SEGUNDO CAPITULO “Evaluación de la calidad sanitaria en ostión

procedente de Yavaros, Huatabampo, Sonora”

CD. OBREGON, SONORA, MARZO DEL 2005.

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA DEPTO. BIOTECNOLOGÍA Y CIENCIAS ALIMENTARIAS

EVALUACIÓN DE LA CALIDAD SANITARIA DEL OSTIÓN PROCEDENTE

DEL ESTERO EL RIITO EN EL MUNICIPIO DE HUATABAMPO,

QUÍMICO

TESIS QUE PARA OBTENER EL TITULO

PRESENTA

DALIA MORENO VALENZUELA

ÍNDICE Pagina

ÍNDICE DE TABLAS....................................................................................... i RESUMEN...................................................................................................... ii INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….. iv JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………… vi OBJETIVO GENERAL Y ESPECÍFICOS........................................................ vii HIPÓTESIS .................................................................................................... viii I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1. Ostión (Crassostrea angulata)...................................................... 1

1.1.1. Morfología………………………………………………………….... 2

1.1.2. Composición Química……………………………………………. . 4

1.1.3. Alteraciones de las Ostras…………………………………….... 5

1.1.4. Factores de Contaminación………………………………………. 6

1.2 Cultivo de ostión................................................................................ 6 1.2.1. Antecedentes ………………………………………………………. 6

1.2.2. Calidad del agua de cultivo……………………………………….. 9

1.3. Calidad sanitaria del ostión.............................................................. 10 1.3.1 Fundamentos de las técnicas de evaluación sanitaria …. .... 11

1.3.1.1 Mesófilos aerobios........................................................ 11

1.3.1.2 Grupo coliforme …………………………………………. 12

1.3.1.3 Salmonella sp……………………………………….......... 14

1.3.1.3 Vibrio cholerae……………………………....................... 17

II. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................. 20 2.1 Generalidades de la zona de muestreo...................................... 20

2.2 Periodo y frecuencia de muestreo............................................. 21

2.3 Recolección y manejo de las muestras para el análisis............ 21

2.4 Análisis bacteriológicos............................................................... 22

2.4.1 Metodología para cada análisis bacteriológicos.................. 22

2.4.1.1 Recuento Mesófilos aerobios............................................ 22

2.4.1.2 Recuento de organismos coliformes totales y fecales....... 23

2.4.1.3 Recuento e identificación Salmonella sp........................... 25

2.4.1.3.1 Aislamiento de Salmonella....................................... 26

2.4.1.3.2 Identificación bioquímica......................................... 27

2.4.1.3.3 Pruebas bioquímicas complementarias.................. 29

2.4.1.4 Recuento e identificación de Vibrio cholerae.................... 31

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN........................................................................ 32 3.1 Cuenta total viable de mesófilos aerobios.................................. 32

3.2 NMP de coliformes totales y fecales por 100 g de muestra.......... 33

3.3 Identificación de Salmonella y Vibrio cholerae............................. 35

CONCLUSIONES................................................................................................. 36 RECOMENDACIONES........................................................................................ 37 BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................... 38

INDICE DE TABLAS

Tabla Descripción Pagina 1 Pescado y mariscos: Composición química 4

Porcentual aproximada.

2 Valor nutritivo de algunos mariscos 5

3 Ubicación de la zona de muestreo 19

4 Fechas de muestreo 20

5 Resultados de organismos mesófilos aerobios 32

(UFC/g) en muestra de ostión.

6 Resultados NMP/100 g para coliformes totales 33

y fecales en muestra de ostión

i

RESUMEN

El ostión en los últimos tiempos ha sido uno de los mariscos mas

consumidos por el hombre, esto debido a sus características nutricionales, sin

embargo para que este no cause trastornos a la salud debe de conservar buena

calidad sanitaria. El presente trabajo se realizó en laboratorio de Microbiología de

la Dirección de Recursos Naturales del Instituto Tecnológico de Sonora (Unidad

Centro), en el periodo comprendido de Junio a Octubre de 2004, analizándose una

muestra por semana en un total de 15 muestreos; El objetivo fue realizar análisis

microbiológicos en ostión procedente del estero el Riito del municipio de

Huatabampo, Sonora, con el fin de evaluar su calidad sanitaria.

Los análisis realizados al ostión fueron: cuenta total viable de mesófilos

aerobios por el método de vaciado en placa conforme a la NOM-092-SSA1-1994,

el número más probable NMP de coliformes totales y fecales por la técnica de

tubos de fermentación múltiple, así como también aislamiento e identificación por

pruebas bioquímicas de Salmonella sp y Vibrio Cholerae. ii

Los resultados obtenidos en cuanto al conteo de mesófilos aerobios fue que

no sobrepaso el limite establecido en la norma NOM-031-SSA!-1993 de 500000

UFC/g, ya que el conteo mas alto se presentó en la muestra 15 con 168000 UFC/g

de muestra.

En cuanto al número más probable de organismos coliformes fecales

excedió el límite permitido de NMP de 230/100 g según la norma NOM-031-

SSA1-1993 en un 60%, en cuanto a coliformes totales se presentaron en un

99.99% de las muestras; por lo que respecta a Salmonella sp y Vibrio cholerae,

no fueron detectadas durante la investigación.

Por ultimo se llega a la conclusión de que el ostión no es recomendable

para consumo humano en forma fresca ya que este presentó incidencia de

organismos coliformes fecales; debido a que se alimentan filtrando el agua que

los rodea su microflora varia y refleja la calidad microbiana del agua en la que se

desarrollan (Doyle, 2001) es recomendable poner al molusco en tanques que

contengan agua limpia y libre de cualquier microorganismo para eliminar toda su

carga bacteriana antes de ser comercializado.

iii

INTRODUCCIÓN

En la actualidad los alimentos se seleccionan tomando en cuenta no sólo el

sabor sino también sus propiedades nutritivas y el ostión sigue siendo uno de los

alimentos marinos más apreciados por el hombre, aventajando a la leche, los

huevos y la carne de res (Cifuentes y colaboradores, 2004).

El ostión presenta externamente color grisáceo, sus dos conchas son

desiguales y alargadas; la inferior es mayor y abombada. Presenta

frecuentemente configuraciones retorcidas, por su íntima unión al sustrato y a

otros ostiones(Ruiz, 1993). La superficie de sus conchas es muy rugosa, con

anillos de crecimiento fuertemente escamados. Los labios de sus valvas suelen

ser muy frágiles, por lo que se pueden abrir rompiendo éstos con un cuchillo e

introduciendo éste por tal rotura para cortar el músculo aductor (Cifuentes y

colaboradores, 2004). iv

Los ostiones son moluscos del grupo de los lamelibranquios o bivalvos, al

que pertenecen gran número de especies comestibles que el hombre aprovecha

como alimento por su alto valor nutritivo y por las grandes posibilidades que tiene

el cultivarlos (Cifuentes y colaboradores, 2004).

Entre los lamelibranquios se encuentran las ostras, manjares muy

apreciados que el mar ofrece; están consideradas como uno de los moluscos de

mayor prestigio y ocupan un lugar importante en la pesca mundial. Su gran valor

económico se debe a que es uno de los organismos más estimados por los

aficionados al buen comer y su consumo se realiza en grandes cantidades

(Cifuentes y colaboradores, 2004).

