedadesópticas talescomo laabsorción, fluorescencia, luminiscenciao índicederefracción,entreotros.Sonlosmásimportantesydesarrolladosquehayhastaelmomento.Tienengranaceptaciónenelanálisisde importantesbiomarcadores de cáncer y de otras enfermedades debido a su buenasensibilidadybajolímitededetección[8,15].

A) MICROARRAYSFLUORESCENTESLa detección de biomarcadoresmediante espectro de fluorescencia selleva acabocuando labiomoléculaquedetectaelanalitoestámarcadacon un fluoróforo. Un fluoróforo es el componente de unamolécula, amenudo su grupo funcional, que absorbe energía en una determinadalongitud de onda y re‐emite esta energía en una longitud de ondadiferente,peroespecífica [16]. La lectura sehacea travésde la imagendelmicroarray,dondeseestimulaelfluoróforoconunalongituddeondaespecífica provocando una emisión de luminiscencia a otra longitud deonda,fácilmenteregistrable[17].Lacuantificacióndelafluorescenciade

Sistema de lectura de microarrays

Óptico

•Fluorescentes

•Quimioluminicentes

•Colorimétricos

•Resonancia de Plasmón Superficial 

Eléctricos

•Conductimétricos

•Electroquímicos

Otros

•Magnéticos

•Mecánicos

12  

cada punto del microarray se corresponde con la concentración delanalito[8].Existenmuchosinstrumentosparamedirmicroarraysdefluorescencia:Microscopio de Fluorescencia: en este microscopio, la luz de unadeterminada longituddeondase transmitea travésdeuncondensadorespecializadoqueseconcentralaluzenunhazmuyestrecho.Cuandolaluzincideenelmicroarray,losfluoróforosseexcitanyempiezanaemitirluz.Laimagenresultantesepuedeinspeccionarvisualmenteoalmacenarcon una cámara de CCD para después ser analizadamediante software[17].MicroscopioConfocal:esunmicroscopioqueempleauna técnicaópticadeimagenparaincrementarelcontraste.Utilizaun"pinhole"(diafragma)espacial que elimina la luz desenfocada. Sólo la luz que está dentrodelplano focal puede ser detectada, demodo que la calidad de imagen esmuchomejor. Como sólo se ilumina un punto cada vez, se requiere un“scanning” de todo lamuestra para poder obtener la imagen resultante[17].ScannerdeDiscodeNipkow:elfuncionamientoessimilaralmicroscopioconfocal,conladiferenciaqueestesistemapuedeanalizarvariospuntossimultáneamente.Laluzincidenteseproyectasobreundiscoenrotaciónque contiene múltiples líneas de pequeños "pinholes" colocados enespiral.Lafluorescenciaemitidadesdecadapuntovuelveatravésdelosmismos"pinholes"yesproyectadasobreunacámaradeCCD[17].Existenotrossistemasquesebasanen losmencionadosanteriormente,con mejoras tecnológicas como es el caso de los escáneres láser debarrido que se basan en el escáner de disco donde pueden lograrvelocidades compatibles con la creación de videos y así producir unmayor rendimiento en la calidad de la imagen. Estos sistemas utilizanMEMSbasadosenespejosdebarrido[18].

B) MICROARRAYSQUIMIOLUMINICENTESSe basan en el empleo de una biomoléculamarcada con un catalizadorcapaz de oxidar sustancia como el luminol, cuyos productos de lareacción son luminiscentes. Al igual que en casos anteriores,  la imagenresultante de este tipo de sistemas se almacenamediante una cámaraCCDparaseranalizadadespuésmediantesoftware[19].

13  

C) MICROARRAYSCOLORIMETRICOSComounmétodoalternativoalafluorescenciaolaquimioluminiscenciadescritos anteriormente, aparecen los sistemas colorimétricos. Estesistemaesutilizadoenmicroarraysmarcadosconnanopartículasdeoro,por ejemplo. El oro al ser un metal refleja la luz. Las propiedadesquímicasdelorosepuedenaprovechartambiénparaamplificarlaseñal.Paraesto,despuésdeleventodebioreconocimientoseagreganitratodeplata y un agente de reducción. La nanopartícula de oro actúa comocatalizador de la reacción de reducción de los iones de plata en platametálica, precipitando sobre lasnanopartículasdeoro. Lasmanchasdeplataenlospuntosdelmicroarraysonclaramentevisibles.LaimagenseobtienemedianteunescánernormalosimplementeunacámaradeCCDconunaluzapropiada.Laventajaquetieneestemétodofrentealosdosmencionadosanteriormenteessubajocoste.Laplatadepositadatienelacaracterística que refleja muy bien la luz en el espectro visible, y estopermiteelusodelectoresbasadosenelprincipiodereflexióndela luz.Otra ventajade estemétodo esque laplatadepositada esmuyestable,estohacequeelmicroarraysepuedaalmacenarduranteunperíodolargodetiempo[20].

D) MICROARRAYSDERESONANCIADEPLASMONSUPERFICIAL(RPS)

Este sistemade lectura esuna importante alternativa a losmétodosdeanálisis químico clásicos. Permite la realización de medidas en tiemporeal con gran sensibilidad. Su principal ventaja es que se trata de unamedidadirecta.Noesnecesarioelempleodereactivosmarcados.Elgraninconveniente de estos sistemas es el costoso detector óptico que senecesitaparalalectura[21].Laresonanciadeplasmónsuperficialesunfenómeno óptico que permite la detección de cambios de índice derefracción en las proximidades de la superficie de separación entre unmetalyundieléctrico.Laluzqueincideenlainterfaseentreunmetalyun dieléctrico provoca la excitación de un plasmón superficial para undeterminado ángulo de incidencia de dicha luz (llamado ángulo deresonancia). El evento de bioreconocimiento produce un cambio en elángulo de resonancia y este cambio es proporcional a la concentracióndelanalito[8].Enla

14  

Figura11sepuedeobservarelesquemadeundispositivodeRPSparalalecturademicroarrays,dondelaluzincidentequeprovienedeunafuentede luzblancacolimada,pasaa travésdeunpolarizadorquegeneraunaluzpolarizada.Estaluzpolarizadaincideenunprismadealtoíndiceyenlamuestra, colocados en un ángulo de incidencia óptimo. Cuando tienelugar el evento de reconocimiento, la luz reflejada pasa a través de unfiltroysefocalizaenunacámaraCCD[22].

Figura11:Esquemadelprincipioderesonanciadeplasmónsuperficial.

1.2.2SistemasmagnéticosLos sistemas de detección basados en transductoresmagnetoresistivosutilizan lamisma tecnología de los lectores de discos duros, donde losspin‐valvespresentanunefectomagnetoresistivo,esdecir,unfenómenocuánticodondeuncambioenelcampomagnéticolocalinduceuncambioenlaresistenciadelosdiscosdebidoaladispersióndelosspines.

MICROARRAY DE SENSORES DE MAGNETORRESISTENCIAGIGANTE(GMR)

GMRcuantifican launióndebiomoléculasdeuniónespecíficamarcadasmagnéticamente a proteínas o cadenas de DNA que se encuentraninmovilizadasenelsustrato.Detectanelcampodedispersióndelamarca

 

Prisma      

Luz reflejada          

Luz incidente       

Au Array             Dieléctrico                    

Polarizador          

Filtro       

15  

magnética para inferir el número de analitos capturado. Tienen lacapacidad de detectar y cuantificar la cinética de unión antígeno‐anticuerpoo las interaccionesproteína‐ADNdeunensayomultiplexadocon limitesdesensibilidad inferioresa losobtenidosmediantemétodosdedetecciónóptica[23].

Las partículas magnéticas se han utilizado durante muchos años enbioensayos. Estas se pueden modificar fácilmente con diferentesbiomoléculas. Inicialmenteestaspartículas seutilizaronparasepararyconcentrar analitos, siendo su uso más común hoy en día lainmovilización de biomoléculas en sustratos para la fabricación debiosensores[24].

1.2.3Sistemasmecánicos

ARRAYDEMICROCANTILEVERSEste sistema de lectura es capaz de detectar además del evento dereconocimiento, las fuerzas implicadasen la interacciónmolecular.Paradetectarelanalitose inmoviliza labiomoléculadereconocimientoen lasuperficiedeunapalance(cantiléver).Cuandotiene lugar la interacciónconelanalitoseproduceuna flexióndelcantiléverquesepuedemedireléctricamente mediante una técnica de lectura piezoresistiva. Lasmicropalancas también pueden funcionar en elmodode frecuencia deresonanciadonde sedetecta el cambiodemasadebido a la interaccióncon el analito como en la frecuencia de resonancia de las mismas. Sinembargo,laamortiguacióndelafrecuenciaderesonanciadeloslíquidoshacequelaresolucióndeestetipodemediasnoseamuybuena[25].

SENSORESDESUPERFICIEDEONDAACÚSTICA(SAW)Elprincipiodefuncionamientodeestossensoressebasaenlamediciónde vibraciones mecánicas que se propagan bajo la superficie depiezoeléctricos sólidos a una frecuencia de resonancia. La velocidad delasSAWessensiblealoscambiosenlamasaquetienenlugarenlazonaactiva, a la viscosidad del material aplicado y a la temperatura de lasuperficie. Un esquema de un sistema basado en el efecto SAW semuestraenlaFigura12.

16  

Figura12:“SAWdelay‐line”[26]

Setratadeunaestructuradenominada“SAWdelay‐line”,queincluyedoselectrodosinterdigitadosfabricadossobreunsubstratopiezoeléctrico.Latensiónsinusoidal aplicadaa la entradade loselectrodos se traduceenuna tensióndeoscilaciónmecánica, formandounaondaacústicaquesepropagaen lasuperficiedelmaterialpiezoeléctrico.Laondaacústicaseconvierte de nuevo a la salida de los interdigitados en una tensiónsinusoidal con diferente frecuencia y amplitud. El evento debioreconociemiento que se produce sobre la superficie del sustratopiezoeléctricopuederesultarenuncambiomasadetectableporestetipodedispositivos[26‐27].

1.2.4SistemasEléctricosTal y como se ha descrito arriba, los microarrays constituyen unasherramientas analíticas muy poderosas pero presentan todavíaimportantes limitaciones asociadas con la lecturaópticade losmismos.Por ejemplo, los escáneres para lectura óptica son caros yvoluminosos[15].Unaalternativaalossistemasdelecturaópticos,queseviene investigando intensamente en los últimos años, es la lecturaeléctrica de los microarrays, normalmente, empleando matrices detransductores amperométricos o conductimétricos que convierten unevento químico asociado con la concentración del analito en una señaleléctrica[28]‐[29].

17  

Estetipodesistemaspodríanjugarunpapelimportanteeneldesarrollode la próxima generación de dispositivos “Point‐of‐Care” para eldiagnósticomolecular,yaquepermitensu integracióncondispositivosmicrofluídicosytecnologíasdetelemetría[30].

La mayoría de los sistemas de lectura eléctricos son de tipoelectroquímico, es decir, están basados en el análisis de reaccioneselectroquímicasque tienen lugar en la interfase entreun electrodoy ladisolución de medida. Sin embargo existe un existe un grupo másreducido de sistemas basados enmedidas puramente eléctricas, comopuedenserlaconductvidadocapacidaddeunasolución.Acontinuaciónse describirán algunos ejemplos de sistemas de lectura eléctricos paraarrays.

SISTEMASCONDUCTIMETRICOS(Conductividadeléctrica)

Arraybasadoenestructurasde“Nanogap”Esunsistemadelecturaquedetectacambiosdeconductividadeléctrica.Este sistema está formado por electrodos de microbandas de oroalineadosverticalmenteencombinacionesortogonales(Nanogap),comosepuedeobservaren laFigura13.Estaestructurasehaempleadoparadetectar secuencias de DNA. En la parte inferior del Nanogap seinmoviliza unahebradeDNA, y en la parte superior se inmoviliza otrahebraquecontienelasecuenciadeinterés.Cuandoseincubalamuestra,tiene lugar lahibridacióncon lasdoshebras, formandounpuente, talycomo se ilustra en la Figura 13. Finalmente se realiza una etapa demetalizaciónde lahebrahibridada, la cualproduceun la conductividadeléctrica entre los dos electrodos que forman el nanogap, el cual esdirectamenteproporcionalalaconcentracióndelahebra.Losautoresdeestetrabajolodescribencomounsistemasimple,rápidoysencilloparala deteccióndeRNAmensajero sin necesidadde amplificaciónporPCR[31].

18  

Figura13:ArraydeNanoGaps.Ilustraciónesquemáticadelosdospasosdehibridaciónyelmecanismodetransduccióneléctrica[31].

SISTEMASELECTROQUÍMICOSLossistemasdelecturabasadosenfluorescencia,apesardeserlosmásestudiados y extendidos, tienen importantes limitaciones, entre las quecabe destacar una instrumentación costosa y de alta precisión, y lanecesidad de desarrollar sofisticados algoritmos numéricos parainterpretar losdatos, loquehacequesuusose limitea laboratoriosdeanálisisclínicocentralizados[32].Lossistemaselectroquímicosrequierendeuna instrumentaciónsencillaybarataynorequierendetratamientosdeseñalsofisticados,siendoalavezmuysensibles.Lamayoríadeellossebasanenelempleodemarcaselectroactivas unidas a biomoléculas, las cuales pueden ser detectadassobreelectrodossólidosylaseñalquegeneranserelacionadirectamentecon la concentración del analito. [33]. A continuación se mencionaranalgunosejemplosdesistemaselectroquímicos.ElectraSense™Este un sistema de detección electroquímica comercial basado en elempleodeunamarcaenzimática,laperoxidasaderábanosilvestre(HRP,del inglés horseradish peroxidase), la cual cataliza la reducción deperóxido de hidrógeno a la vez que tiene lugar la oxidación de unmediador de transferencia de carga. Como mediador se emplean

19  

moléculas orgánicas pequeñas como la tetrametilbenzidina (TMB). ElproductodeoxidacióndelaTMBsepuededetectarelectroquímicamente.El sistema está constituido por un dispositivo que contiene 12.544microelectrodos individualmente direccionables, en una matriz desemiconductores. Los electrodos se modifican con el elemento debioreconocimiento adecuado, donde posteriormente tienen lugar lasreacciones biológicas necesarias. Finalmente tiene lugar la detecciónelectroquímicay lacorrientegeneradadebidoa laelectro‐reduccióndelproductodeoxidacióncatalíticadelTMBesdirectamenteproporcionalalaconcentracióndelanalito[34].ArraydeMicroelectrodosAmperométricosEste sistema consiste en un microarray de electrodos amperométricoscolocadosenunsistemafilacolumnasobredossustratosdevidrio.Cadapar de electrodos está formado por dos bandas de platino dispuestasortogonalmente,comosepuedeobservarenlaenlaFigura14.El eventodebioreconocimiento se llevaa caboenel espaciointermedioentreloselectrodos.Estearraysehaempleadojuntoconunbioensayoqueemplea la la fosfatasaalcalinacomomarcaenzimática, lacualhidrolizaelsustrato4‐aminofenilfosfatoparageneral4‐aminofenol,el cual se oxida selectivamente a un potencial adecuado. La corrientegenerada en este proceso de oxidación se registra con cada par deelectrodosdeplatino[35].Basados en un modo de transducción similar, basado en el empleo defosfatasa alcalina, se ha desarrollado unmicroarray que incorpora unamatriz de electrodos interdigitados y procesos de “redox cycling” paraamplificarlacorrientedeoxidacióngenerado[36]1.3.DetecciónImpedimétrica

Es otro sistemade lectura eléctrica, la cual, por la relevancia que tieneparaeltrabajopresentadoenestaTesis,sedescribeconmásprofundidadenesteapartado.

20  

Figura14:Arraydemicroelectrodosdireccionables.Elensayosellevaacaboenlospuntosdeunióndeloselectrodosylamarcaenzimáticautilizadaeslafosfatasaalcalina.

La espectroscopía de impedancias se ha aplicado como técnica dedeteccióneléctrica/electroquímicaysebasaenlaaplicacióndeunseñaleléctricaperiódicadepequeñaamplitud,yaseatensiónocorriente,y lamedida de la corriente o la tensión alterna correspondiente,respectivamente..A pesar de ser un sistema muy sensible e informativo, la difícilinterpretación de los datos de impedancia ha limitado durante años suexpansión. A diferencia de losmétodos electroquímicos convencionalesque suministran directamente la información relevante del sistema, losdatos obtenidos de los sistemas impedimétricos son más difíciles deinterpretar. El análisis de los datos por lo general implica el uso decomplejas expresiones matemáticas que modelan los procesos físico‐químicos queocurren en el sistema.El desarrollode software simple ycomercialparael análisisde losdatosha favorecido la implementaciónde este método. Por lo tanto, el interés en la espectroscopia deimpedancia se ha incrementado demanera exponencial, llegando a serextremadamente popular en la investigación y ciencias aplicadas. En laactualidad,laimportanciadeestatécnicaemergenteenlacienciaesmuyaltayelnúmerodepublicacionesrelacionadasconestetipodedetecciónseincrementaanualmente.

