ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE GENES EN Pseudomonas aeruginosa CON POTENCIAL PARA LA REMEDIACIÓN DE

PLOMO.

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS APLICADAS

EN EL ÁREA DE BIOTECNOLOGÍA

PRESENTA:

LUIS TERRAZAS SALGADO

DIRECTOR DE TESIS: DR. ISRAEL BENÍTEZ GARCÍA

CODIRECTOR DE TESIS:

DRA. CAROLINA BOJÓRQUEZ SÁNCHEZ

Mazatlán, Sinaloa, septiembre de 2017.

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE SINALOA

MAESTRÍA EN CIENCIAS APLICADAS

ACTA DE LIBERACIÓN DE TESIS

DEDICATORIA

A mi madre y padre, hermana y amigos.

AGRADECIMIENTOS Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca otorgada durante mis estudios de maestría. A mis directores, Dra. Carolina Bojórquez Sánchez y Dr. Israel Benítez García por su ejemplo de trabajo y dedicación. A la Universidad Politécnica de Sinaloa por el apoyo para la realización de este proyecto y terminación de mis estudios de posgrado. A mi comité, Dra. Irasema Luis Villaseñor y Dra. Magda Bergués Tiznado por sus aportaciones, consejos y sugerencias a mi trabajo.

INDICE

Resumen ......................................................................................................... 13

Abstract .......................................................................................................... 14

CAPÍTULO I ................................................................................................. 15 I.I Introducción ............................................................................................................................ 15 I.II Antecedentes .......................................................................................................................... 16

I.II.I Biorremediación .............................................................................................................. 16 I.II.II Metales pesados ............................................................................................................. 16 I.II.III Plomo ............................................................................................................................ 16 I.II.IV Orígenes de la resistencia bacteriana a metales pesados .......................................... 17 I.II.V Mecanismos de resistencia y metabolismo de metales pesados ................................. 18 I.II.V.I Captura y expulsión de iones en la célula bacteriana .............................................. 18 I.II.VI Interacciones de Pb en microorganismos .................................................................. 19 I.II.VII Genes de resistencia en Pseudomonas aeruginosa ................................................... 21

I.III Planteamiento del problema ............................................................................................... 22 I.IV Hipótesis ................................................................................................................................ 23 I.V Objetivos ................................................................................................................................. 24

I.IV.I General ........................................................................................................................... 24 I.IV.II Específicos .................................................................................................................... 24

CAPÍTULO II ............................................................................................... 25 II.I Materiales y Métodos ............................................................................................................ 25

II.I.I Reactivación de cepas a presencia de metales pesados ................................................ 25 II.I.II Análisis de in silico de la secuencia de P. aeruginosa ................................................. 25 II.I.III Síntesis de cDNA para análisis de transcritos. .......................................................... 26 II.I.IV Identificación del gen de resistencia y constitutivos por PCR punto final. ............ 26 II.I.V Cuantificación de transcritos por PCR en tiempo real .............................................. 27

CAPÍTULO III .............................................................................................. 28 III.I RESULTADOS .................................................................................................................... 28

III.I.II Análisis in silico de la secuencia de P. aeruginosa. ................................................... 28 III.I.III Amplificación del gen de resistencia y constitutivos por PCR punto final ........... 30 III.I.IV Cuantificación de transcritos por PCR en tiempo real ........................................... 33

CAPÍTULO IV .............................................................................................. 35 Discusión ....................................................................................................................................... 35

CAPÍTULO V ............................................................................................... 37 Conclusiones ................................................................................................................................. 37 Con base a la hipótesis y a los objetivos planteados, se concluye que: .................................... 37

REFERENCIAS ............................................................................................ 38

LISTA DE FIGURAS:

Figura 1. Mecanismos intra y extracelulares involucrados en la biorremediación microbiana de MP presentes en el ambiente. Figura 2. Prototipos de los principales sistemas de eflujo de iones metálicos. Figura 3. Ilustración general de los mecanismos genéticos de resistencia a MP en bacterias. Figura 4. Amplificación de fragmento de interés por PCR In silico, gen PA1R_gp1547. Figura 5. Amplificación de fragmento de interés por PCR In silico, gen gapA. Figura 6. Amplificación de fragmento de interés por PCR In silico, gen rpsL. Figura 7. Amplificación de fragmento de interés por PCR In silico, gen proC. Figura 8. Resultado de extracción de cDNA. Tiempo de corrida 45 min. y 1% el gel. Figura 9. Amplificación del fragmento de interés por PCR en cepa aclimatada con MP y no aclimatada. Figura 10. Amplificación del fragmento de los genes proC y rpsL con y sin Pb por PCR punto final. Figura 11. Amplificación del fragmento del gen gapA con y sin Pb por PCR punto final. Figura 12. Curva estándar del gen PA1S_gp1547 Figura 13. Curva estándar del gen gapA, Figura 14. Expresión relativa del gen PA1R_gp1547 con plomo (1) y sin plomo (2).

