Tesis que presenta Marcos Andrés Jiménez Moreno · Celda unitaria para la conformación de un...
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“Simulación Molecular de Bionanodispositivos” Tesis que presenta Marcos Andrés Jiménez Moreno Qué Para Obtener el Grado de MAESTRO EN NANOTECNOLOGIA Bajo la Dirección de: DR. ROBERTO LÓPEZ RENDÓN Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma del Estado de México DR. KETZASMIN ARMANDO TERRÓN MEJÍA Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma del Estado de México Chihuahua, México, 21 de Junio de 2018
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“Simulación Molecular de Bionanodispositivos”
Tesis que presenta
Marcos Andrés Jiménez Moreno
Qué Para Obtener el Grado de
MAESTRO EN NANOTECNOLOGIA
Bajo la Dirección de:
DR. ROBERTO LÓPEZ RENDÓN Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma del Estado de México
DR. KETZASMIN ARMANDO TERRÓN MEJÍA Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma del Estado de México
Chihuahua, México, 21 de Junio de 2018
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Índice General
CAPÍTULO I Introducción 5
1.1 Nanotecnología 6
1.2 La bionanotecnologia 7
1.3 Nanodispositivos 9
1.4 El nitruro de silicio 9
1.5 Dinámica Molecular 12
1.6 Objetivos 17
1.61 Objetivo General 17
1.6.2 Objetivos específicos 18
1.7 Justificación 18
1.8 Hipótesis 19
CAPÍTULO II Modelos de potenciales
2.1 Potencial intermolecular 20
2.2 Potencial intramolecular 22
2.3 Distancia de enlaces 23
2.4 Ángulos de torsión 23
2.5 Potencial intermolecular 23
2.6 Potencial de Lennard-Jones 24
2.7 Potencial de Coulomb 24
CAPÍTULO III Metodología de simulación
3.1 Introducción 26
3.2 Nanoporos 27
3
3.3 Nanoporos biológicos 28
3.3.1 Nanoporos en estado sólido sintético 30
3.3.2 Nanoporos híbridos 31
3.4 Membrana cristalina de Si3N4 31
3.5 Ácido desoxirribonucleico ADN 33
3.6 Nanoporos ocupados para la secuenciación ADN 37
3.7 Diagrama de flujo para la simulación 39
3.8 Construcción de membrana cristalina a partir de celda unitaria 41
3.9 Construcción de la membrana de Si3N4 42
3.10 Construcción de la membrana hexagonal de Si3N4 45
3.11 Formación de un nanoporo 47
3.12 Formación de un nanoporo ramificado 50
3.13 Estabilización de la membrana 51
3.14 Calibración del campo de fuerza 52
3.15 Solvatación y adición de iones 61
3.16 Medición de corriente iónica 64
3.17 Construcción de molécula de ADN 68
3.18 Combinación de ADN y nanoporo sintético 72
3.19 Medición de corriente iónica 75
CAPÍTULO IV RESULTADOS Y CONCLUSIONES
Resultados 88
Conclusiones 97
Bibliografía 98
4
Índice de figuras
Figura 1.- Formación cristalográfica del α- Si3N4 11
Figura 2.- Formación cristalográfica del β- Si3N4 11
Figura 3-(a).- Potencial de Interacción intramolecular 20
Figura 3-(b).- Potencial de interacción intermolecular 21
Figura 3-(c).- r es la distancia de enlace entre el átomo A y B 21
Figura 4.- Estructura de tres poros biológicos 28
Figura 5.- Nanoporos en estado sólido de Si3N4 y su interacción con nucleosomas 29
Figura 6.- Membrana de estado sólido y proteína hemosilina formando un nanoporo
híbrido
30
Figura 7.- Celda unitaria para la conformación de un material cristalino 31
Figura 8.- Bases nitrogenadas que forman el DNA 33
Figura 9.- Nucleótidos que conforman el DNA. 33
Figura 10.- Niveles estructurales del DNA 35
Figura 11.- a) Detección electrónica transversal a través de poro de grafeno y b)
secuenciación basada en OPTIPORE
38
Figura 12.- Diagrama de flujo para la simulación 38
Tabla 1.- Características físicas, mecánicas, térmicas del Si3N4 12
Tabla 10.1. Tabla de tiempo y momento dipolo para dipole1.0.dat 92
Tabla 10.1. Tabla de tiempo y momento dipolo para dipole1.0.dat 92
Tabla 20a y 20b: Valores de corriente iónica con y sin ADN
95
5
CAPÍTULO I
Introducción
De acuerdo con Poole P. & Owens F. (2003) la nanotecnología es la manipulación
de la materia a escala atómica, molecular y supramolecular con al menos un
tamaño de dimensión de 1 a 100 nanómetros y es precisamente este
empleamiento de átomos y moléculas; lo que permitirá crear muchos nuevos
materiales y dispositivos con una amplia gama de aplicaciones.
La Bionanotecnología o llamada también Ingeniería Biomolecular es una rama de
la nanotecnología que se origina de la unión de la nanotecnología con la
biotecnología en la cual se destaca y sobre sale la contribución a la ciencia en el
desarrollo tecnológico, estas se fundamentan en la utilización de estructuras
biológicas como las proteínas ATP's, DNA, etc., en las cuales se juntan diferentes
estudios procedentes de la biología, física, química e ingeniería, Cerón, W. (2010.)
La nanobiotecnología indica la fusión de la investigación biológica con diversos
campos de la nanotecnología. La nanobiología incluye: nanodispositivos,
nanopartículas y los fenómenos a nanoescala que se produce dentro de la
disciplina de la nanotecnología.
Los objetivos más importantes que se encuentran con frecuencia en nanobiología
es la aplicación de nanoherramientas a problemas médicos / biológicos
pertinentes y el perfeccionamiento de estas aplicaciones. El desarrollo de nuevas
herramientas, como nanoláminas, para fines médicos y biológicos es otro objetivo
principal de la nanotecnología. Niemeyer, C. & Mirkin C., 2004).
El Si3N4 ha sido tradicionalmente el material del nanoporo debido a su alta
resistencia química y baja tensión mecánica. Los átomos de Silicio se combinan
para formar un sólido, que tiene característicamente una estructura ordenada
llamada cristal.
6
1.1 La nanotecnología
Es el estudio, diseño, creación, síntesis, manipulación y aplicación de materiales,
aparatos y sistemas funcionales a través del control de la materia a nano escala, y
la explotación de fenómenos y propiedades de la materia a esa escala. Cuando se
manipula la materia a una escala tan minúscula de átomos y moléculas,
demuestra fenómenos y propiedades totalmente nuevas [1].
La más temprana y difundida descripción de la nanotecnología se refiere a la meta
tecnológica particular de manipular en forma precisa los átomos y moléculas para
la fabricación de productos a microescala, ahora también referida como
nanotecnología molecular. Subsecuentemente una descripción más generalizada
de la nanotecnología fue establecida por la Iniciativa Nanotecnológica Nacional, la
que define la nanotecnología como la manipulación de la materia con al menos
una dimensión del tamaño de entre 1 a 100 nanómetros, es decir, un nanómetro
(nm) es la mil millonésima parte, o 10-9, de un metro. Esta definición refleja el
hecho de que los efectos de la mecánica cuántica son importantes a esta escala
del dominio cuántico y, así, la definición cambió desde una meta tecnológica
particular a una categoría de investigación incluyendo todos los tipos de
investigación y tecnologías que tienen que ver con las propiedades especiales de
la materia que ocurren bajo cierto umbral de tamaño.
Es común el uso de la forma plural de "nanotecnologías" así como "tecnologías de
nanoescala" para referirse al amplio rango de investigaciones y aplicaciones cuyo
tema en común es su tamaño. Debido a la variedad de potenciales aplicaciones
(incluyendo aplicaciones industriales y militares), los gobiernos han invertido miles
de millones de dólares en investigación de la nanotecnología.
Los costos de la implementación a gran escala la Nanotecnología y sus
inversiones se reparten por regiones en el mundo de la siguiente forma:
Estados Unidos – $1.6 billones (35%)
Asia – $1.6 billones (35%)
7
Europa – $1.3 billones (28%)
El resto del mundo – $133 millones (2%)
Además, según Consulting Resources Corp, el mercado ha estado invirtiendo en
productos y servicios relacionados al ámbito nanotecnológico, más de 200
millones de dólares en los años 2006-2007.
En síntesis, a partir del reordenamiento de átomos y moléculas la nanotecnología
nos permitirá la posibilidad de fabricar nuevos materiales, máquinas, aparatos y
sistemas novedosos de menor costo con propiedades únicas.
1.2 La Bionanotecnología
Es un área multidisciplinaria relativamente nueva. Integra elementos de las
ciencias biológicas (particularmente de ingeniería genética), con las nanociencias
y la nanotecnología [2]. Además, incluye áreas tan diferentes como la informática,
la medicina, química, ingeniería, etc.
Básicamente, la bionanotecnología consiste en:
La modificación de los sistemas biológicos (desde biomoléculas hasta
organismos enteros), utilizando nanomateriales.
La síntesis o modificación de las nanoestructuras, utilizando sistemas
biológicos.
Dentro de la bionanotecnología, las células desempeñan un papel fundamental
porque es la unidad funcional y estructural de la vida. Los nanomateriales tienen
un efecto directo en las células e incluso, las células pueden sintetizar (producir),
directa o indirectamente, diferentes nanomateriales.
El término bionanotecnología es usado a menudo como sinónimo de
nanobiotecnología, aunque a veces se hace una distinción entre ambas. Si
hacemos la distinción entre ambas, la nanobiotecnología se refiere a usar la
nanotecnología para alcanzar las metas de la biotecnología, mientras que la
bionanotecnología puede referirse a cualquier superposición entre la biología y la
8
nanotecnología, incluyendo el uso de biomoléculas como parte o inspiración de
dispositivos nanotecnológicos [3, 4, 5].
Los proyectos más avanzados están en las áreas médicas, particularmente en lo
relacionado al tratamiento de enfermedades infecciosas, el tratamiento de algunos
tipos de cáncer y el transporte dirigido de fármacos. Otras investigaciones
contemplan aspectos como la terapia génica (que consiste en modificar la
información genética para curar enfermedades) y el desarrollo de nanoestructuras
“inteligentes” que puedan reconocer elementos nocivos para el cuerpo y los
eliminen.
En el área de alimentos, hay avances desde su producción (modificando
pesticidas, fertilizantes, etc.) hasta el tratamiento de enfermedades y regulación
hormonal. Esto podría reducir el uso de sustancias químicas, hormonas y otros
productos cuyo uso representa un riesgo para la salud. Asimismo, podemos
mejorar la producción, e incluso, extender el tiempo de vida de algunos alimentos,
al protegerlos de factores ambientales que los descomponen. Otro aspecto
importante trata de las investigaciones para el tratamiento del agua.
Finalmente, en el área energética, hay muchos proyectos interesantes, donde los
nanomateriales prometen mejorar la producción, eficiencia y manejo de la energía
y de sus fuentes. Un ejemplo es el uso de nanomateriales para mejorar la
capacidad fotosintética, en microalgas, para la producción de biodiesel. También
se realizan investigaciones para optimizar las baterías y generar sistemas híbridos
(artificial y biológico), para mejorar las reacciones químicas de los combustibles, e
inclusive para ayudar a disminuir la contaminación, sobre todo la asociada con los
gases de invernadero.
En México se realizan diferentes proyectos que involucran a la bionanotecnología.
Los proyectos cubren diferentes áreas, entre los que se encuentran las
aplicaciones clínicas y veterinarias.