Electrodos           

Electrodos           

Analito marcado con 

una oxidoreductasa       

21  

A continuación, se explicarán algunos conceptos que ayudan a lainterpretación de los datos y el empleo de parámetros eléctricosextraídos de los espectros de impedancias como señales analíticas enmicroarrays.1.3.1EspectroscopiadeImpedanciasComoseha indicadomásarriba,sebasaen laperturbacióndelsistemacon un impulso eléctrico (corriente o potencial) y el estudio de larespuesta obtenida (potencial o corriente, respectivamente). Ladependencia entre la perturbación aplicada y la respuesta generadapuede suministrar información cinética y termodinámica delexperimento.En laespectroscopiade impedancias,seutilizantres tiposdeestímuloseléctricos:

1. Tensióndepaso,dondeseaplicaunatensión[ 0, 0 0],y semide lacorriente resultante, la cualvaríaenfuncióndeltiempo .

2. Ruido aleatorio (blanco) de tensión, donde se aplica una señal compuesta por ruido aleatorio y se mide la corriente

resultante.Paraestecasolosresultadosseanalizaneneldominiode la frecuencia por medio de un análisis de transformada deFourier,quepermitelaobtencióndelaimpedancia.

3. Frecuencia única de tensión o corriente, donde se mide laimpedancia directamente en el dominio de la frecuenciaaplicandouna tensiónauna frecuenciadeterminadaymidiendoel cambiode fasey la amplitudde la corriente resultantea estafrecuencia.

A continuación se evaluará la perturbación mediante un potencialsinusoidal (v, en V) de amplitud pequeña (V, en V) oscilando a unpotencial fijo (CorrienteDirecta (DC), enV) conuna frecuencia angular

(=2f,dondefeslafrecuenciaenHz).

sin (1)En lossistemaselectroquímicos, la respuestadelsistemapor logeneralsigue la naturaleza de la señal de excitación, por lo tanto, una señal

22  

sinusoidaldetensióngeneraunarespuestasinusoidaldecorriente(i,en

A),perocondiferenteamplitud(I,enA)ydiferentefase(t+,dondeeselángulodefase,enradianes):

sin ∅ (2)Pordefinición, laresistencia(RenΩ)deunelementoeslaoposicióndeeste elemento al flujo de corriente eléctrica. Consecuentemente, laimpedancia(Z(), in)puedeserentendidacomolaresistenciadelossistemas complejos, donde, en lugar de corriente directa, se aplicacorriente alterna. De hecho, la impedancia es un conceptomás generalque la resistencia ya que toma en cuenta la diferencia de fase entre latensión y la corriente. Teniendo en cuenta la señal de excitación y larespuestadefinidas en las ecuaciones (1) y (2), la leydeOhmdefine laimpedanciacomo:

∅

∅(3)

Con el fin de facilitar la representación y la interpretación de datos, laexpresiónde impedanciageneralmentesesimplificausando lanotacióndelosnúmeroscomplejos.

∅ ∅ (4)

cos sin (5)

cos ∅ sin ∅ (6)

donde √ 1.En general la impedancia cambia con la frecuencia, salvo los sistemaspuramenteresistivos.Poreso,enestetipodemedidassesuelehacerunarepresentacióngenerandoelespectrodeimpedancia,quesedefinecomolaimpedanciamedidaenunrangodefrecuenciasdeterminado[37].Lasdosformasmáscomunesdegraficarelespectrodeimpedanciasson:EldiagramadeNyquist(Figura15),queseobtienealrepresentarlapartereal de la impedancia frente a la parte imaginaria. La parte real se

23  

representaenelejedeabscisasyenelejedeordenadasgeneralmenteserepresentalaparteimaginariacambiadadesigno.

Figura15.DiagramadeNyquist

EneldiagramadeNyquist,laimpedanciasepuederepresentarcomounvectordemagnitud| |.ElánguloentreestevectoryelejeX,eslafase∅.La segunda forma de representar el espectro de impedancias es eldiagramadeBode(Figura16).Enrealidadsondosgráficas,unaeslogaritmode| |frenteallogaritmodelafrecuenciaylaotraes∅frentelogaritmodelafrecuencia.

Figura16.DiagramadeBodeusadoenespectroscopiadeimpedancias[38].

 | | 

24  

Una vez realizado el espectro de impedancias, una forma útil parainterpretar losresultadosesrealizarelajustede losdatosauncircuitoeléctricoequivalenteformadoporcoponenteseléctricosdiscretos,comoresistores,capacitoreseinductores.Loscircuitoseléctricosequivalentessuelenserrepresentacionesidealesdelsistemaqueseestámidiendo.Paraunresistorideallaimpedancianodependedelafrecuenciaalaqueserealizalamedidaylacorrienteestáenfaseconlatensióndeentrada.Parauncapacitorideallacorrienteestádesfasada 90º con la tensión de entrada. Así, para un resistor laimpedanciasólo tienecomponentereal,mientrasqueparauncapacitorestasóloconstadelacomponenteimaginaria:

Resistorideal Capacitorideal∅ 0

| | 0

∅ 90°| |

0

En la Figura 17 y Figura 18 se muestra, como ejemplo, el espectro deimpedancias de un circuito eléctrico ideal correspondiente a unaresistenciade1KΩenparaleloconuncapacitorde1nF.

Figura17.GráficadeNyquistparaelespectrodeimpedanciadeunresistorenparaleloconuncapacitor

25  

Figura18.DiagramadeBodeparaelespectrodeimpedanciadeunresistorenparaleloconuncapacitor

ComosepuedeobservarenlosdiagramasdeBodedelaFigura18,paralas altas frecuencias el circuito RC paralelo se comporta como unacapacidad, con una pendiente negativa típica de 10 dB por década. Afrecuenciasbajaslaimpedanciadelcircuitosevuelveindependientedelafrecuencia, tomando el valor de la resistencia | | y ∅ 0 . De lamismamanera, en el diagrama deNyquist se observa como para bajasfrecuenciaslaimpedanciasolotienecomponenterealcuyovalores1KΩ.

Para frecuencias intermedias (cercanas a ) la representación de la

impedanciadelcircuitoRCenestediagrama(Figura17)tomalaformadeunsemicírculoqueempiezaenelejedelasabscisas( y 0)yacabaenelorigenparafrecuenciasmaselevadas.

El comportamiento de los sistemas eléctricos analíticos habituales nosiempre se puede representar con circuitos equivalentes formados porresistores y capacitores ideales. Dichos circuitos equivalentes intentanrepresentar con componentes discretos el comportamiento deresistencias y capacidades distribuidas en el espacio. Sin embargo,

cuando las constantes de tiempo ( ) no son exactamente iguales en

todas las partes del sistema, por ejemplo debido a la existencia derugosidad en los electrodos, el comportamiento resultante es el de unelemento con fase constante, la cual no es ni 0º (resistencia) ni 90º

26  

(capacidad). En estos casos los elementos de fase constante (CPE)proveenunarepresentaciónmásexactadelcomportamientodelsistema.Laimpedanciaeléctricadeunelementodefaseconstanteseexpresacomo(7)

(7)

Donde eslaadmitancia| |con =1rad/s

La fase de la impedancia de un CPE es independiente de la frecuenciasegúnestaexpresiónytieneunvalorde‐(90n)°,connde0a1.Cuandon=1,secomportacomouncapacitoridealdonde =capacidad.Cuandon=0,secomportacomounresistorpuro.Una vez obtenido el espectro de impedancias para un sistemadeterminado,sedebehacerunanálisisqueconsisteenajustarelespectrodeimpedanciasobtenidoexperimentalmentealespectrodeimpedanciasdeuncircuitoequivalente.Para que la información obtenida pueda ser útil, los elementos delcircuito deben tener una explicación física. El circuito se construyeteniendoencuentatodaslaspartesdelsistemadondefluyecorriente.Porejemplo,cuandosesumergendoselectrodosenunasoluciónelectrolítica,la corriente que fluye entre ellos se debe a la movilidad de especiesiónicas.Deestamanera lasoluciónsecomportacomounresistor,enelcual, la resistencia depende de la cantidad de iones presentes en lasolución.Laimportanciadedarunsignificadofísicoalcircuitoequivalenteradicaenqueunespectrodeimpedanciassepuedeajustaradiversoscircuitosequivalentes lo que conlleva a interpretaciones erradas de los datosexperimentales. Idealmente se debería asegurar que cada elemento delcircuitocorrespondaaunamagnitudfísicaasignada[39‐41].1.3.2MedidasdeImpedanciaconelectrodosinterdigitados

27  

En la Figura 19 se muestra la configuración básica de un sistema deelectrodos interdigitados (IDEs, del inglés interdigitated electrodes).Consta de dos electrodos de polaridad inversa, cada uno de los cualesestá formado por varios dedos intercalados entre sí, demanera que secreauncampoeléctricoentreambos.

Figura19. Estructura básica de los electrodos interdigitados. La presencia de especiesiónicasenunasoluciónencontactoconlosmismospermitequelacorrientefluyaentreellos[42].

LaFigura20muestraelespectrodeimpedanciastípicodeunpardeIDEssumergidosenunadisolucióndondenoexistenmoléculaselectroactivas(no se producen procesos de transferencia de carga). Este espectro sepuedeasociarauncircuitoequivalentesimplerepresentadoen laFigura21, donde el elemento de fase constante( ) corresponde alacapacidadde doble capay la resistencia( )y el capacitor( )estánrelacionadas conla conductividady la permitividadde la solución,respectivamente.La capacidadde la doble capa surgedel hechode quehay dos materiales conductores (la solución y los electrodos) que nointercambiancargasentreellosysecomportancomoplacasparalelas.Elhechodequeestacapacidadseveacomounelementodefaseconstanteestá asociado a la rugosidadde la superficiede los electrodos, como seapuntabaanteriormente.Enestasgraficassepuedeobservarquelaparteplanadelascurvasestadominadaporlaconductividaddelasolución.Lamedicióndelaparterealdelaimpedanciaenunasolafrecuenciaenestaregióndebendarvaloresdirectamenteproporcionalesalaresistenciadela solución entre los electrodos e inversamente proporcionales a suconductividad.

28  

Figura20.GráficadeBodedelespectrodeimpedanciascorrespondientealamedidadeun IDE inmerso en una solución de KCl. Se muestran 3 regiones que tienen sucorrespondencia en el circuito equivalente. (C ) capacidad de doble capa de loselectrodos, (R )resistencia de la solución y (C )la capacidad dieléctrica de la solución[43].

El circuitoequivalentequemejorseadaptaal comportamientodeestesistemadeelectrodoscuandosesumergeenunadisoluciónelectrolíticase encuentra descrito en la literatura [43], y se puede observar en laFigura21.

Figura21.Modelodelcircuitoequivalente.

Como se aprecia, este sistema esmuy versátil y permite realizar tantomedidas en la interfase electrodos disolución (Cdl) comomedidas de lasolución(RsyCs).

 

 

29  

MEDIDASENLAINTERFASELasmedidasrealizadasenla interfacesepuedenhacerdedosmaneras:midiendoabajasfrecuenciasparaobtenerlacapacidaddeladoblecapaomidiendolatransferenciaelectrónicaentreloselectrodos.MedidasdelacapacidaddeladoblecapaEstasmedidasserealizanparaevaluaruneventodebioreconocimiento,que tiene lugar sobre los electrodos. La interacción del analito con labiomoléculadebioreconocimientohacequecambieeláreaactivadeloselectrodos,loquedarlugarauncambioenlacapacidaddedoblecapa.Lacapacidaddedoblecapadeloselectrodosesmuysensibleacualquierpartículaquesedepositesobreellos.Estacaracterísticaesaprovechadapara hacermedidas en tiempo real de la concentración de analito y eltiempodeinteracción.Sinembargo,tambiénadolecedeunaimportantelimitación,comosonlasadsorcionesinespecíficas,lascualesprovocaríancambios en la señal analítica registrada, no debidos a la detección delanalito.Se ha empleado este tipo de medidas para detectar bacterias,inmovilizandoanticuerposespecíficosenlasuperficiedeuntransductoradecuado. Las bacterias cargadas, al interaccionar con los anticuerposmodifican las propiedades dieléctricas de los electrodos y producen uncambioenlacapacidaddeladoblecapamedida[44].MedidasdelatransferenciadecargaEn este caso la medida de impedancia se realiza en un medio quecontiene alguna especie electroactiva. En este caso, la interacción delanalito con la biomolécula de reconocimiento, inmovilizada sobre lasuperficie del transductor, produce un cambio en la resistencia a latransferenciadecarga(Rct)delaespecieelectroactivaenlainterfase,lacual es directamente proporcional a la concentración del analito. Comoejemplo,sehareportadounsistemaparadetectarsecuenciasencadenasdeADN,enelcuallaprimerahebraqueseinmovilizasobreelectrodosdeoro.Cuando tiene lugar lahibridación con lahebra complementaria seproduceunaumentoenlaRct,queesmedido[45].

30  

MEDIDASENELVOLUMENDELASOLUCION

Lasmedidasrealizadasenelvolumendelasoluciónsepuedenhacerdedosmaneras:midiendolaparterealde lazonaplanaeneldiagramadeBode,dondeseobtienelainformacióndelaresistenciadelasolución,omidiendo la parte imaginaria de la cola que aparece a frecuenciasmásaltas, que da información sobre la capacidad de la solución. Estas sonmedidasmuchomásrobustasquelarealizadasenlainterfaseelectrododisolución ya que no se ven afectadas por procesos de adsorción noespecíficossobrelasuperficiedelelectrodo.MedidasdelacapacidaddelasoluciónEstetipodemedidasesútilparamonitorizarlainteraccióndepartículasque se inmovilizan sobre la superficie de electrodos interdigitados atravésdeunainteracciónbiológicaespecífica,comopuedensercélulas.Un ejemplo es la detección impedimétrica de bacterias, donde seinmovilizan anticuerpos específicos para la bacteria sobre la superficiedel transductor. La bacteria se puede considerar como una partículadieléctricaaunasdeterminadasfrecuenciasdetrabajo.Cuandoseunealosanticuerpos,provocaunaperturbaciónenladistribucióndelaslíneasdecampoeléctrico,quesetraduceenuncambioaparenteenlacapacidadde la solución [46]. Jugando con la penetración del campo eléctrico (lageometríadelosIDEs)sepuedenconseguirmedidassensibles.Unadelasprincipalesventajasdeestetipodemedidasesquenorequierendelusodemarcas.MedidasdelaresistenciadelasoluciónLas medidas en la resistencia de la solución se pueden llevar a cabocuando tiene lugarunaumentoodisminucióndeespecies iónicas en lamisma, el cual se puede relacionar con la concentración del analito. Enmuchoscasos,dichocambiotienelugarmedianteelempleodereactivosmarcados con enzimas, los cuales, cuando tiene lugar la reacciónenzimática correspondiente producen especies iónicas. Este tipo demedidas se ha aplicado en el desarrollo de un sistema para medirsecuenciasespecíficasdeDNA[47].

31  

Referencias

[1]Chen,G.Y.,etal.,Array‐BasedTechnologiesandtheirApplications inProteomics. Current Topics inMedicinal Chemistry, 2003. 3(6): p. 705‐724.[2] BRENNAN, D.J., et al., Contribution of DNA and Tissue MicroarrayTechnology to the Identification and Validation of Biomarkers andPersonalisedMedicine inBreastCancer. CancerGenomics ‐ Proteomics,2007.4(3):p.121‐134.[3] Wilhelm J, A., Next‐generation DNA sequencing techniques. NewBiotechnology,2009.25(4):p.195‐203.[4] Hartmann, M., et al., Protein microarrays for diagnostic assays.AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2009.393(5):p.1407‐1416.[5] Sobek, J., et al., Microarray technology as a universal tool for high‐throughput analysisofbiological systems.CombinatorialChemistryandHighThroughputScreening,2006.9(5):p.365‐380.[6] Sassolas, A., B.D. Leca‐Bouvier, and L.J. Blum, DNA Biosensors andMicroarrays.ChemicalReviews,2007.108(1):p.109‐139.[7]Satoshi,N.,Profilingcancerstemcellsusingproteinarraytechnology.EuropeanJournalofCancer,2006.42(9):p.1273‐1282.[8]Rusling, J.F., et al.,Measurementof biomarkerproteins forpoint‐of‐careearlydetectionandmonitoringofcancer.Analyst,2010.135(10):p.2496‐2511.[9] J.M, L., Microarrays: Molecular allergology and nanotechnology forpersonalised medicine (I). Allergologia et Immunopathologia. 38(3): p.153‐161.[10] Khnouf, R., et al., Cell‐Free Expression of Soluble and MembraneProteins in an Array Device for Drug Screening. Analytical Chemistry,2010.82(16):p.7021‐7026.[11]Stoughton,R.B.,APPLICATIONSOFDNAMICROARRAYSINBIOLOGY.AnnualReviewofBiochemistry,2005.74(1):p.53‐82.[12]Jain,K.K.,Personalisedmedicineforcancer:fromdrugdevelopmentintoclinicalpractice.ExpertOpiniononPharmacotherapy,2005.6(9):p.1463‐1476.[13] Baeumner, A.J., Biosensors for environmental pollutants and foodcontaminants. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2003. 377(3): p.434‐445.[14]Abbas,A.K.andC.A. Janeway Jr, Immunology: ImprovingonNatureintheTwenty‐FirstCentury.Cell,2000.100(1):p.129‐138.[15] Giljohann, D.A. and C.A. Mirkin, Drivers of biodiagnosticdevelopment.Nature,2009.462(7272):p.461‐464.[16] Johnsson, N. and K. Johnsson, Chemical Tools for BiomolecularImaging.ACSChemicalBiology,2007.2(1):p.31‐38.