Al estar cultivadas en aguas contaminadas se puede considerar como un

peligro a la salud de los consumidores, debido a que puede contener bacterias

patógenas como las que producen las fiebres intestinales y la tifoidea. Para evitar

este peligro, en algunos países, trataban a las ostras con rayos ultravioleta, hasta

que se descubrió que con sólo colocarlas en agua potable fácilmente se

eliminaban las bacterias, es decir, se "purifican" (Cifuentes y colaboradores, 2004).

Un factor importante es la manipulación que se le da al momento de ser

recolectadas, ya que estas deben de conservarse a temperaturas de 15 a 20°C,

para evitar la proliferación de microorganismos como la Salmonella sp, Echerichea

coli, Vibrio cholerae, entre otros, que pueden alterar la calidad sanitaria del

alimento.

Por lo antes es realizar exámenes microbiológicos a este tipo de alimento

ya que es una fuente portadora de diferentes tipos de microorganismos por lo que

se analizara y evaluara la calidad sanitaria del ostión procedente del estero el

Riito, en el municipio de Huatabampo, Sonora.

v

JUSTIFICACIÓN

La calidad de un producto puede definirse como su valoración al

compararlo con un estándar, de un precio determinado, considerado excelente y

satisfactorio, tanto por el productor como por el consumidor La calidad se mide

teniendo en cuenta las propiedades organolépticas, la composición química, los

atributos físicos y la flora microbiana (Fortsythe, 2003).

En los últimos años se ha incrementado la contaminación de las aguas de

mar, debido a industrias u otras fuentes como drenes, ríos que arrojan sus

desechos a las mismas y a causa de esto la fauna que vive cerca, resulta

afectada; un ejemplo es el ostión, ya que su aparato digestivo se encuentra

adaptado para filtrar agua; podemos decir que es uno de los moluscos con mas

problemas de contaminación ya que este puede anidar fácilmente bacterias u

otros microorganismos.

Debido a estas características, a su valor nutricional y a la demanda que

tiene el consumirlo fresco, resulto de gran utilidad analizarlos y evaluarlos, para

así obtener resultados confiables con respecto a la calidad sanitaria, para las

diferentes personas que consumen de este producto marino. vi

OBJETIVOS Objetivo General Realizar análisis microbiológicos en ostión procedente del estero el Riito del municipio de Huatabampo, Sonora, con el fin de evaluar su calidad sanitaria. Objetivos Específicos

⇒ Determinar la cuenta total viable de organismos mesófilos aerobios por la técnica de vaciado en placa

⇒ Cuantificar número más probable (NMP) de organismos coliformes totales

y fecales por la técnica de tubos de fermentación múltiple.

⇒ Analizar e identificar por pruebas bioquímicas a Salmonella sp y Vibrio cholerae.

⇒ Evaluar la calidad sanitaria de este alimento de acuerdo a la norma NOM-

031-SSA1-1993.

vii

HIPOTESIS

Es posible que los ostiones analizados provenientes del estero el Riito en

el municipio de Huatabampo, Sonora, no cumplan con las especificaciones

establecidas en la norma NOM-031-SSA1-1993.

viii

I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1. Ostión (Crassostrea angulata)

Los moluscos son, después de los insectos, el grupo más extendido sobre

el planeta, del cual se han clasificado aproximadamente 200 mil especies. Se les

encuentra lo mismo en la copa de los árboles que en las profundidades abisales

marinas. El estudio de estos animales ha ofrecido a los científicos, a través de la

historia, temas por demás interesantes, por lo que es uno de los grupos mejor

entendidos en la actualidad (Cifuentes y colaboradores, 2004).

Se cuenta también con los conocimientos aportados por los coleccionistas

aficionados, algunos de los cuales además del interés que les despierta la belleza

de la concha, se han adentrado en el estudio de la biología de estos animales.

Otros se han dedicado a conocer a los moluscos de interés puramente culinario,

porque éstos, además de ser altamente nutritivos, tienen sabores especialmente

agradables (Cifuentes y colaboradores, 2004). 1

Poco a poco los moluscos se fueron incorporando a la dieta de la

humanidad, aumentando el consumo de algunos de ellos, como las ostras,

los ostiones, las almejas y los pulpos, entre otros; sin embargo, en la

mayoría de los casos su explotación fue para hacer artesanias y para

consumo doméstico (Cifuentes y colaboradores, 2004).

1.1.1. Morfología

El ostión es unisexual, es decir, que cada individuo es siempre y solamente

macho o hembra. A partir de los 18° C de temperatura del agua, desde junio a

noviembre, son expulsados al agua los gametos de distintos sexos, produciéndose

la fecundación en el fondo, ya de 24 a 36 horas el huevo fecundado se transforma

en larva ciliada, siguiendo a partir de este momento una vida prácticamente igual a

la descrita para la ostra. El ostión que habita tanto en el mar como en aquellas

zonas litorales donde se mezclan aguas saladas y dulces, ya sean esteros,

desembocaduras de río o lagunas costeras (Cifuentes y colaboradores, 2004).

Las conchas que poseen son producidas por la misma ostra a través de un

órgano llamado manto y están formadas por dos valvas las cuales son ovaladas

de forma irregular y asimétrica (Ruiz, 1993); la valva inferior se fija al sustrato o a

algún objeto sumergido y está ahuecada para alojar a la masa del cuerpo que es

la que se consume; la mitad superior de la concha es más pequeña, achatada y

delgada (Cifuentes y colaboradores, 2004).

Externamente la concha presenta color grisáceo, es áspera y lisa por

dentro, en donde el carbonato de calcio que la compone se transforma en una

sustancia fluorescente de bella tonalidad que ha sido denominada "nácar (Ruiz,

1993).

2

Las estructuras que forman el cuerpo de las ostras están poco

diferenciadas; el aparato digestivo se encuentra adaptado para filtrar agua; se

calcula que penetran a la concha 150 litros al día llevando protozoarios,

huevecillos, larvas de otros organismos y pequeñas algas que son el alimento del

ostión; al salir, el agua lleva los desechos (Cifuentes y colaboradores, 2004).

Su aparato respiratorio está estructurado por las branquias de forma

laminar que son bañadas por el agua, de la que fijan el oxígeno y luego

desprenden el bióxido de carbono que sale en el agua que el animal expulsa. Su

sistema nervioso es completo y tiene un corazón formado por un solo ventrículo.

Además, el ostión tiene dos tubos llamados "sifones" que se encargan de hacer

circular el agua dentro de la concha del molusco (Figura 1) (Cifuentes y

colaboradores, 2004).

En relación a sus hábitos alimenticios, son individuos activos filtradores de

particulas alimenticias que se nutren básicamente de plancton (Ruiz, 1993).

Las dos conchas están firmemente unidas por un músculo llamado

por lo común "callo" que es muy apreciado por los aficionados a

comer ostiones, quienes opinan que es la parte más sabrosa (Cifuentes y

colaboradores, 2004).

Figura 1. Partes del Ostión (Enciclopedia Encarta, 2002)

3

1.1.2. Composición Química

Los moluscos tiene en un alto valor nutritivo, ya que contienen

vitaminas A, B, C y D; compuestos glicerofosfóricos; cloruros; carbohidratos, y

proteínas en cantidades adecuadas y de fácil digestión. Las proteínas

que están presentes son digeribles casi en un 100%, contra el 63% de

las de carne de res. Algunos moluscos, como las ostras, poseen altas

cantidades de yodo, compuesto que interviene en el funcionamiento de la

tiroides; antianémicos como el cobre y el fierro, lo cual explica la añeja

popularidad que tienen estos organismos como alimento muy nutritivo (Tabla 1)

(Cifuentes y colaboradores, 2004).