Resumen

Los microorganismos se encuentran expuestos en la naturaleza a los metales pesados, comúnmente en sus formas ionizadas. Estos iones generan diversos efectos tóxicos sobre los mismos y a su vez, la exposición a este tipo de contaminantes ha provocado que los microorganismos desarrollen diversas estrategias de resistencia cuando son expuestos a elevadas concentraciones. Se han identificado diversos y eficientes mecanismos de resistencia (genes) en diversas especies de bacterias; entre estos se encuentran los que expulsan metales pesados, destacando los que emplean ATPasas de tipo P. Algunos de esos genes microbianos de tolerancia y resistencia a metales tienen el potencial para ser utilizados en procesos biotecnológicos, como la biorremediación de la contaminación ambiental por metales tóxicos. El presente estudio buscó relacionar los transcritos del gen PAgp_1547 que codifica para una ATPasa de tipo P en Pseudomonas aeruginosa cultivadas en medios adicionados con y sin la presencia de plomo. Se cultivó P. aeruginosa en medio adicionado con una concentración de 17.4 mg/L de ClPb2 y se utilizó PCR en tiempo real (qPCR) para cuantificar los niveles de transcrito del gen PAgp_1547. Los resultados de la expresión del gen y su análisis revelaron que el gen PAgp_1547 muestra una sobre expresión en medio adicionado con plomo. Palabras clave: Metales pesados, Pseudomonas, ATPasa, expression.

Abstract

The micro-organisms are exposed in nature to heavy metals, commonly in their ionized form. These ions produce a variety of toxic effects on themselves and at the same time, the exposure to these types of pollutants have caused microorganisms to develop various strategies of resistance when they are exposed to elevated concentrations. There have been identified various and efficient mechanisms of resistance (genes) in different species of bacteria; among these are the ones that expel heavy metals, highlighting those which employ a type Atpases P-type. Some of these microbial genes of tolerance and resistance to heavy metals have the potential to be used in biotechnological processes, such as bioremediation of the environmental pollution by toxic metals. The present study sought to relate the transcribed gene PAgp_1547 that encodes for a Atpase P-type in Pseudomonas aeruginosa cultured in media added with and without the presence of lead. Grew P. aeruginosa in medium added with a concentration of 17.4 mg/L of ClPb2 and used real-time PCR (qPCR) to quantify the levels of transcribed gene PAgp_1547. The results of the expression of the gene and its analysis revealed that the gene PAgp_1547 shows an over-expression in media added with lead. Key words: Heavy metals, Pseudomonas, ATPase, expression

CAPÍTULO I

I.I Introducción La biorremediación utiliza el metabolismo de los microorganismos (MO) para

transformar diversos contaminantes como los metales pesados (MP) en compuestos simples

o menos tóxicos, por tanto, se pueden emplear para remediar terrenos o cuerpos de aguas

contaminados (Sánchez et al., 2003).

La mayoría de los elementos metálicos que se acumulan en las células bacterianas

pueden ser transformadas a compuestos de menor toxicidad por ciertos complejos

enzimáticos (Cervantes et al., 2006). En la naturaleza existen MO (bacterias, hongos,

levaduras, etc.) tolerantes o resistentes a MP; los tolerantes son indiferentes a la presencia o

ausencia del elemento, mientras que los resistentes se caracterizan por poseer mecanismos

de detoxificación codificados genéticamente, inducidos por la presencia del metal (Cherna et

al., 2003; Marrero et al., 2010); sin embargo, muchos aspectos de la interacción MO–metal

son aún desconocidos, pero sobre todo existe una diversidad de bacterias en las que aún no

se han caracterizado dichos mecanismos de detoxificación y su aplicación requiere de un

conocimiento profundo de las vías genéticas que codifican la resistencia y biotransformación

desarrollada por los MO (Marrero et al., 2010).

Numerosos estudios han reportado bacterias del genero Pseudomonas como un MO

con potencial para remediar Pb (Cherna et al., 2003; Marrero et al., 2010; Pérez et al., 2015;

Das et al., 2016), incluso se han secuenciado genomas de las diversas especies del género y

se ha demostrado con estudios in silico (Jones et al., 2014) que en el genoma de Pseudomonas

existen genes relacionados con el transporte de metales pesados. Por ejemplo, en

Pseudomonas aeruginosa se ha reportado que el gen PA1R_gp1547 es componente integral

de la membrana, tiene capacidad de unión a y está involucrado con el transporte de cationes

y MP, sin embargo, no se ha caracterizado in vitro. Por lo que en el presente trabajo de

investigación se pretende estudiar los niveles de transcrito del gen PA1R_gp1547 de P.

aeruginosa y su posible relación con la tolerancia o resistencia a Pb.

I.II Antecedentes

I.II.I Biorremediación

Los MO utilizados en biorremediación son generalmente no-fotosintéticos,

ecológicamente ocupan el nivel trófico (de alimentación) denominado de los

descomponedores, en el que los hongos y bacterias son componentes principales. Estos

organismos están presentes en prácticamente todos los lugares del planeta, inclusive a

profundidades y temperaturas que se creía libres de ellos, como los pozos petrolíferos

profundos (Leadbetter et al., 2002; Cortón et al., 2006).