32  

[17] White, N.S. and R.J. Errington, Fluorescence techniques for drugdeliveryresearch:theoryandpractice.AdvancedDrugDeliveryReviews,2005.57(1):p.17‐42.[18] Conchello, J.A. and J.W. Lichtman, Optical sectioning microscopy.NatureMethods,2005.2(12):p.920‐931.[19] Porakishvili, N., et al., A low budget luminometer for sensitivechemiluminescent immunoassays. Journal of Immunological Methods,2000.234(1‐2):p.35‐42.[20]Alexandre,I.,etal.,ColorimetricsilverdetectionofDNAmicroarrays.AnalyticalBiochemistry,2001.295(1):p.1‐8.[21] Aguilar, M.R., et al., Modulation of proteins adsorption onto thesurface of chitosan complexed with anionic copolymers. Real timeanalysis by surface plasmon resonance. Macromolecular Bioscience,2004.4(7):p.631‐638.[22] Lee, H.J., A.W. Wark, and R.M. Corn, Creating AdvancedMultifunctional Biosensors with Surface Enzymatic Transformations.Langmuir,2006.22(12):p.5241‐5250.[23]Gaster,R.S.,etal.,Quantificationofproteininteractionsandsolutiontransportusinghigh‐densityGMRsensorarrays.NatNano,2011.6(5):p.314‐320.[24] Baselt, D.R., et al., A biosensor based on magnetoresistancetechnology.BiosensorsandBioelectronics,1998.13(7‐8):p.731‐739.[25]Boisen,A. andT.Thundat,Design& fabricationof cantilever arraybiosensors.MaterialsToday,2009.12(9):p.32‐38.[26]Arruda,D.L.,etal.,Microelectricalsensorsasemergingplatformsforproteinbiomarkerdetection inpoint‐of‐carediagnostics.ExpertReviewofMolecularDiagnostics,2009.9(7):p.749‐755.[27] Mitsakakis, K. and E. Gizeli, Multi‐sample acoustic biosensingmicrosystem for protein interaction analysis. Biosensors andBioelectronics,2011.26(11):p.4579‐4584.[28]Marchand,G.,etal.,ElectricalDetectionofDNAHybridizationBasedon Enzymatic Accumulation Confined in Nanodroplets. AnalyticalChemistry,2005.77(16):p.5189‐5195.[29]Roth,K.M.,etal.,ElectrochemicalDetectionofShortDNAOligomerHybridization Using the CombiMatrix ElectraSense Microarray Reader.Electroanalysis,2006.18(19‐20):p.1982‐1988.[30] Zheng,G., et al.,Multiplexed electrical detectionof cancermarkerswith nanowire sensor arrays. Nature Biotechnology, 2005. 23(10): p.1294‐1301.[31] Chen, X., et al., Electrical Sensor Array for Polymerase ChainReaction‐FreeMessengerRNAExpressionProfiling.AnalyticalChemistry,2010.82(14):p.5958‐5964.[32] Drummond, T.G., M.G. Hill, and J.K. Barton, Electrochemical DNAsensors.NatBiotech,2003.21(10):p.1192‐1199.

33  

[33] Sadik, O.A., A.O. Aluoch, and A. Zhou, Status of biomolecularrecognition using electrochemical techniques. Biosensors andBioelectronics,2009.24(9):p.2749‐2765.[34] Ghindilis, A.L., et al., CombiMatrix oligonucleotide arrays:Genotyping and gene expression assays employing electrochemicaldetection.BiosensorsandBioelectronics,2007.22(9‐10):p.1853‐1860.[35] Lin, Z., et al., An Addressable Microelectrode Array forElectrochemicalDetection.Analytical Chemistry, 2008. 80(17): p. 6830‐6833.[36] Nebling, E., et al., Electrical Detection of Viral DNA UsingUltramicroelectrode Arrays. Analytical Chemistry, 2003. 76(3): p. 689‐696.[37]Muñoz‐Berbel, X., et al., Impedance‐BasedBiosensors forPathogenDetection Principles of Bacterial Detection: Biosensors, RecognitionReceptors and Microsystems, M. Zourob, S. Elwary, and A. Turner,Editors.2008,SpringerNewYork.p.341‐376.[38] Lillie, G., P. Payne, and P. Vadgama, Electrochemical impedancespectroscopy as a platform for reagentless bioaffinity sensing. SensorsandActuatorsB:Chemical,2001.78(1‐3):p.249‐256.[39]Barsoukov,E.andJ.R.Macdonald,ImpedanceSpectroscopy:Theory,Experiment,andApplications(Hardcover).SecondEditioned.2005:JohnWiley&Sons,Inc.616.[40]Bard,A.J.andL.R.Faulkner,Electrochemicalmethods.Fundamentalsandapplications.2001:JohnWiley&Sons.856.[41]MacDonald,J.R.,Impedancespectroscopy.1987.[42]VanGerwen,P.,etal.,Nanoscaledinterdigitatedelectrodearraysforbiochemical sensors. SensorsandActuatorsB:Chemical,1998.49(1‐2):p.73‐80.[43]Zou,Z.,etal.,Functionalizednanointerdigitatedelectrodesarraysonpolymerwithintegratedmicrofluidicsfordirectbio‐affinitysensingusingimpedimetric measurement. Sensors and Actuators A: Physical, 2007.136(2):p.518‐526.[44] Muñoz‐Berbel, X., et al., Impedimetric characterization of thechanges produced in the electrode–solution interface by bacterialattachment. Electrochemistry Communications, 2007. 9(11): p. 2654‐2660.[45] Witte, C. and F. Lisdat, Direct Detection of DNA and DNA‐LigandInteractionby ImpedanceSpectroscopy.Electroanalysis, 2011.23(2):p.339‐346.[46]delaRica,R.,etal.,SelectiveDetectionofLivePathogensviaSurface‐Confined Electric Field Perturbation on Interdigitated SiliconTransducers.AnalyticalChemistry,2009.81(10):p.3830‐3835.[47]Berdat,D.,etal.,DNAbiosensorusingfluorescencemicroscopyandimpedance spectroscopy. Sensors and Actuators B: Chemical, 2006.118(1–2):p.53‐59.

34  

CAPITULOII

ElobjetivoprincipaldeestetrabajodeTesisDoctoraleseldesarrollodeunsistemade lecturaeléctricoparabioarraysquecombine lasventajasde los sistemas de lectura fluorescente basados en el empleo deescáneresycomúnmenteempleadosen laboratoriosdeanálisis, con lasde los sistemas eléctricos reportados y comercializados hasta la fecha.Entrelasventajasdelosprimerossedestacasusensibilidadyelempleode sustratos de vidriomuy baratos para la realización del bioarray. Sudesventajaprincipaleselelevadocostedelainstrumentaciónrequeridaasí como su tamaño que impide su uso fuera de laboratorioscentralizados.Lossistemaseléctricosrequierendeuna instrumentacióncompacta y barata, pero sin embargo, los bioarrays se realizan sobresustratos donde se han fabricado previamente los transductoreseléctricos requeridos para su lectura. Teniendo en cuenta que estossustratos son de un único uso, el coste por análisis se encarecesignificativamente.

Teniendoencuentaestascaracterísticas,seproponeeldesarrollodeunsistema de lectura de bioarrays basados en un array de transductoresimpedimétricos,así como la instrumentaciónasociadanecesariapara lelectura simultánea de todos los puntos del bioarray. El sistema deberpermitir la lectura de bioarrays realizados sobre sustratos de vidrioconvencionales utilizando igualmente una instrumentación compacta ybarata,sinquetodoellolimitelasensibilidaddelalectura.

Deestaformaseplanteanlossiguientesobjetivosconcretos:

1. Desarrollo de una matriz de transductores impedimétricoscompuestos por dos electrodos interdigitados, que permitan lamedidade las propiedades eléctricas de unadisolución. En estecaso, se ha pensado en realizar medidas de cambios deconductividad de la disolución que se puedan asociar a laconcentración de las sustancias que se quieren medir en elbioarray.

35  

2. Diseñoy fabricacióndeuna instrumentacióncon lacualrealizarlalecturaconductimétricadelbioarray.Sediseñaráyfabricaráelcircuitodemedidanecesario,al igualqueelprogramanecesarioparaelcontroldelamisma,empleandoLabview.

3. Automatización de la medida con el sistema de lecturadesarrolladoempleandocomponentesmicrofluídicosdiseñadosyfabricados para facilitar la lectura de un bioarray y la limpiezaposteriordelsistemay,deestaforma,minimizarlaintervencióndelusuarioenelmismo.

36  

CAPÍTULOIII

LECTURAELECTRICADEMICROARRAYSDEPROTEINASREALIZADOSENPORTAOBJETOSDEVIDRIO

En este capítulo se describe el desarrollo inicial realizado para lafabricación de un sistema de lectura eléctrica de microarrays deproteínas basado en una array de electrodos interdigitados de oro ymediadecambiosenlaconductividaddelasoluciónempleandolaureasacomomarcaenzimática.

3.1ResumenEnestetrabajosepresentaunnuevoenfoqueparalalecturaeléctricademicroarrays preparados en portaobjetos de vidrio convencionales,utilizando una matriz de transductores impedimétricos (electrodosinterdigitados,IDE).Ladeteccióndelaimpedanciasebasaenlaelusodeun formato de inmunoensayo marcado ureasa. La ureasa es capaz deproducirunaumentoenlaconductividadporlahidrólisisdelsustratodeurea,quesemideatravésdeunIDEyestadirectamenterelacionadoconla cantidad de analito. A diferencia de sistemas anteriores para lecturaeléctricademicroarrays,elensayonotienelugarsobrelostransductores,y se realiza sobre portaobjetos de vidrio convencionales, lo que podríapermitir el desarrollo de sistemas de análisis multiplexado compactosconunmenorcosteporensayo.Sobrecada transductorde lamatriz sedepositaunagotade solucióndel sustratoenzimático.Elmicroarray secolocaaunadistanciacorta(300micras)demaneraquecadagotamojaun transductor y un punto del microarray al mismo tiempo. Esteprocedimientopermitelareutilizacióndelamatrizdetransductoresparalalecturadeunnúmerovirtualmenteilimitadodemicroarrays.Conelfinde evaluar este concepto de lectura eléctrica, se fabrico unmicroarraybasadoenun inmunoensayopara ladeteccióndeunaproteínagenéricaratón enun rangode concentracionesde0,03 a30mgmL‐1. Seobtuvounarespuestasigmoidalconunlímitededetecciónde0,1mgmL‐1yunrango dinámico de 1 orden de magnitud. También se realizó estudiocomparativocondosprocedimientosanalíticostradiscionales.Enprimerlugar, el inmunoensayo marcado con ureasa se puso a prueba en unaplaca de 96 pocillos (tipo ELISA) usando el indicador de pH rojo fenol,

37  

condeteccióndeabsorbancia.Ensegundolugar,elmicroarraysellevóacabo utilizando el mismo intervalo de concentraciones de analito,marcado con la molecula fluorescente Cy3, con detección defluorescencia.Ambosensayospermitieronlavalidacióndelosresultadosdelsistemadelecturaeléctricapresentado.

3.2Introducción

Las plataformas demicroarrays con diferentes componentes biológicos(DNA,proteínas, anticuerpos, péptidos, carbohidratos, célulaso tejidos)están empezando a desarrollarse y comercializarse comounapoderosaherramienta analítica de alto rendimiento para aplicaciones engenómica[1],proteómica[2],descubrimientodedrogas[3],odiagnósticoclínico[4]. Generalmente, la concentración de analito en cada punto delarray se mide empleando marcas unidas a una de las moléculasinvolucradaseneleventodebioreconociemiento.

Elsistemadelecturadelosmicroarraysestá,porlotanto,adaptadoparadetectar(yalgunasvecescuantificar)eltipodemarcausadoenelensayo.Las marcas usadas más frecuentemente generan fluorescencia[5],quimioluminiscencia[6], o señales colorimétricas[7], las cuales sondetectadasporequiposópticosmásomenosvoluminososycostosos,taly como se ha descrito en la introducción general de este trabajo.Recientemente, los sistemas basados en la lectura eléctrica han sidotambiénpropuestoscomounaalternativaquepodríadarlugaraequiposmás baratos y compactos para aplicaciones como el diagnóstico tipo“Point‐of‐care” (PoC)[8] o estudios descentralizados de monitorizacióndebiomarcadores[9].Estossistemasdemicroarraystambiénpodríanserventajosos en aplicaciones donde actualmente se emplean sistemasanalíticos tradicionales, como por ejemplo, el ensayo porinmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) realizado en placas, de talformaqueseconsigaunareduccióneneltiempodeensayoyvolumendereactivos[10].

La lectura eléctrica de microarrays se basa en el empleo un array detransductoresdosomáselectrodosporcadapuntodelarray),cadaunode los cuales detectan la concentración de un analito en un punto delmicroarray a través de una marca adecuada y la traduce en una señaleléctricadetipocorrienteoimpedimétrica.Porejemplo,seharegistradolavariacióndelaconductanciaentredoselectrodosinterdigitados(IDEs)

38  

después de un evento de hibridación de ADN empleando como marcananopartículasdeoroyunaposterioramplificaciónmediantereducciónde plata sobre dichas nanopartículas[11]. En otro sistemaconductimétricosemidióelcambioderesistenciaalgenerarpuentesdeplataennanogapsentredoselectrodosunavezquehabíatenidolugarlahibridacióndehebrasdeRNA[12].Loseventosdebioreconocimientoenmicroarrays también se han detectado mediante corrientes faradaicasregistradas a través de marcas electoactivas[13] o marcas enzimáticasque generan productos electroactivos[14‐16]. Todas estas plataformasdemicroarrayseléctricossonrealmentearraysdebiosensores,yaqueloselementos de bioreconocimiento se encuentran inmovilizados sobre lasuperficie de los transductores[17,18]. En estos casos, los sustratosdondeserealizanlosmicroarrayssonlosmismosquecontienenelarrayde transductores, lo que implica un procesado de losmismos en salasblancasTeniendoencuentaquelosmicroarrayssonnormalmentedeunúnicouso,sufabricaciónimplicaunaumentodesucostey,porlotanto,enelcosteporensayo,locualpuedeimpedirsuaplicacióngeneralizada.

Enestetrabajo,sepresentas losresultadosinicialesquedemuestranunnuevo concepto de sistema de lectura eléctrico de microarrays. Se hadesarrolladounarraydetransductoresimpedimétricosdeorosobreunsustratodevidrio,conlaparticularidaddequeestesustratoesdiferentealsustratodondeserealizaelmicroarray.Estaconfiguraciónpermitelalectura de un número virtualmente infinito de microarrays realizadossobre sustratos de vidrio bajo coste, comúnmente empleados para surealización,deunamanerasimilaralossistemasdelecturaópticos,peroconlaventajaañadidadesermáscompactoyrentable.Unadescripcióndetalladadelmismosemuestraacontinuación.

3.3SecciónExperimental

3.3.1Principiodelsistemadelecturaeléctrica:

El microarray de proteínas, preparado en un portaojetos de vidrio, sealinea en la parte superior del array de transductores con la ayuda decincoestructurasdealineamiento(Figura3.1)demaneraquelaposicióndecadaspotdelmicroarraycoincideconlaposicióndecadatransductordel lector.Enelmomentodeposicionarelmicroarray,cadatransductorestácubiertoconunagotadesolucióndemedida.Elmicroarrayseapoyaendossoportesquelomantienenfijoa300µmdeseparacióndelarray

39  

detransductores.Unavezposicionadoelmicroarray,cadagotamojauntransductoryunpuntodelmicroarray.Estagotadesolucióncontieneunsustrato enzimático para la marca empleada en el desarrollo delmicroarray, la cual permite llevar a cabo la lectura conductimétrica delmismo(Figura3.2).