Tabla 1. Pescado y marisco: Composición química porcentual aproximada.

Especies Agua Carbohidratos Proteína Grasa CenizasPescado con espinas Pescado azul Bacalao Eglefino Hipogloso Arenque (Atlántico) Caballa (Atlántico) Salmón (Pacífico) Pez espada

74.6 82.6 80.7 75.4 67.2 68.1 63.4 75.8

0 0 0 0 0 0 0 0

20.3 16.5 18.2 18.6 18.3 18.7 17.4 19.2

4.0 0.4 0.1 5.2 12.5 12.0 16.5 4.0

1.2 1.2 1.4 1.0 2.7 1.2 1.0 1.3

Crustáceos Cangrejos Langosta

80.0 79.2

0.6 0.5

16.1 16.2

1.6 1.9

1.7 2.2

Moluscos Almejas, carne Ostión Vencras

80.3 80.5 80.3

3.4 5.6 3.4

12.8 9.8

14.8

1.4 2.1 0.1

2.1 2.0 1.4

Fuente: Watt y cerril (Jay, 1994)

El tejido muscular de los moluscos contiene arginína libre, y ácido aspártico

y glutámico libres que se encuentran en el pescado (Jay, 1994). En la Tabla 2 se

puede observar el valor nutritivo de algunos moluscos.

4

Los compuestos hidrocarbonados se encuentran principalmente en forma

de glucógeno y en concentraciones del orden de las que existen en las carnes

de los moluscos, es posible esperar que como parte integrante de la alteración

microbiana, tenga lugar a actividades fermentativas ( Jay,1994).

Tabla 2. Valor nutritivo de algunos moluscos.

(100 gramos de peso neto) Porción Proteínas Grasa Calcio Fósforo FierroAlimento comestible Calorías (g) (g) (mg) (mg) (mg)

Calamar 78 16.40 0.90 12 119 0.50 Ostión 1.00 42 6.30 0.40 147 85 8.42 Pulpo 0.75 72 12.60 2.00 39 109 2.53 Sepia 0.75 74 14.02 1.47 Almeja 1.00 74 10.17 2.53

Fuente: (Cifuentes y colaboradores, 2004).

1.1.3. Alteraciones de las ostras

Los moluscos, en general contienen mayores cantidades de aminoácidos

libres que el pescado. Los crustáceos poseen oxido de trimetilamina, compuesto

que los moluscos no contienen (Doyle, 2001).

El tipo de alteración de las ostras desprovistas de sus conchas depende de

la temperatura de almacenamiento (Frazier, 1993). Los moluscos poseen

cantidades mayores de carbohidratos principalmente en forma de glucógeno.

Como resultado, la alteración de estos difiere de otros alimentos marinos (Doyle,

2001).

Mantenidas a temperaturas de refrigeración las ostras se conservan en

buen estado mientras siguen estando vivas dentro de las conchas, pero se

descomponen rápidamente en cuanto mueren, ocurriendo lo mismo en las que se

conservan sin sus conchas ( Frazier, 1993). 5

En cambio a temperaturas próximas a las de congelación, las bacterias

mas importantes que alteran a este tipo de alimento son las especies de los

géneros Pseudomonas, Acinetobacter, y Moraxella, aunque también se pueden

multiplicar en ellas especies de los géneros Flavobacterium y Micrococcus .Si

bien a la alteración que se presenta o experimentan se le denomina “agriado”, las

modificaciones que tienen lugar en ellas son principalmente de tipo proteólitico

(Frazier, 1993).

A temperaturas mas elevadas, el agriado puede ser consecuencia de la

fermentación de los azucares llevada a cabo por bacterias coliformes, por

estreptococos, por lactobacilos y por levaduras que producen ácidos y un olor

agrio. Al principio puede haber multiplicación de especies de los géneros Serratia,

Pseudomonas, Proteus y Clostridium. Un tipo de alteración no corriente debido a

una levadura asporógena, comunica a las ostras un color rosa ( Frazier, 1993)

1.1.4. Factores de contaminación La población y composición de la microflora de las especies marinas, esta

influenciada por el ambiente de la zona de captura, la época del año y las

condiciones de pesca, manipulación y procesado; también el almacenamiento

afecta la población bacteriana, esta se ve influenciada por la calidad del agua,

siendo los moluscos unos de los productos marinos, con mayor recuento de

bacterias, recolectados en agua contaminadas (Doyle, 2001).

1.2 Cultivo de ostión 1.2.1 Antecedentes

El cultivo de ostras se viene realizando desde la más remota antigüedad.

En época romana en el lago Lucrino (Nápoles) sé hacia un cultivo extensivo. En el

siglo XIX, las ostras eran muy comunes en casi todos los mares europeos y la

recolección se hacía manualmente debido a su abundancia. Hasta los años 50 el

desarrollo de la ostricultura se basaba en el engorde de larvas juveniles

capturadas en la naturaleza (http://ecologia.unex.es/ostras/ostras.html, 2004). 6

Con posterioridad a la década de los 50, las catástrofes naturales y la

creciente contaminación de los mares obligaron a una intensificación del cultivo

ante la escasez de larvas naturales. Hoy en día su desarrollo ha adquirido un alto

nivel técnico en países como Francia, Holanda, Japón y USA. Adicionalmente se

han desarrollado los criaderos intensivos por el aumento del consumo y la

necesidad de mejora de caracteres de resistencia a enfermedades o de engorde

(http://ecologia.unex.es/ostras/ostras.html, 2004).

La industria mundial de los mariscos es una actividad importante que, en

razón de la penuria creciente de proteínas animales, está llamada a un mayor

desarrollo. Ahora que la mayoría de las grandes reservas de pescado en el

mundo están ya explotadas, es necesario contar con una expansión de la

industria marisquera, ya que técnicas sencillas y ensayadas permiten producir un

buen numero de especies en las aguas costeras (Wood, 1977).

La acuicultura ha sido históricamente una actividad en pequeña escala. El

cultivo de moluscos, especialmente de bivalvos es único desde varios puntos de

vista, es una de las primeras formas de acuicultura con organismos marinos

practicada en el hemisferio occidental, desde tiempos de los primeros romanos

(Pillay, 2002)

La acuicultura actual tiene una mayor importancia en el desarrollo

socioeconómico y en el manejo de los recursos naturales. A pesar de algunas

áreas, la producción total de las pesquerías mundiales se ha estabilizado en

unos 70 – 75 millones de toneladas y la producción de las especies preferidas ha

permanecido estacionaria o incluso ha disminuido en algunos casos (Pillay,

2002).

Dado que los ostiones son organismos sésiles y filtradores de agua

durante la mayor parte de su vida, puede cultivarse a un costo relativamente

bajo. El cultivo se realiza principalmente en aguas abiertas a menudo en sus

habitats naturales con semillas (larvas) recolectadas en la misma zona (Pillay,

2002). 7

Por otro lado algunos de los bivalvos como las otras se comen crudos, y

que su habito de alimentarse por filtración puede dar por resultado la

acumulación de contaminantes, son los primeros alimentos de los que se

sospecha en tiempo de epidemias de trastornos intencionales del ser humano

(Pillay, 2002).