9
El espacio entre estos átomos en una molécula, están alrededor de los 0,12–0,15
nm y la doble hélice de un ADN tiene un diámetro de alrededor de 2 nm, es por
eso que se usa esa escale para la bionanotecnología.
Con la tecnología actual, se requiere dos meses y aproximadamente diez millones
de dólares para determinar un genoma. El 99,99% de precisión deseada,
obviamente demasiado lenta y demasiado costosa para uso en medicina personal.
Un dispositivo nanopore, junto con un detector de semiconductores integrado,
tiene la promesa de reducir el tiempo y el gasto de la secuenciación del genoma
por órdenes de magnitud [6].
1.3 Nanodispositivos
Para entender mejor la importancia de los nanodispositivos, es necesario
contextualizar las dimensiones de las que se trata. Por ejemplo, el tamaño de los
átomos oscila entre 0.1 y 1 nm, mientras que las moléculas simples pueden estar
entre 1 y 10 nm; los virus llegan a medir hasta 100 nm y las bacterias hasta 10
micrómetros [7]. Las partículas menores a 50nm se comportan de acuerdo a las
leyes de la física cuántica, mientras que las partículas más grandes responden a
las leyes de la física clásica (Leyes de Newton). A nivel de nanopartícula pueden
ocurrir cambios respecto a las propiedades eléctricas, químicas, magnéticas,
mecánicas o biológicas del material que lo diferencian del correspondiente en su
forma normal aunque sin cambios en su composición química. Los nanomateriales
pueden presentar características nuevas realzadas, como flexibilidad, fortaleza,
conductividad, tensión, superficial e inclusive el color cuando las partículas son
menores a los 100 nm. No obstante, son capaces de aumentar su reactividad
debido a una mayor razón masa/superficie.
1.4 El nitruro de silicio
Es un compuesto químico de silicio y nitrógeno, con la fórmula Si3N4. Es un sólido
blanco, de punto de fusión alto, que es relativamente inerte químicamente, siendo
atacado por HF diluido y H2SO4 caliente. Es muy duro (8.5 en la escala de Mohs).
10
Es el más estable termodinámicamente de los nitruros de silicio. Por ello, Si3N4 es
comercialmente muy importante [8].
El nitruro de silicio es el material dominante para los usos de cerámicos
estructurales en ambientes de la alta tensión mecánica y térmica por ejemplo en
los motores de vehículos de propulsión. Sus características hacen a este material
el único conveniente para alta tensión mecánica a temperatura ambiente y a
temperaturas elevadas, buena resistencia a la oxidación y al desgaste a altas
temperaturas, alta resistencia al choque térmico, resistencia excelente a la
abrasión y a la corrosión, baja densidad, y, por lo tanto, un momento bajo de
inercia. Además, el nitruro de silicio se fabrica de materias primas abundantes.
Hay dos técnicas básicas para la síntesis industrial del polvo Si3N4, aunque existen
otros métodos disponibles. El más antiguo y más extensamente utilizado es el
método de nitración del silicio. El silicio se calienta en una atmósfera del nitrógeno
a las temperaturas de 1100-1450 ºC en la presencia de un catalizador de hierro.
La pureza del producto depende de la pureza de los materiales de partida, de la
cantidad de catalizador usada, y del grado al cual se quita el catalizador. El otro
proceso comercial es una reacción donde el tetracloruro del silicio o un silano
reaccionan con amoníaco líquido a bajas temperaturas.
El nitruro de silicio existe en dos modificaciones cristalográficas hexagonales
señaladas como la α y las β-fases. La fase β es frecuente a altas temperaturas.
Las impurezas metálicas son negativas para las características termomecánicas
del Si3N4 y en los polvos más puros su concentración total no excede de 100 ppm.
Los niveles de tolerancia para los metales varían, pero cualquier contaminante
preferiblemente se debe dispersar homogéneamente en el polvo que estar
presente en partículas discretas. Los álcalis y los metales que forman los cristales
que tienen un bajo punto de fusión son inaceptables porque pueden causar fallos
a las altas temperaturas. El aluminio y el magnesio no son problemáticos por lo
11
que se utilizan con frecuencia como aditivos de sinterización. Los metales de
transición tales como Fe, Ni, o Cr pueden afectar a la dureza del material [9].
Figura 1.- Formación cristalográfica del α- Si3N4
Figura 2.- Formación cristalográfica del β- Si3N4
12
Propiedades
Eléctricas
Constante dieléctrica 10
Resistividad de volumen 25C (Ohmcm ) >107
Propiedades
físicas
Densidad ( g cm-3 ) 2,4
Porosidad aparente ( % ) 15-23
Propiedades
mecánicas
Dureza - Vickers ( kgf mm-2 ) 800-1000
Módulo de tracción ( GPa ) 170-220
Resistencia a la cizalla ( MPa ) 190-240
Resistencia a la compresión ( MPa ) 550-650
Propiedades
térmicas
Calor específico a 25C ( J K-1 kg-1 ) 690
Coeficiente de expansión térmica a 20-1000C ( x10-6 K-1 ) 3,3
Conductividad térmica @20C ( W m-1 K-1 ) 10-16
Temperatura máxima de utilización continua ( C ) 1200-1500
Propiedades
químicas
Ácidos – concentrados- Aceptable
Ácidos – diluidos Buena
Álcalis- Aceptable
Halógenos- Buena
Metales- Aceptable
Tabla 1.- Características físicas, mecánicas, térmicas del Si3N4
1.5 Dinámica Molecular
La dinámica molecular (MD, Molecular dynamics) es un método o tecnica de
simulación molecular computacional que permite analizar el comportamiento o
evolución de un sistema (físico, químico o biológico) a través del tiempo,
calculando las fuerzas entre los átomos que lo conforman mediante las
ecuaciones del movimiento de Newton [10].
Operacionalmente, es un método para generar las trayectorias de un sistema
compuesto de N partículas por integración numérica directa de las ecuaciones de
movimiento de Newton, con especificaciones de un potencial de interacción
interatómico de condiciones iniciales y de frontera adecuadas. MD es un método
13
de modelado y simulación a nivel atomístico cuando las partículas en cuestión son
los átomos que constituyen el material o sistema de estudio.
Por medio de MD, se pueden calcular diferentes propiedades fisicoquímicas del
sistema como la energía libre, entropía, solubilidad, viscosidad, presión,
temperaturas de cambio de fase, y en sistemas biológicos, permite medir la fuerza
de interacción entre posibles fármacos y sus dianas biomoleculares o receptores,
e incluso, describir el comportamiento de una proteína y moléculas complejas bajo
ciertas condiciones, por mencionar algunas de sus capacidades. Si bien, las
ecuaciones del movimiento no describen el sistema a nivel cuántico (lo cual
requeriría una capacidad de cálculo extremadamente grande), este tipo de
estudios han mostrado buena correlación con resultados experimentales, y se
pueden realizar con equipos de cómputo ciertamente convencionales, pero que
cumplan ciertas especificaciones técnicas.
Básicamente se requiere una configuración inicial del sistema a analizar, es decir,
se requieren las posiciones iniciales de los átomos que lo conforman. Un ejemplo
de esto son los llamados fluidos de Lennard-Jones, como son los gases nobles.
Este tipo de sistema está constituido esencialmente por partículas esféricas que
no forman interacciones covalentes entre sí, y donde las interacciones no
covalentes son principalmente de carácter repulsivo.
De esta forma, un fluido con estas características puede ser visto como un arreglo
de partículas esféricas donde el tamaño y la masa dependen del gas noble a
considerar, y las posiciones iniciales pueden ser asignadas al azar. Sin embargo,
en estudios de tipo biológico, esta información puede provenir de fuentes
experimentales como difracción de rayos-X o RMN, pues la resolución de una
molécula por estos métodos analíticos, brinda conocimiento sobre la disposición
tridimensional de cada uno de los átomos que la conforman, constituyendo un
buen punto de partida.
14
En la actualidad, existen programas computacionales que permiten la construcción
de sistemas complejos como son sólidos, líquidos, gases, interfaces (sólido-
líquido, liquido-gas, líquido-líquido, sólido-gas), membranas celulares o moléculas
de ADN, por citar algunos ejemplos. Pero siempre se debe considerar que la
calidad de los resultados (output) depende de la información inicial o datos de
entrada (input), por lo que en ocasiones es mejor recurrir a fuentes experimentales
de información, aunque esto depende del problema en cuestión.
Además de lo anterior, se requiere conocimiento teórico básico sobre Mecánica
Estadística, campos de fuerza (force fields), y sobre el manejo general del paquete
a utilizar, pues cada uno tiene un protocolo a seguir.
A diferencia de otros métodos de simulación molecular, que permiten simular una
etapa o “un estado” del sistema en estudio, la dinámica molecular nos brinda la
evolución de dicho sistema a través del tiempo (medido en picosegundos),
además, puesto que se consideran las velocidades de los átomos, también se
puede calcular la energía cinética del sistema. Además, si por ejemplo, se analiza
la interacción de un fármaco con su receptor, MD permite observar cambios
conformacionales de dicho receptor y no únicamente del fármaco, lo que puede
arrojar información crucial para el diseño de nuevas moléculas para uso clínico.
Otra ventaja es que no sólo permite la simulación del sistema ligando-proteína,
sino que además se puede incluir el disolvente que lo rodea (como el agua), así
como la inclusión de iones, regular la temperatura o la presión, o la incorporación
de entidades químicas (metales, azucares, cofactores, grupos prostéticos) que
usualmente no son consideradas en otros métodos de simulación debido a sus
limitaciones. Esto último resulta muy interesante, pues el sistema a analizar
adquiere gran representatividad, aunque se debe considerar que la inclusión de
estas entidades químicas incrementa la complejidad del sistema de estudio, y en
consecuencia la duración de la simulación aumenta.
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Si es posible realizar dinámica molecular en computadoras convencionales
aunque no es lo recomendado. Muchos de los programas y paquetes para
dinámica molecular están disponibles de forma gratuita, lo cual en si ya es una
ventaja. Algunos de ellos, se pueden usar bajo el ambiente Windows®, aunque en
su mayoría, están diseñados para los sistemas operativos Unix® y Linux. Algunos
programas como NAMD, pueden ejecutarse en interface gráfica, con un manejo
amigable.
Otros como LAMMPS o Gromacs se ejecutan desde una ventana de línea de
comandos o terminal, por lo que requieren del conocimiento de ciertas
instrucciones y comandos para facilitar su uso.
En cada caso, los desarrolladores señalan cuales son los requerimientos técnicos
(procesador, espacio libre en disco duro, memoria RAM, tarjeta gráfica, etc.).
Sistemas pequeños compuestos por pocos átomos pueden ser simulados en un
tiempo corto en computadoras ordinarias, pero sistemas biológicos complejos con
el ADN o proteínas requieren de tiempos de cálculo elevados, que puede ir de
unas horas hasta semanas o meses, de ahí la importancia de contar con equipo
de cómputo con elevada capacidad de cálculo. Hoy en día, es común el uso de
GPU’s (Graphics processing unit) ya que ciertos cálculos los realiza la tarjeta
gráfica del ordenador, lo cual ahorra tiempo. Aunque en teoría es posible realizar
dinámica molecular en prácticamente cualquier computadora actual, el tiempo que
dure la simulación está en función de las características del sistema a estudiar y el
tiempo que se deseé realizar la simulación.