 

 

Figura 3.1. Sistema de lectura eléctrica de microarrays preparados en portaobjetos de vidrio, 

utilizando transductores impedimétricos con electrodos interdigitados, (IDE). 

Esteconceptogeneralsehapuestoenprácticaempleandoureasacomomarca enzimática[19]. La ureasa cataliza la hidrólisis de urea paragenerar bicarbonato y amonio en solución, especies que aumentan laconductividad eléctrica de la misma a la vez que aumentan su pH. Ellectorcontieneparesdeelectrodos interdigitados(IDEs), con loscualesmedir dicho cambio de conductividad. Concretamente, convierten elaumento de la conductividad en un aumento de la conductancia, a unafrecuenciadeterminada.

40  

 

Figura 3.2. Esquema del corte transversal del sistema de  lectura de microarrays  (1, spots en 

rojo), array de transductores (2, IDEs en amarillo, estructuras de alineamiento en gris) y gotas 

de urea (3) para realizar la lectura eléctrica. 

 

La ureasa es unmarcador enzimático que ofrece varias ventajas sobreotras marcas más comunes como la peroxidasa o la fosfatasaalcalina[20]. Es un enzima estable que muestra una actividad máselevada que los marcadores ezimáticos mencionadas anteriormente,cuando trabaja en condicionesoptimasdepHy temperatura.Asimismolasolucióndesustratodeureaesestableporlargosperiodosdetiempoyesinocuaparaelusuarioyelmedioambiente.

 

3.3.2DiseñoyFabricaciondelArraydeTransductores

Elarraydetransductoresconstade36paresdeelectrodosinterdigitadosdeoro (IDE). Cadaparde IDEs tiene13dedos (siete enun electrodoyseisenelotro)de20µmdeancho,separados20µmyconunalongitudde500µm.LosIDEestándistribuidosenunamatrizrectangularde4x9elementos y están separados6mmen vertical y enhorizontal como lomuestra la Figura 3.3. El dispositivo se fabricó mediante procesos defotolitografía estándar dentro de la sala blanca del Instituto deMicroelectrónicadeBarcelona.

La tecnología de Sala Blanca del IMB, permite trabajar con obleas deSilicioovidriotipoPyrex.

La fabricación de lamatriz que contiene los IDEs se realizó a partir deobleasdevidriotipoPyrexde100mmdediámetro.Encadaunade las

1

23

41  

obleassefabricarondosarraysdeIDEs,cadaunodeloscualesocupaunáreade29mmdeanchox54mmdelongitud.

SeeligióelPyrexenlugardelsilicioparaeliminar lacapacidadparásitaqueapareceentre los electrodosa travésdel sustrato. Lasdimensionesde la matriz de IDEs exigían pistas lo suficientemente anchas y largaspara poder llevar la señal a la PCB conuna baja resistencia serie. Si sehubieraempleadosiliciocomosustrato,sehabríacreadounacapacidadparásitatangrandequenopermitiríamedirlaspropiedadeseléctricasdelasolución. 

 

 

 

 

Figura 3.3.  a. Matriz de 4x9 IDE. b. Detalle de un IDE. 

 

 El proceso de fabricación empezó con la deposición de una tricapametálicadetitanio,níquelyoro(eltitaniosedepositósobreelPyrexconungrosorde20nm,elníquelsobreeltitanioconungrosorde50nmyeloro sobre el níquel con un grosor de 50 nm). Los tres metales sedepositaron por pulverización catódica. El níquel y el titanio sonnecesariosparamejorarlaadhesióndelacapadeoroyevitarsudifusiónenelsustrato.Eloroalserunmetalnoble,permiterealizarmedidasensoluciónsufriendounprocesodecorrosiónmínimoquenolodeterioran.

Despuésdelprocesodedeposicióndelatricapa,serealizóunprocesodefotolitografía estándar con unamáscara que contenía losmotivos paradefinir una matriz de IDEs. A continuación se llevó a cabo el ataquequímico de losmetales en diferentes soluciones de ataque. Este es un

a 

b

6mm 6mm 

42  

procesomássencilloyfácildecontrolarqueladefiniciónporlift‐off,ydaresultadossatisfactoriosparadimensionesgrandes(~20µm)como lasutilizadaseneldiseñodelospresenteselectrodos.Paraelataquedeloroseutilizóunamezclade5700mldeH2O,435gdeKIy250gdeI2.Paraelníquelseutilizóunamezcla1:4deHNO3al70%:H2O.Parael titanioseutilizóunamezcla1:10:33deHF49%:H2O:1,2‐Propanodiol.

Finalmente se depositó capa de pasivación consistente en 300 nm deóxido de silicio y 700 nm de nitruro de silicio mediante un procesoplasmaPECVD(plasmaenhancedchemicalvapordeposition).Serealizóun segundo proceso de fotolitografía estándar y se abrió la pasivaciónmedianteunprocesodeataqueconionesreactivos(RIE).Finalmenteseeliminó la resina definida por fotolitografía, dejando así expuestas lasestructurasinterdigitadasylospadsdeconexiónenelbordedelchip.

Laoblea se cortó con la ayudadeuna sierramecánicapara separar lasdosmatricesdeIDEs.Cadamatrizsepegóauncircuitoimpreso(PCB),enelquesehabíadefinido lasáreasnecesariaspara la conexiónmediantesoldaduraporhilo y tambiénun conectorpara conectar eléctricamentelos electrodos a la instrumentación. Finalmente las conexiones seprotegieronconunasiliconadeDowCorning.

Para completar la fabricación del lector, se colocaron las cincoestructuras de alineamiento de polimetilmetacrilato (PMMA) y las dosestructurasdeapoyosobrelaPCB,siguiendoelmodelodelaFigura3.1..

3.3.3Instrumentación

La instrumentación de medida consiste en fuentes de excitación detensión alterna y circuitos medidores de corriente alterna, quecombinadossoncapacesdemedirlaimpedanciaenlasterminalesdelosIDEs. La conexión de dichas fuentes y circuitos con los electrodos sepuede ver en la Figura 3.4. Como se puede apreciar en la figura, lostransductores impedimétricos permiten un conexionado tipo fila‐columna. Esto hace que sea práctica la realización dematrices de grannúmerodeelementos.Porejemplo,paraunamatrizde1024elementosbastaríacon32fuentesdeexcitaciónalternay32circuitosdemedidadelacorriente.

43  

 

 

Figura 3.4. La  instrumentación de  lectura consiste en: un conjunto de  fuentes de excitación 

alterna y   un conjunto de circuitos de medida de corriente. En el dibujo sólo se muestran  la 

primera y la última fuente, así como el primer y el último circuito de medida de corriente.  

El circuito eléctrico diseñado para este sistema de lectura consiste encuatrofuentesdetensiónAC(unaporfila)ynuevebloquesdecircuitosmedidoresdecorrienteatensión(unoporcolumna), loscualesseunenparamedirlaimpedanciaenlasterminalesdelos36IDEs.Lalecturaserealiza filapor fila,detalmaneraque,mientrasqueunafilaesexcitadaconunafuentedetensión,lasotrasfilasestánatierra.Laimpedanciaquesale del circuito medidor de corriente es virtualmente cero y estaconectadoatierra.Porlotanto,losIDEsnocomienzanaexcitarseenunacolumnamientrastengaambosterminalesaunpotencialde0V,demodoque la corriente que fluye a través del IDE excitado va totalmente alcircuitodemediciónde corriente a tensión.Este análisis es válidoparaloscomponenteselectrónicosideales.Enelanálisisrealapareceunefectodecross‐talk,quesehadeevaluar.

Paraevaluarelcorss‐talkenunacolumnaparticular,setienelasituaciónqueseobservaenlaFigura3.5,dondealhacerlamedidadeunIDE,los3restantes están conectados a tierra y por tanto su resistencia esta enparaleloconlaresistenciadeentradaalcircuitodemedidadecorriente.

44  

 

Figura 3.5. Columna de interconexiones  

 

La corriente que fluye a través de los IDEs (ver Figura 3.6) no seconvierte en tensión. Los IDEs que están conectados a tierra secomportan como una resistencia (Ri) mientras que el IDE que se estámidiendosecomportacomounaresistencia(Rm).

 

 

 

 

 

 

Figura 3.6. Esquema del flujo de la corriente a través de los IDES 

Rf 

Zi I Rf

Ri 

Rm 

45  

≅   dondeAeslaGananciadelAmplificador.

Se debe tener en cuenta que dependiendo de la frecuencia a la que setrabaje la ganancia de amplificador no es el 100%, ya quedependedelanchodebandadelmismo.

LamáximainterferenciacuandoseestámidiendoRmocurrirácuandoRitenga el valor más bajo posible. Esta situación se corresponde con lamayor conductividad alcanzada en la solución de lectura durante lareaccióndelaureasaconlaurea,ysedacuandoseleelaconcentraciónmásaltademIgGdondelaresistenciamedidaesde10kΩ.

Elerrorrelativoenlamedidadebidoalcross‐talksepuedecalculardelasiguientemanera:

η1

 

DondeNeselnumerodefilasdelArray.

Porlotanto,conlaactualinstrumentación(N=4, =100kΩyA=350a40

kHz)elerrordebidoalcrosstalkesperadoseriade8.6%.Elcross‐talksemidióexperimentalmentemedianteresistenciasdiscretas.EnlugardelosIDEsseconectaron4resistenciasde10kΩparaunacolumna.Luegosedesconectaron3resistenciasysemidiólacuartaresistenciaconectada,lacual presentóun cambiodel 3.1%.Este valor esmenorde lo esperado,probablementedebidoaunamayorgananciadelazoabiertodelaqueseespecificaenlahojadedatosdelamplificadoroperacional.

Esteerrordecross‐talkpodríaserdemasiadoaltoparaalgunaaplicacióndeterminada, pero se puede reducir fácilmente disminuyendo laimpedancia de entrada (Zi). Esto se puede conseguir usando unamplificadoroperacionalconunabandamásancha(mayorgananciaa40kHz)omedianteelusodedosetapasdelcircuitodemedidadecorriente,poniendoenlaprimeraetapaunaRfmenor.

En este trabajo, los generadores fueron las salidas analógicas de unatarjetaNIUSB‐6259deNationalInstruments.Loscircuitosdemedidadecorriente se implementaron con amplificadores operacionales, con unaresistenciade realimentacióndeprecisión.El registrode los valoresde

46  

tensiónalasalidadelosamplificadoresoperacionalesserealizóatravésdelasentradasanalógicasdelamismatarjeta.

3.3.4Reactivosquímicosymateriales

LaureasadeJackBean(tipoC‐3,≥600000unidades/gsolido),laurea,las tabletas de solución salina de fosfato (10 mM fosfato , pH 7.4 quecontiene 140 mM NaCl, PBS), el suero bovino de albumina (BSA), elTween20,lainmunoglobulinaGderatón(mIgG),elanticuerpoderatónIgG (molécula conjugada)‐biotina, y la estreptavidina‐Cy3 fueronsuministrados por Sigma‐Aldrich (España). El kit de conjugaciónLightning‐linkEstreptavidina(InnovaBiosciencesLtd.)fuesuministradopor Antibody BCN (España) y se utilizó para obtener el conjugadoestreptavidina‐ureasa. Los portaobjetos de vidrio Nexterion AL (SchottAG) fueron suministrados por Isogen Life Science, S.L. (España). Todoslosdemásproductosfuerondegradoanalítico.

3.3.5Fabricacióndelmicroarraydeproteínasmarcadoconureasa

Seevaluólautilidaddeldispositivomediantelalecturadeunmicroarrayde proteínas. Este microarray se fabricó empleando un formato deinmunoensayo tipo “Reversed‐phase” (Figura 3.7)[21]. Para este ensayose utilizó como substrato un porta‐objetos de vidrio modificado congrupos aldehído, que permite la unión covalente de la biomolécula atravésdegruposaminoprimariosdelamisa.ComoanalitoseutilizarondiferentesconcentracionesdemIgGdisueltoenPBS.Finalmenteseutilizóunabiomoléculadeunióespecificamarcadapararealizarlalectura.Estabiomolécula es la anti‐Inmonoglobulina G de ratón (anti‐mIgG) unida aunabiotina.Como labiotinaseuneespecíficamentea laestreptavidina,entonces,seutilizóunaureasaunidaaunaestreptavidinaqueseuniráalabiotinadelanti‐mIgGydeestaformasepudomarcarlaanti‐mIgGconlaureasa.

LasconcentracionesdemIgGsevariaronenunrangoentre30ngmL‐1y30 μg mL‐1. Se depositaron alícuotas de 0.2 μL de cada disolución porcuadruplicados en cada porta‐objetos de vidrio. Para ello se utilizó unmicrodispensador de gotas (spotter, modelo iTWO de M2‐Automation,Berlín).Elmicroarrayseincubóenunacámarahúmedadurante1horaatemperaturaambiente. Después se continuóconun lavadoenPBSquecontieneTween200.1%(PBS‐T),yacontinuaciónserealizóunbloqueo

47  

enPBSquecontiene1%deBSA(PBS‐BSA)durantetodalanochea4ºC.Las siguientes incubaciones del microarray se llevaron a cabo en unacámaradeincubacióncaserafabricadausandounportaobjetosdevidriodelmismotamañodelmicroarrayalqueseunióunmarcodePDMSde0.5mmdeespesor.Enprimerlugar,secolocó1mLdeunasoluciónde30μgmL‐1deanti‐mIgG–biotinadisueltoenPBSdentrodeestacámaradeincubación, lacualsecubrióconelmicroarray,sellandocompletamentelacavidadparaevitarlaevaporación.Estacámarasevolteódetalformaque el microarray pasaba a ser el sustrato de la misma y entraba encontactoconladisolucióndeincubación.Lasoluciónseincubódurante1horaatemperaturaambiente.Finalizadalaincubación,elmicroarrayselavótresvecesconPBS‐Tysevolvióaincubaren1mLdeunadisoluciónde1/10delstockdelconjugadoestreptavidina‐ureasarealizadaenPBS,duranteunahoradelamismamaneraquesehizolaincubaciónanterior.FinalmenteelmicroarrayselavatresvecesenPBS‐TyseguardaenPBShasta elmomento de lasmedidas de lectura (nomás de 1 hora). Justoantes de realizar la lectura, el microarray, se lava en una solución deglicina250mMysesecacuidadosamenteencorrientedenitrógeno.

 

 

Figura 3.7.  Esquema de las reacciones que tienen lugar en cada punto del microarray de 

proteínas desarrollado.  

 

3.3.6Procesodelectura

Con la ayuda del microdispensador, se coloca una gota de 1.7 µL desolucióndeurea0.1Mpreparadaenglicina250mM,sobrecadaIDE.Se

C

O

H2N NH2

NH4+ HCO3

-

mIgG

Conjugado anti mIgG‐ ureasa

Reaction enzimática

microarray

OH-

IDE

48  

posicionaelmicroarraysobreelarraydetranductoreshaciendocoincidircada gota con un punto delmicroarray correspondiente. Alrededor delsistema se genera un ambiente húmedo colocando pequeños trozos depapel humedecido, con el fin de evitar la evaporación de las gotas desolución de medida. La reacción enzimática de la ureasa tiene lugardurante30minutos,ylaimpedanciasevaregistrandocada10segundos.Antesdeempezarcadalecturadeunnuevomicroarray,lostransductoresse limpian con agua desionizada, con el fin de eliminar los posiblesresiduosquehayanquedadodelareaccióndelecturaanterior.

3.4Resultadosydiscusión

3.4.1Caracterizacióndelostransductoresylainstrumentacióndelectura

Para la caracterización del sistema en conductividad, se prepararonsoluciones de KCl con diferentes conductividades en un rango de 10 a120 μS/cm, preparadas y medidas con un conductímetro (μCM 2202,CRISON). Se depositaron gotas de 1.7 μL de solución sobre lostransductoresysemidiósuespectrodeimpedanciaconunanalizadordeimpedanciascomercial(SI1260SOLARTRON),realizandounbarridoenunrangodefrecuenciasentre10kHza1MHz,aunpotencialde0VDCyunaamplitudde50mV.EnlaFigura3.8sepuedeobservareldiagramadeBodedelosespectrosdeimpedanciasdelasdiferentessolucionesdeKCl.EstosmuestranlaformaesperadaparaunpardeIDEsinmersosenunasolucióndondenotiene lugar fenómenoalgunodetransferenciadecarga.Esteespectropuedeestarasociadoalcircuitoequivalentesimple,incluido en la Figura 3.8, donde el elemento de fase constante (CPEdl)corresponde a la capacidad de la doble capa y la resistencia (Rsol) ycapacidad(Csol)estánrelacionadosconlaconductividadylapermitividaddelasolución,respectivamente.