La ostricultura se ha extendido por todo el mundo gracias a que los

biólogos han llegado a conocer profundamente la biología de estos moluscos.

Se aprovechan dos características fundamentales, la primera, su alto índice de

fecundidad, según algunos autores la ostra americana puede soltar en cada

puesta de 14 a 114 millones de huevecillos y, en segundo término, el haber

observado que las áreas en que las ostras se reproducen, generalmente no

son buenas para su crecimiento y engorda, hecho que se logra debido a que

las ostras pueden ser transportadas vivas a través de largas distancias,

aunque no tengan agua, con la condición de mantenerlas frescas (Cifuentes y

colaboradores, 2004).

La reproducción de los moluscos se inicia cuando el agua alcanza la

temperatura adecuada para cada especie, que comúnmente es alta, por lo que en

los trópicos pueden presentarse durante todo el año. En los ostiones, los

productos de los órganos de ambos sexos, es decir, óvulos y

espermatozoides, son liberados en el agua y la fecundación y la

incubación se llevan a cabo fuera de la concha; en las ostras las hembras

retienen óvulos dentro de su concha y hasta ellos llegan los

espermatozoides para fecundarlos; el desarrollo embrionario se hace también

adentro, liberando posteriormente a la larva (Cifuentes y colaboradores, 2004).

La larva, es microscópica y flota formando parte del plancton durante dos o

tres semanas, hasta que se fija a una superficie relativamente limpia mediante un

pie pequeño y fuerte e inicia el desarrollo de la concha, recibiendo el nombre de

semilla; incrementa su alimentación haciendo pasar corrientes de agua entre sus

valvas, reteniendo los microorganismos que van en ellas, los cuales digieren y

asimilan permitiéndoles crecer y engordar (Cifuentes y colaboradores, 2004). 8

La mayoría de las ostras se fijan a sustratos duros y pueden tolerar

amplias variaciones en la salinidad, a menudo entre 5 a 32 partes por mil. Para

el desarrollo larval se consideran preferibles salinidades mas bajas entre 15 y 16

partes por mil (Pillay, 2002).

Las ostras cultivadas pertenecen a dos géneros Crassostrea (ostras

convexas) y ostrea (ostras planas) la producción de las ostras convexas es mucho

mayor que la de las ostras planas, la mayoría de las ostras convexas, crecen bien

a temperaturas de 10 a 30 ºC aunque para el desove y el desarrollo larval se

consideran optimas temperaturas de unos 20ºC (Ruiz, 1993).

1.2.2 Calidad del agua de cultivo La disponibilidad de agua con calidad adecuada es importante para todos

los sistemas de acuicultura, pero la cantidad es de importancia particular para

los sistemas basados en tierra (Pillay, 2002).

La calidad del agua es un termino difícil de precisar debido a que

depende del uso del agua; por ejemplo un agua de “buena” calidad para el

crecimiento de algas puede no ser igualmente “buena” para beber. La calidad del

agua es buena o mala dependiendo del uso que se le da. Una agua buena debe

de estar a una temperatura ideal o al menos dentro de los promedios limitados en

los cuales los animales pueden sobrevivir (Wheaton,1982).

Debido a que el interés es producir organismos acuáticos el agua de

buena calidad se define como el agua capaz de mantener vivo al organismo

deseado y capaz de mantener los estándares sanitarios necesarios para que los

organismos cosechados sean utilizados como se programo (Wheaton,1982).

9

Es importante que las corrientes marinas sean débiles para permitir la

fijación de la larva. La ostra necesita una serie de factores ambientales para poder

desarrollarse, estos factores deben considerarse para establecer los cultivos

(http://ecologia.unex.es/ostras/ostras.html).

A pesar de los problemas para definir la buena calidad del agua o la

contaminación, de tal forma que la definición sea independiente del uso del agua,

esta debe poseer ciertas características para que sea valiosa para un sistema

acuático de producción (Wheaton, 1982).

El agua que abastece a una empresa acuática debe tener características

para ser definida como agua de buena calidad. El contenido de oxigeno, la

temperatura, la salinidad y la dureza de la fuente de agua debe estar cerca de

los niveles óptimos para el tipo y numero de organismos acuáticos que se cultiven

en ellos (Wheaton, 1982).

- Salinidad: Esta naturalmente varia básicamente de cero a mas de 40 mg/l

El agua de mar generalmente varia de 33 a 37 mg/l con un promedio de

salinidad de aproximadamente 35 mg/l (Wheaton, 1982).

- Temperatura: Esta probablemente tiene mas influencia en la vida acuática

y en los sistemas acuáticos que cualquier otra variable. Esta influye en su

densidad y como las diferencias de densidad son una fuerza matriz

primaria de circulación en los sistemas naturales (Wheaton,1982).

1.3. Calidad sanitaria del ostión

Es importante mantener en todo alimento una buena calidad sanitaria para

así evitar alguna enfermedad producida por cualquiera de los alimentos que

pueden contener microorganismos patógenos que las causen, en este tema se

hablara de los posibles microorganismos presentes en el ostión y así como su

descripción. 10

Los mariscos destinados al consumo humano no deben en principio

contener organismo de ningún tipo. Sin embargo, las bacterias fecales están muy

extensamente difundidas y, ha sido ampliamente demostrado que los mariscos

que contienen un pequeño número de coliformes o E. coli o que proceden de

aguas que contienen pequeñas cantidades de estos organismos pueden ser

consumidos sin peligro por el hombre (Wood, 1977).

1.3.1 Fundamentos de las técnicas de evaluación sanitaria 1.3.1.1 Mesófilos aerobios

El grupo de organismos mesofílicos, aerobios pertenece una gran variedad

de microorganismos, están incluidos todos aquellos microorganismos capaces de

desarrollarse entre las temperaturas de 20 y 37 °C, que son los extremos de

temperaturas a las cuales suele realizarse este recuento, en condiciones de

aerobiosis (López y colaboradores, 1993).

En algunos alimentos, este grupo de microorganismos presenta máximos

recuentos, pero eso dependerá del predominio de otros grupos como lo son

psicrofílicos, anaerobios, etc. Dentro de la flora mesofílica aerobia se tienen a los

bacilos, cocos, gram positivos y gram negativos, aislados o agrupados en todas

las variedades que son familiares. Desde el punto de vista fisiológico y de su

patogeneicidad se encuentran: cromogenos, proteolíticos, lipolíticos, sacarolíticos,

saprofiticos, patógenos, etc (López y colaboradores, 1993).

La utilidad de las bacterias mesófílicas aeróbicas en la microbiología sanitaria se

ha recomendado para los siguientes objetivos:

• Como indicador de la posible presencia de microorganismos patógenos.

• Como indicador del valor comercial de un alimento

• Como indicador de las condiciones higiénicas en que ha sido manejado el

producto. 11

• Como indicador de la seguridad de un ingrediente cuando se va a

incorporar a un alimento

• Para seguir la eficiencia de un proceso germicida o de preservación

• Para predecir la vida de anaquel de un alimento.

Esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos

presentes en un alimento determinado, ya que la variedad de especies y tipos

diferenciables por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su

crecimiento, oxígeno disponible, etc; hacen que el número de colonias contadas

constituyan una estimación de la cifra realmente presente. No obstante, cuando se

siguen fielmente las condiciones que se señalan en la técnica para su desarrollo,

puede llegar a proporcionar resultados lo suficientemente reproducibles para darle

significado a la prueba (López y colaboradores, 1993).