I.II.II Metales pesados

Los metales son componentes naturales de la corteza terrestre. Muchos de estos tienen

un papel importante en los organismos, ya que son parte fundamental de sus funciones

bioquímicas y fisiológicas (Ferré et al., 2007). Los MP se clasifican en dos grupos,

oligoelementos o micronutrientes, necesarios en pequeñas cantidades para los organismos,

pero tóxicos una vez pasado cierto umbral, estos incluyen cobre (Cu), cobalto (Co), cromo

(Cr), manganeso (Mn), níquel (Ni) y zinc (Zn); y los sin función biológica conocida, además

que son altamente tóxicos, incluyen cadmio (Cd), mercurio (Hg), plomo (Pb), antimonio (Sb)

y bismuto (Bi) (Navarro et al., 2007).

La toxicidad de los MP sobre los seres vivos ocurre a través del bloqueo de las enzimas

por la formación de enlaces entre el metal y los grupos sulfhidrilos (-SH) de las proteínas,

causando daños irreversibles en los diferentes organismos (Soto et al., 2010).

I.II.III Plomo

El Pb es un elemento relativamente abundante en la naturaleza, el agua de mar

contiene entre 0.003 y 0.20 mg/L, por lo que las concentraciones de este metal en aguas

marinas contribuyen a la contaminación de los peces que habitan en ellas. En el suelo de

terrenos no cultivados se han encontrado de 8 a 20 mg/Kg mientras que en terrenos cultivados

puede llegar a encontrarse por encima de 360 mg/Kg y cerca de fuentes de contaminación

industrial, el suelo alcanza contenidos de 10 g/Kg o más (Revert et al., 2004).). Dependiendo

del grado de contaminación, en zonas urbanas las cantidades de Pb en el aire están

comprendidas entre 1 y 3 µg/m3 y ocasionalmente pueden ser mucho mayores (Revert et al.,

2004).

La mayor parte del Pb que participa en el ciclo biogeoquímico se origina por las

actividades humanas (se calcula que más del 90% del Pb en la atmosfera es generado por la

industria) (Castillo, 2005; Cortón et al., 2006). Este metal no juega ningún papel en el

metabolismo propio de los organismos, aunque éstos se ven afectados por su presencia,

debido a su capacidad para unirse a macromoléculas como aminoácidos, hemoglobina,

enzimas, RNA y DNA (Castillo, 2005).

I.II.IV Orígenes de la resistencia bacteriana a metales pesados

La interacción entre bacterias y los MP se da por dos tipos de sistemas de captura de

cationes que se inician fuera del entorno celular, el primero es un sistema generalmente

dependiente del gradiente quimiosmótico y el segundo posee una gran especificidad de

sustrato, es más lento y generalmente utiliza la hidrólisis de ATP como fuente de energía en

adición al gradiente quimiosmótico. Cuando una célula se enfrenta a grandes concentraciones

de algún MP que es acumulado por el sistema inespecífico, el catión del MP es transportado

al citoplasma, a pesar de su elevada concentración, porque estos transportadores

inespecíficos son expresados constitutivamente (Marrero et al., 2010). Una vez dentro de la célula, cuando estos elementos se encuentran en exceso, pueden

formar enlaces con aniones que bloquean grupos funcionales de enzimas, inhibir sistemas de

transporte, desplazar metales esenciales desde los sitios nativos de enlace e interrumpir la

integridad de la membrana celular. La acumulación gradual de cationes metálicos en sitios

impactados por actividades antropogénicas, así como en ecosistemas naturales, ha conducido

a que los MO adquieran procesos de adaptación al medio, debido al desarrollo o adquisición

de sistemas genéticos que contrarrestan los efectos de las elevadas concentraciones de iones

metálicos para la célula (Marrero et al., 2010).

I.II.V Mecanismos de resistencia y metabolismo de metales pesados

La resistencia a MP es el resultado de la intervención de múltiples sistemas con

especificidad de sustrato diferentes, pero que comparten las mismas funciones (Figura 1).

Estos sistemas desarrollados por las bacterias para capturar los iones en la célula bacteriana

y tolerar los efectos nocivos de los metales tóxicos son diversos, entre ellos, se encuentran

principalmente los que involucran: i) componentes celulares que capturan a los iones,

neutralizando su toxicidad, ii) enzimas que modifican el estado redox de los metales o

metaloides, convirtiéndolos en formas menos tóxicas, y iii) transportadores ubicados en la

membrana que expulsan las especies nocivas desde el citoplasma celular (Cervantes et al.,

2006; Marrero et al., 2010).

Entre las transformaciones enzimáticas de los metales se incluyen la oxidación,

reducción, metilación y desmetilación, estas pueden dar como resultado compuestos poco

solubles en agua o bien compuestos volátiles. Las bacterias tolerantes a MP, pueden

acumularlos sin perder su viabilidad debido a que tienen enzimas llamadas metalotioneínas

(MT’s) que tienden a unirse a iones metálicos evitando su interacción con proteínas

relacionadas con procesos bioquímicos en el metabolismo bacteriano (Cervantes et al., 2006;

Marrero et al., 2010).