49  

Figura 3.8. Diagrama de Bode del espectro de  impedancia para un  solo  IDE medido con un 

analizador  de  impedancias  cubierto  por  una  gota  de  solución  de  KCl  a  diferentes 

conductividades (la curva de arriba corresponde a 16 μS cm‐1 y la curva de abajo corresponde 

a 115 μS cm‐1). Se muestra igualmente el circuito equivalente que mejor se ajusta a los datos 

experimentales y describe el experimento realizado.  

Estos resultados muestran que la porción plana de las curvas estádominadaporlaconductividaddelasolución.Lamedidadelaparterealdelaimpedanciaaunafrecuenciaúnicaenestaregiónpodríadarvaloresdirectamente proporcionales a la resistencia de la solución entre loselectrodoseinversamenteproporcionalasuconductancia.Deestaformase eligió una frecuencia fija de 40 kHz para realizar la lectura de losmicroarrays.

En la Figura 3.9 se puede observar el promedio de la conductancia (G,calculado como la inversa de la parte real de la impedancia) de los 36IDEsdelarrayparadiferentesconductividades(σ)medidasa40kHzconlainstrumentacióndesarrolladaenestetrabajo.

LadesviaciónestándardelosvaloresdeGesmenoraun6.3%paratodaslas conductividades medidas, la cual hace evidente la buenareproducibilidadenloselectrodosfabricados.Semuestralacomparacióncon los valores de conductancia obtenidos con el analizador deimpedanciasparaunsoloIDE.

50  

Figura 3.9. Promedio de la respuesta de los 36 IDEs medida con la instrumentación basada en 

le  tarjeta DAQ  y  comparación  con  la  respuesta  obtenida  con  el  analizador  de  impedancias 

comercial. 

 

Como se esperaba, la respuesta para la conductividad es lineal y losvalores obtenidos con la instrumentación desarrollada en este trabajosonacordesconlosobtenidosconelanalizadordeimpedancias.

Apartirdeestosdatos,sehacalculadolaconstantedeceldadelosIDEs,definida como k=Δσ/ΔG, donde ΔG es el incremento en conductanciaesperado para un incremento Δσ en la conductividad de una solución.Según esta ecuación la k se puede extraer directamente de la gráficaanterioryeslainversadelapendientedelaregresiónlinealdelosdatosmostrados en la Figura 3.8. Se obtuvo un valor de 3.07 cm‐1 (datoobtenidodelainstrumentación).

Igualmente se estimó el valor del cross‐talk esperado en el rango deconductividadesmedido, siendo este de un 3.1%, valor que concuerdaconelvalorteóricoestimadoenlasección3.3.3.

3.4.2Lecturaeléctricadelmicroarraydeproteinas

Para probar la capacidad del sistema para realizar la lectura demicroarrays, se escogió como analito, la proteína genérica mIgG. Sehicieron7dilucionesdiferentesdesde0,03µgml‐1hasta30µgml‐1, lascuales se midieron por cuatriplicado (una dilución por columna del

51  

array).Enlasotrasdoscolumnasdelmismo,semidiólaseñaldelblanco,generado incubandosoluciónsalina tamponadacon fosfato (PBS).En laFigura 3.10 se puede observar la distribución de cada una de lasdiferentesdilucionesdemIgGdentrodelmicroarray.

Lascolumnasdeblancossepusieronunaalladodelospuntosdemayorconcentración (blanco‐1) y la otra al lado de los puntos con menorconcentración (blanco‐2). Con estadisposiciónde losblancos se evaluóunaposiblecontaminaciónpormigracióndeproductosdelareaccióndeun punto a otro adyacente. Como se ha comentado anteriormente, lahidrólisisdelaureacatalizadaporlaureasageneraamonioybicarbonatoendisolución.Estasdosespeciespresentanunequilibrioácido‐baseconlasespecies gaseosas, amoniacoydióxidode carbono, respectivamente.Ambas especies pueden migrar de una gota de disolución a las gotasadyacentesdandolugaralfenómenodenominado“cross‐talkquímico”,elcualdebeserevaluadoyaqueafectanegativamentealasensibilidaddelalecturadelarray,comosecomentamásabajo.

En la Figura 3.10 se puede observar la respuesta en conductanciaobtenidaparalospuntosdeunafila.Comoeradeesperar,enlospuntosde mayor concentración de mIgG se produjo un mayor aumento en laconductancia.Amayorconcentracióndeanalitomayor laconcentracióndelamarcaenzimáticasobreelpuntodelmicroarrayserámayor,yestadarálugaraunmayoraumentoenlaconductividaddeladisolución.

Laconcentracióndeureautilizada(0,1M)eslosuficientementealtaparaque la reacción siga el comportamiento del modelo de cinética deMichaelis‐Menten,dondelavelocidaddereacciónenzimáticanodependedelaconcentracióndelsustratoyesproporcionalalaconcentracióndelenzimapresente.

52  

 

Figura 3.10. Disposición de las concentraciones de mIgG (en µg ml‐1) en el microarray y perfil 

de  respuesta  para  las  diferentes  disoluciones  ensayadas.  A  los  valores  de  conductancia 

registrados  se  les  restaron el  valor de  conductancia  inicial  con el  fin de que  los perfiles de 

respuesta partiesen todos de cero, y así poder compararlos fácilmente.  

 

Dadoquelaconductividadesproporcionalalaconcentracióndeespeciescargadas, la tasa de aumento de la conductancia medida debe serproporcional a la cantidad de marca en cada punto. Por lo tanto, esposibleutilizarlapendientedelacurvadeconductanciafrentealtiempocomoseñalanalítica.Apartirdeesteanálisisseesperaríaquelascurvastuvieranunaúnicapendiente,peroparaalgunasmedidasestonoesdeltodocierto(Figura3.11).

 

53  

 

Figura  3.11.  Conductancia  en  función  del  tiempo.  Señal  de  un  punto  incubado  con  una 

concentración baja de mIgG (0,03 μgmL‐1) 

Durante los primeros segundos de la medida, la señal presenta unpequeñostep‐like,debidoaunaumentoenlaconductividadnodebidoala reacción enzimática. Posiblementedicho aumento sedeba a especiesiónicasquesefueronacumulandoencadapuntodelmicroarrayduranteel desarrollo del inmunoensayo y que no se eliminaron totalmentedurante las etapasde lavado. Sin embargo, pasadoun cortoperiododetiempo la pendiente de la curva se hace constante. Este tiempo es elnecesarioparaquelosproductosdelareacciónsedifundanyalcancenlazona de penetración del campo eléctrico en la proximidad de loselectrodos.Comoestosfenómenosinicialesnotienenningúnsignificadoanalítico,laseñalseempezóaregistrarenelmomentoenquetodaslasseñalesaumentabandeformaconstante.

Se detectaron otros dos efectos asociados, los cuales son visibles en laFigura 3.10. El primero se observa en aquellos puntos donde laconcentración de mIgG era más alta. En esto, la señal después de 10minutosdemedidacomienzaasaturar.Elsegundoefectoseobservaenlosblancos,dondepasados15minutoslaseñaldelblancoqueestáalladodelospuntosdemayorconcentracióndeanalito(blanco‐2),comienzaadarunvalordistintode0.Sinembargo,en losblancosadyacentesa lospuntosdemenorconcentracióndeanalito(blanco‐1),estefenómenonoseproduce.

54  

El aumento de la conductancia observado en el blanco‐2 puede serdebidoalefectodel “cross‐talkquímico”,definidoanteriormente,alcualse lepuede sumarun fenómenodeevaporación, el cualpodría sermásacusado en las gotas de los blancos por encontrarse en el borde delmicroarray. Este, como se ha comentado, se ha intentado minimizarllevando a cabo la medida en atmósfera húmeda, de tal forma que seesperaquelacontribucióndelmismoalaseñalseamínima.

Con el fin de minimizar los efectos negativos descritos, se tomó comoseñal analítica la pendiente del perfil de respuesta en el intervalo detiempoentrelos100y600segundos,dondeelcambioenconductividaddependemayoritariamente de la actividad enzimática. La pendiente secalcula en este intervalo como la pendiente de la regresión linealestimada con el método de mínimos cuadrados. En el capitulo IV seexplicanciertasmejorastecnológicasquesecrearonparaevitaralgunosdeestosproblemas.

 

 

Figura 3.12. Resultado de la lectura eléctrico que muestra promedio de la pendiente para las 

señales de diferente concentración de mIgG en el intervalo de 0,03‐30 µg ml‐1 

 

En la Figura 3.12 se muestra la curva de calibración obtenida en elintervalo de concentraciones de mIgG medido. La curva de calibradomuestra un perfil sigmoidal en la escala semilogarítmica, típica de

55  

Inmunoensayos.Cadapuntodelacurvadecalibradosecorrespondeconel valor medio de las 4 puntos del micoarray, realizados para cadaconcentración, y las barrasdeerror representan ladesviaciónestándarde dichas medidas. El limite de detección, calculado como laconcentraciónmínimamedidaconelsistemacuyacorrespondienteseñales igualomayorqueel valormediomedidode la señaldelblancomástres veces su desviación estándar, fue de 0,1 mg mL‐1. El intervalodinámicoesdeaproximadamenteunordendemagnitud.

Los resultados se validaron realizando dos estudios comparativosbasadosenprocedimientosanalíticosestándar(Figura3.13).Enprimerlugar,serealizóunensayocolorimétricoenplacasdeELISAutilizandolamismamarcaenzimática(ureasa)yañadiendoaladisolucióndemedidael indicador de pH rojo fenol. Este indicador presenta un intervalo devirajeentre6.8y8.2,cambiandosucolordeamarillo(formaácida)arojo(forma básica). Así, cuando tiene lugar la reacción enzimática, losproductos de la reacción hacen aumentar el pH de la disolución, tal ycomosecomentóanteriormente,produciendouncambioenelcolordelindicadorysuintensidad,quesepuedemedir.

 

 

Figura  3.13.  Los  resultados  de  los  estudios  comparativos.  (a)  diagrama  de  calibración  para 

ELISA realizado en placas de 96 pocillos usando la marca enzimática ureasa y rojo fenol como 

un indicador de pH. Cada punto es el valor medio de la absorbancia de las medidas llevadas a 

cabo  para  cada  concentración  de  analito,  y  las  barras  de  error  representan  la  desviación 

estándar  correspondiente.  (b)  diagrama  de  calibración  para  inmunoensayo  realizado  en 

microarrays usando  la marca fluorescente Cy3 y  leída con un escáner de fluorescencia. Cada 

punto es el valor medio de  la  intensidad de  fluorescencia de  las  cuatro medidas  llevadas a 

cabo  para  cada  concentración  de  analito,  y  las  barras  de  error  representan  la  desviación 

estándar  correspondiente.  El  recuadro muestra una  imagen  escaneada del microarrays  (las 

concentraciones de mIgG están en µg mL‐1). 

56  

 

La curva de calibración correspondiente a este ensayo de validaciónmostró el comportamiento sigmoidal típico de los inmunoensayos(Figura 3.13(a)). Mostró límites de detección similares a los obtenidosconelsistemade lecturaeléctrico.Apesardelbuenrendimientode losinmunoensayosmarcados con ureasa, su uso ha sido bastante limitadodebidoprobablementealhechodequelasreaccionesenzimáticasdelosinmunoensayos se realizan en soluciones a PH lejos del pH óptimo deureasa,yelproblemadelosfalsospositivosdebidoalamigracióndelosproductos enzimáticos [22‐23]. Estos inconvenientes se minimizan ennuestrosistemautilizandounpHmásadecuadoyuntiempomáscortodereacciónenzimática.

En segundo lugar, se fabricó un microarray con la misma proteínagenéricaderatóncomoanalitoyenelmismorangodeconcentraciones,peroenestecasoseutilizóunamarcaparaladetecciónporfluorescencia(Cy3).Tambiénseobservóunatendenciasimilaralacurvadecalibraciónsigmoidal(Figura3.13(b)).Elrangodinámicotambiénfuede1ordendemagnitud,yellímitededetecciónestimadoutilizandoelmismocriterioque anteriormente fue de 0,01 mg mL‐1. Es 1 orden de magnitud pordebajodelobtenidoconnuestrosistema.Sinembargo,sepodríamejorarsu límite de detecciónmediante la optimización del conjugado ureasa‐estreptavidina,asícomoporladisminucióndelvolumendelasgotasdesolución de urea utilizadas en el proceso de lectura . Además, esimportantenotarqueeste inmunoensayogenéricosehautilizadocomopruebadeconceptoparalalecturaeléctricademicroarraysdeproteínasy para compararlo con dos procedimientos immunoanaliticosmultiplexados ya establecidos. Los límites reales de deteccióndependeran de la aplicación específica y el formato de ensayo demicroarraysseleccionado.

3.5Conclusiones

Se demostró la lectura eléctrica de microarrays de proteínas enportaobjetos de vidrio. Para este propósito se desarrolló undispositivode lectura basado en un array de transductores interdigitados y unainstrumentacióndemedida tipo fila‐columna.Estedispositivo seutilizóparaleerlosmicroarraysdeproteínasbasadosenelusodelaetiquetadela ureasa y se probó en un inmunoensayo para la detección de una

57  

proteínagenéricoinmunoglobulinas‐globulinaderatón.Larespuestafuesimilaralaobtenidaconunescánerdefluorescenciasiguiendoelmismoformatodemicroarray,peroelusodeunaetiquetaCy3.

En este primerprototipo, el espaciadode los puntos fue diseñadoparaser lo suficientemente grande como para facilitar la alineación entre ellectoryelmicicroarraysinunasofisticadasujeciónmecánica.Elaumentode densidad de puntos en los diseños futuros implicará trabajar convolúmenesdegotasmáspequeñasyunaespaciomenorentreellectorylossustratosdemicroarrays.Enestesentido, la integracióndesistemasmicrofluídicos para la rápida formación de las gotas de la solución delecturaencadaspotpodríaayudaraqueelprocedimientodelecturaseamás sencillo[16]. Estos sistemas microfluídicos también se podríanutilizarparalaautomatizacióndelafabricacióndelinmunoensayo[24],locual es necesario para el desarrollo de plataformas de microarrayscompactas y de bajo coste, que pueden ser utilizados fuera de loslaboratoriosyenaplicacionesPoC.

Referencias

[1]Lockhart,D.J.;Winzeler,E.A.Nature2000,405,827–836.[2]Chen,G.Y.;Uttamchandani,M.;Lue,R.Y.;Lesaicherrea,M.L.;Yao,S.Q.

Curr.Top.Med.Chem.2003,3,705–724.[3]Khnouf,R.;Olivero,D.;Jin,S.;Coleman,M.A.;Fan,Z.H.Anal.Chem.2010,82,

7021–7026.[4]Hartmann,M.;Sj€odahl,J.;Stjernstr€om,M.;Redeby,J.;Joos,T.;Roeraade,

J.Anal.Bioanal.Chem.2009,393,591–598.[5]Shalon,D.;Smith,S.J.;Brown,P.O.GenomeRes.1996,6,639–645.[6]Zhou,D.;Qiao,W.;Yang,L.;Lu,Z.Anal.Biochem.2006,351,26–35.[7]Kristensen,R.;Gauthier,G.;Berdal,K.G.;Hamels,S.;Remacle,J.;Holst‐

Jensen,A.D.L.J.Appl.Microbiol.2007,102,1060–1070.[8]Arruda,D.L.;Wilson,W.C.;Nguyen,C.;Yao,Q.W.;Caiazzo,R.J.;Talpasanu,

I.;Dow,D.E.;Liu,B.C‐S.ExpertRev.Mol.Diagn.2009,9,749–755.[9]Lalvani,A.;Pareek,M.Brit.Med.Bull.2010,93,69–84.[10]Bellevillea,E.;Dufvaa,M.;Aamandb,J.;Bruunc,L.;Clausend,L.;

Christensen,C.B.V.J.Immunol.Methods2004,286,219–229.[11]Park,S.‐J.;Taton,T.A.;Mirkin,C.A.Science2002,295,1503–1506.[12]Chen,X.;Roy,S.;Peng,Y.;Gao,Z.Anal.Chem.2010,82,5958–5964.

58  

[13]Dill,K.,Liu,R.H.,Grodzinski,P.,Eds.InMicroarrays:Preparation,Microfluidics,DetectionMethods,andBiologicalAppli‐cations;SpringerLink:NewYork,2009,pp247‐260.

[14]Kojima,K.;Hiratsuka,A.;Suzuki,H.;Yano,K.;Ikebukuro,K.;Karube,I.Anal.Chem.2003,75,1116–1122.