A diferencia de otros métodos de simulación computacional, la dinámica molecular
calcula las fuerzas de los diferentes átomos en función del tiempo, esto implica
que cada vez que haya un cambio de posición y velocidad, se tendrá que calcular
nuevamente las propiedades del sistema en cuestión, lo cual exige altas
capacidades de infraestructura computacional. Para acelerar este proceso se ha
optado por el uso de Clusters, que básicamente son un grupo de computadoras
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conectadas entre sí que pueden realizar cálculos de forma paralela. Otra opción
ya mencionada es el uso de GPU’s, aunque computadoras de alto rendimiento
pueden realizar dinámica molecular sin problemas.
Para otros tipos de estudios in sílico (QSAR, Virtual Screening, Docking, por
mencionar algunos) el tiempo requerido para su realización, está en función del
ritmo de trabajo, la fuente de información experimental y la solución de ciertos
problemas técnicos. En el caso de la dinámica molecular, además se debe tener
en cuenta el tiempo de cómputo, que resulta proporcional a la complejidad del
sistema de estudio. Para aplicar dinámica molecular en un tiempo relativamente
corto, se debe contar con equipo de cómputo de alto rendimiento computacional.
Las diferentes etapas de una simulación por dinámica molecular se pueden
resumir en el siguiente esquema:
Preparación del sistema. Se establece o elige la configuración inicial (CI) a utilizar
compuesta de N átomos y se definen las condiciones de equilibrio (CE).
Equilibramiento. Mediante diferentes esquemas o ensambles de simulación
(microcanónico, canónico, isotérmico-isobárico), se lleva el sistema al
equilibrio donde la energía permanece casi constante. Dependiendo del
esquema a utilizar, se pueden definir condiciones constantes de energía,
presión (P) y/o temperatura (T).
Simulación MD. Se define el tiempo de ejecución (L pasos de ejecución -
runs-) y se corre la dinámica molecular. Este es el paso que requiere el
mayor tiempo, pues puede ir de pocos picosegundos a nanosegundos
(horas a semanas). Se realiza el cálculo de fuerzas del sistema con lo que
se pueden obtener las propiedades fisicoquímicas de interés.
Resultados. Finalmente, se analizan los resultados y se obtiene la
información deseada. Dependiendo del paquete utilizado, se puede hacer el
cálculo de algunos parámetros, además, se puede analizar la trayectoria o
17
comportamiento del sistema (animación o película) por medio de
visualizadores moleculares con interface gráfica
Hoy en día, la dinámica molecular se aplica para el análisis de prácticamente
cualquier sistema fisicoquímico de interés, siempre y cuando se disponga de una
configuración inicial adecuada. Ejemplos de esto son el estudio de cambios de
fase, solubilidad de moléculas, viscosidad de líquidos, pegamentos, pero quizás el
mayor interés que está surgiendo es su aplicación a la biología. Permite establecer
la conformación de menor energía de proteínas, ADN y moléculas pequeñas
(Optimización de geometría), por lo que está siendo aplicada al modelado
molecular. Posibilita el estudio del comportamiento de un ligando (molécula
pequeña con potencial farmacológico) frente a su diana biomolecular, resultando
crucial en el diseño de nuevos fármacos. Se puede estudiar un fluido y establecer
su temperatura de fusión o evaporación. Facilita el estudio de solubilidades y el
paso de moléculas a través de membranas celulares, entre muchas otras cosas.
En general, superando ciertos aspectos técnicos, su uso es poco limitado,
resultando un método de simulación molecular muy versátil.
En este proyecto se propone realizar un estudio de las interacciones moleculares
en la permeación del DNA a través de un nanoporo de Si3N4 usando los métodos
de simulación molecular. La permeación del DNA a través de dispositivos de
nanométricos son el elemento clave en la tecnología propuesta para de alto
rendimiento de secuenciación de DNA.
1.6 OBJETIVOS
1.6.1 OBJETIVO GENERAL
El objetivo principal de este proyecto de tesis es estudiar las interacciones
moleculares más importantes en la interacción del DNA con un dispositivo
bionanotecnológico (Si3N4) usando las técnicas de simulación molecular,
específicamente el método de dinámica molecular atomística.
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1.6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
La manera de garantizar llevar a buen término las metas propuestas de este
proyecto es mediante la ejecución de los siguientes objetivos específicos:
1.- Comprender la importancia de la bionanotecnologia en la actualidad.
2.- Identificar el procedimiento computacional para llevar a cabo una simulación
molecular.
3.- Explorar las aplicaciones y ventajas de la bionanotecnología.
4.- Aprender más sobre la nanotecnología y aprender a usar dichos conocimientos
teóricos en el desarrollo de la visualización en el programa VMD y NAMD.
1.7 Justificación
El ADN posee propiedades singulares, que incluyen su función biológica,
biocompatibilidad, capacidad de reconocimiento molecular y la posibilidad de
controlar su estructura a nanoescala; para aprovecharlas, se han creado una gran
variedad de nanomateriales. Estos nuevos materiales de ADN proporcionan un
puente natural entre la nanotecnología y la biotecnología, lo que lleva a
aplicaciones de gran alcance en el mundo real.
Dentro de los nanomateriales, los nanoporos han evolucionado ampliamente en
varios dispositivos, que abarcan muchas áreas diferentes, desde la detección de
una molécula única hasta el diagnóstico médico, cobrando un papel cada vez más
importante en el área de la biotecnología y las ciencias de la vida.
Los bionanodispositivos basados en nanoporos (tanto biológicos como sintéticos),
nos permiten detectar e “interrogar” moléculas individuales a través del control de
la modulación de la conductancia eléctrica del poro. Este mecanismo es muy
potente debido a varias ventajas particulares, como por ejemplo, nos ha permitido
reducir el volumen y concentración necesaria de la muestra; Lo anterior representa
un gran potencial para aplicaciones de detección de moléculas únicas sin
etiquetas (no identificadas con anterioridad); Y la posibilidad de realizar el análisis
19
en tiempo real reduciendo en gran medida el tiempo y el costo del mismo,
adicionalmente tienen el potencial para detectar anomalías en una hebra de ADN,
arrojando así una advertencia oportuna a los médicos acerca de la susceptibilidad
de un paciente a enfermedades específicas como el cáncer.
La simulación representa un proceso que hace más simple y entendible un
experimento, esta simulación en particular es indispensable para la visualización
del comportamiento e interacción entre un bionanodispositivo de Si3N4 en una
molécula de DNA.
En los últimos años, se ha demostrado que la técnica de hibridación de ácido
nucleico es una plataforma potencial para crear dispositivos biosensores de
secuencias de ADN, ya que el sensor traduce directamente los eventos de
hibridación en una señal de lectura electrónica medible.
1.8 Hipótesis
Una selecciona adecuada de los diferentes software o programas de simulación
molecular, aumentan la comprensión de interacción entre un bionanodispositivos
de Si3N4 en una molécula de DNA.
20
CAPÍTULO II
Modelo de potencial
2.1 Potencial intermolecular
Los potenciales intermoleculares describen las interacciones entre moléculas, es
decir, cada átomo de una molécula interacciona con los átomos de otra molécula,
con un potencial por pares. Este potencial tiene dos contribuciones: uno de corto
alcance y otra de largo alcance, dichas contribuciones están dadas por los
potenciales de Lennard-Jones y Coulomb.
Un campo de fuerza es un conjunto de ecuaciones analíticas que permiten
caracterizar cada uno de los grados de libertad de las componentes de un sistema
molecular bajo ciertos parámetros. Hoy en día se tiene en existencia campos de
fuerza estándares como OPLS (Optimized Potential for Simulation Liquides),
AMBER (Assisted Model Building with Energy Re_nement) o CHARMM (Chemistry
at Harvard Macromolecular Mechanics), que fueron parametrizados a partir de
datos experimentales para una amplia gama de moléculas orgánicas.
Con el tiempo las versiones para el campo de fuerzas CHARMM se han
optimizado para el uso con biomoleculas. En la presente tesis se desarrollara un
modelo propio que sea aplicable a nuestros fines, bajo el perfil del campo de
fuerzas CHARMM, descrito a continuación.
La interacción entre el núcleo y la nube de electrones de un par de moléculas i y j
da como resultado una función complicada para las posiciones de la molécula ri y
rj así como para sus orientaciones.
De tal forma que la manera de modelar una molécula es a través de la posición y
tamaño de los átomos que la constituyen.
21
La energía potencia total del sistema molecular tiene dos contribuciones:
𝑈𝑃(𝑟) = 𝑈𝑖𝑛𝑡𝑟𝑎(𝑟, 𝜃, 𝜙)⏟ 𝐼
+ 𝑈𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟(𝑟)⏟ 𝐼𝐼
(3.1)
Donde 𝑈𝑖𝑛𝑡𝑟𝑎 es la energía intramolecular que representa la interacción entre
átomos de una misma molécula, mientras que 𝑈𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟 es la energía intermolecular
que por su parte representa la interacción entre moléculas distintas. En la
ecuación (3.1), el término I se representa como:
𝑈𝑖𝑛𝑡𝑟𝑎(𝑟, 𝜃, 𝜙) = 𝑈(𝑟𝑖𝑗) + 𝑈(𝜙𝑖𝑗𝑘) + 𝑈(𝜙𝑖𝑗𝑘𝑙) (3.2)
Aquí 𝑈(𝑟𝑖𝑗) y 𝑈(𝜙𝑖𝑗𝑘) representan la energía potencial debida a la distancia de
enlace y ángulos de enlace respectivamente, 𝑈(𝜙𝑖𝑗𝑘𝑙) representa la energía
debida a la rotación del ángulo de torsión, véase la figura 3.1. Por otra parte, el
término II corresponde a la energía intermolecular, figura 3.1, por dos tipos de
interacciones, de Van der Waals y Coulomb, potenciales de corto y largo alcance
respectivamente, mediante la relación:
𝑈𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟 = 𝑈𝐿𝐽(𝑟𝑖𝑗) + 𝑈𝐶𝑜𝑢𝑙𝑜𝑚𝑏(𝑟𝑖𝑗) (3.3)
Figura 3-(a).- Potencial de Interacción intramolecular
22
Figura 3-(b).- Potencial de interacción intermolecular
Figura 3-(c).- r es la distancia de enlace entre el átomo A y B; θ es el ángulo de
enlace entre átomos.
2.2 Potencial intramolecular
Nos referimos a un potencial intramolecular cuando en un sistema molecular
podemos utilizar potenciales atómicos para describir la interacción entre átomos
pertenecientes a una misma molécula, estas interacciones son debidas a
vibraciones internas de la molécula. Para este tipo de contribuciones se
consideran los grados de libertad: distancia de enlace las cuales se pueden
modelar fijas o armónicas; el ángulo de enlace que se forma entre tres átomos
23
adyacentes modelados por una función de tipo armónico y el ángulo de torsión
que se forma entre los planos de cuatro átomos consecutivos de una molécula.
Este tipo de contribuciones se representan en la figura 3.a y son expuestos a
continuación:
2.3 Distancias de enlace Las distancias de enlace se pueden modelar mediante una función de tipo armónico:
𝑈(𝑟𝑖𝑗) =𝑘𝑟
2(𝑟𝑖𝑗 − 𝑟0)
2 (3.4)
Donde 𝑟𝑖𝑗 es la distancia relativa entre los átomos i y j, r0 es su distancia de
equilibrio y kr la constante del enlace. Los parámetros r0 y kr pueden obtenerse por
medio de técnicas experimentales o bien por métodos teóricos.
2.4 Angulo de torsión Se consideran los ángulos de torsión, como un tercer tipo de grado de libertad
conformacional. Este tipo de torsiones están relacionados con los cambios de
energía que se presentan en una molécula cuando los átomos giran alrededor de
los enlaces sencillos.