I.II.V.I Captura y expulsión de iones en la célula bacteriana

La acumulación y distribución de iones metálicos en la célula bacteriana puede ocurrir

en la membrana, el espacio periplasmático y el interior celular, como ocurre en la especie P.

aeruginosa. En ella intervienen polímeros estructurales y extracelulares que interactúan con

los metales atrapándolos dentro de su estructura celular (bioabsorción) o proteínas que se

unen a los iones metálicos por los que poseen una gran afinidad, evitando sus interacciones

con otras proteínas esenciales para el MO (Cervantes et al., 2006; Marrero et al., 2010). La

mayoría de los sistemas de resistencia a MP se basan en el eflujo activo de iones tóxicos tales

como los que expulsan iones derivados del cadmio, cobalto, cobre, níquel, plata, plomo y

zinc (Das et al., 2016).

En este proceso intervienen fundamentalmente tres sistemas diferentes: los

facilitadores de difusión de cationes (CDF), las ATPasas tipo P y los transportadores

compuestos por miembros de la familia de resistencia, nodulación y división celular (RND)

(Figura 2). Estos aparecen en una gran variedad de bacterias resistentes a MP, donde

conforman una red muy eficiente que asegura la homeostasis celular y garantiza la

supervivencia en ecosistemas con elevadas concentraciones de metales (Cervantes et al.,

2006; Marrero et al., 2010).

I.II.VI Interacciones de Pb en microorganismos

La interacción de los MP, en especial de Pb puede ocurrir en organismos procariotas

como eucariotas. Ambos tipos de organismos utilizan iones metálicos para funciones

estructurales y/o catalíticas, y tienen capacidad de unirse a estos compuestos a través de las

interacciones químicas en su superficie celular o transportarlos hacia dentro de la célula

(Figura 3) (Volke et al., 2005).

Figura 1. Mecanismos intra y extracelulares involucrados en la biorremediación microbiana de metales pesados presentes en el ambiente. Los procesos incluyen: A) oxidación-reducción de MP, B) secuestro de metales por metalotioneínas, C) formación de conjugados con otros componentes organicos, D) flujo de metales por transportadores ubicados en la membrana y E) bioremoción de metales por productos microbianos (biosurfactantes o EPS). Tomado de Das et al., 2016.

Marrero et al; Aguilar et al., en 2010 y Das en 2016 reportaron diferentes MO y sus

genes que codifican las proteínas involucradas en los mecanismos de resistencia a Pb, estos

genes se encuentran generalmente localizados en el cromosoma bacteriano, en elementos

móviles como plásmidos o transposones o en ambos. Por otro lado, en especies vegetales,

cuando el Pb alcanza niveles tóxicos, provoca la disminución de la fotosíntesis, transpiración

y reducción en el desarrollo; además genera lesiones cromosómicas, inhibición de la división

celular e interferencia con enzimas ligadas al metabolismo del nitrógeno (INECC, 2009).

Las interacciones a nivel intracelular entre las bacterias y los MP, se inician con un proceso

activo conocido como bioacumulación, seguido de transformaciones enzimáticas y/o

inducción de la síntesis de proteínas enlazadoras (Suárezet al., 2002).

Figura 2. Prototipos de los principales sistemas de eflujo de iones metálicos. I) ATPasas tipo P; II) sistemas RND y III) facilitadores de difusión (CDF). Tomado de Marrero et al., 2010.

I.II.VII Genes de resistencia en Pseudomonas aeruginosa

Un estudio realizado por Joneset al. (2014) demostró que el gen PA1S_gp1547 está

involucrado con el transporte de cationes, indicando que este gen se encuentra relacionado

con la resistencia a Pb, además de tener la capacidad de transportar MP y tener actividad de

transporte de cationes por ATPasas de tipo P siendo este un mecanismo de resistencia a MP

adoptados por las bacterias y localizados en el cromosoma bacteriano. Las ATPasas

constituyen una superfamilia de transportadores ubicados en la membrana con motivos

únicos (TMBS) dentro del dominio E1-E2 que forman parte del sitio de unión al metal para

su translocación en bacterias (Argüello et al., 2011).

En especial en el género de interés P. aeruginosa sugiere que estos genes están

involucrados en la resistencia de MP del organismo cuando este es expuesto a altas

concentraciones en especial de Pb.

Figura 3. Ilustración general de los mecanismos genéticos de resistencia a MP en bacterias. La resistencia a MP en bacterias se atribuye a sistemas de eflujo, genes de resistencia y destoxificación, biosorción o bioacumulación. Tomado de Das et al., 2016.

I.III Planteamiento del problemaLos efectos de los MP pueden ser mitigados por los MO a través de mecanismos de

tolerancia o resistencia mediados por genes, los cuales incrementan su expresión cuando

están en presencia de elevadas concentraciones de Pb. La mayoría de las especies metálicas

que se acumulan en las células bacterianas pueden ser transformadas a compuestos de menor

toxicidad por ciertos complejos enzimáticos. Actualmente las investigaciones detalladas

sobre los genes que les confieren la capacidad de tolerar o resistir a concentraciones elevadas

de MP son escasas, aunado a esto se ha demostrado que los niveles de transcrito de genes

involucrados en la tolerancia a MP incrementan en presencia del metal permitiendo que los

MO puedan sobrevivir en esos ambientes y al mismo tiempo lo puedan captar en su interior.