[15]Roth,K.M.;Peyvan,K.;Schwarzkopf,K.R.;Ghindilis,A.Electroanalysis2006,18,1982–1988.

[16]Marchand,G.;Delattre,C.;Campagnolo,R.;Pouteau,P.;Ginot,F.Anal.Chem.2005,77,5189–5195.

[17]Schienle,M.;Paulus,C.;Frey,A.;Hofmann,F.;Holzapfl,B.;Schindler‐Bauer,P.;Thewes,R.IEEEJ.Solid‐St.Circ.2004,39,2438–2445.

[18]Lin,Z.;Takahashi,Y.;Kitagawa,Y.;Umemura,T.;Shiku,H.;Matsue,T.Anal.Chem.2008,80,6830–6833.

[19]delaRica,R.;Baldi,A.;Fern_andez‐S_anchez,C.App.Phys.Lett.2007,90,074102.

[20]Lo,C.Y.;Notenboom,R.H.;Kajioka,R.J.Immunol.Methods1988,114,127–137.

[21]VanGerwen,P.;Laureyn,W.;Laureys,W.;Huyberechts,G.;DeBeeck,M.‐O.;Baert,K.;Suls,J.;Sansen,W.;Jacobs,P.;Hermans,L.;Mertens,R.Sens.Actuators,B:Chem.1998,49,73–80.

[22]Pirnia,F.;Pawlak,M.;Thallinger,G.G.;Gierke,B.;Templin,M.F.;Kappeler,A.;Betticher,D.C.;Gloor,B.;Borner,M.M.Proteomics2009,9,3535–3548.

[23]Blakeley,R.L.;Zerner,B.J.Mol.Catal.1984,23,263–292.[24]Echevarría,M.G.;Nosetto,E.O.;Etcheverrigaray,M.E.J.Vet.Diagn.Invest.

2000,12,266–268.[25]Seidel,M.;Niessner,R.Anal.Bioanal.Chem.2008,391,1521–1544. 

 

 

 

 

 

 

59  

CAPÍTULOIV

IMPLEMENTACIÓNDEUNARRAYDEMICROPOCILLOSENELSISTEMADELECTURAELÉCTRICA.APLICACIÓNALADETECCIÓNDEBOLDENONA

En esta capítulo se describe la implementación de un array demicropocillos fabricados por litografía blanda en polidimetilsiloxano(PDMS)enelsistemadelecturaeléctrica,elcualaportaunasmejorasalfuncionamiento del mismo, que se describen y demuestran acontinuación.

4.1Resumen

Se ha fabricado una matriz de 36 micropocillos de PDMS empleandotécnicas de litografía blanda (del inglés soft lithography), el cual seposicionasobreelarraydetransductores,yconelquesepretendeevitary eliminar los problemas de funcionamiento que tenía el sistema delectura eléctrico descrito en el capítulo anterior. Dicha matriz demicropocillospermiteposicionarlasgotasdeladisolucióndemedidadeformamanual,evitandodeestaformaelempleodeinstrumentoscomoelmicrodispensador,empleadoanteriormente.Asuvez,cadamicropocilloaíslacadaunodelospuntosdemedidadelosadyacentesydelmedioqueles rodea, de tal forma que se evita la evaporación de la disolucióndurante la medida del microarray, así como el cross‐talk químico quetenía lugar entre puntos de medida adyacentes. Igualmente, semodificado la instrumentación desarrollada con el fin de minimizar elcross‐talkeléctricoquelaempleadainicialmentemostraba.

Gracias a la introducción de esta matriz de pocillos y a la nuevainstrumentación,sehaconseguidomejorar lasensibilidadyel límitededetección conseguido en la lectura eléctrica de un microarray,obteniéndose valores muy similares a los registrados empleando unmétodo de lectura fluorescente convencional, realizado usando unescáner. Estamejora tan significativa se demuestra para unmicroarraydesarrolladoparalamedidadelahormonaboldenona.

60  

4.2Introducción

El empleo de técnicas de litografía blanda para la fabricación demicroestructuraspoliméricasestámuyextendido.DesdequeelgrupodeWhitesideshaceyacasidosdécadas [1],describieseporprimeravez latécnicademicrotransferenciademotivosenunelastómero,enconcreto,el polidemetilsiloxano (PDMS), son muchas las técnicas incluidas en lallamadalitografíablandaquesehandescritoenlaliteraturaeinfinitasymuyvariadassusaplicaciones[2].Detodasellas,esquizáselmodelado(molding) lamásempleada,siendo igualmenteelPDMSelmaterialmásdemandadoenestecaso.Enlatécnicademodeladoseempleaunmásterque contiene el negativo de los motivos deseados, fabricado por otrastécnicaslitográficas.Silosmotivosestántodosenelrangodelasmicras,las técnicas fotolitográficas empleando fotoresinas son las másextendidas. De todas las fotoresinas, es quizás la conocida como SU‐8,comercializadaporDowCorninglamásaplicada.

Si nos centramos en la fabricación de micropocillos, estos se hanpropuestopararealizarcultivoscelularesprincipalmente.Porejemplo,seha descrito la fabricación demicropocillos de PDMS para el cultivo decélulas epiteliales humanas y su potencial aplicación en ingeniería detejidos [3]. Más recientemente, se ha descrito la fabricación de undispositivo que incluye un arraydemicropocillos enPDMSque incluyeestructuras complejas3Ddondepoder crecerembriones [4]. De formasimilar, en este trabajode tesis se fabricóunarraydemicropocillosde1.2µLdevolumenapartirdeunmásterdeSU‐8ymedianteelreplicadodel mismo en PDMS. Como se muestra a continuación, dicho arraypermitió eliminar varios de los problemas existentes en el primerprototipo del sistema de lectura eléctrico mostrado en el capítuloanterior.

Parademostrar laefectividaddelnuevosistemadelectura,serealizólalecturaeléctricadeunamicroarraypara lahormonaboldenona,basadoenunformatodeinmunoensayocompetitivoindirectoyelempleodelamarca enzimática ureasa. La boldenona es un esteroide anabólicoandrogénico (AAS). Los AASs son usados ilegalmente para mejorar el

61  

rendimiento de los atletas y también para aumentar la producción decarne en el campo agroalimentario [5]. Dichos esteroides estáncompletamenteprohibidosenlaagenciamundialantidoping(WADA)ylaUniónEuropea[6].

4.3Secciónexperimental

4.3.1.Diseñoyfabricacióndelsistemadelecturaeléctrico

LafabricacióndeIDEsdeorosehizodeformaanálogaaladescritaenelcapítulo 3 de este trabajo, con una única diferencia. En este caso seeliminaron las estructuras de apoyo de 300 µm de altura, que seempleaban en el diseño inicial para posicionar el microarray a unadistanciafijadellector.

Eldiseñodel arraydemicropocillos incluyeuna estructurade agujerosde 2mmde diámetro y 200 µmde altura, sobre la cual se definió unajuntadeotras200µmdealtura.Deestaformasedefinióunmicropocillode2mmdediámetroy400µmdealtura,conunvolumentotalde1.2µL.UnesquemadelosmismossemuestraenlaFigura4.1.

62  

Figura4.1.Esquemadeldiseñodeunmicropocillo.

ElarraydemicropocillosdePDMSsefabricóporlatécnicademodeladoempleandounmásterfabricadoadosnivelesconlafotoresinaSU‐8sobresustratos de silicio, por un proceso de fotolitografía estándar. Dichomáster contenía el negativo de las estructuras de los pocillos. Para sureplicado, se empleó el precursor del elástomero PDMS Sylgard 184, elcualsemezclóconelagentecurante(mezclacomercialdeDowCorning)enunaproporción10:1(v/v).SedesgasificólamezclaeinmediatamentesevertiósobreelmásterdeSU‐8.Seguidamente,elPDMSsecubrióconuna lámina de poliéster, sobre la cual se realizó una presión constanteposicionandounapiezapesadademetalencima.ElPDMSsecuródurante48horasatemperaturaambiente.Laláminadepoliésterseempleóparaprevenir que el PDMS se pegase a la láminametálica. La aplicación depresiónfuenecesariapararetirarelPDMSdelacarasuperiordelmásteryasíconseguirlasestructurasabiertasqueconsituyenlosmicropocillosenelarray.LaestructurafinaldelarraysemuestraenlaFigura4.2,juntoconsu implementaciónsobreelarrayde transductores.Comosepuedeobservar, la definición de las juntas de PDMS que forman parte de laestructura de los pocillos crea un espacio vacío entre las mismas quetieneunafunciónimportanteenelfuncionamientodelsistema,elcualsedescribemásadelante.

63  

Figura 4.2. Esquema del sistema de lectura que incluye el array de transductores, demicropocillosylasestructurasdealineamientoparaposicionarelmicroarray.

El sistemasecompletócon la instrumentacióndescritaenelcapítulo3,con la que realizar la lectura eléctrica. Esta incluye dos etapas deamplificacióndondesemantienelamismagananciaperoseminimizaelcross‐talkeléctrico,talycomosedescribemásabajo.

Una imagen del sistema de lectura y otra más detallada de unmicropocilloalineadosobreunIDEsemuestraenlaFigura4.3.

64  

Figura 4.3. Imágenes del array de IDEs encapsulado con el array de micropocillosalineadosobreelmismo.

4.3.2.Reactivosquímicosymateriales

Bicarbonatodeamonio,hidróxidodeamonio,glicina,ureasadeJackBean(tipo III, 15000‐50000 unidades/ g sólido), urea, tampón de fosfato enpastillas(PBS),Tween20,3‐glicidoxipropilmetildietoxisilano(GPTMS)yestreptavicina‐Cy3 fueron suministrados por Sigma‐Aldrich. Boldenonafue suminstrado por Sequoia Research Products, Ltd. (Oxford, UK). LosportaobjetosdevidriosondeCorning(PozuelodeAlarcón).Elconjugadoseroalbúminabovina‐ boldenona (BSA‐B) y el antisuero anti‐boldenonabiotinilado (anti‐B‐biot) fueron preparados en el laboratorio del grupoGrupo de Nanobiotecnología por Diagnóstico (Nb4D) del Instituto deQuímica Avanzada de Cataluña (iQAC), CSIC. Ambos reactivos fuerontestadospreviamenteparaladeteccióndeboldenonaenplacasdeELISA[7]. El kit de conjugación Lightning‐Link para estreptavidina de InnovaBiosciencesLtdfuesuministradoporAntibodyBCN(Barcelona)yusadopara producir el conjugado estreptavidina‐ureasa. El resto de losreactivosquímicosfuerondegradoanalítico.

65  

Sepreparóuntampóndeglicina250mM(Gli),elcualtieneunpHde6.1.Se preparó una soluciónmadre emulandourea hidrolizadamediante lamezcladeO.1MNH4HCO3y0.1MNH4OHentampónGli.PBScontenía10mMfosfatopH7.5enunadisoluciónsalinaal0.8%(137mMNaCl,2.7mMKCl).PBSTsepreparóañadiendoaPBS0.05%vTween20.PBST‐IseprepareañadiendoaPBS0.005%vTween20.Seprepareunadisolucióndeurea0.1MentampónGli.

4.3.3.Funcionamientodelsistemadelecturaeléctrica

LalecturaeléctricadelmicroarraysellevóacabollenandomanualmentelosmicropocillosdePDMSenel sistemade lectura conunexcesode ladisolución de urea, empleando una pipeta Pasteur. Se alineó elmicroarrayenelsistemaconlaayudadelasestructurasdealineamiento,detalmaneraqueelmismoseapoyabasobrelosmicropocillosdePDMS.Alhaceresto,elexcesodesolucióndeureaencadapocillossedesplazóalaespaciovacíoalrededordelasjuntasdecadapocillo,ypermanecióeneste espacio durante la medida. De esta manera se garantizó elaislamiento del líquido en un pocillo de los adyacentes además delllenadototaldecadaunodelospocillos.UnesquemadeesteprincipiodefuncionamientosemuestraenlaFigura4.4.

Lasmedidasdeimpedanciaseregistaroncadad15sduranteunmáximode1800s,aunafrecuenciafijade40kHz,potencialDCdeOVyamplitudde50mV.Lapendientedelacurvamedidaenunintervalodetiempofijosehatomadocomoseñalanalítica,deformaanálogaacomosehizoeneltrabajodelcapítulo3.

66  

Figura4.4.Esquemadeunaseccióntranversaldelsistemadelecturaeléctricaincluidoelarraydetransductores,losmicropocillosdePDMS(1),loscualesincluyenlajunta(2)yelespaciovacío(3)dondealojarelexcesodesolucióndeurea(4).

Elsistemadelecturarequieredeunmínimomantenimientoporpartedelusuario. Los IDEs y micropocillos se lavan con agua desionizada y sesecan en corriente de N2 después de cada uso. Cuando no se usa, seguardaenuncontenedortapadoencondicionesambientales.

4.3.4.Estudiosdecross‐talkquímicoyevaporación

ConelfindeestudiarelefectodelarraydemicropocillosdePDMSenlaprevencióndelcross‐talkquímicoylaevaporación,sehicierondilucionessucesivas de la disoluciónmadre que simula la hidrólisis de urea, tal ycomosemencionaenlasección4.3.2.,enunintervalodeconcentracionesentre 10‐5 M y 3x10‐2 M de urea hidrolizada. Estas se midieron en elsistemade lecturaconysinelarraydemicropocillos,estaúltimaconysin control de la humedad (recordatorio: para mantener la humedaddurante la medida se usaron tiras de papel absorbente mojadasdispuestas alrededor del array de IDEs, tal y como se menciona en elcapítulo3).

Para llevar a cabo el análisis, se añadió la dilución correspondiente deurea hidrolizada en 8 pocillos (dos columnas en el centro del array)mientrasqueen lasotrassólosepusoel tampóndeGli.Lospocillos se

11 3

4

2

67  

taparonconunportaobjetosdevidrio,talycomosehaceparalalecturadeunmicroarray.Paraaquellasmedidasrealizadassinlospocillos,gotasde 1.5 µL se posicionaron sobre los IDEs empleando elmicrodispensador.

4.3.5.Formatodeinmunoensayoparaboldenona

Se empleó un formato de inmunoensayo competitivo indirecto para ladetección de esta hormona. Inicialmente, los portaobjetos de vidrio sesilanizaron con GPTMS. Seguidamente, gotas de 0.2 µL de PBS quecontenían 100 µgmL‐1 del conjugado BSA‐B se depositaron sobre elsustratoconlaayudadelmicrodispensador.Estassedejaronsecara4ºCdurante una noche. A continuación, los sustratos ya modificados selavaron cuatro veces conPBST. Diluciones sucesivasdeunadisoluciónmadre de boldenona se prepararon en PBST‐I en un intervalo deconcentraciones de 0.3 nM a 3000 nM, y 50 µL de cada disolución semezclaron con 50 µL de una disolución del anti‐B‐biot 1 µgmL‐1preparadaenPBST‐I.Cadaunadelasdisolucionesresultantesseincubó30min a temperatura ambiente sobre el sustrato de vidrio empleandouna plantilla de PMMA fabricada por un proceso de mecanizado, quecontenía 9 pocillos, cada uno de los cuales incluía 4 puntos delmicroarray.50µLdecadaunadeestasdisolucionesseañadieronacadapocillo.Acontinuación,elsustratoselavódenuevocomoanteriormentey seguidamente se incubó cada uno de los pocillos con 100 µL de unadilución 1/400 de la disolución madre del conjugado estreptavidina‐ureasarealizadaenPBST‐Idurante1ha37ºC.Enelcasodelossustratospreparados para realizar la lectura fluorescente, esta última incubaciónse llevó a cabo con 100 µL en cada pocillo de una disolución delconjugado estreptavidina‐Cy3, preparada en PBST‐I. Se realizó unatercera etapa de lavado, como los anteriores y, finalmente, realizó otraetapade lavadoconel tampóndeGliparaelmicroarraypara la lecturaeléctrica y con agua desionizada para el fluorescente. Los sustratos sesecaron en una corriente de N2 antes de realizar las medidas. UnesquemadelinmunoensayoylalecturaeléctricadelarraysemuestraenlaFigura4.5.

68  

Figura4.5.EsquemadelformatodeinmunoensayodeBoldenona.Envioleta:ConjugadoBSA‐B;enrojo/azul–Anti‐B‐biot;ennaranja/verde–estreptavidina‐ureasa.ElrestodeloscoloressonlosmismosquelosmostradosenlaFigura4.4.

La lectura fluorescente se realizó con un ScanArray Gx PLUS (PerkinElmer,USA)usandoelfiltroópticoparaCy3,conunaresoluciónde5µm.LaintensidaddefluorescenciaencadaspotsemidióconelF543_Mean‐B543(mediadelaintensidaddelCy3menoslamediadelaintensidaddelfondo).