La forma del potencial 𝑈(𝜙𝑖𝑗𝑘𝑙) es una función periódica en el ángulo de torsión
asociado a los cuatro átomos involucrados (i, j, k, l). El potencial que describe este
tipo de interacción está dado por
𝑈(𝜙𝑖𝑗𝑘𝑙) = ∑ 𝑉𝑛
2(1 + cos (𝑛𝑛 𝜙 − 𝜙0)) (3.5)
2.5 Potencial intermolecular
Los potenciales intermoleculares describen las interacciones entre moléculas, es
decir, cada átomo de una molécula interacciona con los átomos de otra molécula,
con un potencial por pares. Este potencial tiene dos contribuciones: uno de corto
24
alcance y otra de largo alcance, dichas contribuciones están dadas por los
potenciales de Lennard-Jones y Coulomb.
2.6 Potencial de Lennard-Jones
El potencial de Lennard-Jones describe las interacciones de corto alcance entre
los átomos. Para nuestro sistema la interacción entre el átomo a de la molécula i y
el átomo b en la molécula j está dado por:
𝑈𝐿𝐽 = ∑∑∑∑𝑈𝐿𝐽(𝑟𝑖𝑎𝑗𝑏)
𝑁𝑗
𝑏=1
𝑁𝑖
𝑎=1
𝑁
𝑗>𝑖
𝑁−1
𝑖=1
𝑈𝐿𝐽 = ∑∑∑∑4𝜀𝑎𝑏 [(𝜎𝑎𝑏𝑟𝑖𝑎𝑗𝑏
)12 − (𝜎𝑎𝑏𝑟𝑖𝑎𝑗𝑏
)6]
𝑁𝑗
𝑏=1
𝑁𝑖
𝑎=1
𝑁
𝑗>𝑖
𝑁−1
𝑖=1
Donde el término (𝜎
𝑟𝑖𝑎𝑗𝑏)12 nos muestra la contribución atractiva y el termino
(𝜎
𝑟𝑖𝑎𝑗𝑏)6 la contribución repulsiva, σ es una medida del diámetro de los átomos
que interaccionan y ε es la profundidad del pozo que representa la atracción entre
los sitios en moléculas distintas, y 𝑟𝑖𝑎𝑗𝑏 es la distancia entre sitio a en la molécula i
y el sitio b en la molécula j.
2.7 Potencial de Coulomb
La energía electrostática entre dos cargas eléctricas está dada por:
𝑈𝐶 =1
4𝜋𝜀0
𝑞𝑖𝑎𝑞𝑗𝑏
𝑟𝑖𝑎𝑗𝑏
Siendo 𝜀0 la permitividad en el vacío y 𝑟𝑖𝑎𝑗𝑏 la distancia relativa entre la carga 𝑞𝑖𝑎
del átomo a en la molécula i y 𝑞𝑗𝑏 la carga del átomo b en la molécula j.
25
A diferencia del potencial de LJ, el potencial de Coulomb es un potencial de largo
alcance, las interacciones coulombianas decaen lentamente con la distancia entre
las partículas, alcanzando valores apreciables incluso en posiciones muy alejadas
entre ellas. Esto hace que el alcance de este potencial sea mayor que la mitad de
la arista de las cajas que se usan habitualmente en una simulación y no es posible
realizar un truncamiento del potencial.
No obstante, existe un método eficiente para el cálculo de interacciones
electrostáticas en un sistema periódico infinito definido mediante condiciones
periódicas, conocido como sumas de Ewald. La principal característica de las
sumas de Ewald es que transforman una serie lenta y condicionalmente
convergente en la suma de dos series rápidamente convergentes más un término
constante [11, 12 ,13].
26
CAPÍTULO III
Metodología de la simulación
3.1 introducción
Los programas de simulación molecular para visualización como VMD y de
cálculos como NAMD permiten la simulación de una de las grandes aplicaciones
de la bionanotecnología que es la construcción de un nanoporo en una membrana
sintética y la interacción con moléculas biológicas como el caso específico de una
molécula de DNA, estos procesos de simulación molecular se reproducen
sistemáticamente en el presente capítulo y se muestran los resultados obtenidos.
Como ya se ha descrito VMD (Visual Molecular Dynamics) es un programa de
modelación molecular y de visualización de estructuras; el cual fue desarrollado
como una herramienta para ver y analizar los resultados de las simulaciones de
dinámica molecular; trabaja con archivos PDB que dan las coordenadas y
características propias de los átomos que conforman la estructura a simular y
archivos que contienen los parámetros estructurales de las moléculas. Por otra
parte, NAMD es un código paralelo de dinámica molecular diseñado para
simulaciones de grandes sistemas biomoleculares. Las simulaciones de dinámica
molecular computan las trayectorias atómicas resolviendo las ecuaciones del
movimiento numéricamente, utilizando campos de fuerza empíricos, como el
campo CHARMM, que aproxima la fuerza real entre los átomos en sistemas de
biopolímeros. La utilización de ambos programas nos permite realizar la
simulación que se tiene por objetivo.
Considerando la bionanotecnología como integración de moléculas y herramientas
útiles, y de la simulación computacional para la comprensión e incrementación del
conocimiento de materiales biológicos e inorgánicos y su integración en una única
descripción. Por tal motivo se plantea la aplicación de métodos moleculares
básicos como introducción al estudio bionanotecnológico.
27
En este sentido se busca la construcción de una membrana de Si3N4 con un
nanoporo de aproximadamente 2 nm de diámetro y su interacción con una
molécula de DNA, simulación que se basa en experimentos asociados a nuevas
tecnologías en la secuenciación de DNA y proteínas. A lo largo del documento se
hará énfasis en distintos conceptos a tener en claro para la comprensión del
ejercicio realizado, así como la metodología a seguir para lograrlo basándose en lo
propuesto por Alek Aksimentiev y Jeffrey Comer.
3.2 Nanoporos
Dentro de la bionanotecnología se ha desarrollado la tecnología de nanoporos la
cual emplea un agujero a nanoescala en una membrana aislante con un alto
rendimiento de moléculas individuales en solución. La generalidad del principio de
detección de nanoporos y la facilidad de detección de la molécula individual
sugiere muchas aplicaciones potenciales de nanoporos en la biotecnología [14].
Se han hecho progresos recientes con fabricación de nanoporos y sofisticación,
así como aplicaciones en el mapeo de ADN/proteína, análisis de la estructura
biomolecular, detección de la proteína, y la secuenciación del ADN. Además, los
conceptos para dispositivos de secuenciación del ADN se han sugerido, y se han
hecho esfuerzos computacionales. El estado del campo de los nanoporos está
madurando, teniendo en cuenta el tipo de condiciones y funcionamiento de
nanoporos, casi todas las aplicaciones podrían revolucionar la medicina en
términos de velocidad, costo y calidad.
Los nanoporos son producidos en la naturaleza en membranas con funciones
asociadas al cruzamiento de material a través de la pared celular y paredes de
orgánulos intracelulares; siendo vitales para la función celular y la vida. Existe una
clase de poros que permite que las células mantengan diferentes concentraciones
internas de solutos desde el medio ambiente exterior para mantener el equilibrio
osmótico.
28
El análisis de proteínas usando nanoporos se pueden clasificar en las siguientes
grandes áreas de investigación: análisis de la estructura, biosensores, y
caracterización vinculante.
Los experimentos con Biosensores se llevan a cabo mediante el diseño de un poro
que se adapta con un sitio de unión específico capaz de mantener la proteína
analito dentro del poro. La característica de unión se lleva a cabo mediante el
cálculo de constantes de velocidad de unión y el tiempo de vida media [15]. La
motivación de estos estudios incluyen aplicaciones en la ingeniería de proteínas,
la ciencia farmacéutica, y biosensores (detección de enfermedades -
biomarcadores).
Otro campo en el que la tecnología de nanoporos se ha introducido es la
ultrafiltración. La capacidad de fabricar matrices ordenadas de nanoporos en las
membranas ultrafinas ha hecho posible el desarrollo de dispositivos de separación
molecular altamente eficientes.
La selectividad de tales dispositivos se puede adaptar para aplicaciones
específicas de la modificación de la superficie química o mediante la modificación
de la capa alrededor de los poros utilizando electrodos incrustados. La selectividad
de tales membranas es más o menos un orden de magnitud mayor que la diálisis
convencional de membranas. Se investiga la cinética de la digestión enzimática
directa de moléculas de ADN únicas atrapadas por exonucleasa usando una
membrana de alúmina nanoporosa, elaborado a través de la modificación
electroquímica (anodización) de alúmina de alta pureza [16]. Los nanoporos se
clasifican en tres: poros biológicos, poros sintéticos fabricados en sustratos sólidos
y poros híbridos.
3.3 Nanoporos biológicos A través de los años, los canales relativamente grandes en comparación con los
canales iónicos se han explorado para los fines de detección de nanoporos. El
29
sustrato de elección para todos los poros biológicos son membranas líquidas,
liposomas o membranas de polímero alojado en el interior de una cámara
electroquímica. La producción a gran escala y purificación de diversas proteínas
de los canales son posibles mediante el empleo de técnicas estándar de biología
molecular. Además, la ingeniería explícita de los poros de los canales a través de
mutagénesis directa es posible debido a la estructura de cristal disponible, de
varias proteínas del canal [17].
Figura 4.- Estructura de tres poros biológicos: A) alfa-homosilina de S. aureus. B)
MspA porina de M. smegmatis y C) Conector Phi29.
Fuente: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3596169/figure/F1/
30
3.3.1 Nanoporos en estado sólido sintéticos
Los nanoporos en estado sólido se han convertido en una alternativa versátil a
nanoporos biológicos debido a sus propiedades únicas, incluyendo geometrías y
dimensiones bien definidas, robustez mecánica, facilidad de modificaciones, y la
compatibilidad con varias técnicas de medición electrónica u óptica.
En general, los nanoporos de estado sólido en los materiales dieléctricos, como
Si3N4 (el cual es material obtenido para la presente práctica), presentan estabilidad
química y térmica sobre las membranas lipídicas [18]. Sin embargo, su estabilidad
es dependiente de las condiciones utilizadas para formar estos poros.
En cuanto a nanoporos basados en grafeno, a pesar de su estabilidad química y
térmica no se ha demostrado de manera concluyente, sus propiedades eléctricas
únicas son una gran ventaja sobre los homólogos biológicos. En los últimos años,
los nanoporos en estado sólido han abierto la puerta a una amplia gama de
aplicaciones potenciales en la secuenciación del ADN, interacciones de proteína,
el control de transporte molecular, y la fabricación de dispositivos nanofluídicos
[19].
Figura 5.- Nanoporos en estado sólido de Si3N4 y su interacción con
nucleosomas. Fuente: (H.M. van den, et al. 2010)
31
3.3.2 Nanoporos Híbridos El concepto de poros híbridos se demostró mediante la inserción del canal de
hemolisina en los poros de SiN [20]. La hemolisina posee una estructura de
precisión atómica y el potencial para la ingeniería genética específica del sitio o
modificaciones químicas. La hemolisina se basa en una frágil membrana de
bicapa lipídica de soporte mecánico, lo que limita en gran medida su integración
en dispositivos. Pero esta limitación se elude mediante la colocación de un poro
biológico dentro de un nanoporo de estado sólido mecánicamente robusto creando
de ese modo un poro híbrido con ventajas de ambos.