Actualmente numerosos estudios reportan la especie de P. aeruginosa como un

biosorbente potencial para remediar Pb, sin embargo, se desconocen una gran cantidad los

genes relacionados con la degradación o transformación en el catabolismo de este MP. El

presente trabajo de investigación pretende cuantificar los niveles de expresión del transcrito

del gen PA1R_gp1547 de P. aeruginosa y su posible relación con la tolerancia resistencia a

concentraciones elevadas de Pb.

I.IV Hipótesis

La presencia de concentraciones elevadas de Pb induce la sobreexpresión del gen de

resistencia PA1R_gp1547 en P. aeruginosa.

I.V Objetivos

I.IV.I General

• Analizar los niveles de transcrito del gen PA1R_gp1547 de P. aeruginosa con

potencial para la remedición de Pb.

I.IV.II Específicos

• Analizar in silico la secuencia del gen PA1R_gp1547 de P. aeruginosa con la finalidad

de ver similitudes con transportadores de metales pesados reportados en otros MO.

• Determinar por PCR la presencia del gen PA1R_gp1547 en cepa aclimatada a 17.4

mg/L de Pb y en no aclimatada.

• Analizar el perfil de expresión del gen PA1R_gp1547 en cepa aclimatada a 17.4 mg/L

de Pb y en no aclimatada.

CAPÍTULO II

II.I Materiales y Métodos

II.I.I Reactivación de cepas a presencia de metales pesados

En un experimento previo la cepa de P. aeroginosa fue aclimatada a una concentración

de 17.4 mg/L de sal de cloruro de plomo (PbCl2) mediante el método de presión selectiva

(Orrantia, 1997). El proceso de reactivación consistió en inocular la bacteria en medio líquido

Caldo de soja tripticasa (BD bioxon No. de catálogo: 211670) suspendiendo 30 g de medio

en un litro de agua MilliQ adicionada con PbCl2 y agar de soja tripticasa (Marca Dibico No.

de catálogo: 1025-E) rehidratando 40 g de medio en un litro de agua MilliQ adicionada con

PbCl2.

Los cultivos se agitaron (180 rpm) por 24 horas a una temperatura de 37° C, se

determinó el crecimiento de P. aeroginosa mediante lecturas de densidad óptica (DO) a

longitud de onda de 680 nm, para posteriormente continuar con el procedimiento de

conservación de la cepa y su extracción de ácidos nucleicos.

El proceso de conservación consistió en resembrar las cepas de P. aeroginosa en

cultivos los medios caldo de soja tripticasa y agar de soja tripticasa adicionado con 17.4 mg/L

de PbCl2 y determinando el crecimiento por medio de DO.

II.I.II Análisis de in silico de la secuencia de P. aeruginosa

Se realizó el análisis in silico de los genes de resistencia a MP a partir de la secuencia

de DNA de P. aeruginosa anotada en la base de datos Pseudomonas Genome DB

(http://www.pseudomonas.com) y NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Una vez analizada la secuencia se seleccionó el gen de resistencia de acuerdo a sus

funciones y roles. Los parámetros de selección fueron que el gen tuviera funciones como

transportar metales y cationes, que fuera parte integral de la membrana y que tuviera

capacidad de ATPasa.

II.I.III Síntesis de cDNA para análisis de transcritos.

La síntesis de cDNA inició con la purificación de RNA total usando el kit “EZ-10

Spin Column Total RNA Mini- preps Super Kit” (No. de catálogo: BS584), posteriormente

se sintetizó el cDNA con el kit “Tetro cDNA Synthesis Kit” (No. de catálogo: BIO-65042).

La integración del cDNA se verificó en un gel de agarosa al 1 %, pesando 0.30 g de agarosa

en 30 ml de TBE 1X y teñido con un microlitro de GelRedTM (Marca: Biotium, No. de

catálogo: 41003).

II.I.IV Identificación del gen de resistencia y constitutivos por PCR punto final.

La identificación del gen de interés PA1S_gp1547 y de los genes constitutivos rpsL

(gen ribosomal), proC (gen codificante de la proteína prolina-5-carboxilasa) y gapA

(GAPDH) se realizó por PCR punto final en un termociclador Eppendorf (22331 Hamburg).

Amplificándose con cebadores específicos para el gen PA1S_gp1547: 5’-

AGTTGATCGAGGCGAAGTC -3’ y 5’- CTTCCAGTTCCACTTGCTTG -3’, rpsL: 5’-

GCAAGCGCATGGTCGACAAGA-3’ y 5’-CGCTGTGCTCTTGCAGGTTGTGA-3’,

proC:5’-CAGGCCGGGCAGTTGCTGTC-3’ y 5’-GGTCAGGCGCGAGGCTGTCT-3’ y

gapA: 5’-ACACCAACGACCAGAACCTC-3’ y 5’-TGAAATCCACCGACACCAG-3’.