El fundamento consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio

de elección (agar cuenta estándar) después de un cierto tiempo y temperatura de

incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la

muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas

de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores (López y

colaboradores, 1993).

1.3.1.2 Grupo Coliforme

Los organismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat

primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra. A fin

de simplicar su manejo en el laboratorio, se ha establecido una definición en

base a las características mas constantes que exhibe la especie tipo del grupo,

Escherichia coli (López y colaboradores, 1993).

12

La definición del grupo coliforme los describe como bacilos gram

negativos no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que fermentan

lactosa con producción de gas, dentro de las 48 hrs de incubación a 35 ± 2 ºC

(Jay, 1994).

La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse

mediante el empleo de medios de cultivo líquidos o sólidos con características

selectivas y/o diferenciales (López y colaboradores, 1993).

La situación de los organismos coliformes, considerando su definición, es

mas que suficiente para evaluar la calidad sanitaria de algunos productos, sin

embargo, por las características del grupo en donde encontramos

microorganismos que no son estrictamente de asiento intestinal, se llega a tener

la necesidad de diferenciar a los organismos coliformes contenidos en la prueba

confirmativa de la técnica de NMP o bien de los encontrados en las placas de

agar rojo bilis violeta (RVBA) con el fin de demostrar la presencia de Escherichia

coli (López y colaboradores, 1993).

Los miembros del grupo coliforme proliferan abundantemente en los medios

de cultivo simples. Sus demandas nutricionales son satisfechas sin necesidad de

recurrir a compuestos especialmente complejos (Frazier 1993).

Se tiene conocimiento de la presencia de cepas atípicas de Salmonella,

Providencia, Serratia y Proteus (variable según la especie) que puede fermentar

lactosa. Para esto se tiene como alternativa resembrar en un medio selectivo

(EMB) y de aquí llevar a cabo la diferenciación de organismos coliformes por

medio de pruebas bioquímicas (López y colaboradores, 1993).

13

La Escherichia coli da lugar a varias toxinas intracelulares, es decir las

asociadas con enfermedades diarreicas, estas alcanzan un grado de afección

entre moderado y severo, son similares al cólera y pueden aparecer en los

adultos y en los niños. En los niños menores de dos años, estas son la causa

principal de diarreas esporádicas y epidémicas que brotan en países

subdesarrollados, pero son poco comunes en los industrializados. En los adultos

constituyen el primer agente de la diarrea de los viajeros, adquirida por los turistas

visitantes de países en desarrollo (Freeman, 1985).

1.3.1.3 Salmonella sp

El género Salmonella es quizá el

microorganismo mas extensamente estudiado

entre los patógenos que pueden ser aislados de

los alimentos. ( Frazier, 1993).

Las salmonelas pertenecen al genero de la familia de las

Enterobacteriaceae, son bacilos cortos gram negativos, aerobios facultativos y no

esporulados, la mayoría de las especies son moviles con flagelos, fermentan la

glucosa, generalmente con producción de gas, pero normalmente no fermentan

ni la lactosa ni la sacarosa. Lo mismo que sucede en otras bacterias, cuando se

trata de un medio de temperaturas, de pH, y de aw mas amplios que cuando

se trata de un medio de cultivo con escasez de nutrientes (Forsythe, 2003).

Su temperatura máxima de crecimiento es de unos 45.6 ºC. Las

salmonelas crecen bien a temperatura ambiente, si bien su temperatura optima

de crecimiento es de aproximadamente 37 ºC. El intervalo de pH se halla

comprendido entre los valores 4.1 y 9.0, multiplicándose, por lo tanto, en

alimentos de baja acidez; se ha comprobado que el pH de 5.5 a 5.7 de la

ensalada no es apropiado para su multiplicación ( Frazier, 1993). 14

Su actividad de agua mínima de crecimiento varia para cada alimento

aunque es de aproximádamente 0.93 a 0.95. Además, las especies y cepas de

Salmonella se diferencian por su termorresistencia y por la influencia que los

factores ambientales ejercen en el crecimiento ( Frazier, 1993).

Son muchos los alimentos contaminados con salmonelas implicados en su

toxiinfeccion, entre ellos, carnes crudas de mamiferos y aves, huevos, leche y

productos lacteos, pescado, ancas de rana, levadura, coco, salsas y ciertos

aderezos de ensaladas, mezclas para tartas, postres y rellenos de crema, gelatina

en polvo, manteca de cacahuate, cacao y chocolate (Forsythe, 2003).

Parece ser que las Salmonellas alcanzan cifras importantes en los

alimentos sin producir alteraciones detectables de su aspecto, de su olor, e

incluso de su sabor. No cabe duda que cuanto mayor sea el número de

cualquiera de estos microorganismos patógenos que contiene el alimento, tanto

mayor es la probabilidad de que provoquen infección en la persona que lo

ingiere y tanto mas corto es el periodo de incubación (Frazier, 1993).

La probabilidad de infección por ingestión de un alimento que contiene

salmonelas dependen de la resistencia del consumidor, del grado de infección

de la cepa de Salmonella en cuestión, y del número de microorganismos

ingeridos (Frazier, 1993).

Las salmonelas están muy extendidas en el medio natural a consecuencia

de la contaminación por las materias fecales. En muchos sitios, la presencia de

Salmonella es frecuente en la comunidades animales y humanas y los residuos

que se vierten al mar pueden contenerlas en grandes cantidades. Los

moluscos y los crustáceos de las aguas costeras contaminadas pueden por

consiguiente contener salmonelas (Wood, 1977). 15

Para determinar salmonela se necesita de un pre-enriquecimiento que

cosiste en facilitar a las bacterias presentes una recuperación del estado en el

que se encuentra como resultado de la elaboración de algunos alimentos (López

y colaboradores, 1993).

Los medios de cultivo que se utilizan para el pre-enriquecimiento no

contienen sustancias inhibidoras, por lo que la flora asociada no se ve impedida

para proliferar. De ahí el pre-enriquecimiento debe manejarse cautelosamente

para obtener sus beneficios en la recuperación de las salmonelas y evitar un

sobre-desarrollo de la flora competitiva que enmascararía su aislamiento (López y

colaboradores, 1993).

Entre los medios de pre-enriquecimiento esta, el agua peptonada, el caldo

lactosado. Dos grupos de medios de enriquecimiento selectivo han sido utilizados

con mayor profusión:

- El grupo tetrationato (caldo tetratotionato-bilis-verde brillante o medio de

Kauffmann, caldo tetrationato verde brillante, caldo tetrationato-sulfatiazol-bilis-

verde brillante y caldo tetrationato novobiocina). Este grupo tiene una fuente

de nitrógeno orgánico a base de peptona, triptona, extracto de carne o extracto

de levadura, adicionado, según el caso, de sales biliares o novobiocina para

inhibir a bacterias Gram positivas; el verde brillante puede inhibir además de

estas bacterias a los coliformes, el carbonato de calcio es para regular el pH

neutralizando el ácido que se va generando y el tiosulfato de sodio que

parcialmente pasa a tetrationato de sodio (cuando se adiciona el yodo al

inocular la muestra) tienen un efecto toxico cuando actúan en combinación,

según se cree por reacción con los grupos sulfhídrico de las enzimas

involucrados en la síntesis de la membrana y pared celular de las bacterias

sensibles (López y colaboradores, 1993).