Figura 6.- Membrana de estado sólido y proteína hemosilina formando un
nanoporo híbrido. Fuente: (A.R. Hall, et al. 2010)
3.4 Membrana cristalina de Si3N4 Los nanoporos son generalmente reproducidos sobre membranas, en el caso
particular se realiza la construcción en una membrana de Si3N4 como soporte para
la creación del nanoporo y su posterior utilización en la interacción con molécula
de DNA. De esta manera la membrana que se construye es una membrana
cristalina. Por un lado, definimos una membrana como una lámina delgada y con
32
gran flexibilidad, es decir, una membrana es toda capa de poco espesor que
adquiere fácil movilidad y es observada mayormente para crear secciones de
separación o adhesión; esta membrana puede ser cristalina y polimérica como el
caso específico, para comprenderse como tal la membrana esta totalmente
conformada por la unión de moléculas de nitruro de silicio en un orden constante y
con un crecimiento especifico. Para la caracterización de una membrana cristalina
una parte fundamental es la identificación de la celda unitaria que es la porción
más simple de la estructura cristalina que al repetirse mediante traslación
reproduce todo el cristal.
Figura 7.- Ejemplificación de una celda unitaria para la conformación de un
material cristalino. Fuente: https://es.slideshare.net/tango67/cristales-y-celdas-
unitarias
Las membranas de Si3N4 presentan estabilidad química y térmica sobre las
membranas lipídicas, siendo preferiblemente ocupadas para las aplicaciones que
se buscan de la misma. Estas propiedades se deben a las propiedades de los
materiales dieléctricos [21].
No poseen electrones libres en su estructura.
Tienen sus electrones fuertemente ligados a los núcleos (requieren un gran
suministro de energía externa para desplazarlos de un átomo a otro).
33
Sus moléculas son eléctricamente neutras y contienen igual número de
cargas positivas y negativas.
Sus moléculas pueden ser: polares o no polares.
Puede soportar un campo eléctrico de alta energía sin dejar que el flujo de
corriente pase a través de ella.
Se definen por su constante dieléctrica, corriente y tensión de ruptura.
Dadas estas propiedades su utilización en membranas para procesos de
secuenciación basados en electroforesis es óptima debido a que falta de
interferencia sobre la corriente eléctrica (porque su conductividad eléctrica es baja)
permite a la molécula de DNA, que es una molécula cargada, fluir a través del
nanoporo. Como se puede comprobar con su amplia utilización de la misma en
aplicaciones de separación de iones.
3.5 Ácido desoxirribonucleico (DNA) En la presente práctica se realiza una simulación de la interacción del nanoporo
con una molécula de DNA, por lo tanto, es necesario tener un pequeño
acercamiento al DNA su estructura y propiedades. EL ácido desoxirribonucleico
(DNA), es el material genético de todos los organismos celulares y casi todos los
virus. Su secuencia de nucleótidos contiene la información necesaria para poder
controlar el metabolismo de un ser vivo. El DNA lleva la información necesaria
para dirigir la síntesis de proteínas y la replicación.
El DNA está formado por la unión de muchos desoxirribonucleótidos (unión de una
desoxirribosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada). La mayoría de las
moléculas de DNA poseen dos cadenas antiparalelas (una 5´-3´ y la otra 3´-5´)
unidas entre sí mediante las bases nitrogenadas, por medio de puentes de
hidrógeno. La adenina enlaza con la timina, mediante dos puentes de hidrógeno,
mientras que la citosina enlaza con la guanina, mediante tres puentes de
hidrógeno.
34
Figura 8.- Bases nitrogenadas que forman el DNA. Fuente:
http://bioquimicaescencial.blogspot.mx/2016/06/acidos-nucl-eicos-unorganismo-
vivo.html
Figura 9.- Nucleótidos que conforman el DNA. Fuente:
https://prezi.com/cawspao13bun/nucleosidos-nucleotidos-y-acidos-nucleicos/
35
El estudio de su estructura se puede hacer a varios niveles, apareciendo
estructuras, primaria, secundaria, terciaria, cuaternaria y niveles de
empaquetamiento superiores [22]:
Estructura primaria: Se trata de la secuencia de desoxirribonucleótidos de
una de las cadenas. Las bases nitrogenadas que se hallan formando los
nucleótidos de ADN son Adenina, Guanina, Citosina y Timina. Los
nucleótidos se unen entre sí mediante el grupo fosfato del segundo
nucleótido, que sirve de puente de unión entre el carbono 5' del primer
nucleótido y el carbono 3' de siguiente nucleótido. Como el primer
nucleótido tiene libre el carbono 5' y el siguiente nucleótido tiene libre el
carbono 3', se dice que la secuencia de nucleótidos se ordena desde 5' a 3'
(5' → 3').
Estructura secundaria: Es una estructura en doble hélice. Permite explicar
el almacenamiento de la información genética y el mecanismo de
duplicación del ADN. Es una cadena doble, dextrógira o levógira, según el
tipo de ADN. Ambas cadenas son complementarias, pues la adenina de
una se une a la timina de la otra, y la guanina de una a la citosina de la otra.
Estas bases enfrentadas son las que constituyen los Puentes de Hidrógeno.
Estructura terciaria: El ADN presenta una estructura terciaria, que consiste
en que la fibra de 20 Å se halla retorcida sobre sí misma, formando una
especie de super-hélice. Esta disposición se denomina ADN
Superenrollado, y se debe a la acción de enzimas denominadas
Topoisomerasas-II. Este enrollamiento da estabilidad a la molécula y
reduce su longitud.
1. En procariontes se pliega como una super-hélice en forma, generalmente,
circular y asociada a una pequeña cantidad de proteínas. Lo mismo ocurre
en las mitocondrias y en los plastos.
2. En eucariontes el empaquetamiento ha de ser más complejo y compacto y
para esto necesita la presencia de proteínas, como son las histonas y otras
de naturaleza no histónica. A esta unión de ADN y proteínas se conoce
36
como Cromatina, en la cual se distinguen diferentes niveles de
organización:
a) Nucleosoma
b) Collar de perlas
c) Fibra cromatínica
d) Bucles radiales
e) Cromosomas
Estructura cuaternaria: La cromatina en el núcleo tiene un grosor de 300Å.
La fibra de cromatina de 100Å se empaqueta formando una fibra de
cromatina de 300Å. El enrollamiento que sufre el conjunto de nucleosomas
recibe el nombre de Solenoide. Los solenoides se enrollan formando la
cromatina del núcleo interfásico de la célula eucariota. Cuando la célula
entra en división, el ADN se compacta más, formando los cromosomas.
Figura 10.- Niveles estructurales del DNA. Fuente:
http://www.taringa.net/posts/apuntes-y-monografias/16195772/Biologia-
Reproduccion-y-ADN.html
37
La estructura del DNA se mantiene unida por distintas fuerzas como [23]:
Puentes de H: estos son muy numerosos, debido a que se dan entre los
pares de bases de los distintos nucleótidos que se van uniendo; son fuerzas
débiles, que ayudan a mantener la estructura de doble hélice de la
molécula, pero interaccionan de forma distinta dependiendo de las bases
que se unan; mientras entre la unión A-T, se dan dos puentes de H2, entre
C-G se dan tres uniones por puente de H2, por lo tanto, las regiones ricas
en C-G, están más fuertemente unidas.
Wander Wals: se dan entre cada peldaño de la hélice, gracias a que los P
están cargados negativamente. De esta manera la carga neta de la
molécula es negativa.
Hidrofóbicas e hidrofílicas: ayuda a la estabilidad de la estructura, que las
bases sean hidrófobas, lo cual favorece la cohesión, ya que excluye a las
moléculas de agua de su interior. Además, los P- se estabilizan con iones +
de la solución acuosa que impiden la repulsión entre estos P-.
3.6 Nanoporos ocupados para la secuenciación de DNA La creación de nanoporos y su interacción con moléculas biológicas se ha
orientado a la posibilidad de ser ocupado en procesos de secuenciación de las
moléculas en especial del DNA. Se ha propuesto que las hebras de DNA podrían
ser impulsados por electroforesis a través de un poro pequeño, y las fluctuaciones
de corriente resultantes podrían permitir la secuenciación en tiempo real de
polinucleótidos [24]. El uso de una hemolisina, ha demostraron que el DNA
monocatenario (ssDNA) podría ser detectado al pasar a través de un poro.
Se ha explorado la translocación de ADN bicatenario (dsDNA) a través de una
porina mitocondrial, conocido como un canal de aniones dependiente de voltaje
llamado (VDAC), y a través de bicapas que contienen canales iónicos, esto en
Bacillus subtilis [25]. Sin embargo, el tamaño de estos canales iónicos y su
carácter dependiente de voltaje, lo hacen poco prácticos para aplicaciones de
38
secuenciación. Si bien estos primeros estudios demostraron que las hebras largas
de ADN y ARN pueden ser accionados linealmente a través de los poros
biológicos, también se revelan varios retos para lograr secuenciación rápida de
ADN mediante sistemas de detección de pulso-resistivo.
Gran parte del crecimiento del campo en nanoporos pueden atribuirse a sus
perspectivas fascinantes como plataformas de secuenciación de ADN; dos de las
direcciones actuales de secuenciación de ADN basada en nanoporos son:
La primera está basada en dos esquemas para la lectura electrónica de una
secuencia de ADN mediante la detección electrónica transversal. El primero
se basa en la translocación del ADN a través de un poro de grafeno
mientras se pasan los electrones a través de la cinta de grafeno [26]. En
este caso, la señal de corriente a través de la cinta se ve afectada por la
identidad de la base; en el segundo caso, el ADN se pasó a través de una
separación de los electrodos y corrientes de túnel.
En el segundo la secuenciación de ADN está basada en OPTIPORE, que se
origina en la detección óptica de fluoróforos en nanoporos. En este esquema, una
molécula de ADN que va a ser secuenciado que se convierte primero en una
secuencia más grande y se hibrida después con sondas indicadoras. A
continuación, los constructos se descomprimen usando una matriz de nanoporos
montada en un microscopio de fluorescencia inteligentemente diseñado y cada
vez que un reportero se elimina de la secuencia, que emite fotones del color que
corresponde a la identidad del reportero. La secuencia de las cuatro bases ya se
ha medido usando el dispositivo [27].
39
Figura 11.- a) Detección electrónica transversal a través de poro de grafeno y b)
secuenciación basada en OPTIPORE. Fuente: (Rodríguez, M.; 2015)
3.7 Diagrama de flujo para la Simulación
Teniendo en cuenta lo abordado a lo largo del apartado teórico se presenta el
diagrama de flujo propio para la realización de la simulación de la interacción de
una molécula de DNA con un nanoporo en una membrana de Si3N4, el cual
seguirá la siguiente estructura:
Figura 12.- Diagrama de flujo para la simulación
Construcción de la
membrana de Si3N4 a
partir de una celda
unitaria
Creación de un poro
de aproximadamente
2nm en la membrana
Minimización de la energía y
estabilización de la membrana
a temperatura dada
Solvatación y
adición de iones
Medición de la
corriente iónica
Construcción de una molécula de
DNA y adecuación para interacción
Combinación de DNA
y nanoporo sintético
Medición de
corriente iónica
Simulación de
translocación
40
Para lograr esto es necesario tener un acercamiento a la estructura de las
carpetas que contienen los archivos para realizar la simulación:
Partiendo de esto se inicia el diagrama de flujo:
41
Ejecución de celda unitaria de Si3N4
3.8 Construcción de membrana cristalina a partir de celda unitaria
Para comenzar no situamos en la terminal sobre la carpeta bionano- tutorial-
files. y de ahí a la carpeta 1_build:
Utilizando el comando more revisamos el archivo unit_cell_alpha.pdb que
corresponde a una celda unitaria
0
42
La celda unitaria puede ser explorada con distintas visualizaciones en
Graphics/Representations
Ejecución de pdb en vmd
Recordemos que los archivos PDB, nos dan la información sobre la posición
de cada átomo sobre el espacio
Ejecutamos el archivo pdb llamando el ejecutable del vmd desde la carpeta
Software_Dr_Roberto/vmd193/bin/vmd, lo cual muestra la celda unitaria
43
Abrimos TKconsole en VMD: VMDmain->Extensions->Tkconsole y
ejecutamos el archivo replicateCrystal.tcl con el comando source.