Las condiciones de reacción de PCR punto final fueron las siguientes:

desnaturalización inicial a 94º C por 3 minutos, seguido de 30 ciclos a 94º C por 45 segundos,

54º C por 30 segundos y 72º C por 1 minuto con 30 segundos, finalizando con una incubación

a 72º C por 10 minutos. La mezcla de reacción se compone de 29.8 µl de H2O, buffer 10X 5

µl. MgCl2 [50 mM] 1.5 µl, dNTPs [10 mM] 1 µl, oligo fwd [10 mM] 5 µl, oligo rev [10 mM]

5 µl, AND polimerasa [5 u/µl] 0.2 µl y AND 2.5 µl.

Las bandas de amplificación se observaron en un gel de agarosa al 2% pesando 0.60

g de agarosa en 30 ml de TBE 1X y teñido con un microlitro de GelRedTM (Marca: Biotium,

No. de catálogo: 41003).

II.I.V Cuantificación de transcritos por PCR en tiempo real

Los ciclos de amplificación de qPCR se realizaron en el equipo StepOne plus de

AppliedBiosystems. Los genes PA1S_gp1547, rpsL, proC y gapA se amplificaron con los

cebadores específicos utilizados en el apartado II.I.IV y SYBR GREEN PowerUP

(AppliedBiosystems, Catálogo No.A25741). Las condiciones de reacción de la qPCR, se

realizaron de acuerdo a las condiciones establecidas por el proveedor: activación UDG 50º

C, Dual-Lock DNA polymerase 95º C, seguido de 40 ciclos: desnaturalización inicial a 95º

C por 15 segundos, alineamiento de 55º C 15 segundos y extensión a 72º C por 1 minuto.

La mezcla de reacción para un volumen final de 10 µl se compone de 5 µl de PowerUP SYBR

Green Master Mix 2X, oligo fwd [500 nM] 0.5 µl, oligo rev [500 nM] 0.5 µl, 1 µl AND 1-

10 ng y H2O a 10 µl.

Los genes rpsL, proC y gapA se evaluaron por el programa NormFinder para la

selección del mejor gen de referencia a utilizar, con base a su estabilidad en la reacción de

qPCR. La eficiencia de amplificación se calculó utilizando la fórmula 10^(-1/m). Para el

análisis de la expresión de los genes se realizó por el método de Hellemans et al. (2007).

CAPÍTULO III

III.I RESULTADOS

III.I.II Análisis in silico de la secuencia de P. aeruginosa.

De acuerdo al análisis in silico se encontró que el gen PA1S_gp1547 (EC 3.6.3.3)

presente en el cromosoma bacteriano (WP_003092492) tiene funciones y roles como ser

componente integral de la membrana, tener capacidad de unión a metales y estar involucrado

en el transporte de cationes y metales descritos en las bases de datos, todo esto de la

característica de una ATPasa. El gen cuenta con 2220 pares de bases (740 aminoácidos), es

un gen encargado del transporte de MP por ATPasas de tipo P. Cuenta con dos dominios

conservados, el primero está asociado a MP y el segundo a una ATPasa E1-E2.

Mediante el análisis en primer BLAST se determinó que los primers diseñados para la

reacción de PCR y qPCR no generan dímeros ni estructuras secundarias, del mismo modo se

realizó un PCR in silico tomando como molde la secuencia completa del genoma de P.

aeruginosa y demostró que los primers para el gen de interés da como resultado la

amplificación de un solo fragmento (Figura 4), el cual corresponde al tamaño esperado de

135 pb que corresponde a la región conservada del gen PA1S_gp1547 que codifica para una

ATPasa de tipo P.

Figura 4. Resultado de la amplificación de fragmento de interés por PCR In silico.

Se realizó la misma metodología para los genes de referencia gapA, rpsL y proC. Siendo

el gen gapA codificante para la proteína GAPDH (Figura5), rpsL gen ribosomal 30s

(Figura6) y proC para la prolina-5-carboxilasa (Figura7).

Figura 5. Resultado de la amplificación de fragmento del gen gapA por PCR In silico.

Figura 6. Resultado de la amplificación de fragmento del gen rpsL por PCR In silico.

III.I.III Amplificación del gen de resistencia y constitutivos por PCR punto final

Para llevar a cabo la amplificación del gen PA1S_gp1547, se obtuvo DNA

complementario (Figura8) a partir de RNA total aislado de la cepa bacteriana PA con Pb y

sin Pb. El RNA aislado se cuantificó por medio de NanoDrop y se obtuvo un rendimiento de

240 ng/ul y una relación 260/280 de 2.05 de RNA en P. aeruginosa sin Pb y para el RNA

con Pb se obtuvo 265 ng/µl y una relación 260/280 de 2.12. Se sintetizó cDNA a partir del

RNA mencionado anteriormente y se usó como molde para la amplificación de los genes

PA1S_gp1547, rpsL, proC y gapA en la cepa de P. Aeroginosa con y sin presencia de Pb. De

acuerdo a nuestras condiciones de experimentación se amplificó un fragmento de 135 pb que

corresponden al fragmento identificado in silico (región conservada) del gen PA1S_gp1547,

(Figura 9).