16

- El grupo selenito (caldo selenito F, caldo selenito-cistina, caldo selenito-verde

brillante y caldo selenito-sulfa-verde brillante). Contiene una fuente de

nitrógeno a base de triptona y peptona debiéndose el efecto toxico del

selenito a dos posibles mecanismos: reacción con el grupo sulfhídrico

enzimático o formación de aminoácidos análogos en los que el selenito ha

tomado el lugar del azufre, contiene también lactosa y fosfatos los cuales

tienen un efecto regulador del pH. La cistina favorece el desarrollo de las

salmonelas en presencia del alimento involucrado (López y colaboradores,

1993).

Para el aislamiento de la salmonela se realiza en medios sólidos, los cuales

mantienen un efecto inhibitorio en la flora producida en los medios anteriores.

o Agar Eosina azul de Metileno y Agar Mac Conkey moderadamente

selectivos.

o Agar Entérico de Hecktoen y Agar XLD o sea Agar Xilosa lisina

desoxicolato fuertemente selectivos (López y colaboradores, 1993).

1.3.1.4 Vibrio cholerae

Vibrio Cholerae es la especie mejor

conocida como causa del cólera (Adams,

1997). El agente etiológico del cólera

asiático, V. cholerae es un bastoncillo corto,

gramnegativo, ligeramente curvo y enrollado,

que mide 1.5 a 3 µm de longitud y,

aproximádamente, 0.5 µm de anchura.

Generálmente aparece aislado, pero la existencia de una espiral levemente

enrollada. Los vibriones son móviles y tienen un único flagelo polar (Freeman,

1985). 17

Las colonias se parecen a las de otros bacilos entéricos, pero pueden

distinguirse por que a las 24 horas tienen una apariencia opalescente tenue.

Las colonias de vibrio tienen un diámetro de 1 a 2 mm son bajas, convexas,

finamente granulares, y tienen un color amarillo grisáceo (Freeman, 1985).

El Vibrio cholerae es fuertemente aerobio, crece de un modo poco denso

en condiciones anaerobias. La temperatura óptima de crecimiento es de 37 ºC,

pero hay crecimiento en el intervalo comprendido entre 16 º y 42 º C. Aunque la

bacteria puede ser cultivada en un pH que varie entre 6.4 y 9.6, el crecimiento

esta favorecido notable por reacciones alcalinas, a un pH de 7.8 a 8.0 (Adams,

1997).

El Vibrio cholerae es sensible a muchos agentes físicos y químicos. Es

destruido por temperaturas moderadamente altas (10 min. a 55 ºC) y los

desinfectantes lo destruyen rápidamente, Es especialmente sensible a la

desecación (Freeman, 1985).

Este organismo no se encuentra generalmente en la naturaleza, excepto

cuando se produce casos de cólera. El Vibrio cholerae se trasmite casi

exclusivamente a través del agua contaminada. La enterotoxina del cólera

produce diarrea que pone en peligro la vida, pues puede llevar a una

deshidratación y a la muerte su al paciente no se le administra una terapia a base

de líquidos y electrolitos (Madigan y colaboradores. 1998). Puede penetrar por las

aguas residuales en las aguas costeras donde sobreviven durante periodos de

duración variable (Freeman, 1985).

La muestra a analizar deberá tomarse en su composición básica de liquido

y carne. Se utilizaran medios de cultivo selectivos como el agar tiosulfato, citrato,

sales biliares y sacarosa (TCBS) o agar celobiosa polimixina B y colistina

(mCPC), como en caldos triptona y triptona con sal a diferentes porcentajes

(NOM-031-SSA1-1993). 18

Para su diferenciación se realizan pruebas bioquímicas en agar triple

azúcar y hierro (TSI), agar hierro kligler (KIA), agar arginina glucosa inclinado

(AGS) (NOM-031-SSA1-1993).

19

II. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1 Generalidades de la zona de muestreo

La zona de muestreo se encuentra a lado de la desembocadura del río

Mayo, dicho lugar lleva por nombre Estero el Riito ubicado en el municipio de

Huatabampo, Sonora (Tabla 3).

Tabla 3. Ubicación de la zona de muestreo.

LADOS COORDENADAS

E P.V

LONGITUD RUMBO ASTRONOMICO

X Y

1 2 98.1801 41.23´18.63” NW 616,546.312 2´960,924.981

2 3 101.3066 50°37´49.03” NE 616,481.399 2´960,998.640

3 4 167.1061 12°25´19.80” NE 616,559.716 2´961,062.901

4 5 85.1763 83°04´51.62” SE 616,595.663 2´961,226.095

5 6 285.9080 22°30´16.20” SW 616,680.219 2´961,215,834

6 7 20.0000 41°23´18.63” SE 616,570.786 2´960,951.698

7 1 39.4744 72°44´27.60” SW 616,584.009 2´960,936.693

20

2.2 Periodo y Frecuencia de muestreo

El periodo comprendido para el muestreo fue de tres meses, muestreando

cada semana y las fechas de muestreo se observan en la tabla 4.

Tabla 4. Fechas de muestreo

Muestras

Meses 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Junio 24 28

Julio 05 12

Agosto 04 09 16 23

Septiembre 04 13 20

Octubre 04 11 18 25

2.3 Recolección y manejo de la muestra

Lavar los moluscos bivalvos con agua potable retirando la arena y cualquier

material extraño. Desconchar la carne con cuidado, sin lesionar el cuerpo del

molusco. Colectar aproximadamente 150 gramos de carne. Descartar las conchas,

moler la carne en una mezcladora o licuadora hasta la homogeneización, pasar la

cantidad de 10 g a un frasco de dilución con 90 ml de solución buffer para ser la

primera dilución 10-1 y pasar 1 ml a un tubo con 9 ml de solución buffer la cual

será la segunda dilución 10-2 continuar hasta 10-5 (NOM-031-SSA1-1993).

21

2.4 Análisis bacteriológicos

2.4.1 Metodología para cada análisis bacteriológico

2.4.1.1 Recuento de Mesófilos aerobios.

La técnica comúnmente utilizada para determinar el contenido de

microorganismos viables en un alimento es el recuento en placa, en medios de

cultivo con un soporte nutricional adecuado y libres de agentes inhibidores

(López y colaboradores, 1993).

Metodología 1. Realizar diluciones seriadas de 10-1 a 10-5

2. Inocular 1 ml de las diluciones 102, 10-3, 10-4, 10-5 en las cajas de petri estériles

previamente rotuladas. Distribuir unifórmente en toda la área de las cajas petri

de 15 a 29 ml de medio de cultivo (agar cuenta estándar) fundido y a una

temperatura tolerable (45°C aproximadamente), sin olvidar los testigos.

3. Inmediatamente incorporar el inoculo al medio mediante 6 movimientos de

derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido

contrario y 6 de atrás hacia delante. Evitar el derrame de liquido y su contacto

con la cubierta de la caja. El tiempo transcurrido desde la preparación de la

primera dilución hasta la incorporación del medio de cultivo a todas las cajas

no debe exceder de 20 minutos.

4. Dejar solidificar e incubar a 35± 2 °C durante 48± 2 horas.

5. Reportar los promedios de colonias desarrolladas por gramo o por ml de

muestra analizada (multiplicando el numero de colonias por el inverso de la

dilución) en las 2 repeticiones.