Al terminar manda un letrero de que se ha hecho exitosamente
Entrada: unit-cell-alpha.pdb
Salida: membrane.pdb
Función: replica la celda unitaria “n” número de veces formando una membrana
3.9 Construcción de la membrana de Si3N4
Construcción de membrana de Si3N4
Los archivos .tcl son scripts o programas que permiten la ejecución de lo
que se ha programado en él, tiene un archivo de entrada y de salida propios.
Para visualizar cargamos el archivo:
membrane.pdb con los comandos: mol load pdb membrane.pdb
44
Salida: membrane.pdb n número de veces
formando una membrana
Entrada: unit-cell-alpha.pdb
Salida: block.pdb
Función: replica la celda unitaria n número de veces formando una
menbrana x:6u, y:6u y z:16u
En la terminal abrimos el archivo: replicateCrystal.tcl con el comando gedit:
replicateCrystal.tcl y cambiamos el output por block.pdb y en n3 de 6 a 16 y
ejecutamos en TKconsole de nuevo el tcl.
Para visualizar cargamos el archivo memebrane.pdb con los comandos: mol
load pdb block.pdb y para eliminar ocupamos mol delete pdb membrane.pdb
45
3.10 Construcción de membrana hexagonal de Si3N4
Construcción de membrana hexagonal de Si3N4
Entrada: membrane.pdb
Salida: membrane_hex.pdb y membrane_hex.bound
Función: corta el pdb membrane.pdb bajo las coordenadas dadas en forma
de prisma hexagonal
Para la construcción de la membrana hexagonal es necesario ejecutar
cutHexagon.tcl en TKconsole
Los archivos boundary corresponden a archivos de límites que contienen
los vectores reticulares periodicos necesarios para formar enlaces entre
átomos en las fronteras
Visualización de membrane_her.pdb
Para visualizar cargamos el archivo membrane_hex.pdb con los comandos:
mol load pdb membrane_hex.pdb
46
Formación de un bloque hexagonal:
En la terminal abrimos el archivo cuthexagon.tcl con el comando gedit
cutHexagon.tcl y cambiamos el fileNamePrefix membrane por fileNamePrefix
blok, guardamos y ejecutamos en TKconsole
Para visualizar cargamos el archivo block_hex.pdb con los comandos: mol
load pdb block_hex.pdb
Entrada: block.pdb
Salida: block_hex.pdb y block_hex.bound
Función: corta el pdb block.pdb bajo las coordenadas dadas en forma de
prisma hexagonal eliminando los átomos que no forman parte de los límites
47
3.11 Formación de un nanoporo
Abrimos TKconsole en VMD y ejecutamos el archivo drillPore.tcl con el
comando source.
48
Visualización del poro
Entrada: membrane.-hex.pdb y membrane_hex.bound
Salida: pore.pdb y pore.bound
Función: produce un poro en forma de dos conos que se cruzan,
determinando los límites.
Para visualizar cargamos el archivo pore.pdb con los comandos: mol load pdb
pore.pdb
Para visualizarlo mejor en Graphics->Representations: Ponemos los límites:
abd(y)<5 en Select Atoms
49
Creación de un archive Boundary:
Es necesario crear un archivo de límites, por lo tanto copiamos
membrane_hex.bound de la forma: cp membrane_hex.bound pore.bound
para generar el archivo boundary correspondiente
Modificando en drilPore.tcl los parámetros radiusMin y radiusMax se puede
cambiar el tamaño y del poro.
50
3.12 Formación de un nanoporo ramificado
En la terminal abrimos el archivo drillBranchedPore.tcl con gedit y
modifique las líneas 21 y 22, como se muestra en la figura, guardar y
ejecutar en TKconsole
Visualización de pdb
Entrada: block_hex.pdb
Salida: branch.pdb
Función: produce un poro en forma de "y", determinando los límites puestos
y eliminando a los átomos que no estén dentro
Para visualizarlo, en TK console ponemos mol load pdb branch.pdb y en
Graphics->Representations ponemos los límites: abs (y) < 5 en Selected Atoms
51
3.13 Estabilización de la membrana
Creación de archivo de estructura (formación de enlaces)
Es necesario definir los enlaces de cualquier tipo que existan en la
membrana, por tanto, ejecutamos en TKconsole source
siliconeNitridePsf.tcl, antes modificando en fileNamePrefix a membrane_hex
y en zPriodic a 1
Los archivos PSF describen los enlaces (conexiones entre dos átomos) y
los ángulos (conexiones entre tres átomos) del sistema
Entrada: membrane_hex.pdb y membrane_hex.bound
Salida: membrane_hex.psf
Función: determina los enlaces entre átomos presentes en la membrana así
como los ángulos propios
Para visualizar cargamos el archivos con los comandos: mol load pdb
membrene_hex.pdb psf membrane_hex.psf y repetir pasos para pore.pdb y
pore.psf
52
3.14 Calibración del campo de fuerza
Estando en TKconsole cambiamos a la carpeta 2_calibrate con el
comando cd ../2_calibrate
53
Inspeccionar inp:
En la terminal abrimos el archivo par_silicon_ions_NEWO.1.inp con el
comando gedit
Parte uno: parámetros de función de enrgía para enlaces armónicos
Parte dos: parámetros de función de energía para flexión del ángulo armónico
Parte tres: parámetros para interacciones no enlazadas
En TKconsole ejecutamos el archivo constrainSilicon.tcl con el comando
source. Éste puede ser modificado para el calculo de la constante dieléctrica
en 1.0 y en 10.0 en la línea betaList{}
54
Ejecución de eq1.namd
Entrada: membrane_hex.psf y membrane_hex.pdb
Salida: siliconRest_1.0.pdb o siliconRest_10.0.pdb
Función: determina la constante dielectrica para los valores de 1.0 y 10.0
En la terminal ejecutamos eq1.namd llamando el ejecutable namd2 y
creando un archivo para escritura de los valores arrojados llamado eq1.log
con el comando ->$nanmd2 eq1.namd > eq1.log antes en eq1.namd se dan
los valores de cellBasisVector 1-3 tomados de membrane_hex.bound
55
Ejecutar eq2.namd
Entrada: estructura: membrane_hex.pdb y coordenadas:
membranes_hex.psf
Salida: eq1.log y eq1.dcd
Función: hace una minimización energética a una temperatura constante
(295 k) En la terminal ejecutamos eq2.namd llamando el ejecutable namd2 y
creando un archivo para escritura de los valores arrojados llamado eq2.log
con el comando ../../software_Dr_Roberto/namd.2.12/nanmd2 eq2.namd >
Ejecución de null.namd
Entrada: estructura: membrane_hex.pdb y coordenadas: membranes_hex.psf
Salida: eq2.log y eq2.dcd
Función: hace una estabilización de la estructura en la temperatura (295 k)
En la terminal ejecutamos null.namd, llamando el ejecutable namd2 y creando
un archivo para escritura de los valores arrojados, llamado null.1.0.log con el
comando ../../software_Dr_Roberto/namd.2.12/nanmd2 null.namd > null.1.0.log
este mismo proceso puede hacerse para la constante 10 modificando el set
constrain
56
Ejecutar field.namd
Entrada: estructura: membrane_hex.pdb y coordenadas:
membranes_hex.psf
Salida: null1.0.log o null10.0.log, null1.0.dcd
Función: simula el sistema sin un campo eléctrico aplicado
En la terminal ejecutamos field.namd llamando el ejecutable namd2 y
creando un archivo para escritura de los valores arrojados llamado
field1.0.log con el comando ../../software_Dr_Roberto/namd.2.12/nanmd2
field.namd >field1.0.log este mismo proceso puede hacerse para la
constante 10 modificando el set constrain
57
Calculo de momento dipolar
Entrada: estructura: membrane_hex.pdb y coordenadas:
membranes_hex.psf
Salida: field1.0.log o field10.0.log, field1.0.dcd
Función: simula el sistema con un campo eléctrico asociado 16 kcal / (mol
Å e)
En TKconsole ejecutamos dipoleMomentZdiff.tcl con el comando source,
este se realiza para 1.0 y
Visualización eq1.dcd
Entrada: membranes_hex.psf, field1.0.dcd y null1.0.dcd o fiel10.0.dcd y
null10.0.dcd
Salida: dipoles1.0.dat o dipoles10.0.dat
Función: calcula el momento dipolar y calcula la constante dieléctrica del
material.
TK console cargamos las moléculas con el comando: mol load dcd eq1.dcd
pdb membrane_hex.pdb
58
Visualización eq2.dcd
Se puede ver el proceso de minimización en la creación de cinco frames.
Los archivos .dcd son archivos de trayectoria
EnTK console cargamos las moléculas con el comando: mol load dcd
eq2.dcd pdb membrane_hex.pdb, esto muestra el proceso de estabilización
59
Fig.1. Grafica de la energía potencial del nanoporo obtenida en la etapa de
minimización, en la cual se observa la disminución de la energía como función de
los pasos de la simulación.