Del mismo modo se realizó la amplificación de los genes gapA, proC y rpsL con y

sin 30oil30omon de Pb (Figura10 y 11).

Figura 7. Resultado de la amplificación de fragmento del gen ProC por PCR In silico.

Figura 8. Resultado de extracción de cDNA. Tiempo de corrida 45 min. y 1% el gel.

Figura 9 . Amplificación del fragmento de interés por PCR en cepa aclimatada con MP y no aclimatada. Tamaño de fragmento es de 135 pb. Carriles: 1) Escalera peso molecular, 2) control negativo, 3, 4 y 5) producto de PCR, 6-8) vacios.

100

200 300 400 500

1500 1000

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 10. Amplificación del fragmento de los genes proC y rpsL con y sin Pb por PCR. Tamaño de fragmento es de 180 y 200 pb. Carriles: 1 y 8) Escalera peso molecular, 2 y 5) control negativo, 3, 4, 6 y 7) producto de PCR.

Figura 11. Amplificación del fragmento del gen gapA con y sin Pb por PCR. Tamaño de fragmento es de 309 pb. Carriles: 1 y 8) Escalera peso molecular, 2 y 3) control negativo, 5, 6 y 7) producto de PCR.

III.I.IV Cuantificación de transcritos por PCR en tiempo real

Se realizó la cuantificación y validación de los genes de referencia rpsL, proC y gapA

por q-PCR en el equipo StepOnePlus (AppliedBiosystems). Para evaluar la estabilidad del

mejor gen de referencia se utilizó el programa NormFinder (Andersen, Jensen, y Ørntoft

2004) que permitió estimar las varianzas de expresión de los genes entre y dentro de grupos;

y se calculó la estabilidad combinando ambas fuentes de información. Los genes con mínima

varianza entre y dentro de grupos son los más estables. Un bajo valor de estabilidad es

indicativo de una baja variación entre y dentro de grupos, lo cual demuestra una alta

estabilidad de la expresión. En los resultados de la selección del gen de referencia se muestra

que el gen gapA es el que presenta menor valor de estabilidad (0.001) en comparación con

los genes proC (0.037) y rpsL (0.036) que presentan un mayor valor de estabilidad. Los genes

proC y rpsL en conjunto presentan una estabilidad baja (0.001) esto nos indica que si se

usaran dos genes de referencia estos genes fueran los indicados para la cuantificación del

transcrito por qPCR.

La cuantificación del gen de interés se realizó por el método de cuantificación por curva

estándar relativa, este método determina el cambio de expresión de una diana en una muestra

en relación con la misma diana de una muestra de referencia. Para conseguir los resultados,

se utilizó una curva estándar construida a partir de una dilución seriada (1:10) de una cantidad

conocida. Los resultados de las curvas estándar de cada gen (PA1S_gp1547 y gapA) se

muestran en la figuras12 y 13.

y = -3.0756x + 37.85R² = 0.98987

0.000

9.000

18.000

27.000

36.000

45.000

0 1 3 4 5 6

Ct

Diluciones

Gen problema: PA1R_gp1547

Figura 12. Curva estándar del gen PA1S_gp1547 con un factor de dilución 1:10.

En la figura 14 se observa que hay una sobreexpresión del gen PA1S_gp1547de 1.5

veces más en presencia de Pb con respecto al control. La prueba T de student indicó que

existen diferencias significativas entre los diferentes tratamientos (con y sin Pb), (p<0.0183).

y = -3.2082x + 36.086R² = 0.98812

0.000

8.500

17.000

25.500

34.000

42.500

0 1 3 4 5 6

Ct

Diluciones

Gen endógeno: gapA

2.0279

0.504

0.000

0.750

1.500

2.250

3.000

1 2

expr

esió

n re

lativ

a (FO

LDS)

Con plomo Sin plomo

Expresión Relativa: Gen PA1R_gp1547

Figura 13. Curva estándar del gen gapA con un factor de dilución 1:10.

Figura 14.Expresión relativa del gen PA1R_gp1547 con plomo (1) y sin plomo (2).

CAPÍTULO IV

Discusión Con base al análisis in silico la secuencia que codifica para el dominio conservado

E1-E2 es específico en las proteínas transportadoras tipo ATPasa (Jones et al., 2014), así

mismo, de acuerdo con Lewinson et al., (2008) este dominio se encuentra codificado en genes

que codifican para ATPasas tipo P identificadas en otros MO (E. Coli, C. Jejuni, R.

Radiobacter, S. Pneumoniae) que al igual que P. aeruginosa presentan resistencia a MP.