Con los datos anteriores discutir los resultados y derivar conclusiones.

(NOM-092-SSA1-1994).

22

2.4.1.2 Recuento de organismos coliformes totales y fecales. Metodología para recuento de organismos coliformes por la técnica del numero más probable (NMP). 1. Realizar diluciones decimales de 10-1 a 10-3.

Prueba presuntiva. 2. Inocular 1 ml de cada dilución en cada uno de los tres tubos con 10 ml de

caldo lauril sulfato triptosa.

3. Incubar los tubos a 35± 2°C durante 48± 2 horas.

4. Examinar los tubos a las 24± 2 horas y observar si hay producción de gas en

la campana de fermentación, si no hay, seguir incubando hasta las 48± 2

horas.

La presencia de gas, en cualquier cantidad, dentro del tiempo de incubación

hace positiva la prueba (NOM-112-SSA1-1994).

Prueba confirmativa

5. Agitar suavemente los tubos de caldo lauril triptosa que resultaron positivos

en la prueba presuntiva.

6. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo lactosa bilis verde brillante.

Al efectuar la reinoculación sostener el tubo primario (lauril sulfato triptosa) en

un ángulo tal que se pueda tomar la asada evitando la película que existiera

en el medio. Sacar el asa del liquido en sentido perpendicular a su superficie

de manera que se forme un menisco bien definido.

7. Incubar el caldo lactosa bilis verde brillante a 35± 2°C durante 48± 2 horas.

8. Considerar la prueba positiva si hay formación de gas en cualquier cantidad.

9. Determinar el numero de organismos coliformes de acuerdo con la tabla

correspondiente, tomando como base el numero de tubos en que se observe

producción de gas. 23

10. Reportar: Número más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de

muestra (NOM-112-SSA1-1994)

Procedimiento para recuento de NMP de organismos coliformes fecales

1. Realizar diluciones decimales de 10-1 a 10-3.

Prueba presuntiva. 2. Inocular 1 ml de cada dilución en cada uno de los tres tubos con 10 ml de

caldo lauril sulfato triptosa.

3. Examinar los tubos a las 24± 2 horas y observar si hay producción de gas en

la campana de fermentación, si no hay, seguir incubando hasta las 48± 2

horas.

La presencia de gas, en cualquier cantidad, dentro del tiempo de incubación

hace positiva la prueba (NOM-112-SSA1-1994).

Prueba confirmativa 4. Agitar suavemente los tubos de caldo lauril tritosa que resultaron positivos

en la prueba presuntiva.

5. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a tubos de caldo EC (Eijkman) con

sus respectivas campanas de Durham.

6. Incubar los tubos de 44.5± 0.2 °C en baño de agua y observar si hay

producción de gas a las 24 o 48 horas.

7. La presencia de gas en cualquier cantidad, dentro de las 48 horas de

incubación, hace positiva la prueba.

8. Alternativamente transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo en la prueba

presuntiva, a tubos con caldo lactosa bilis verde brillante y agua peptonada

(Mackenzie).

9. Incubar los tubos a 44.5± 0.2 °C en baño de agua y observar si hay

producción de gas las 24 a 48 horas. 24

10. Adicionar al tubo de agua peptonada de 2 a 3 gotas de reactivo de Kovac

(prueba de indol). Una coloración roja hace positiva la prueba.

11. Reportar: Numero más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de

muestra (NOM-112-SSA1-1994).

2.4.1.3 Recuento e identificación de Salmonella sp.

La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un

esquema general que consiste de 5 pasos básicos:

1. Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio

nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas

a una condición fisiológica estable.

2. Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de favorecer las

poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra.

3. Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que

restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y permite el

reconocimiento visual de colonias sospechosas.

4. Identificación bioquímica, este paso permite la identificación génerica de los

cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

5. Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificación

específica de un cultivo (NOM-114-SSA1-1994).

25

2.4.1.3.1 Aislamiento de Salmonella

Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de

preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la

mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de

caldo selenito cistina (NOM-114-SSA1-1994).

Incubar de 18 a 24 h a 35°C o, para alimentos fuertemente contaminados a

42°C por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente

enriquecidos en medios selectivos (NOM-114-SSA1-1994).

Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina

desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de

los medios selectivos adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto

o Agar SS) (NOM-114-SSA1-1994).

Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato.

Incubar las placas 24± 2 h a 35°C.

Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de

Salmonella, de acuerdo con las siguientes características:

Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro

negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.

Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio

enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.

Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En

algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras (NOM-114-

SSA1-1994).

26

Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés,

grises o negras; con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante

(halo) es café, tornándose posteriormente negro. Algunas cepas producen

colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran

colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales ( NOM-114-

SSA1-1994).

Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan

centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas ( NOM-114-

SSA1-1994).

2.4.1.3.2 Identificación bioquímica

Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se

encuentren bien aisladas. Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular

dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina

(LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo (NOM-114-

SSA1-1994).

Incubar por 24 ± 2 h a 35°C.

Almacenar en refrigeración de 5 a 8°C las placas con medios selectivos por si es

necesario retomar más colonias (NOM-114-SSA1-1994).

Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para

Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones:

Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la

fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo

más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de

la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de

la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico ( NOM-114-SSA1-1994). 27

Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la

descarboxilación de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que

produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar ( NOM-114-SSA1-1994).

La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfihídrico en este medio

con ennegrecimiento a lo largo de la punción (NOM-114-SSA1-1994).

Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de

Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas en

Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan

reacciones en LIA típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya

que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas

de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos

que muestren reacciones atípicas en ambos medios (NOM-114-SSA1-1994).

Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el

cultivo presenta reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de

las placas de donde se obtuvo el cultivo atípico anterior y sembrar las pruebas

bioquímicas nuevamente (NOM-114-SSA1-1994).

Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos

recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad

analítica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de

enriquecimiento (NOM-114-SSA1-1994).

Prueba de ureasa

• Prueba de ureasa (convencional). Con una asa estéril, tomar crecimiento del

cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos

de caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire púrpura de las

reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a 35°C.

Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den

la prueba negativa (sin cambio de color del medio) (NOM-114-SSA1-1994). 28

2.4.1.3.3 Pruebas bioquímicas complementarias

Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados

atípicos o no concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuación

(NOM-114-SSA1-1994).

Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar

citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para

confirmar la presencia de la especie S. arizonae.

Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:

Agar citrato Simmons

Inocular por estría el tubo.

Incubar 96 ± 2 h a 35±2°C.

Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.

Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.

Medio SIM

Inocular por punción.

Incubar 24 h a 35±2°C.

Movilidad.

Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.

Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.

Producción de ácido sulfihídrico.

Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el medio.

Prueba negativa: ausencia de color negro.

Producción de indol: Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac.

Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.

Prueba negativa: sin cambio de color. 29

Caldo RM-VP

Inocular un tubo con el medio.

Incubar 48 ± 2 h a 35±2°C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM.

Prueba de Voges-Proskauer (VP)

Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48 h.

Adicionar 0,6 ml de solución de alfa naftol.

Adicionar 0,2 ml de solución de hidróxido de potasio 40%.

Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).

Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35±2°C o 4 h a temperatura ambiente.

Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.

Prueba negativa: sin cambio de color.

Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2°C.

Prueba de rojo de metilo (RM)

Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo.

Interpretar los resultados inmediatamente.

Prueba positiva: desarrollo de color rojo.

Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.

Caldo malonato

Inocular un tubo conteniendo el medio.