Visualización eq1.log
En vmd main -> extensions -> analysis-> NAMDplot -> File-> select
NAMDlog file y escogemos eq1.log -> abrir -> se escoge la variable en “y”
y se da en file-> plot select data para graficar
Visualización eq2.log
isualización eq2.dcd Muestra el proceso de minimización de energía
En vmd main -> extensions -> analysis-> NAMDplot -> File-> select
NAMDlog file y escogemos eq2.log -> abrir -> se escoge la variable en y y se
da en file-> plot select data para graficar
60
Gráfica de dipolo eléctrico
isualización eq2.dcd Muestra el proceso de estabilización a la temperatura dada
Para graficar los datos de la constante dieléctrica graficamos dipole1.0.dat
con el comando xmgrace dipole1.0.dat
61
3.15 Solvatación y adición de iones
Solvatación
Estando en TKconsole nos movemos a la carpeta 3_solvate con cd
../3_solvate y ejecutamos addWater.tcl con el comando source
Visualización
Entrada: pore.pdb y pore.psf
Salida: pore_solv.pdb y pore_solv.psf
Función: solvata la membrana
Cargamos la molécula con mol load psf pore_solv.psf pdb pore_solv.pdb
62
Ejecutar cutWaterHex.tcl
En TKconsole ejecutamos el archivo cutWaterHex.tcl con el comando
source
Visualización
Entrada: pore_solv.pdb y pore_solv.psf
Salida: pore_hex.pdb y pore_hex.psf
Función: elimina las moléculas de agua en los límites hexagonales de la
membrana
Cargamos la molécula con mol load psf pore_solv.psf pdb pore_solv.pdb
63
Adición de iones
Estando en TKconsole ejecutamos addIons.tcl
Visualización
Entrada: top_all27_prot_lipid_pot.inp, pore_hex.pdb y pore_hex.psf
Salida: pore_ions.pdb, pore_ions.psf, pore_all.pdb y pore_all.psf
Función: añade iones de K y Cl
Cargamos la molécula con mol load psf pore_all.psf pdb pore_all.pdb
64
3.16 Medición de corriente iónica
Estando en TKconsole cambiamos a la carpeta 4_current
con el comando cd ../
Medición de corriente iónica
Medicion de corriente iónica
Ejecutar constrainSilicon.tcl
En TKconsole ejecutamos el archivo constrainSilicon.tcl con el comando
source. Éste puede ser modificado para el cálculo de la constante
dieléctrica en 1.0 y en 10.0 en la línea betaList{}
Ejecución de eq0.namd
Entrada: estructura: pore_all.pdb y coordenadas: pore_all.psf
Salida: siliconRest_1.0.pdb
Función: determina la constante dielectrica para los valores de 1.0 y 10.0
En la terminal ejecutamos eq0.namd llamando el ejecutable namd2 y
creando un archivo para escritura de los valores arrojados llamado eq0.log
con el comando ../../software_Dr_Roberto/namd.2.12/nanmd2 eq0.namd >
eq0.log
65
Ejecución de eq1.namd
Entrada: estructura: pore_all.pdb y coordenadas: pore_all.psf
Salida: eq0.log y eq0.dcd
Función: hace una minimización energética a una temperatura constante
(295 k) En la terminal ejecutamos eq1.namd llamando el ejecutable namd2 y
creando un archivo para escritura de los valores arrojados llamado eq1.log
con el comando ../../software_Dr_Roberto/namd.2.12/nanmd2 eq1.namd >
eq1.log
66
Ejecutar eq2.namd
Entrada: estructura: pore_all.pdb y coordenadas: pore_all.psf
Salida: eq1.log y eq1.dcd
Función: equilibra el sistema en función de la temperatura a un volumen
constante
En la terminal ejecutamos eq2.namd llamando el ejecutable namd2 y
creando un archivo para escritura de los valores arrojados llamado eq2.log
con el comando ../../software_Dr_Roberto/namd.2.12/nanmd2 eq2.namd >
eq2.log
Gráfica
Entrada: estructura: pore_all.pdb y coordenadas: pore_all.psf
Salida: eq2.log y eq2.dcd
Función: estabilización en función de la presión
En vmd main -> extensions -> analysis-> NAMDplot -> File-> select
NAMDlog file y escogemos eq2.log -> abrir -> se escoge la variable en “y”
y se da en file-> plot select data para graficar (temperatura, presión y
energía)
67
Ejecución de electricCurrentZ.tcl
En la terminal ejecutamos run0.namd llamando el ejecutable namd2 con el
comando ../../software_Dr_Roberto/namd.2.12/nanmd2 run0.namd. En
TKconsole ejecutar electricCurrentZ.tcl con el comando source
68
3.17Construcción de molécula de DNA
Entrada: semple.pdb, semple.psf y run0.dcd
Salida: curr_20V.dat
Función: calcula la corriente iónica a 20V
Manipulación del DNA
Estando en TKconsole cambiamos a la carpeta 5_manipulate_dna con el
comando cd ../
Cargar moléculas de DNA
En TKconsole cargamos los archivos con el comando mol load pdb
dsDnaAmber.pdb psf dsDnaAmber.psf
69
Cambio de lenguaje
La molécula puede ser caracterizada con los residuos como resname CYT,
THY, ADE, GUA
Los archivos amber son modelos moleculares que describen campos de
fuerza
En TKconsole se ejecuta el tcl llamado convertDNAtoCHARM.tcl con el
comando source
Convertir a una sola hebra
Entrada: dsDnaAmber.pdb y dsDnaAmber.psf
Salida: dsDnaCharm.pdb y dsDnaCharm.psf
Función: hace el cambio del modelo molecular del lenguaje Amber al
lenguaje Charm
En TKconsole ejecutamos removResidues.tcl con el comando source, en
la linea 6 elegimos la hebra a eliminar en este caso removemos selText
"segname BDNA"
70
Visualización DNA de una hebra
Entrada: dsDnaAmber.pdb y dsDnaAmber.psf
Salida: ssDna.psf y ssDna.pdb
Función: elimina el segmento BDNA dejando un DNA de una sola hebra
En TKconsole para visualizar se cargan las moléculas con el comando mol
load pdb ssDna.pdb psf ssDna.psf
71
Manipulación del DNA
La molécula puede ser caracterizada con los residuos como resname CYT,
THY, ADE, GUA
Los archivos amber son modelos moleculares que describen campos de
fuerza
En TKconsole ejecutamos source scuptor y posteriorment sculptorGUI lo
que despliega una ventana en Phat se dan coordenadas y después se da clic
en sculp para aplicar las coordenadas a la molécula
Visualización
Para invertir los cambios se puede poner undo y para guardar simplemente
se da clic en Save Molecule Coordinates, tomando el nombre puesto en Save
File. La visualización se muestra en la ventana de visualización
72
3.18 Combinación de DNA y nanoporo sintético
Estando en TKconsole ejecutamos source combine.tcl
73
Cargar moléculas de DNA
Entrada: pore.psf, pore.pdb, ssDna.psf y ssDna.pdb
Salida: pore+dna.psf y pore+dna.pdb
Función: combina el nanoporo sintetico y la hebra de DNA en un solo pdb
y psf
En TKconsole cargamos los archivos con el comando mol load pdb
pore+dna.pdb psf pore+dna.psf, una visualización de la interacción se
´puede ver en Graphics->Representations->selected atoms segname
ADNA and whitin 4.0 of resname SIN
Cambio de posición de DNA
Paramodificar la posición del DNA en TKconsole ponemos los siguentes
comandos: set sel [atomselect top "segname ADNA] / $sel moveby {4 1 7} /
set all [atomselect top all] / $all writepdb pore+dna.pdb / $sel delete / $all
delete
74
Modificaciones con sculptor
En TKconsole ejecutamos source scuptor y posteriorment sculptorGUI lo
que despliega una ventana en Phat se dan coordenas y después se da
clic en sculp para aplicar las coordenadas a la molécula
75
3.19 Medición de corriente iónica
Visualización
Para invertir los cambios se puede poner undo y ara guardar simplemente
se da clic en Save Molecule Coordinates, tomando el nombre puesto en
Save File: pore+dna_other.pdb. la visualización se muestra en La ventana
de visualización
Estando en TKconsole nos movemos a la carpeta 6_current_dna/ con el
comando cd ../, además pasamos los archivos psf y pdb de pore+dna
cambiando el nombre con los comandos cp
../5_manipulate_dna/pore+dna.pdb pore.pdb y
cp../5_manipulate_dna/pore+dna.psf pore.psf
76
Ejecutar solvatación
En TKconsole ejecutamos la solvatación con addWater.tcl y el comando
source
Visualización
Entrada: pore.psf, pore.pdb,
Salida: pore_solv.pdb y pore_solv.psf
Función: añade moléculas de agua solvatando las estructuras
Para visualizar en TKconsole cargamos con los comandos mol load pdb
pore_solv.pdb psf pore_solv.psf
77
Corte de solvatación
En TKconsole ejecutamos source cutWaterHex.tcl
78
Visualización
Entrada: pore_hex.psf, pore_hex.pdb,
Salida: pore_all.pdb, pore_all.psf, pore_ions.pdb y pore_ions.psf
Función: añade iones de NaCl en una concentracion de 2mM
Paravisualizar en TKconsole cargamos con los comandos mol load pdb
pore_all.pdb psf pore_all.psf
Medición de corriente iónica
Se hace un proceso de estabilización del sistema basados en el archivo
sample.xsc a 20V y haciendo los cálculos con run0.namd ejecutando
../../../Sofware_Dr_Robert/namd2.12/namd2 run0.namd
79
Ejecutar solvatación
En TKconsole ejecutamos el cálculo de la corriente iónica con el
comando source electricCurrentZ.tcl
80
Gráfica
Entrada: sample.pdb, sample.psf, run0.dcd y run0.restar.xsc
Salida: curr_20V_dna.dat
Función: Hace el cálculo de la corriente iónica
Graficamos la corriente iónica correspondiente al nanoporo y al nanoporo
con DNA, en la terminal ponemos el comando xmgrac
../4_current/curr_20V.dat curr_20V_dna.dat
Traslación del DNA
Estando en TKconsole cambiamos a la carpeta 7_translocate con el
comando cd ../
81
Correr constrainSilicon.tcl
En TKconsole ejecutamos constainSilicon.tcl con el comando source
82
Ejecutamos eq0.namd
Entrada: pore+dna.pdb y pore+dna.psf
Salida: siliconRest_1.0.pdb siliconRest_50.0.pdb
Función: determina la constante dielectrica para 1.0 y 50.0
En la terminal ejecutamos eq0.namd llamando el ejecutable namd2 con el
comando ../../software_Dr_Roberto/namd.2.12/nanmd2 eq0.namd
Ejecutamos eq1.namd
Entrada: pore+dna.pdb y pore+dna.psf
Salida: eq0.xst
Función: hace una minimización energética
En la terminal ejecutamos eq1.namd llamando el ejecutable namd2 con el
comando ../../software_Dr_Roberto/namd.2.12/nanmd2 eq1.namd
83
Ejecutamos eq2.namd
Entrada: pore+dna.pdb y pore+dna.psf
Salida: eq1.xst
Función: hace una minimización energética del sistema
En la terminal ejecutamos eq2.namd llamando el ejecutable namd2 con el
comando ../../software_Dr_Roberto/namd.2.12/nanmd2 eq2.namd
84
Ejecutamos run0.namd
Entrada: pore+dna.pdb y pore+dna.psf
Salida: eq2.xst
Función: equilibra el sistema a una temperatura constante
En la terminal ejecutamos run0.namd llamando el ejecutable namd2 con el
comando ../../software_Dr_Roberto/namd.2.12/nanmd2 run0.namd
Visualización de moléculas
Entrada: pore+dna.pdb y pore+dna.psf
Salida: run0.xst, run0.dcd
Función: aplica una corriente electrica de 150 Kcal/(mol A e)
En TKconsole cargamos: mol load psf pore+dna.psf dcd run0.dcd
85
Ejecutamos corriente iónica
EnTKconsole ejecutamos electricCurrentZframe.tcl
86
Ejecutamos corriente iónica
Entrada: pore+dna.pdb y pore+dna.psf y run0.dcd
Salida: curr: 6V.dat
Función: hace la medición de la corriente iónica del sistema en vacío
En TKconsole ejecutamos trackPositionZFrame.tcl
Cargamos las moléculas
Entrada: translocate.pdb translocate.psf y translocate.dcd
Salida: pos_6V.dat
Función: hace la medición de la corriente iónica del sistema
Se carga la molécula con mol load psf translocate.psf dcd translocate.dcd.
en Graphics->Representation ponemos resname SIN and y < 5
87
Ejecutamos run0.namd
Cargamos las graficas en la terminal con el comando xmgrace
curr_6V.dat pos_6V.dat
88
CAPÍTULO IV
Resultados y Conclusiones
1.- El Pdb de la celda unitaria:
Se muestra el pdb de la celda unitaria que contiene la posición de los 14 átomos
que la componen correspondiente a dos moléculas de Si3N4.
2.- Se obtiene la figura de la molécula de Si3N4.
Los átomos azules corresponden al nitrógeno y los átomos amarillos corresponden
a silicio
89
3.- Se obtiene la forma de la membrana
Es generada por la replicación de la celda unitaria en 6 celdas en cada dirección
(x,y,z) y el pdb generado. La membrana tiene un tamaño en promedio de 44
unidades por cada lado. Se muestra como la celda unitaria es la base mínima para
la construcción de la membrana cristalina. La membrana tiene un total de 3024
átomos y un solo frame.