Tanto las medidas fluorescentes como las eléctricas se analizaronempleandounaecuaciónlógicaacuatroparámetrosmedianteelsoftware[SoftmaxPro v4.7 (Molecular Devices) and GraphPad Prism v 4(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)]. Para realizar lacomparativaentreambasmedidas,losvaloresanalíticossenormalizarontomando la media y la desviación estándar de cuatro replicados. Lascurvas de calibrado correspondientes se ajustaron a una la formulasiguiente:Y=[(A‐B)/1‐(x/C)D]+B,dondeAeslaseñalmáxima,Beslaseñalmínima,Ceslaconcentraciónquegenerael50%delaseñalentreA y B (IC50), y D es la pendiente del punto de inflexión de la curvasigmoidal.Ellímitededetección(LOD)sedefiniócomolaconcentraciónquegeneraunaseñaligualal90%delaseñalmaxima(IC90).

NH4+HCO3

‐

CON2H4

CON2H4

HCO3‐

NH4+NH4

+

NH4+

69  

4.4ResultadosyDiscusión

Elprincipiodefuncionamientodelsistemadelecturasehadescritoenelcapítulo 3. Sin embargo, este sistema presentaba varios defectos quelimitabansufuncionamientoentérminosdesensibilidadconrespectoalossistemasdelecturafluorescente.EnestecapítulosetratódemejorarelfuncionamientodelmismomediantelamejoradelainstrumentaciónylaimplementacióndelarraydemicropocillosdePDMS.

4.4.1.Cross‐talkeléctricoycalibracióndelsistema

Sehamejorado la instrumentación desarrollada, incluyendodos etapasdemedidaenvezdeunaqueteníalaoriginal.SerecogeunesquemaenlaFigura4.6.Cadaunodelasetapasincluyeunamplificadoroperacionaldeimpedancia muy baja. De esta forma, el cross‐talk eléctrico se reduceunas10veces(del3.1%quemostrabalaanterioral0.3%quemostrabala nueva instrumentación). Este valor de cross‐talk garantizó que elefectoenlasmedidasdeconductanciaconlosIDEsfuesendespreciables.

Figura4.6.Esquemade lanueva instrumentacióndesarrolladapara la lecturaeléctricadeunmicroarray.

70  

Conesta instrumentación, secalibróel arrayde IDEsconsolucionesdeKCldeconductividadconocida(σ)enelrangoentre20to140µS/cm,enlas condiciones descritas en la sección 4.3.3 y de forma análoga a lacalibraciónrealizadaenel capítulo3.Así, los resultadossecompararoncon los obtenidos utilizando un analizador de impedancias comercial.EstossemuestranenlaFigura4.7.

Figura 4.7. Rectas de calibración del array de IDEs usando la instrumentación y elanalizadorde impedanciascomercial.Losvaloresdeconductanciarepresentadosson lamedia de los obtenidos con los 36 IDEs del array, y la barra de error describe ladesviaciónestándardelasmedidas.LasmedidasconelanalizadorseregistraronusandosólounIDEdelarray.

LarespuestadelosIDEseslinealenelrangodeconductividadesmedido,y la desviación estándar relativa de los valores de conductancia (G)medidos está por debajo del 6 % en todos los casos. Igualmente, losresultados de calibración son muy similares a los obtenidos con elanalizador comercial si tenemos en cuenta la pendiente de lascorrespondientesrectasdecalibrado.Comosedescribióenelcapítulo3,dicha pendiente representa la inversa de la constante de celda (k) delIDE. Los valores de K fueron de 4.76 cm‐1 y 4.83 cm‐1, para lainstrumentaciónyelanalizador,respectivamente,siendoelerrormenordel1.5%.

71  

4.4.2.Estudiosdecross‐talkquímicoyevaporación

LaaplicacióndelosmicropocillosdePDMSgarantizaelaislamientodeladisolucióndemedidadecadapocillodelosadyacentes.Parademostrarlose realizaron los experimentos descritos en la sección 4.3.4 de la parteexperimental para diferentes concentraciones de urea hidrolizada ensolución.Seeligiócomoconcentraciónmáxima1mMdeureahidrolizada,teniendoen cuentaque la conductanciadeesta soluciónestáalrededorde40µS,siendoestevalormuycercanoalvalormáximodeconductanciadondelarespuestadelIDEesaúnlineal(verFigura4.6.).La Figura 4.8.muestra un esquema de la distribución de los puntos deanálisis en el microarray y los valores de respuesta registrados con elsistema de lectura sin y con el array de micropocillos de PDMS. Porclaridad en la presentación sólo se muestra la señal obtenida en dospuntosde1mMyensietepuntosdondesólosemidióGli(blancos).LaposiciónexactadeesosnuevepuntossemuestratambiénenelesquemadelaFigura4.8.Lasmedidasconelsistemaeléctricosinelarraydemicropocillosysinhumedad pocillos (Figura 4.8(A)) muestran una dispersión bastantegrande y una señal claramente diferente de 0 registrada en aquellospuntos que contenían blancos. Se observan dos fenómenos mezclados.Porunladoelefectodelcross‐talkquímicohaceque,enaquellosblancosmáscercanosalospuntosde1mMureahidrolizada,laGaumentedebidoalamigracióndelasespeciesCO2yNH3,esdecir,alcross‐talkquímico.Amedida que los puntos están más alejados de los de 1 mM ureahidrolizada, este efecto se va diluyendo y el aumento de G sea menosacusado, tal y como se esperaba. A su vez, en las señales de urea seregistró claramente el efecto de la evaporación, que hace que la Gaumente a partir de su valor inicial en la gota situada en el borde delarray,debidoalapérdidadevolumendelagota,yportanto,alaumentode la concentración de las especies iónicas presenten en la disolución.Igualmenteseobservaelefectodemigracióndeespeciesiónicasenestasseñales.LaseñaldeaquellagotadeureanosituadaenelbordemuestraunadisminucióndesuG,debidoprobablementeadicha,mientrasqueenlasituadaalborde,elefectodelaevaporaciónesmásacusadodeahíqueseregistreelmencionadoaumentodeG.

72  

73  

Figura4.8.Estudio de cross‐talk químico. Esquema de distribución de los puntos. Lasmedidas mostradas en las gráficas se corresponden con los puntos que aparecenmallados.Lasmedidassecorrespondena:(A)sinelarraydepocillosysinhumedad;(B)sinelarraydepocillosyconhumedad;(C)conelarraydepocillos.(D)Gráficodebarrasmostrandolaspendientesdelasrespuestas(entre100y400s)ygráficodepuntosdelosvalores registrados a los 1500 s. En verde – señales correspondientes al sistema conpocillos; en rojo – sin pocillos conhumedad; ennegro‐ sinpocillos y sin humedad. Lasbarrasdeerrormuestranladesviaciónestándardelosvaloresregistradoscontodoslospuntosqueconteníanlamismadisolución.

Las medidas registradas sin el arraydepocillospero conhumedadpocillos (Figura4.8(B))muestranunadispersiónmenorqueenel casoanterior,peroaúnsevendiferenciasentrelosblancos,detalformaquelos que están más cerca de los puntos que contienen 1 mM de ureahidrolizada muestran los cambios en G mayores y estos cambios vandisminuyendoamedidaquenosalejamosdedichospuntos.Lasseñales

74  

registradasenlospuntosconureasonenestecasomuysimilaresdebidoa que al poner humedad el efecto de la evaporación es prácticamentenulo,mostrándose solamenteel efectodel cross‐talkquímico en ambospuntos.Por último, las medidas registradas con el array de pocillos (Figura4.8(C))muestranseñalesmuyestablestantoparalosblancoscomoparalospuntosconurea,loquedemuestraqueestasestructurasevitantantolaevaporacióncomoelcross‐talk.Enamboscasos,laspendientesdelasrespuestassoncero,demostrandoquenohayvariaciónalgunadeGconeltiempo.La Figura4.8(D)muestra las pendientes de los perfiles de respuesta asícomolosvaloresabsolutosdeGtomadosa1500s.Serepresentalamediayladesviaciónestándardetodoslospuntosdelmismotipo.Semuestracomo los valores registrados usando el array de pocillos de PDMSmuestra los valores más estables y las dispersiones más bajas. Estosdatos ponen demanifiesto la utilidad del array de pocillos y lamejorasignificativaquehasupuestosuimplementaciónenelsistemadelecturaeléctrica.Conel findeevaluarsisepodríanmedirconcentracionesaúnmásaltasdeureahidrolizadasinelefectodelcross‐talk,semultiplicópor10dichaconcentraciónyserepitióelexperimentoanterior.LaFigura4.9muestralosresultados.SeapreciacómolosperfilesderespuestacuandonoseempleóelarraydemicropocillossonaúnmásdisparesmientrasquelosregistradoscuandoseusaronlospocillosapareceuncambioapreciabledeGparalosblancosmáspróximosalospuntosdeureahidrolizada10mM.Enelrestodeloscasos la señal es estable y la pendiente de la respuesta es cercana a 0.Este estudio pone de manifiesto que, en el caso de obtenerconcentracionesdeureahidrolizadamásaltasde1mM,sedeberíaponerespecialcuidadoensituarlosblancosenpuntosalejadosaaquellosquecontienen las concentraciones más altas de analito. Sin embargo caberecordar que los valores de conductancia registrados para estasconcentracionesestánfueradelrangolinealderespuestadelsistemadelectura, que como se indicó anteriormente, tiene un límite superioralrededorde40µS.

75  

Figura4.9.Estudiodecross‐talkquímicoconunadisolucióndeureahidrolizada10mM.CondicionescomoenlaFigura4.7.

76  

4.4.3.Lecturaeléctricayfluorescentedelarrayparaboldenona.

Serealizó la lecturaeléctricadeunmicroarrayempleandoelconjugadoestreptavidina‐ ureasa y la lectura fluorescente de otro que incluye elconjugadoestreptavidina‐Cy4.Los resultados semuestran en laFigura4.10. En ambos casos se observa el perfil sigmoidal típico en la escalasemilogarítmica.

Figura4.10. Curvasdecalibradodelmicroarraydeboldenonaobtenidasconelsistemadelecturaeléctricoymedianteunescánerdefluorescencia.Paralasmedidaseléctricassetomaronlaspendientesdelosperfilesderespuestaentre10y400s.Lospuntosmuestranlosvaloresmediosdecuatromedidasrealizadasparacadaconcentraciónylasbarrasdeerrorrepresentanladesviaciónestándardedichasmedidas.

LaconcentraciónmáximaadmitidaporlaWADAesde10ngmL‐1.ConelarrayeléctricoseobtuvounavalordeIC50de180.4ngmL‐1yunlímitededetecciónde4.0ngmL‐1,mientrasqueconelarrayfluorescenteelvalordeIC50fuede425.2ngmL‐1yellímitededetecciónde15.2ngmL‐1.Enelcasodel arrayeléctrico seobtuvounvalorclaramentepordebajode laconcentración máxima permitida, mientras que en el fluorescente esligeramentemásalto. Además, losvaloresobtenidosconelsistemadelectura eléctrica son ligeramente mejores que los obtenidos con lamedidafluorescente,loqueponedemanifiestolamejoraconseguidaennuestrosistemaalimplementarelarraydemicropocillosdePDMS.

77  

4.5Conclusiones

SellevóacabolaimplementacióndeunarraydemicropocillosdePDMSfabricado por litografía blanda en el sistema de lectura de microarray,conelqueseevitólosproblemasdecross‐talkquímicoyevaporacióndelosqueadolecíaelprimersistemadesarrollado,mostradoenelcapítuloanterior. Igualmente se mejoró la instrumentación asociada y se logróreducir el ruido eléctrico hasta 10 veces, haciéndolo despreciable. Elpotencialdelarraydemicropocillossedemostrómediante la lecturadeuna microarray para boldenona, donde se consiguieron límites dedetecciónmuyinferioresalosvaloresmáximospermitidosporlaWADAademás de conseguir sensibilidades muy similares con el sistema delectura eléctrica a las obtenidasmediante la lectura fluorescente. Estosdatosdemuestranelimportanteavancequelaintegracióndelospocillosde PDMS ha supuesto en el funcionamiento del sistema de lecturaeléctricademicroarraysdesarrollado.

Referencias

[1]XiaY,WhitesidesGM.AngewChem,IntEd1998;37:550–75.

[2]QinD,XiaY,WhitesidesGM.Nat.Prot.2010;5:491‐502.

[3]MiY,ChanY,TrauD,HuangP,ChenE.Polymer2006;47:5124–5130.

[4]XuY,XieF,QiuT,XieL,XingW,ChengJ.Biomicrofluidics2012;6:016504.

[5]WorldAnti‐DopingAgency(WADA),2004:http://www.wada‐ama.org/Documents/World_Anti‐Doping_Program/WADP‐IS‐Laboratories/Archives/WADA_TD2009MRPL_Minimum_Required_Performance_Levels_V2.0_EN.pdf

[6]EuropeanCommission,Directive2003/74/EC,Off.J.Eur.Commun.L,262,vol.46,pp.17‐21,2003.

[7]TortN,SalvadorJP,MarcoMP.Anal.Bioanal.Chem.2012;403:1361‐1371.

78  

CAPÍTULOV

FABRICACIÓNDEUNDISPOSITIVOFLUIDICOPARAELLLENADO AUTOMÁTICO DEL ARRAY DEMICROPOCILLOS:AUTOMATIZACIÓNDELSISTEMADELECTURA

A partir de los resultados alcanzados con el array de micropocillos dePDMS, se pensó en mejorar el proceso de lectura mediante laautomatización del proceso de llenado de los pocillos y la limpiezaposterior de losmismos una vez realizada la lectura de unmicroarray.Paraellosediseñóy fabricóundispositivomicrofluídicodePDMS.Estecapítulorecoge ladescripcióndedichodispositivo,su funcionamientoyla aplicación del sistema de lectura eléctrica para la medida de dospesticidas.

5.1Resumen

Eneste trabajosedesarrollóundispositivomicrofluídicoque integraelarraydemicropocillosdePDMSdescritoenelcapítuloIV, juntocon loscomponentes microfluídicos necesarios para realizar el llenado de losmismosconladisolucióndemedidaasícomollevaracabosuvaciadoylimpieza una vez realizada la lectura de un microarray. El dispositivoconstadecanalesdeentrada individualesacadaunode lospocillosdelarray para su llenado, al igual que pequeños orificios conectados acanalesdesalidaeneláreavacíaexistentealrededordelasjuntasdelospocillos,queactúanamododesumiderosparaelvaciadodelospocillosysulavado.Eldispositivomicrofluídicosepuedeposicionarsobreelarrayde IDEs, de manera análoga al array de micropocillos del capítuloanterior. Se evaluó su funcionamiento y sedemostró el funcionamientodelsistemadelecturafinalmediantelalecturadelospesticidasatrazinaysimazina,obteniéndosevaloresanalíticosmuysimilaresalosobtenidos

79  

mediante lectura fluorescente ymuy por debajo de los valores umbraladmitidosenaguas.

5.2Introducción

Durante los últimos años la tendencia a la miniaturización de losdispositivosengeneralesmuyclarayeláreadelosequiposanalíticosnoeslaexcepción,dondeelrápidodesarrolloenestaáreahadadoalugaralconcepto de laboratorio en un chip o microsistemas de análisis total(µTAS). Estos sistemas de ensayo miniaturizados se han venidoaplicando en diferentes áreas de la biología, incluyendo la genómica, laproteómicaylosensayosmultianalitoentreotros.Conrespectoalcampode los inmunoensayos, se han venido desarrollando diferentesdispositivos microfluídicos para adaptar los convencionales ensayosELISA a la microescala [1]. Los sistemas microfluídicos por suversatilidad, son herramientas que permiten la automatización desistemas de lectura de microarrays, adaptándolos a los sistemasanalíticosyadesarrolladoscomoeselcasodenuestrosistemadelecturaeléctricademicroarrays.

La atrazina y la simazina son herbicidas de la familia de las triazinasutilizados durante años para el control de malezas en la industriaagrícola. La toxicidadde estas triazinas y su elevadapersistencia en elmedioambientederivóenlaprohibicióndesuusoenlaUniónEuropeaen 2005 y su inclusión en la lista de sustancias contaminantesprioritarias, cuya monitorización seráde obligado cumplimiento enunfuturopróximo[3,4].Apesardeestarprohibidos,debidoalautilizaciónmasiva de estos pesticidas en el pasado, es necesario llevar a cabo unriguroso control de la presencia de dichos compuestos triazínicos enaguas,suelos,etc.

Lalegislacióneuropeaestableceunaconcentraciónmáximaadmisibleenaguasde2ppbparaatrazinay4ppbparasimazina[4].EstonivelessonsimilaresalosestablecidosporlaEPA(AgenciadeProteccióndelMedio

80  

Ambiente)enEstadosUnidos(3ppbatrazinay ppbsimazina),dondeelusodeatrazinaysimazina,aunquerestringido,aúnestápermitido[5].