Incubar 40 ± 2 h a 35±2°C.

Prueba positiva: desarrollo de color azul.

Prueba negativa: sin cambio de color.

(NOM-031-SSA1-1993).

30

2.4.1.4 Recuento e identificación de Vibrio cholerae.

Metodología

Se transfieren 25 g de muestra a un matraz que contenga 225 ml de caldo

peptona alcalino e incubar durante 24 ± 2hrs.

Transcurrido el tiempo de incubación sembrar en superficie en agar TCBS

haciendo estría por agotamiento para así aislar las colonias de Vibrio, incubar

durante 24 horas.

Sembrar colonias características en pruebas bioquímicas.

- Agar TCBS. Las colonias de V. cholerae (El Tor y Clásico) son grandes, lisas,

amarillas (positivas para la fermentación de la sacarosa) y ligeramente achatadas,

con el centro opaco y los bordes translúcidos (NOM-031-SSA1-1993).

Nota: Las especies de Vibrio no producen colonias pequeñas de color crema en

agar TCBS.

Las colonias de V. mimicus, que están estrechamente relacionadas con la

especie anterior, son verdes (sacarosa negativas). La mayoría de las demás

especies de Vibrio crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y verdes

(NOM-031-SSA1-1993).

Diferenciación.

Diferenciación de los Vibrios sospechosos de los microorganismos que no son

Vibrios.

- TSI,KIA y agar inclinado de Arginina y Glucosa (AGS). Inocular las

colonias individuales en medios de cultivo TSI (Agar de Triple Azúcar y Hierro),

KIA (Agar de Hierro Kliger) y AGS, picar y estriar en el agar inclinado. Incubar los

tubos inoculados, con el tapón no muy apretado, durante 18 a 24 horas de 35-

37ºC (NOM-031-SSA1-1993).

Se recomiendan estos medios porque las reacciones permiten efectuar una

diferenciación presuntiva entre la mayoría de las especies de Vibrio, Aeromonas,

Plesiomonas shigella y otras bacterias(NOM-031-SSA1-1993).

31

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el presente trabajo se realizaron 15 muestreos procedentes de una

ostricola ubicada en el Estero el Riito, en el municipio de Huatabampo, Sonora,

recolectándose una muestra de 15 ostiones por semana, en el periodo

comprendido de Junio a Octubre del 2004.

3.1 Cuenta total viable de mesófilos aerobios

La cuenta total viable de mesófilos aerobios es un indicador de las posibles

bacterias presentes en el ostión (Tabla 5) ya que los resultados arrojados

durante las 15 muestreos no se observo un alto número de UFC/g en estas,

aunque la muestra 15 fue una de las mas altas seguida de la muestra 10, pero de

acuerdo a la NOM- 031-SSA1-1993 que establece un limite máximo de 500 000

UFC/g, quedaron dentro del limite permitido. 32

Tabla 5. Resultados de organismos mesófilos aerobios (UFC/g) en muestras de ostión.

MUESTRA FECHA DE MUESTREO

UFC/g DE MESOFILOS AEROBIOS

1 25-Jun-04 1470

2 28-Jun-04 260

3 05-Jul-04 190

4 12-Jul-04 130

5 04-Ago-04 360

6 09-Ago-04 210

7 16-Ago-04 100

8 23-Ago-04 510

9 01-Sep-04 260

10 13-Sep-04 31200

11 20-Sep-04 1210

12 04-Oct-04 1170

13 11-Oct-04 1140

14 18-Oct-04 1740

15 25-Oct-04 168000

3.2 NMP de coliformes totales y fecales por 100 g de muestra

Los coliformes son un indicador importante de la calidad sanitaria de

cualquier alimento. Según la SSA el limite permitido para este microorganismo es

de 230/100g de NMP por muestra establecido en la NOM-031-SSA1-1993, en la

Tabla 6 se pueden observar los resultados obtenidos durante los 15 muestreos.

33

Los estudios para coliformes totales y fecales, realizados en la laguna

Madre de Tamaulipas (Téllez y colaboradores, 1999), no excedieron el limite de

230/100 g situación que no se presento en las muestras analizadas procedentes

del Estero el Riito en el municipio de Huatabampo, ya que el 60% de la muestras

hubo incidencia de coliformes fecales por lo que la calidad sanitaria de este

alimento no es apta para consumo humano; mientras que el 40% restante solo se

identificaron coliformes totales (muestras 4,5,6,9 y 13. Tabla 6).

Tabla 6. Resultados NMP/100 g para coliformes totales y fecales en

muestras de ostión.

MUESTRA FECHA DE

MUESTREO COLIFORMES

TOTALES COLIFORMES

FECALES

1 25-Jun-04 110000 20000

2 28-Jun-04 2300 2300

3 05-Jul-04 2300 900

4 12-Jul-04 50000 0

5 04-Ago-04 2300 0

6 09-Ago-04 400 0

7 16-Ago-04 400 400

8 23-Ago-04 9000 9000

9 01-Sep-04 900 0

10 13-Sep-04 2000000 200000

11 20-Sep-04 20000 900

12 04-Oct-04 2300 2300

13 11-Oct-04 0 0

14 18-Oct-04 2300 0

15 25-Oct-04 5000000 50000

34

3.3 Identificación de Salmonella y Vibrio cholerae

La incidencia de Salmonella y Vibrio Cholerae, en cualquier alimento

debe ser nula ya que este tipo de microorganismos son causantes de

enfermedades patógenas para el ser humano.

La presencia de Salmonella y Vibrio Cholerae fue totalmente negativa

durante el análisis, pero se logro la identificación Enterobacterias como, Proteus,

Providencia y Escherichia coli, esto en comparación de los resultados de las

pruebas bioquímicas.

35

CONCLUSIONES

En presente trabajo se llegó a las siguientes conclusiones:

• En organismos mesófilos aerobios el 100 % de las muestras cumplió con el

limite permitido siendo este de 500 000 UFC/g.

• El 99.99% de las muestras analizadas fueron positivos para coliformes

totales, presentándose una incidencia del 60% para coliformes fecales.

• En el 100 % de las muestras no hubo incidencia de Salmonella sp.

• El 100 % de las muestras no hubo incidencia de Vibrio Cholerae.

Los parámetros bacteriológicos del ostión cumplieron para mesófilos

aerobios, Salmonella y Vibrio Cholerae, de acuerdo al NOM-031-SSA1-1993,

para moluscos frecos-refrigerados y congelados debido a que no se detecto la

presencia de estos microorganismos, en cuanto a coliformes fecales el limite

permitido de 230/100 g excedió, por lo que no cumplió con el requerimiento en

dicha norma.

36

RECOMENDACIONES

• Conforme a los resultados obtenidos se recomienda no consumir el ostión

en forma fresca ya que se encontraron organismos de tipo fecal que

pudieran causar daño a la salud.

• Verificar que no existan posibles descargas de agua residual en el lugar

donde sea cultivado el ostión que puedan perjudicar la calidad sanitaria de

este.

• Realizar monitoreos al agua de cultivo, para cerciorarse de que esta

realmente cumpla con especificaciones sanitarias.

• Finalmente hay que hacer la observación de que el ostión por

autodepurarse y alimentarse por filtración de agua y al colocarse en agua

de buena calidad microbiología eliminan de su organismo cualquier

bacteria que pueda causar daño al ser humano (Roberts, 2000)

37

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