4.- Se construye el bloque
La construcción de un bloque por la replicación de la celda unitaria, bajo las
condiciones especificadas en el tcl con una replicación de 6 celdas en x-y y de 16
celdas en el eje z. Con un total de 8064 átomos y un sólo frame. También se
muestra el inicio del pdb generado.
5.- Membrana hexagonal
Se ejecutó cutHexagon.tcl para realizar el corte de la membrana en forma
hexagonal de manera que el programa analiza cada átomo dentro de los límites y
si no entra lo elimina. La morfología de un prisma hexagonal es más conveniente
para la construcción de nanoporos.
El prisma hexagonal tiene 2268 átomos en contraste a los 3024 antes del corte y
un solo frame. Lo mismo se realiza para el bloque generando uno de 6048 en
90
contraste a los 8054 del inicio. Ambas membranas hexagonales tienen un tamaño
de 20 unidades en cada lado del hexágono.
6.- Nanoporo
Tras la aplicación de drillPore.tcl se genera un poro en forma de dos conos
concéntricos sobre la membrana. Este tcl ejerce un condicional analizando cada
átomo dentro de los límites determinados para el poro. El poro mide 15 unidades.
Para ejemplificar se modificó el tamaño del bloque y los tamaños de mínimo y
máximo correspondiente al nanoporo para mostrar la forma predicha en la primera
descripción.
7.- Determinación de enlaces y ángulos
La determinación de los enlaces entre dos átomos y los ángulos entre tres átomos
se ejecuta el tcl siliconNitridPSF generando los archivos psf correspondientes,
esto se realiza para los archivos de membrana y para la membrana con el poro.
Podemos comprobarlo debido a que se han asignado ya los ángulos que en pdb
no existían los asignados a la membrana con nanoporo con 1814 átomos que
forman 2914 enlaces entre átomos y 6838 ángulos calculados. Para la
membrana sin el poro contiene 2268 átomos que forman 3888 enlaces y 9720
ángulos.
8.- Minimización de la energía
A través de NAMD se hace una minimización energética con eq1.namd generando
una minimización energética a una temperatura constante generando un total de 5
frames que reflejan el proceso de minimización.
Así mismo se modificó la cantidad de puntos de análisis generando 50 frames.
También se muestra la gráfica generada en eq1.log correspondiente al proceso de
minimización de la energía en el sistema de membrana hexagonal.
91
9.- Estabilización de la temperatura
Se realiza una estabilización a una temperatura dad (295K) a través de cálculos
generados por eq2.namd ocupando namd y generando un total de 5 frames de
acuerdo a lo programado para la realización del cálculo. El proceso de
estabilización se ejemplifica con la gráfica mostrada de la temperatura con
respecto al tiempo generada a partir de los datos generados en eq2.log
10.- Calculo del momento dipolar
El cálculo del momento dipolar para el sistema se realizó con
dipoleMomentZDiff.tcl que realiza el cálculo del momento dipolar para cada
constrain 1 y 10 haciendo una diferencia entre ambos, lo cual genera dos archivos
dipole1.0.dat y dipole10.0.dat generados a partir de la ejecución del tcl.
Posteriormente se grafican los datos obtenidos del cálculo del momento dipolar.
Tiempo Momento dipolo
0.00045 627.278361
0.00055 671.271513
0.00065 709.742942
0.00075 741.662484
0.00085 772.392608
0.00095 814.05924
Tabla 10.1. Tabla de tiempo y momento dipolo para dipole1.0.dat
Tiempo Momento dipolo
0.00045 155.695969
0.00055 106.235896
0.00065 168.777144
0.00075 117.596382
0.00085 140.560678
0.00095 116.966205
Tabla 10.2. Tabla de tiempo y momento dipolo para dipole10.0.dat.
92
11.- Solvatación
Una vez estabilizada la membrana se procede a poner la membrana en un medio
acuoso por medio de addWater.tcl que agrega moléculas de agua en un bloque
con medidas determinadas, generando un pdb propio de la solvatación. La adicion
de moléculas de agua hizo pasar la cantidad de átomos a 8150 y en específico
2112 moléculas de agua.
Posteriormente es necesario eliminar las moléculas de agua que se encuentren
fuera de los límites de la membrana hexagonal, obteniendo un total de 5735
átomos y 1387 moléculas de agua.
12.- Adición de iones
Para poner el nanoporo en condiciones fisiológicas para ser capaz de
interaccionar con una molécula biológica se solvata y se añaden iones de KCl a
una concentración de 2mM esto se logra con la ejecución de addIons.tcl y el
archivo top_all27_prot_lipid_pot.inp que hace el cambio de NaCl a KCl. Esto
genera un psf y pdb con iones y solvatado, generando iones de Cl de color azul y
iones de K de color dorado.
13.- Medición de corriente iónica
La medición de corriente iónica es necesaria para la caracterización de la
membrana y su entorno como probables dispositivos de secuenciación de ADN
puesto que este funciona por medio de una diferencia de corriente generada para
hacer pasar la hebra por el nanoporo. Para lo cual se hicieron tres procesos:
Minimización energética por eq0.namd
Estabilización en función de la temperatura por eq1.namd
Estabilización en función de la presión por eq2.namd expresada en función
de volumen
93
14.- Revisión de la molécula de ADN
La interacción del nanoporo sintético con una molécula de DNA hace necesario
una revisión de la misma. Las moléculas en formato topológico y de condiciones
se visualizan en dos tipos de lenguajes distintos Amber y Charm que no hay
diferencia a nivel topológico, pero si un refinamiento entre ambos lenguajes.
La molécula de DNA que se visualiza primero es una molécula de doble cadena
como se encuentra en general. La molécula tiene un total de 508 átomos, 546
enlaces, 990 ángulos, 1440 ángulos diedros y dos segmentos correspondientes a
cada hebra de DNA. Los residuos de color morado corresponden a timina (6),
naranjas a citosina (2), amarillos a guanina (2) y azules adenina (6).
15.- DNA de cadena sencilla
Los dispositivos de nanoporo sintético interaccionan mejor con moléculas de
cadena sencilla (ssDNA) además que estas tienen mayor capacidad de torsión a
diferencia del DNA de doble cadena. Por lo cual se eliminó la cadena B de la doble
hélice quedándonos con la cadena A del ADN y asimismo se realizó una
replicación de la hebra sencilla generando una cadena larga de ssDNA.
El pdb ssDNA contiene 257 átomos, 277 enlaces, 502 ángulos, 732 ángulos
diedros y ocho nucleótidos. El pdb correspondiente al ssDNA_largo contiene 3529
átomos, 3797 enlaces, 6912 ángulos, 10034 ángulos diedros y 111 nucleótidos.
16.- Combinación de DNA y nanoporo
Se realizó la unión de ambas estructuras por medio del tcl combine.tcl que une
ambas estructuras como se muestra. Tiene 2071 átomos, 3191 enlaces, 7340
ángulos, 732 ángulos diedros y 2 segmentos, uno que corresponde al ssDNA y
otro al nanoporo sintético.
17.- Modificación de posición y torsión de DNA
La modificación de la posición de DNA y su torsión se modificó por comando
movedy o a través de sculptor, dando las coordenadas precisas, en un primer
94
caso se modificó para tener una posición más arriba del nanoporo y en un
segundo caso para generar una interferencia en su paso por el mismo.
18.- Solvatación de DNA y nanoporo sintético
La adición de moléculas de agua se hace por medio de la ejecución de
addWater.tcl con un tamaño de caja específico, el cual después es procesado
para generar solamente una solvatación dentro de los límites del prisma
hexagonal.
El primer pdb contiene 11914 átomos, 9753 enlaces, 10621 ángulos, 732 ángulos
diedros y 3281 moléculas de agua, en contraste la solvatación ajustada contiene
8140 átomos, 7122 enlaces, 9363 ángulos, 732 ángulos diedros y 2023 moléculas
de agua.
19.- Adición de iones
Para generar un ambiente fisiológico para que la conformación y disposición del
ADN se mantenga de manera natural es necesario crear un ambiente fisiológico
que se hace por la solvatación y la adición de iones NaCl 2mM en la proporción
dada. Se muestra el proceso de solvatación donde las formas de color amarillo
corresponden al sodio y las de color azul corresponden a iones de cloro.
20.- Medición de corriente iónica
La medición de la corriente iónica se realizó por medio del ejecutable
electricCurrentZ.tcl el cual valora la corriente iónica a 20V, y está fue medida para
las condiciones de la membrana simple y la modificación de la membrana sintética
con la molécula de DNA, mostrando diferencias en la corriente eléctrica generada
por la polaridad y carga propias de la molécula de DNA que para los fines
predichos de secuenciación permiten el paso de la molécula por el nanoporo
sintético en un proceso electroforético.
La línea negra corresponde a la corriente iónica del nanoporo sintético y la roja
corresponde al nanoporo sintético con la molécula de DNA.
95
Tabla 20a: Valores de corriente iónica con ADN
Tabla 20b: Valores de corriente iónica sin ADN
21.- Simulación de traslación en vacío
Una vez realizado la minimización energética, la estabilización del sistema a una
temperatura constante, y la aplicación de la corriente 150 Kcal/(mol A e) así como
la aplicación de la corriente a 6V, lo cual se realiza en un sistema en vacío que
solo contiene la hebra de DNA y el poso sintético.
96
Este se visualiza y se ve la generación de 81 frames que corresponden a los
procesos de simulación realizados, estos al ejecutarse se pueden visualizar a la
hebra de DNA atravesando el nanoporo realizado, cada frame corresponde a un
nanosegundo.
22.- Simulación de traslación en condiciones fisiológicas
Se realiza el cargado de la molécula que contiene un nanoporo y una hebra de
DNA en forma de hairpin la cual se encuentra en condiciones fisiológicas,
solvatada y ionizada. Se presentan un total de 31 frames los cuales en la
simulación corresponden a un proceso de 31 nanosegundos.
La simulación se realiza sobre 194978 átomos, por lo cual no fue realizada en la
computadora sino solamente se cargó la misma.
23.- Comparación de corrientes iónicas
La corriente iónica fue calculada con el los tcls marcados para cada sistema, en
caso específico se determinó la corriente iónica para el sistema en el vacío el cual
solo contiene al DNA y a la membrana y también se determinó la corriente iónica
para el sistema en condiciones fisiológicas que corresponden a curr_6V.dat y
pos_6V.dat correspondientemente.
Esta corriente iónica se midió aplicando un sistema de 6V a las moléculas lo cual
produce la gráfica que es presentada, en la que se puede ver como la presencia
de un ambiente fisiológico tiene un efecto drástico en el proceso de la corriente
iónica, en el que el paso de la hebra por el nanoporo en condiciones fisiológicas si
tiene diferencia a la realización en el vacío.
97
Conclusiones
El caso particular estudiado permitió comprender la importancia de la
bionanotecnologia, así como también el conocer otras áreas de aplicación, como
por ejemplo, la medicina y el cáncer.
Se tuvo la oportunidad de aprender el procedimiento computacional con los
programas VMD y NAMD para la simulación molecular.
Finalmente se concretó el aprendizaje de uso y aplicación de la dinámica
molecular de la interacción del DNA y el dispositivo bionanotecnológico (Si3N4).
98
Bibliografía
[1].- Charles P. Poole, Jr., Frank J. Owens, 2003, Introduction to Nanotechnology,
ISBN: 978-0-471-07935-4
[2].- Cerón, W. 2010. Bionanotecnología. Argentina: Universidad Mayor de San
Andres.
[3].- Institute of Bionanotecnology in Medicine [IBNAM]: http://www.ibnam.
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