Lastécnicasmásempleadasparaladeterminacióndeestospesticidasenaguas son la cromatografía de líquidos (HPLC) y la cromatografía degases (GC), acopladas a espectrometría de masas (MS) [6]. En labúsquedadealternativasmássencillas,rápidasyeconómicas, laEPAhaverificadoen losúltimosaños, lautilizacióndediversoskitsdeanálisisbasados en inmunoensayos (http://nepis.epa.gov.). Además de lasventajascitadasconanterioridad,losinmunoensayospresentanunagransensibilidad y selectividad, basada en la elevada afinidad de la uniónantígeno‐anticuerpo. Dichos inmunoensayos pueden ser aplicados enformatomicroarray[7].

5.3SecciónExperimental

5.3.1Diseñoyfabricacióndelsistemamicrofluídico

Se diseñó un dispositivo en PDMS que incluye la plantilla con losmicropocillosqueconfinanlasgotasencadapunto.

LosmotivosdelaplantillasedibujaronconCADENCE.Sedibujarontresnivelesdemáscara,elprimeroconteníalospozosde2mmdediámetroy400micrasdeprofundidad,dondevacadaIDE.Elsegundonivelconteníalos anillos que rodea cada pozo y el tercer nivel corresponde a losmicrocanales que distribuyen la solución de lectura dentro y fuera delsistema.Se fabricó lamascarayserealizóunmasterenSU‐8,de formaanáloga a la fabricación descrita en el capítulo 4. Igualmente, lasmicroestructurasdefinidasenelmástersereplicaronenPDMSsiguiendoelprocedimientodescritoenel capítulo4, con laúnicavariaciónqueelporcentajedepolímeroyagenteentrecruzantefuede1:5,envezdel1:10empleadoanteriormente.

81  

SefabricaronlasdospiezasdePDMSqueformaneldispositivofluídico.Estas se pegaron activando las superficies en un plasma de oxígeno yalineándolas empleando una estructura de autoalineamientodesarrolladaenelgrupo.

Figura5.1.Esquemadeladistribucióndeloscanalesdelamicrofluídica.ElCanalrojoesel de llenado y el canal azul es el de vaciado. En uno de los puntos de medida seesquematizael funcionamientodelsistema.a)El líquidoesempujadodesdeelcanaldeentradaacadapuntodemedida.b)ElliquidosaledelanillodePDMSycubreloscuatrodesagües que rodean cada punto. c) Simultáneamente este líquido es aspirado hasta elcanaldesalida.

EnlaFigura5.1sepuedeveresquematizadoelsistemademicrofluídica.Este sistema está formado por 2 microcanales principales, uno paradistribuirlasolucióndemedidaencadapunto(elcanaldeentradarojo)yelotropararecogerlasolucióndespuésdecadamedida(elcanalsalidaazul).Del canal de entradaparten canales a cadapocillo. Además, cadapocilloestárodeadoporcuatroorificiosquehacendedesagüe.Porestos

82  

agujeros de desagüe se recoge la solución de medida y la solución delimpiezadespuésdecadamedida.

5.3.2Reactivosymateriales

Todos los reactivos empleados a excepción de los requeridos pararealizar el inmunoensayo fueron los mismos que los empleados en elcapítulo4.Portaobjetosdevidrio(25x75mm)modificadosconpolilisinafueronsuministradosporThermoy filtroscentrífugosAmiconUltra0.5mL,100kDafueronsuministradosporSigma‐Aldrich.

5.3.3PesticidasyHaptenos

Laatrazina,lasimazina,loshaptenos2a,2bylosbioconjugados2a‐BSAy2b‐BSA(BSA‐albúminadesuerobovino)fueronfacilitadosporelGrupodeNanotecnología y Diagnóstico (Instituto de Química Avanzada deCataluña,IQAC‐CSIC).Losbioconjugadosde loshaptenos2ay2bconBSAsonutilizadosparaeltapizadodelossustratosdevidrio.

Ambos pesticidas son estructuralmente muy similares y su estructuraquímicasemuestraenlaFigura5.2.

Figura5.2.Estructuraquímicadelaatrazinaylasimazina

N

N

N

Cl

NH

NH

N

N

N

Cl

NH

NH

Atrazina Simazina

83  

5.3.4Inmunoreactivos

Los antisueros policlonales de conejo As8 y As12 obtenidos utilizandomediante la inmunización de los conjugados 2c‐KLH y 2d‐KLH (KLH‐hemocianina) respectivamente, también fueron facilitados por elGrupodeNanotecnologíayDiagnóstico.

El anticuerpode ratón anti‐IgGde conejomarcado con isotiocianatodetetrametilrrodamina (TRICT), empleado para los ensayos con lecturafluorescente y el anticuerpo biotinilado de ratón anti‐IgG de conejonecesarioparalamedidaeléctricasecompraronaSigma‐Aldrich.

Para realizar la lectura se empleó el conjugado estreptavidina‐ ureasaobtenidasiguiendoelkitdeconjugacióndescritoenelcapítuloanterior.

5.3.5Inmunoensayoenzimáticocompetitivoindirecto

Enuninmunoensayocompetitivodetipoindirectoelconjugadohapteno‐proteínaseencuentrainmovilizado,yelanalitoyelanticuerposeañadenendisolución.

Ennuestrocaso, losbioconjugadoshapteno‐proteína(2a‐BSAy2b‐BSA)seinmovilizansobreunsustratodevidriomodificadoconpolilisinatodala noche a 4ºC. A continuación, se añade la muestra incorporando unanticuerpo2a‐BSA10µg/mLenPBSpH7.5(As8)y2b‐BSA5µg/mLenPBSpH7.5(As12)capazde interaccionarselectivamenteconelanalito.Durante esta etapa, el analito presente en la muestra compite con elinmovilizadoporelanticuerpoespecíficoendisolución.Laconcentraciónde analito se mide de forma indirecta mediante la adición de unanticuerpo secundario (anti‐IgG) unido covalentemente a la enzimamarcadora.

Enelconjugadode tapizadoseutilizaunaproteínadiferentea lausadaparainmunizar,conelfindeevitarqueelanticuerporeconozcatantoalanalito como a la proteína de tapizado. Por ello, los sueros As8 yAs12obtenidos al inmunizar con KLH se ensayaron frente a conjugados deBSA.

Lasconcentracionesytiemposdeincubacióndetodaslasetapas,exceptolareacciónbiotina‐estreptavinina,exclusivadelalecturaeléctrica,fueronpreviamente optimizadas mediante lectura fluorescente. Los lavados

84  

entrecadapasose realizaronconPBST.Elbloqueode la superficieconBSA 1% en PBS durante media hora. Las incubaciones se hicieron enPBST durante 30 min, con distintas concentraciones de pesticida libre(10μM ‐0.01 nM ) y una dilución 1/500 del As8 y 1/2000 del As12.Después, la incubación con el anticuerpo anti‐IgG de ratón (1/250 enPBST)marcadoconbiotina, sehizodurantemediahora.Paralelamente,en el ensayo con lectura fluorescente se incuba con un anticuerpomarcado con TRICT, la lectura del ensayo fluorescente (543 nm). Seetiqueto el ensayo incubándolo con ureasamarcada con estreptavidinaenPBSaunadisoluciónde1/5000durantemediahora.Sehicieron losdos últimos lavados protocolizados con PBST y finalmente glicina. Y seprocedióa la lecturaeléctricaen0.1Mureaen250mMglicinadurante30min.

El la Figura 5.3 se puede observar un esquema del bioensayodesarrolladoparaestaaplicación.

Figura5.3.Esquemadeunbioensayoparadetectarpesticidas

5.4Resultados

EnlaFigura5.4semuestraeldispositivomicrofluídicofabricadoconlospocillosllenosconunadisolucióncoloreada.Estospocillossehanllenadoinyectando la disolución a través del canal de entrada y se puso demanifiesto que se podían llenar los 36 pocillos del array de formasimultáneaenpocossegundos.LaFigura5.4muestraundetalledeseispocillos,dondeseaprecian loscanalesdeaccesoa losmismosasícomolos 4 orificios alrededor de cada uno de ellos conectados a sus

85  

correspondientes microcanales y al canal de desagüe, empleados pararealizarelvaciadoylavadoposteriordeldispositivo.

Figura5.4ImágenesdeldispositivofluídicofabricadoEn las Figuras 5.5 y 5.6 se puede observar las curvas de calibradoobtenidasenlalecturaeléctricadelosmicroarraysrealizadossiguiendolos protocolos de inmunoensayo descritos en la sección anterior. Pararealizar lascurvassetomócomorespuestaanalíticadel lectoreléctrico,la pendiente del perfil de respuesta entre 400 y 600 s. Como se puedeobservar, el As 8 responde de manera similar a ambos pesticidas,mientrasqueelAs12presentaunamayorsensibilidadparalaatrazina.

Figura5.5.ResultadosdelalecturaeléctricadearraydeproteínasAs8.Losvaloressonlamediadelasmedidasdecuatropuntosdelarray,siendolasbarrasdeerror,ladesviaciónestándardedichasmedidas.

Atrazine

As8

Simazine

86  

Figura5.6.ResultadosdelalecturaeléctricadearraydeproteínasAs12.OtrosdatoscomoenlaFigura5.5.

Loslímitesdedetección,calculadoscomolaconcentracióndeanalitoqueoriginaunadisminucióndelaseñalrespectoalblancodel10%estánpordebajodelosvaloresmáximospermitidosporlalegislación,talycomosepuedeobservaren las tablasde la figura5.6.El IC50es laconcentraciónqueprovocaun50%dedisminucióndelaseñalmáximaysecorrespondeconelpuntodeinflexióndelacurva.

Figura 5.7. Tablas con los parámetros analíticos extraídos de las curvas de calibrado

mostradosenlasFiguras5.5.y5.6.

As12

Atrazine

Simazine

ATRAZINE IC50(nM) IC50(ppb) LD (nM) LD (ppb)

As8 3,59 0.77 0,24 0.05

As12 7,84 1.69 1,04 0.22

SIMAZINE IC50(nM) IC50(ppb) LD (nM) LD (ppb)

As8 3.38 0.68 0.07 0.01

As12 225 45 2.4 0.48

87  

La sensibilidad obtenida empleando el sistema de lectura eléctrico esmuysimilaralaregistradamediantelalecturafluorescente,talycomoseapreciaenlaFigura5.8.

Figura5.8. Resultados comparativos de los dos estudios realizados en paralelo con elsistemadelecturaeléctricayelfluorescente.

5.5Conclusiones

Se desarrolló un dispositivo microfluídico con el que llevar a cabo laautomatizacióndel sistemade lectura eléctrico, que incluye el arraydemicropocillos y los componentes fluídicos necesarios para su llenadosimultáneo y su lavado posterior una vez realizada la lectura de unmicroarray.

As12 IC50(ppb) LD(ppb)

Fluorescent 1.69 0.40

Conductimetric 2.28 0.22

As8 IC50(ppb) LD(ppb)

Fluorescent 2.55 0.12

Conductimetric 0.77 0.05

88  

Pardemostrarelsistemadelecturaunavezimplementadoeldispositivomicrofluídico,sellevóacabolalecturaeléctricadeunmicroarrayparalamedida de atrazina y simazina, obteniéndose límites de detecciónmásbajosquelosvaloresumbralpermitidosporlaUniónEuropeaenaguas.Igualmente se consiguieron valores analíticos similares a los obtenidosconelarrayfluorescente,conloquepodemosconcluirqueelsistemadelecturaeléctricodesarrolladoenestetrabajoesunaalternativarealalossistemasfluorescentestanestudiadosycomercializados[8].

Referencias

[1] Yakovleva, J. Et al. Microfluidic enzyme immunosensors withimmobilised protein A and G using chemiluminescence detection.BiosensorsandBioelectronics19(2003)21‐34.

[2]Bonilla,D.Et al.ElectricalReadoutofProteinMicroarraysonRegularGlassSlides.Anal.Chem.2011,83,1726–1731

[3]Regulación del Parlamento Europeo y del Consejo (EC) 689/2008(AnexoI).

[4]DirectivadeParlamentoEuropeoydelConsejo2008/105/CE.

[5]EPA822‐S‐12‐001.2012EditionoftheDrinkingWaterStandardsandHealthAdvisories

[6]Islam,DFK.Etal.Fastdetectionoftriazineherbicidesonamicrofluidicchip using capillary electrophoresis pulse amperometric detection.MicroelectronicEngineering97(2012)391–395.

[7]Morals,S.Etal.MultiplexedMicroimmunoassaysonaDigitalVersatileDisk.Anal.Chem.2009,81,5646–5654

[8] Nagl, S. Et al. Fluorescence Analysis in Microarray Technology.MicrochimActa151,1‐21(2005)

89  

CAPITULOVI

CONCLUSIONES

Sedesarrollóunsistemadelecturaeléctricademicroarraysqueincluyeun array de transductores interdigitados, con los cuales poder detectarcambios en la conductividad de una solución. Con el fin de acoplar elsistemadelecturaalosmicroarraysseempleólaureasacomomarcaenlos inmunoensayos aplicados, teniendo en cuenta el cambio enconductividadquetienelugarcuandolaureasacatalizalahidrólisisdelaureaygeneralasespeciesiónicasbicarbonatoyamonioendisolución.

La particularidad que tiene este sistema de lectura es que permitetrabajar con microarrays desarrollados sobre sustratos de vidrioconvencionalesy es reutilizable, siendoeste elprimer sistemaeléctricode estas características reportado hasta la fecha. El sistema permitealinear unmicroarray de tal forma que cada punto delmismo coincidaconuntransductordelsistema.Ambosseponenencontactomedianteladisolución de medida. Así, durante la lectura, los cambios deconductividadque tienen lugar en lamisma, directamente relacionadoscon la concentración del analito a través del uso de la marca ureasa,puedensermedidosconeltransductor.

Para realizar dicha lectura se diseñó y fabricó una instrumentación demedidatipofila‐columnacapazdeanalizarunagrancantidaddepuntosenmuypocotiempo.

Eltrabajofueincrementaldetalformaqueseconsiguieronlossiguientesavances:

90  

1. Inicialmentecomopruebadeconceptosedemostrólalecturaeléctricademicroarraysdeproteínasensustratosdevidrioconvencionales.Serealizó la lectura de un microarray para un analito modelo, unainmunoglobulinade ratón,dondesepusodemanifiesto laviabilidaddel sistema de lectura propuesto y su buen funcionamiento. Lasensibilidad y los límites de detección fueron sensiblemente máselevadosque losobtenidosmediante lectura fluorescente.Seplanteóque tales resultados se debían a problemas de cross‐talk eléctrico yquímico así como efectos debidos a la evaporación de las gotas desolucióndemedida.

2. Enunsegundotrabajosedemostrólamejoraenelfuncionamientodelsistema de lectura eléctrica para microarrays basada en laimplementacióndeunarraydemicropocillosdePDMS.Seevaluósufuncionamientomediantelalecturadeunmicroarrayparalahormonaboldenona. Se obtuvieron resultados con límites de detección ysensibilidad similares a los obtenidos con el sistema de lecturafluorescente, con la ventaja de que solo se requirió nuestrainstrumentacióncompactaydepreciooptimo.LosresultadosdeesteenfoquepuedencontribuiraldesarrollodeestaplataformaanalíticaysusaplicacionesparadescentralizardiagnosticosPoC.

3. Finalmente en un tercer trabajo se logró automatizar el proceso demedida del sistema de lectura mediante la implementación de unarray de micropocillos de PDMS que incluían los componentesmicrofluídicosnecesariosparael llenadoautomáticosdellosmismosy su lavado posterior tras cada medida. Se demostró el buenfuncionamientodelsistemamediantelalecturadeunmicroarrayparala medida de los pesticidas atrazina y simazina, obteniéndoseresultados muy similares a los registrados mediante la lecturafluorescente.

A partir de estos resultados podemos decir que el sistema de lecturaeléctrico propuesto puede ser una alternativa real a los sistemas delecturafluorescentesusadosdeformahabitualenlaboratoriosdeensayo,conlaventajaañadidadeserunsistemamuchomásbarato,compactoyquepermitiríadescentralizarestetipodeensayosy,conello,aplicarloaladeteccióndeunamayorvariedaddeanalitosdeinterésenloscamposdeldiagnósticoyelmedioambiente.

91  

Comotrabajofuturoseabrelapuertaalaminiaturizacióndeldispositivoyelaumentodeladensidaddepuntosdelectura,conelfindemejorarelrendimiento del sistema de lectura y acercarse un poco más a losmicroarraysdefluorescenciaactualmenteenuso.