En este estudio se analizó el gen PA1S_gp1547 que codifica para una ATPasa de tipo

P que no ha sido caracterizada in vitro en P. aeruginosa y que de acuerdo con nuestros

resultados sugiere la sobrevivencia de la bacteria en medio adicionado con Pb. Este

transportador posee dos dominios de unión al metal (MBD por sus siglas en inglés): dominio

N-terminal citoplasmático y un dominio localizado en la región transmembrana (Arüello,

2003; Dutta et al., 2006) estos dominios son homólogos de otros MO (Borremans et al., 2001;

Hynnien et al., 2009). Reportes indican que los MO resistentes a Pb presentan en su

membrana genes como CadA (transportadora de cationes en especial Cd), ZntA

(transportadora de zinc) y PbrA (parte del operon pbrTRABCD mecanismo específico para

el transporte de Pb) que codifican para ATPasas tipo P que interaccionan con MP (Marie et

al., 2000; Hynninen et al., 2009; Marrero et al., 2010; Jaroslawiecka et al., 2014;

Vidhyaparkavi et al., 2017).

El gen PA1S_gp1547 presenta homología con respecto a los genes CadA, ZntA y

PbrA que a su vez son ortólogos con otros genes como PA3690 (ATPasa tipo P),

PA14_16660 (ATPasa tipo P), PALES_12941 (ATPasa tipo P), PSPA7_1448 (ATPasa tipo

P), PSPTO_5279 (ATPasa tipo P), Q9HXV0 (exportador de Cd2+/Zn2+), Q9I147 (importador

de Cu2+/Zn2+) y Q9HUY5 (exportadora de Cu+/Ag+) de otras especies de Pseudomonas

(Arüello, 2003; Permina et al., 2006; Lewinson et al., 2009; Jones et al., 2014).

Las ATPasas de tipo P tienen gran afinidad por diferentes sustratos como Cu+, Zn2+,

y Co2+ y es por esto que también pudieran presentar afinidad a MP como Cd2+, Pb2+, Au+ y

Ag+) y están presentes en los mecanismos de transición de MP (Argüello et al., 2011).

Por otro lado, Jones et al., (2014) demostraron in silico que la secuencia que

corresponde al gen PA1S_gp1547codifica para una proteína transportadora de MP, que de

acuerdo a la base de datos InterPro, predice que la proteína tiene características de transportar

cationes, con el dominio E1-E2 presente en las ATPasas de tipo P.

Un modelo descrito por Hynninen et al., (2009) describe la función de estos

transportadores de membrana donde su síntesis es iniciada por la presencia del MP cuando

este entra en la célula en donde por medio de una cascada de señalización mediada por

caspasas, se activan genes relacionados con la respuesta a MP.

Otras investigaciones han descrito diferentes mecanismos para contrarrestar los

efectos de los MP, por ejemplo, Braudet al., (2010) y Erdem et al., (2016) reportaron que la

presencia de ciertos MP inducen exudación de sideróforos (compuesto quelante de hierro

secretado por MO) que reducen la toxicidad a los MP desencadenando una cascasa de

señalización para la producción de pioverdina (tipo de sideróforo), la expresión de fvpA

(receptor de ferripioverdina) y activando genes (CadA, ZntA y PbrA) involucrados en el

transporte de MP que entran al periplasma de las bacterias Gram negativas por difusión una

vez que es modificada su valencia en asociación previa con los sideroforos (Braudet al.,

2010).

Jones et al., (2014) reportaron en su análisis in silico que el gen PA1S_gp1547 está

involucrado en el transporte de MP dentro de la célula, lo que concuerda con los resultados

de la presente investigación, ya que la expresión del gen PA1S_gp1547se incrementó en

presencia de PbCl2 (Figura 18).

Chakraborty et al., (2014) analizaron los niveles de transcrito de un gen similar al de

este estudio, el cual codifica para una proteína de membrana involucrada al transporte de MP,

observando que en presencia de Cr2+, As3+, Hg2+, Pb2+, Ni2+ y Zn2+ se incrementa su

expresión con respecto al control, este efecto fue similar a lo reportado en este trabajo en

donde el gen PA1S_gp1547 tuvo mayor expresión con respecto a la cepa sin tratamiento. Por

otro lado, Marie et al. (2000) Reportaron un efecto similar en el análisis de expresión del gen

ZntA de E. Coli que codifica para una proteína ATPas tipo P que confiere resistencia a MP

como el Pb, los autores mencionados anteriormente, demostraron que la expresión del gen es

proporcional a la resistencia a MP, así mismo demostraron que la expresión del gen aumenta

en presencia del Pb.

CAPÍTULO V

Conclusiones

Con base a la hipótesis y a los objetivos planteados, se concluye que:

• El análisis in silico demostró que la secuencia del gen PA1R_gp1547 codifica para

una ATPasa de tipo P con un dominio conservado de unión a MP.

• Se identificó por PCR punto final la presencia del gen PA1R_gp1547 en la cepa de

Pseudomonas aeruginosa.

• El proceso de aclimatación permitió la expresión del gen de resistencia bacteriana

PA1R_gp1547 en Pseudomonas aeruginosa.

• Se determinó que los niveles de transcrito del gen PA1R_gp1547 en Pseudomonas

aeruginosa incrementan en presencia de Pb de acuerdo con el análisis cuantitativo de

PCR en tiempo real.

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